纤维素酶活性测定
技术报告NERL/TP-510-42628 2008年1月实验室程序分析发行日期：1996年8月12 日
B. 阿德尼和J. 贝克
科罗拉多州科尔大道戈尔登国家可再生能源实验室1617，80401-3393303-275-3000?https://www.doczj.com/doc/bd18817432.html, 美国能源部办公室的能源效率和可再生能源由中西部研究所?巴特尔主持。合同号：DE - AC36 - 99 - GO10337
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纤维素酶活性测定
技术报告
1。简介
1.1下面的方法介绍了纤维素酶的活性测定过程采用国际纯粹化学与应用化学的指导方针。该过程已被设计用来测量在“过滤条件下纤维素酶的活性单位”（FPU）的原始酶液。对于酶制剂的定量结果进行比较，必须在此基础上进行重要的和平等的转换。
2.0毫克血糖的价值相当于从50毫克的过滤纸在60分钟（4％的转换）已被指定为计算所的IUPAC的滤纸纤维素酶单位（FPU）的拦截的还原糖。
1.2这是极为重要的一点，要记住：FPU的定义只是在这个意义上的转换。还原糖产量不是在检测的混合物中线性函数酶的数量，而是由高斯讨论（1987年），两倍的酶不会在相等的时间被预期得到两倍还原糖的产率。因此该检测程序需要找到一种稀释原始的酶原料，比如一个0.5毫升稀释液在60分钟内稀释催化4％（或者，在实践中，发现两个稀释支架上的4％转换点，使之密切合作，所需的稀释可以
得到合理的精度，有插值），然后计算符合稀释要求原活动（浮点运算单元/毫升）。进一步评价所需的计算，其重要意义，要在附录中找到。
1.3测定混合物时，可能在某些情况下含有还原糖与底物蔗糖水解酶。将发酵液的检测纤维素酶可能含有营养糖，纤维素和还原端基体聚合物的有时在任何酶的攻击下是可以衡量葡萄糖的量。出于这个原因，控制包括酶无需底物和酶的底物，不包括所有酶检测值与样品空白值的任何修正。
2。范围
2.1本程序只用于浮点运算单元，在一个适当的活性中，测定纤维素酶的制备过程的IUPAC定义如上所述。
3。参考文献
3.1高斯，T.K. 1987。“测量纤维素酶的活动。”纯净代谢。化学。59：257-268。3.2米勒，G.L.1959 “利用二硝基水杨酸试剂测定还原糖。”分析化学。31:426-428。
4。意义和使用
4.1这个步骤根据IUPAC（国际理论和应用化学联合会）理论，决定了在纤维素酶的准备工作中酶活动的滤纸功效。
5。装置设备
5.1保持在500C范围内的水浴。
5.2 能测量540nm吸光度的分光光度计。
6。试剂和反应物
6.1蒸馏水1416ml
二硝基水杨酸10.6g
氢氧化钠19.8g
混合溶解上述物质，然后添加罗谢尔盐306g
苯酚7.6ml（在500C时溶解）
焦亚硫酸钠8.3g
将3ml样品混合着0.1N盐酸滴到酚酞的末端，它将需要5-6ml盐酸，如果需要，添加氢氧化钠。
6.2柠檬酸盐缓冲溶液：对于里氏木霉纤维素酶，在PH值为4.8的0.05M柠檬酸盐缓冲溶液中执行纤维素酶鉴定。
对于其他纤维素酶，PH值和温度可能会不同。当报告结果时，鉴定的条件一定是明确的。
柠檬酰胺210g
去离子水750ml
添加氢氧化钠直至PH为4.3
在溶液中加水冲淡至1L，然后测其PH。如果需要，在溶液中加入氢氧化钠至PH值为4.5.当1M柠檬酸盐缓冲溶液用水冲淡至50mM，那么它的PH应该为4.8.在冲淡柠檬酸钠缓冲溶液至PH为4.8时，检测和适应它。
7。思考与尝试
7.1追随合适的特定的卫生计划方针的NREL实验室。
7.2 当使用有毒的，腐蚀的苯酚时，一定要小心。
8。使纤维素糖化的滤纸分析的步骤
8.1通过类似的和完全相同的三类试验方法发现的糖苷键分裂为下面讲述的细节作了准备。这种酶作用物是一种高级滤纸条
（1.0cm*6.0cm）。
8.2酶的试管化验
8.2.1在每个13*100的试管中放置一张卷的滤纸。
8.2.2 将1.0ml，PH为4.8的0.05M的柠檬酸钠加入试管中，缓冲溶液应该使滤纸饱和。
8.2.3 使令缓冲溶液的试管和酶作用物相互平衡，都达到50O C。8.2.4 在柠檬酸盐缓冲溶液中加入0.5ml稀释的酶，至少两种稀释溶液必须由酶样品制成，一种稀释溶液释放超过2m的葡萄糖，另外一种少于2mg。这两种稀释溶液把释放2.1和1.9mg葡萄糖作为目标，依赖于酶，这种目标实现比较困难，额外的稀释溶液必须使用。
8.2.5 在50O C环境下培养60min。
8.2.6 在培养最后阶段，将试管从50O C水浴中移出，通过和加入
3mlDNS试剂并与溶液混合使酶停止反应。
8.3试剂和反应物
8.3.1试剂溶液：1.5ml柠檬酸盐缓冲溶液。
8.3.2酶控制：1.0ml柠檬酸盐缓冲溶液+0.5ml稀释的酶（为每个稀释溶液准备一个独立的控制）。
8.3.3酶作用物控制:1.5ml柠檬酸盐缓冲溶液+滤纸条。
8.4葡萄糖标准
8.4.1无水葡萄糖的库存解决方案应该制定部分这些存货应该密封
和冷藏在融解并确保充分混合后，这种标准应该是旋涡。
8.4.2稀释溶液在以下方式中的库存制成的。
1.0ml+0.5ml buffer=1:1.5=6.7mg/ml(3.35mg/0.5ml)
1.0ml+1.0ml buffer=1:2=5mg/ml(
2.5mg/0.5ml)
1.0ml+
2.0ml buffer=1:3=6.7mg/ml(1.65mg/0.5ml)
1.0ml+4.0ml buffer=1:1.5=2mg/ml(1.0mg/0.5ml)
8.4.3含有1.0ml柠檬酸钠缓冲溶液的应该通过在13*100mm的试管中加入0.5ml葡萄糖缓冲溶液来准备葡萄糖标准试管。
8.4.4应该在50O C时和酶化验试管一起培养，然后在60O C时通过加入3.0mlDNS试剂停止培养。
8.5发展（Miller,1959）
8.5.1在含有足够水的持续沸腾的水浴中加热所有试管5min来覆盖部分被混合着试剂的反应物占有的试管，所有的样品应该一起煮沸。在煮沸后，移至冰水浴。
8.5.2让试管静置直至产生沉淀，用离心机器简单分离，在水中冲淡所有试管。通过测量吸光度决定颜色的形成。这种在上面描述的稀释的吸光度应该在0.1到1.0A。
9。结果
9.1利用过量的葡萄糖（mg/0.5ml）搭配A540构建葡萄糖标准的线性曲线，标准曲线的数据应密切符合适当的直线，直线的关联系数是最接近的那一个。验证标准曲线通过运行一个校准验证的直线，
一种独立的，准备好的溶液，里面包含已知量的葡萄糖浓度为标准曲线上的一半。
9.2使用此标准曲线确定的葡萄糖量为每个样品试管在减去空白的酶之后得出来的。
9.3估计将2.0mg的葡萄糖的酶浓度和一大块葡萄糖酶浓度的对数做比较。（请参考附录B，就是使用半对数方格纸）。为了找到要求的酶的浓度，两份数据指出需要非常接近 2.0ml，然后在它们之间画一条路线，使用此线两点之间找到稀释的酶，将产生和2.0mg葡萄糖等价的还原糖，附录B提供了一个例子：
在这个部分，在下面计算FPU的等式中，酶浓度在这个术语是指在酶稀释溶液中原来酶所占的比例。
9.4计算FPU
FPU=0.37/(酶)2.0mg葡萄糖
在公式中，酶代表了在直接测试酶稀释溶液里面的原来的酶的比重，由此引出的FPU见GHOSE（1987）和附录A。
9.5用IUPAC-FPU计算一个例子涉及附录B。
10。精度和偏差
10.1精度的测量只有精确的重复测量相同的数量的酶。这个过程,如果仔细地进行,应该像得到其他实验室使用相同的过程那样得到同样的近似数字读数。用滤纸检测的精度可能受固有的纤维素酶制剂的物理特性的影响。
11。质量控制
11.1报道有象征意义的数字:典型的效果显著的统计报告作为整个整数和标准差。报道之前必须明确检测条件的结果。
11.2重复:配制每个稀释溶液,一式三份。
11.3空白:所描述的那部分“空白和控制”。
11.4标准:不是百分之相对不同定义,依赖于这种被测试的酶。
11.5方法:不可自审核标准酶随时间变化。
11.6标准检定校准:校准标准应独立标定及分析所描述的那部分“计算”。
11.7样本大小:依赖于酶浓度。
11.8样本贮存:根据样本酶的来源及厂商的使用说明。
11.9贮存: 标准储存在-20oC或准备新鲜的批次,请在使用前用力的摇匀。
11.10标准:所描述的那部分“葡萄糖水平”。
11.11定义了一批:各种标准、空白及样品在一起。由于通过工具约束这批样品的大小是有限的,不应大于实际处理的标准大小。
11.12控制图:不适用。
11.13其他:不适用。
12。附录A:在方程的数值用于计算,滤纸的活动
实际的底线是,如果使用按照说明的指示,这些计算进行了计算公式,在获得的结果一致公认的活动,在“滤纸单位”,将会得到在世界上其它实验室,是这些酶解试题。对于那些工人感兴趣的这个方程,推导出的“滤纸单位”, 结合Ghose(1987)，下面的意见可能是有益的。
分子(0.37)方程的系数为转换。
2.0毫克的葡萄糖水准产生的分析方法,葡萄糖(2.0÷0.18016),从量的测试,用于检测(0.5毫升),并由溶解时间(60分钟)所需的减少。
因为在分母上“酵素浓度”是一种无量纲化方程的数量(等于比例的酶素浓度在0.5毫升的酶稀释加入检测到这种酶浓度,原方案)、价值预期FPU右边的方程,因此风和单位(mmol min-1mL-1),看起来像“国际单位/ mL”(廖/毫升)。
Ghose自己所指出的,然而,由于FPU化验是非线性的,使用国际单位本身是不正确的,因为这个单位是基于最初的速度,即线性反应产生的产品以相同的速度在每分每秒的反应。”作者继续建议FPU价值观对于一个给定的纤维素酶解给出简单的结论称为“单位/ mL”。
“滤纸单位”的定义。由于上述选择的数值,“滤纸单位”实际上不是明确的定义。滤纸单位的定义是0.1875 FPU,即酶活动的数量,根据指令的结果,将会产生包含减少相当于2.0毫克的糖的葡萄糖。一个能从等式验证了由计算假定的酶解不需要进行稀释来满足。
还原糖含量相当于2.0毫克的葡萄糖(例如,“酵素浓度”的比例分母等于1,在这种情况下,这个活动的解进行测量为0.37滤纸单元每毫升。因为0.5毫升的这个方案被用于检测、绝对数量的酶活性的测定,从中可看出等作用能被0.1875 FPU)。
另一方面,我们有一个确定的方法测量了纤维素酶的活性0.1875含有滤纸单元每0.5毫升化验aliquot(0.37滤纸单位曼梯·里的酶解),但是我们没有办法测量酶解的滤纸活动和其他任何价值的解决方案。
含有超过0.37”单位”每毫升须因此被稀释到这个标准来衡量的价值,并含有少于0.37单位“每毫升”、还原糖产生于60分钟小于2.0毫克的等效葡萄糖)不能指定的“滤纸单位”的活动。这些后者“sub-2.0-mg "要么必须集中在解决溶解之前,要么活动的化验报告不应该报道为“滤纸单位”,而是应报告为“mmoles葡萄糖平均每分钟释放量”。
Ghose(1987)解释的特殊情况下参与计量滤纸。活动”,工人正在呼吁关注文本的文章(特别是文本围绕方程的263页),而不仅仅是“提升”的方程式本身。
13。附录B:为例IUPAC-FPU计算
13.1纤维素酶活性测定酶制剂的使用方法,概述了在IUPAC基础上的方法。在所有的酶稀释,柠檬酸钠缓冲4.8,下表所示的酶解正在被稀释的酶在柠檬酸中缓冲1:20。术语“专注”是用来表示这个比例的原酶解存在于稀释加入了胰高糖素的混合物。举个例子,一个1:10 1:20稀释的股票的工作将集中酶的0.005。
13.2葡萄糖稀释标准和做出稀释的标准曲线。
13.3葡萄糖浓度的测定标准曲线。
13.4测定酶的浓度,就会释放完全2.0毫克的葡萄糖,通过对酶浓度（enzyme dilution）的葡萄糖（glucose）中释放出来。
13.5从图中计算FPU vs.葡萄糖稀释浓度。
0.37/0.0053=70 FPU/mL
纤维素酶 一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂： 试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。 试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。 标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白： 无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。 无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。 四、结果计算 土壤纤维素酶活性（μg·g-1·(24 h)-1）＝(C*V*f)/ dwt 式中C为样品的葡萄糖含量（μg·ml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；
DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案 目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。 目前实验室采用测酶活方法： 1、葡萄糖标准曲线制作： 530nm比色。 2、酶活测定方法：
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。 单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000 1 )/(???=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug. 以下是近期所做的实验结果： 葡萄糖标准曲线 两种产纤维素酶细菌不同测试结果
测定结果 实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。 根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。 刚果红染色法：常用的刚果红染色法有两种， 一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板 时就加入刚果红。方法一在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mg ／mI。的CR溶液，10～15 min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为l mol／I。的NaCI溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的 茵落周围将会出现透明圈。 方法二配制质量浓度为10 mg／mI。的CR溶液，灭菌后，按照每200 mI。培养基加入1 mI。的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长 出茵落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。 两种刚果红染色法的比较刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经 有超过20年的历史，课本中给出了两种方法。 方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间 发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。 方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于在纤维素 粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出
纤维素酶活力的测定 一、目的 学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。 二、原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1 酶、CX 酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 （1）纤维素酶制剂 500mg （2）新华定量滤纸 50mg / 份× 4 （3）脱脂棉花 50mg / 份× 4 （4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg （5）水杨酸苷 500mg 2．主要仪器 （1）722 型或其他型号的可见分光光度计 （2）恒温水浴2 台 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）万分之一分析天平 （7）恒温干燥箱 （8）冰箱 （9）试管架 （10）胶头滴管 （11）具塞刻度试管20mL×24 （12）移液管或加液器0.5 mL×3；2mL×7 （13）容量瓶100 mL×6；1000 mL×3 （14）量筒50 mL×2；100 mL×1；500 mL×1 （15）烧杯100 mL×6；500mL×3；1 000 mL×1 3．试剂（均为分析纯）
（1）浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液 将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12～15 天）。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液 准确称取DNS 6.3g 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL，再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠（C4H4O6KNa · 4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。 （3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C6H8O7 · H2O （MW=210.14）21.014g 于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
土壤纤维素酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法） 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与?3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可 用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L； 0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至1L； 取11ml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀即成PH5.5醋酸盐缓冲液。4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml2mol/LNaOH和125ml 水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）。 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，
山东大学实验报告2011年4月20日 姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者于潜科目生物化学实验题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法仪器编号105 一、实验目的 1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、巩固使用分光光度计 二、实验原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。 本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。 三、实验器材 （1）722型分光光度计（2）恒温水浴 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）分析天平（7）试管架 （8）胶头滴管 （9）具塞比色管（25mL×10）（10）移液管（2mL；5mL）（11）烧杯（500mL×3）（12）洗耳球 四、实验材料 （1）纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）； （2）3、5—二硝基水杨酸显色液； （3）0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；（4）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）； （5）蒸馏水。 五、实验操作 1.空白管的测定：
本科开放项目 题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 学生姓名： 指导教师： 学院： 专业班级： 2016年3月
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 摘要 纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。 关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株
目录 第1章绪论 (1) 1.1 实验原理 (1) 1.2 实验仪器及试剂 (1) 1.2.1 实验材料 (1) 1.2.2 实验仪器 (1) 1.2.3 培养基 (2) 第2章实验步骤 (3) 2.1 采样培养 (3) 2.2 初筛 (3) 2.3 复筛 (3) 2.4 酶活的测定 (3) 2.4.1原理 (3) 2.4.2溶液配制 (3) 2.4.3实验步骤 (4) 第3章实验结果 (6) 3.1 标准曲线的绘制 (6) 3.2 菌株复筛结果 (6) 3.3 测定纤维素酶活力结果 (7) 结束语 (8) 参考文献 (9)
β-糖苷酶活力的测定（CMC） 一目的： 掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。 原理： 纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中分解出还原糖，还原糖又同3，5-而硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，用分光光度计可测定其色度，计算酶活力。 二试剂： 1．3，5-而硝基水杨酸显色剂（又称DNS试剂）：称取10g3,5-而硝基水杨酸，溶于蒸馏水中，加入20g分析纯NaOH，200g酒石酸钾钠，加税500ml,升温溶解后，加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠,加热搅拌，待全部溶解后，定容至1000ml。贮存于棕色瓶中，室温保存，放置一周后使用。 2．L 醋酸-醋酸钠缓冲液：称取结晶醋酸钠（H2O），醋酸（CH3COOH），用蒸馏水溶解，并定容至1000 ml，配好后用pH计矫正。 3．1mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在70℃、600nm汞柱下干燥5h至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml，冰箱中保存备用。 4．代测酶液：称取酶粉（或吸取酶液），先用少量的L 醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再加上述缓冲液溶解，如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，40℃水浴锅中浸提1h，用四层纱布或脱脂棉过滤，滤液供测定用。 5．底物：%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，配制方法为城区羧甲基纤维素钠（Sigma公司生产），准确至,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存，有效期3d。 三仪器： 分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。 四方法步骤： 1．标准曲线的绘制 分别吸取, , , , , , 的1mg/ml葡萄糖液于7支20ml的比色管中，分别用蒸 馏水补充体积至,各加3，5-而硝基水杨酸,在沸水浴中煮沸5min，冷却后 分别用蒸馏水定容至20ml，摇匀。以2ml蒸馏水加DNS溶液,按上述同样 操作为空白调零，在540nm处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体 积见下表。以吸光度A值为纵坐标，葡萄糖毫克数W(mg)为横坐标绘制出 标准曲线（理论上此线应过原点）。
纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定 1.纤维素CMC酶 1.0标题 用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。 2.0范围 生产分析和质量控制部门适用。 3.0原理 纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。 4.0试剂 4.1无水醋酸钠(分析纯) 4.2冰醋酸(分析纯) 4.3 3.5－二硝基水杨酸 4.4无水葡萄糖 4.5四水酒石酸钾钠(分析纯) 4.6氢氧化钠(分析纯) 4.7重蒸苯酚(分析纯) 4.8无水亚硫酸钠(分析纯) 4.9叠氮化钠(分析纯) 4.10羧甲基纤维素钠 5.0仪器 5.1水浴锅(恒温)50±1℃ 5.2电热干燥箱80±1℃ 5.3 722型分光光度机计 5.4分析天平感量0.1㎎ 5.5一级玻璃制品 5.6电冰箱 6．0试剂的准备 6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8） 溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。 6.2 DNS试剂: 溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。 溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。 将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。 6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。 7．0标准曲线制作： 7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。 7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。 7.3标准葡萄糖曲线制作
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纤维素酶活力的测定 1.纤维素酶活力单位定义 在37?,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液 中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u. 2.测定原理 纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还 原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与 酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力. 3.试剂与溶液 除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水. 3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml: 称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml. 3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L: 吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml. 3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L: 称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml. 3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L: 称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml. 3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5: 称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定 溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至 5.5. 3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)
测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn
β-糖苷酶活力的测定(CＭC) 一目的: 掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。 原理: 纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠(CMＣ-Nａ)中分解出还原糖,还原糖又同3,５－而硝基水杨酸发生反应,产生一种黄橙混合色,用分光光度计可测定其色度,计算酶活力。 二试剂: 1.3,5-而硝基水杨酸显色剂(又称DNS试剂): 称取10g3,5-而硝基水杨酸,溶于蒸馏水中,加入20g分析纯NaOH,２00g酒石酸钾钠,加税5０0mｌ,升温溶解后,加入重蒸酚2ｇ,无水亚硫酸钠0、5g,加热搅拌,待全部溶解后,定容至1000mｌ。贮存于棕色瓶中,室温保存,放置一周后使用。 ２.０、1moｌ／ＬｐH4、5醋酸－醋酸钠缓冲液:称取结晶醋酸钠(CＨ3COOＮａ、3 Ｈ2Ｏ)13.６１g,醋酸(ＣH３COOH)6、０0g,用蒸馏水溶解,并定容至1００0 ml,配好后用pH计矫正。 3、1mg/ml葡萄糖标准溶液:准确称取10０mｇ分析纯葡萄糖(预先在70℃、60０nm汞柱下干燥5h至恒重),用少量蒸馏水溶解并定容至100ｍl,冰箱中保存备用。 ４.代测酶液:称取酶粉1、0ｇ(或吸取酶液1、０0ml),先用少量的０、05ｍoｌ／L pＨ４、5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中,沉渣部分再加上述缓冲液溶解,如此反复捣研３－4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度,４0℃水浴锅中浸提1h,用四层纱布或脱
脂棉过滤,滤液供测定用。 5、底物:０.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液,配制方法为城区0、5000g 羧甲基纤维素钠(Ｓigmａ公司生产),准确至０、0０1g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存,有效期3d。 三仪器: 分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。 四方法步骤: 1．标准曲线的绘制 分别吸取0.２, 0.４, 0、6, ０、8, 1.0, 1.2, １.4ｍl的1ｍg／ml葡萄糖液于７支20ｍl的比色管中,分别用蒸馏水补充体积至2、ｏml,各加３,５-而硝基水杨酸1、5ml,在沸水浴中煮沸5ｍiｎ,冷却后分别用蒸馏水定容至２0ｍl,摇匀。以2ml蒸馏水加DNS溶液１、5mｌ,按上述同样操作为空白调零,在５40ｎm处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体积见下表。以吸光度A值为纵坐标,葡萄糖毫克数Ｗ(mg)为横坐标绘制出标准曲线(理论上此线应过原点)。 标准曲线绘制各试管所含物质的体积
实验二十纤维素酶活力的测定 一、目的 学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维 素酶的作用特性。 二、原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C 酶、C 酶和 |?-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C 1 X 1 酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，C 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成 X 纤维寡糖，|?-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的 纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红 色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜 色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 （1）纤维素酶制剂 500mg （2）新华定量滤纸 50mg / 份 4 （3）脱脂棉花 50mg / 份 4 （4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg （5）水杨酸苷 500mg 2．主要仪器 （1）722 型或其他型号的可见分光光度计 （2）恒温水浴 2 台 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）万分之一分析天平 （7）恒温干燥箱 （8）冰箱 （9）试管架
（10）胶头滴管 （11）具塞刻度试管 20mL24 （12）移液管或加液器 0.5 mL3；2mL7 （13）容量瓶 100 mL6；1000 mL3 （14）量筒 50 mL2；100 mL1；500 mL1 （15）烧杯 100 mL6；500mL3；1 000 mL1 3．试剂（均为分析纯） （1）浓度为 1mg/mL的葡萄糖标准液 将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至 100mL，充分混匀。4℃冰箱 中保存（可用 12～15 天）。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液 准确称取DNS 6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶 液 262mL，再加到 500mL含有 185g酒石酸钾钠（C H O KNa ! 4H O，MW=282.22）的热 4 4 6 2 水溶液中，再加5g结晶酚（C H OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na SO ，MW=126.04）， 6 5 2 3 搅拌溶解，冷却后移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色 瓶中，室温放置一周后使用。 （3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液 A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C H O ! H O（MW=210.14） 21.014g于 500mL 6 8 7 2 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至 1 000mL，充分 混匀。4℃冰箱中保存备用。 B 液（0.1 mol/L 柠檬酸钠溶液）：准确称取Na C H O ! 2H O（MW=294.12）29.412g 3 6 5 7 2 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中，然后用蒸馏水定容 至 1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
纤维素酶活的测定 一纤维素酶活力单位定义 在37℃、pH值为5.50的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。 二测定原理 纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原集团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中的纤维素酶的活力。 三试剂与溶液 除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。 3.1 葡萄糖溶液，c（C6H12O6）=10.0mg/ml 称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。 3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH)=0.1mol/L 吸取冰乙酸0.60ml，加水溶解，定容至100ml。 3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）=0.1 mol/L 称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100ml。 3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）=200g/L 称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100ml。 3.5 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH-CH3COONa） 称取三水乙酸钠11.57g，加入冰醋酸0.85ml，加水溶解，定容至1000ml，测定溶液的pH值，如果pH偏离5.50，用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调至5.50. 3.6 羧甲基纤维素钠溶液，0.8%（w/v） 称取羧甲基纤维素钠（Sigma C5678）0.40g，加入到盛有30ml3.5缓冲溶液的烧杯中，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解（在搅拌加热过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过50ml），停止搅拌，用3.5缓溶将其定容至50ml，羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为3天。 3.7 DNS试剂 称取3，5-二硝基水杨酸（化学纯）3.15g，加水500ml，搅拌5min，水浴至45℃，然后逐步加入100ml 氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，知道溶液清澈透明（在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）.再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g，继续45℃水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml，用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色试剂瓶中，避光保存，室温下可以存放7天后可以使用，有效期为6个月。 四仪器与设备 4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。 4.2分样筛：口径为0.25mm（60目）。 4.3分析天平：精确至0.001g。 4.4 pH计：精确至0.01. 4.5磁力搅拌器：附加热功能。 4.6振荡器
纤维素酶活性测定 一、试剂： 1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。 2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。 3）还原糖试剂： 试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。 试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。 4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。 标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白： 无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。 无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。
纤维素酶的检测方法 摘要：本文主要介绍了纤维素酶的降解原理，通过实验比较了四种常用纤维素酶的检测方法的稳定性，以及纤维素酶的发展前景，为纤维素酶的应用提供了进一步的参考价值。 关键词：纤维素酶酶活测定葡萄糖回归方程 一、纤维素酶及其降解原理 纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30%-50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%。据报道，我国每年光作物秸秆，稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55X109吨，其中尚有89%未被人们利用，而大量的秸秆，稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低。大多采用燃烧的方式来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。所以，纤维素的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机，粮食短缺，环境污染等有重大意义。 纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充分的利用了纤维素。自1906年Sellieres 在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。目前，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品，医药，饲料，洗涤等工业中，不仅解决了纤维素的再利用问题还取得了很可观的经济效益。 纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的。习惯上将纤维素酶分成三种主要成分：内切酶（内切β-1,4-葡萄糖酶，也称Cx酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也称C1酶）、β-1,4葡萄糖酶（即为纤维二糖酶）[1]。C1酶主要作用于天然纤维素，使之转变为非结晶的纤维素。Cx酶又分为Cx1酶和Cx2酶。Cx1酶是一种内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-（1,4）糖苷键，生成纤维糊精和纤维二塘。Cx2酶是一种外断型纤维素酶，
实验5纤维素酶活力的测定 一、原理： 纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。 二、试剂： 1、3、5—二销基水杨酸显色液：称取10克3、5-二销基水杨酸，溶入蒸馏 水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000毫升。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2、0.1摩尔PH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液。 3、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。 4、标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100毫克，溶解后定容至100 毫升，此溶液含葡萄糖1.00毫克/毫升。 三、测定方法： 1、标准曲线的绘制：分别吸取0. 2、0.4、0.6 、0.8.0、1.0毫升的葡萄糖于5 支试管中,均用蒸馏水稀释至1毫升,加3.5-二销基水杨酸显色剂3毫升, 在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,加蒸馏水21毫升,摇匀.以1毫升蒸馏 水代替糖作空白管,在550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克 数为横坐标，绘出标准曲线。 2、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于40度 水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化 液。取糖化液１毫升，按制标准曲线时一样加显色液比色。同时以１毫 升煮沸的酶液代替酶做一空白对照。 四、计算： 在上述条件下，1毫克酶每分钟催化纤维素水解生成１微克葡萄糖的酶量定为一个活力单位。 N *OD值对应的葡萄糖量 纤维素酶活力单位＝—————————————— ３０*１N---酶液的稀释倍数 ３０――糖化所用时间 １――反应酶液毫升数
土壤纤维素酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法） 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L 醋酸溶液11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L； 0.2mol/L 醋酸钠溶液16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L； 取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液。4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）。 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。培养结束后，过滤并取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。） 四、结果计算 纤维素酶活性以72h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。 纤维素酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n／m 其中：a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m表示烘干土重