［文章编号］1000－4718（2012）11－1928－05
［收稿日期］2012－07－16
［修回日期］2012－10－11
*［基金项目］广东省自然科学基金资助项目（No．9151052002000006）；国家自然科学基金青年项目（No．81201453）；广州市医药卫生科技项目（No．201102A213020）
△通讯作者Tel ：020－34152381；E －mail ：gzliushiming@126．com
MicroRNA －29a 对大鼠心肌细胞Bcl －2和
Mcl －1表达的调控作用及其机制
*
张振辉1，尤祥宇2，刘少军2
，刘
连2，刘世明2，3△
（广州医学院第二附属医院1重症医学科，2广州心血管疾病研究所，3心血管内科，广东广州510260）［摘
要］目的：探讨microRNA －29a （miR －29a ）对大鼠心肌细胞（CM 细胞）B 细胞白血病/淋巴瘤－2（Bcl
－2）和髓样细胞白血病－1（Mcl －1）表达的调控机制。方法：体外培养新生Sprague －Dawley 大鼠CM 细胞和人胚肾细胞株293T 。合成大鼠miR －29a 的拟似物（mimic ）和抑制剂（inhibitor ）。用脂质体Lipofectamine RNAiMAX 转染miR －29a mimic 进入CM 细胞，转染48h 后分别用实时荧光定量PCR 和Western blotting 检测Bcl －2和Mcl －1mRNA 和蛋白的表达变化。构建Bcl －2和Mcl －1的萤光素酶报告基因载体（DNA 质粒），转染293T 细胞（DNA 质粒和miRNA 共转染）和CM 细胞（miRNA 和DNA 质粒先后转染），双萤光素酶报告基因系统检测萤光素酶的表达变化。结果：CM 细胞转染miR －29a mimic 48h 后，
Bcl －2和Mcl －1mRNA 和蛋白的水平均下调（P ＜0．05）。双萤光素酶报告基因系统显示，在293T 细胞中，miR －29a 可特异抑制带有bcl －2和mcl －13’UTR 上野生型识别元件的报告基因表达（P ＜0．05），在CM 细胞中，抑制内源性的miR －29a 水平能促进bcl －2和mcl －13’UTR 上野生型识别元件的报告基因表达。结论：抗凋亡基因bcl －2和mcl －1是miR －29a 的靶基因。miR －29a 可能通过作用于Bcl －2和Mcl －1实现对心肌细胞凋亡的调控作用，
具体效应仍待进一步阐明。［关键词］MicroRNA －29a ；细胞凋亡；B 细胞白血病/淋巴瘤－2；髓样细胞白血病－1［中图分类号］R363
［文献标志码］A
doi ：10．3969/j．issn．1000－4718．2012．11．002
Roles of microRNA －29a in expression of Bcl －2and Mcl －1in rat car-diomyocytes
ZHANG Zhen －hui 1，YOU Xiang －yu 2，LIU Shao －jun 2，LIU Lian 2，LIU Shi －ming 2，
3
（1Intensive Care Unit ，2
Guangzhou Institute of Cardiovascular Diseases ，3Department of Cardiology ，the Second Affiliated Hos-
pital of Guangzhou Medical University ，Guangzhou 510260，China．E －mail ：gzliushiming @126．com ）
［ABSTRACT ］AIM ：To investigate the regulatory mechanisms of microRNA －29a （miR －29a ）on the expression of Bcl －2and Mcl －1in rat cardiomyocytes （CM cells ）．METHODS ：The CM cells were isolated from the hearts of new-born rats and transfected with miR －29a mimic （100nmol /L ）by Lipofectamine RNAiMAX．The expression of Bcl －2and Mcl －1at mRNA and protein levels was detected by real －time fluorescence quantitative PCR and Western blotting．The luciferase assay was performed in HEK293T cells and CM cells ，which were co －transfected with plasmid DNA and miRNA using Lipofectamine 2000．RESULTS ：Transfection of miR －29a mimics significantly reduced the expression levels of Bcl －2and Mcl －1in CM cells as compared with the control cells （P ＜0．05）．In addition ，HEK293T cells co －transfected with miR －29a mimic and Bcl －2－3’UTR －WT or Mcl －1－3’UTR －WT plasmid significantly reduced the luciferase activity as compared with control group （P ＜0．05）．While CM cells transfected with miR －29a inhibitor and Bcl －2－3’UTR －WT or Mcl －1－3’UTR －WT plasmid in succession ，the luciferase activity was increased inversely （P ＜0．05）．CONCLUSION ：miR －29a may regulate apoptosis by targeting the bcl －2and mcl －1genes．
［KEY WORDS ］MicroRNA －29a ；Apoptosis ；B －cell leukemia /lymphoma －2；Myeloid cell leukemia －1
微小RNA （microRNA ，
miRNA ）是一类长度约22个核苷酸大小的内源性非编码RNA ，它可通过识别
靶基因mRNA 的3’
端非编码区（3’UTR ），并与之结合阻止翻译或导致mRNA 降解，从而抑制靶基因的
表达［1－3］
。miRNA 在发育调控、细胞增殖与凋亡、造
血等方面均可发挥作用
［4－6］
，近年的研究发现，多种·8291·中国病理生理杂志Chinese Journal of Pathophysiology 2012，28（11）：1928－1932
心脏疾病的发病受miRNA的调控［7－9］。心肌细胞凋亡存在于多种心脏疾病，在心室重构（ventricular re-modeling）和心力衰竭发病过程中起重要作用［10］。目前已有研究报道，microRNA－29（miR－29）参与肝癌细胞凋亡的调控作用［11］，但miR－29调控心肌细胞凋亡及其相应的靶基因情况目前仍缺乏报道，本研究通过合成miR－29a（miR－29的主要成员）的拟似物（mimic）和抑制剂（inhibitor），将其转染至体外培养的乳鼠心肌细胞中，观察miR－29a对凋亡相关蛋白B细胞白血病/淋巴瘤－2（B－cell leuke-maia/lymphoma－2，Bcl－2）和髓样细胞白血病－1（myeloid cell leukemia－1，Mcl－1）表达水平的影响，并验证miR－29a凋亡相关的靶基因。
材料和方法
1试剂
DMEM细胞培养基、Opti－MEM细胞转染培养基和胎牛血清购自Gibco；细胞转染试剂Lipo-fectamine RNAiMAX、RNA抽提裂解液Trizol和SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒均购自In-vitrogen；Bcl－2、Mcl－1和内参照蛋白GAPDH的抗体均购自Santa Cruz；双萤光素酶报告基因活性检测试剂盒（Dual－Luciferase Reporter Assay System）购自Promega；pGL3－control－MCS和Renilla lucifer-ase质粒DNA购自Invitrogen；内切酶和连接酶购自Fermentas；质粒提取试剂盒购自Promega。
2乳鼠原代心室肌细胞（cardiomyocytes，CM细胞）的分离和培养
新生1 2d的Sprague－Dawley大鼠（购于广东省实验动物中心）常规乙醇消毒，剪开胸腔，超净工作台中无菌条件下取心尖部，放入冰冷的无钙镁PBS缓冲液中漂洗3 5次。将心室组织剪成约1 mm?1mm?1mm碎块后用0．25%胰蛋白酶37?水浴分次消化。收集各次消化的上清液，于1000 r/min室温离心10min分离出细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养液采用差速贴壁原理分离CM细胞，调整浓度为3?108/L，接种于60mm培养皿或6孔板中培养。前48h加5－溴脱氧尿嘧啶（5－Br-dU）0．1mmol/L抑制非心肌细胞生长。培养至第4 d后去血清培养过夜，第5d的细胞用于实验。3293T细胞培养
人胚肾细胞株293T（购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）采用DMEM培养基和10%FBS培养。
4方法
4．1寡核苷酸序列设计与合成大鼠miR－29a的（mimic）（miRBase acces-sion No．MI0000863）合成，miR－29a的抑制剂（in-hibitor）则采用miR－29a成熟体的反向互补序列，并对所有碱基都进行2’－甲氧基修饰（由吉玛公司设计）。双链RNA的负对照（NC）和单链RNA的负对照（anti－miR－C）为与哺乳动物基因组没有同源性的序列，该序列是上海吉玛公司设计的。寡核苷酸均由上海吉玛公司合成。PCR引物均由上海英骏生物公司合成，见表1。
表1引物序列
Table1．Sequences for primers
Gene name Primer sequence
Bcl－2Forward：5'－GGAGGATTGTGGCCTTCTTT－3'
Reverse：5'－TTCCACAAAGGCATCCCAG－3'
Mcl－1Forward：5'－AGAAAGCTGCATCGAACCAT－3'
Reverse：5'－CCAGCTCCTACTCCAGCAAC－3'
β－actin Forward：5'－AAGATGACCCAGATCATGTTTGAG－3'
Reverse：5'－GCAGCTCGTAGCTCTTCTCCAG－3'
4．2载体构建bcl－2和mcl－13’UTR报告基因载体pGL3－Bcl2－3’UTR－WT和pGL3－Mcl－1－3’UTR－WT携带野生型（wild type，WT）的3’UTR，而pGL3－Bcl－2－3’UTR－Mut和pGL3－Mcl －1－3’UTR－Mut则携带突变了miR－29识别元件的3’UTR（突变体，mutant，Mut）。所有载体均以pGL3－control－MCS为基础，插入野生型或突变型的bcl－2和mcl－13’UTR序列。野生型插入片段的模板是大鼠bcl－2基因（NM_016993）和mcl－1基因（NM_021846）的3’UTR。突变型插入片段的模板是以野生型载体为基础，在PCR扩增使用的引物上引入突变位点产生［11］。
4．3细胞转染和报告基因活性检测将CM细胞分为对照组（CON组）、miR－29a拟似物转染阴性对照组（negative control，NC组）、miR－29a拟似物转染组（miR－29a组）、miR－29a抑制剂阴性对照组（anti －miR－C组）和miR－29a抑制剂组（anti－miR－29a组）。miRNA的单独转染采用转染试剂Lipo-fectamine RNAiMAX（按说明书操作），miRNA的终浓度为100nmol/L。
在双萤光素酶报告基因系统的实验中，293T细胞的转染在细胞铺板24h后用Lipofectamine2000进行（按说明书操作），RNA的浓度为10nmol/L，firefly luciferase质粒10ng，Renilla luciferase质粒2 ng。CM细胞转染先采用Lipofectamine RNAi MAX 转染miRNA，24h后用Lipofectamine2000转染表达质粒，各自转染步骤类似上述，最后1次转染48h后按实验需要处理细胞，报告基因活性检测按说明书
·
9291
·
操作，用化学发光法检测。
4．4心肌细胞总RNA提取及实时荧光定量PCR 检测细胞总RNA提取按Trizol试剂盒说明书操作；使用Invitrogen的逆转录反应试剂盒，按试剂盒说明书进行，反应产物进行PCR扩增；PCR过程按Invitrogen的SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒说明书在ABI7500荧光定量PCR仪上进行，使用GAPDH作为内参照同时进行PCR，获得Ct值后，应用比较Ct法进行相对定量，目标基因的相对定量用2－ΔΔCt计算。
4．5心肌细胞样本的Western blotting实验细胞去掉培养基后加入蛋白裂解液，BCA法行蛋白定量后用于上样跑胶或者－80?保存备用。恒压电泳，浓缩胶80V，20 30min，分离胶100V电泳，电泳时间根据marker的位置确定；恒流276mA转膜2．5 h；室温封闭1h；Ⅰ抗4?孵育过夜；Ⅱ抗室温孵育1 h；用ECL solution在暗室中X光片显影，洗片机冲洗胶片，扫描仪扫描胶片后用Bio－Rad的胶片灰度分析软件分析。
5统计学处理
采用SPSS15．0统计软件进行数据分析，所有计量资料采用均数?标准误（珋x?s E）表示，组间差异只有两组时用t检验，有多组时用单因素方差分析（One－way ANOVA）。以P＜0．05为差异有统计学意义。
结果
1CM细胞分离培养效果和寡核苷酸转染效率经上述方法分离的心肌细胞，经心肌细胞肌动蛋白（α－actin）标记行细胞免疫荧光检测鉴定，心肌细胞纯度＞95%，细胞存活状态良好。采用脂质体Lipofectamine RNAiMAX转染体外合成的miR－29a 的拟似物mimic（100nmol/L）进入CM细胞，转染48 h后可使CM细胞内miR－29a的水平上升（90．62?12．72）倍；而转染miR－29a的抑制剂inhibitor（200 nmol/L）进入CM细胞，可使CM细胞内的miR－29a 水平降至（35．82?8．52）%（另文报道），证实采用此方法转染miR－29a的mimic和inhibitor，能在心肌细胞中成功过表达或抑制miR－29a的水平。
2过表达miR－29a后Bcl－2和Mcl－1的mR-NA表达下降
CM细胞转染100nmol/L miR－29a48h后，与CON和NC组比较，Bcl－2和Mcl－1的mRNA表达水平均下降，提示过表达miR－29a能使Bcl－2和Mcl－1的mRNA表达水平下降，见图1
。
Figure1．Overexpression of miR－29a regulated the mRNA levels of Bcl－2（A）and Mcl－1（B）in cardiomyocytes．珋x?s
E
．n=3．* P＜0．05vs CON．
图1过表达miR－29a后心肌细胞Bcl－2和Mcl－1mRNA表达的变化
3过表达miR－29a后Bcl－2和Mcl－1的蛋白表
达下降
CM细胞转染100nmol/L miR－29a48h后，与
对照组比较，Bcl－2和Mcl－1蛋白表达均减少，提
示过表达miR－29a能使Bcl－2和Mcl－1的蛋白
表达水平下调，见图2。
4双萤光素酶报告基因系统验证miR－29a的靶基
因
293T细胞同时转染miR－29a的mimic和Bcl－
2（或Mcl－1）的报告基因载体（WT野生型或Mut
突变体），结果显示转染WT载体的细胞萤光素酶活
性均下调，提示miR－29a能特异性作用于bcl－2或
mcl－1的3’UTR区域，见图3A、B。CM细胞先后转
染miR－29a inhibitor和bcl－2（或mcl－1）的报告
基因载体（WT野生型或Mut突变体），结果显示，转
染WT载体的细胞萤光素酶活性上调，而Mut载体
未见变化。先用miR－29a的抑制剂抑制心肌细胞
内源性miR－29a的水平，削弱了对Bcl－2和Mcl－
1表达的影响，见图3C、D。
·
0391
·
Figure 2．Overexpression of miR －29a regulated the protein levels of Bcl －2and Mcl －1in cardiomyocytes．珋
x ?s E ．n =3．*P ＜0.05，＊＊
P ＜0．01vs CON and NC．
图2过表达miR －29a 后Bcl －2和Mcl －1
蛋白的表达
Figure 3．MiR －29a regulated the expression of Bcl －2（A ，C ）and Mcl －1（B ，D ）through their recognition component of 3'untrans-lated region （UTR ）．A ，B ：miR －29mimic and Bcl －2/Mcl －13'UTR －WT /Mut were co －transfected into HEK293T cells ；C ，D ：miR －29a inhibitor and Bcl －2/Mcl －13'UTR －WT /Mut were transfected into rat cardiomyocytes．珋
x ?s E ．n =3．*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01vs NC ；△P ＜0．05vs anti －miR －C．
图3miR －29a 通过bcl －2和mcl －13’UTR 上的识别元件进行表达调控
讨论
本研究通过体外化学合成miR －29a 的拟似物（mimic ），转染miR －29a 进入CM 细胞，经实时荧光定量PCR 检测验证，发现心肌细胞中miR －29a 成熟体的表达量较对照组上升90．6?12．7（P ＜0．01），证实通过转染miR －29a mimic 能成功在心肌细胞内过表达miR －29a ，并能进一步促进CM 细胞凋亡（另文报道）。
已知miRNA 通过对下游靶基因蛋白表达水平
的调控行使其生物学功能，目前研究表明它们常通过识别并结合靶基因3’
UTR 上的位点，起到降解靶mRNA 或抑靶基。们Tar-getScan 4．0及Pictar 程序预测了miR －29a 可能的
靶基因，结果发现在bcl －2和mcl －1的3’
UTR 上分别有一段miR －29a 的结合位点（种子序列）。Bcl －2和Mcl －1都是Bcl －2蛋白家族的成员，通过结合Bcl －2蛋白家族中的促凋亡成员阻断线粒体通
透性改变及线粒体内凋亡诱导因子的释放，
从而起抗凋亡的作用
［12－13］
，Bcl －2家族成员在心肌细胞缺血再灌注所致心肌细胞凋亡过程中的作用显
著［14－15］
。为了证实miR －29a 能否抑制CM 细胞Bcl －2和Mcl －1的表达，
我们检测了过表达miR －29a 后CM 细胞内Bcl －2和Mcl －1mRNA 和蛋白的水平。结果发现，过表达miR －29可明显抑制CM 细胞中
·
1391·
内Bcl－2和Mcl－1mRNA和蛋白的表达。为了进一步验证bcl－2和mcl－1是否直接受miR－29a的调控，我们将含有大鼠miR－29a种子序列的bcl－2和mcl－1的3’UTR片段克隆到报告基因载体pGL3－MCS－control中，得到pGL3－Bcl－2－3’UTR－WT和pGL3－Mcl－1－3’UTR－WT报告载体，并且构建了含有突变序列的载体pGL3－bcl－2－3’UTR －Mut和pGL3－Mcl－1－3’UTR－Mut。然后利用双萤光素酶报告基因系统检测在过表达或抑制miR －29a后萤光素酶活性改变情况。实验首先在工具细胞293T细胞中进行，因为在工具细胞中导入外源性的质粒载体和miR－29a寡核苷酸，如果能观察到它们之间的相互作用，则能证实该作用机制具有普遍性，结果发现，在293T细胞中过表达miR－29a，可抑制野生型报告载体的萤光素酶活性；突变体的作用则相反。接着，我们在CM细胞中导入外源性的质粒载体和miR－29a寡核苷酸，观察它们与内源性miR－29a之间的相互作用，结果发现，在CM细胞中通过转染miR－29a inhibitor抑制miR－29a水平，可提高野生型bcl－2和mcl－13’UTR报告载体的萤光素酶活；突变体的作用也相反。上述结果提示miR－29a可通过降解mRNA或抑制蛋白翻译，来抑制CM细胞内bcl－2和mcl－1基因的表达。
综上所述，miR－29a可通过靶向2个抗凋亡基因bcl－2和mcl－1，调控其表达水平，进而可能影响心肌细胞的凋亡水平，研究结果为进一步完善心肌细胞凋亡调控机制提供了有力的基础。
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