1.基因工程定义。
答：基因工程原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行剪接重组，然后转入另一生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。广义的基因工程定义为DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是外源基因重组、克隆、表达的设计与构建（即狭义的基因工程）；而下游技术则涉及含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养，以及外源基因表达产物的分离纯化过程。
2.基因工程三大要素。
答：供体、受体、载体。
3.基因过程基本过程：切、接、转、增、检。
4.基因工程基本原理。
答：基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达。
5.基因工程的研究意义。
答：①大规模生产其他生物体内含量极微但却具有较高经济价值的生物分子；
②设计构建新物种(新性状乃至全新物种)。
③搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资源(基因)。
第二章 1.绝大多数分子克隆实验所使用的载体是DNA双链分子，其功能是：（1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；
（2）为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力；
（3）为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。
2.质粒的定义。
答：质粒是一类存在细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称为cccDNA。
3.质粒的四个特性。
答：（1）自主复制性；（2）可扩增性；（3）可转移性；（4）不相容性。
4.人造染色体载体定义及用途。
答：定义：将细菌接合因子、酵母或人类染色体DNA上的复制区、分配区、稳定区与质粒装配在一起，即可构成染色体载体。
用途：可以用于人类大规模测序。
5.限制性核酸内切酶。
答：几乎存在于任何一种原核细菌中，它能在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。
6.II类限制性核酸内切酶的命名。
答：具体规则：以生物体属名的第一个大写字母和种名的前两个小写字母构成酶的基本名称，如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将株名的一个字母加在基本名称之后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则还需用一个大写字母表示这些非染色体的遗传因子。酶名称的最后部分为罗马数字，表示在该生物体中发现此酶的先后次序。如Hind III则是在Haemophilus influenzae d株中发现的第三个酶，而EcoR I则表示其基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。
7.Klenow酶。
答：该酶实际上是大肠杆菌DNA聚合酶I C端的大片段。
大肠杆菌聚合酶I活性：
（1）5’→3’的DNA聚合活性，使DNA链在模板的指引下延伸；
（2）3’→5’的核酸酶外切活性，其主要是识别并切除错配的碱基；
（3）5’→3’的核酸酶外切活性；
（4）核酸内切酶活性。
Klenow酶活性：保留了大肠杆菌聚合酶I5’→3’聚合活性和3’→5’的外切校正功能，删除了相应的5’→3’的外切活性及核酸内切酶活性。
8.DNA重组方法。
答：（1）相同黏性末端的连接；（2）平头末端的连接；（3）不同黏性末端的连接；
(4)人工黏性末端的连接；（5）酶切位点的定点更换。
粘性末端：加入T
-DNA连接酶退火复性连接，属于分子内作用；平头末端：
4
-DNA连接酶，为分子间反应。
加入T
4
9.感受态定义。
答：受体细胞最易接受外源DNA片段而实现转化的一种特殊生理状态。
10.重组DNA分子的转化方法。
答：（1）Ca2+诱导转化；（2）PEG介导的细菌原生质体转化；（3）电穿孔驱动的完整细胞转化；（4）接合转化；（5）λ噬菌体的转染。
11.转化率及重组率的定义。
答：转化率：转化率是转化（包括感染）效率的评估指标，通常有两种形式表征转化率。一是在待转化DNA分子数大于受体细胞数的条件下，转化细胞与细胞总数之比。另一种形式是在受体细胞数相对于待转化DNA分子数大大过量时，每微克DNA转化所产生的克隆数。
转化率的定义也可表征为每微克DNA进入受体细胞的分子数。
重组率:连接反应结束后，含有外源DNA的重组分子数与加入的载体分子数之比。较为理想的重组率为25-75%。
12.基于载体遗传标记的筛选与鉴定方法。
答：（1）抗药性筛选法；（2）营养缺陷性筛选法；（3）显色模型筛选法；（4）噬菌斑筛选法。
13.基因工程或DNA重组技术三大用途的前提是从生物体基因组中分离克隆目的基因。
14.目的基因的克隆概念及其方法。
答：战略：（1）构建感兴趣的生物个体的基因组文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；（2）利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。
方法：（1）鸟枪法；（2）cDNA法；(3)PCR扩增法；（4）化学合成法。
15.基因文库概念及其构建战略。
答：概念：基因文库是指某一特定生物体全基因组的克隆集合。
构建战略：（1）鸟枪法；（2）cDNA法。
1.外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理。
答：包括大肠杆菌在内的所有原核细菌高效表达真核基因，都涉及强化蛋白质生物合成、抑制蛋白产物降解、维持或恢复蛋白质特异空间构象三个方面的因素。其中，强化异源蛋白的生物合成主要归结为外源基因剂量（拷贝数）、基因转录水平、mRNA翻译速率的时序性控制，而这种控制又是在重组分子构建过程中通过相应表达调控元件的精确组装来实现的。
2.大肠杆菌工程菌的构建策略。
答：（1）包含体型异源蛋白的表达；（2）分泌型异源蛋白的表达；（3）融合型异源蛋白的表达；（4）寡聚型异源蛋白的表达；（5）整合型异源蛋白的表达；（6）蛋白酶抗体或缺陷型表达系统的构建。
3.包含体的分离有哪三大操作步骤。
答：菌体破碎、离心收集、清洗。
4.重组异源蛋白体外复性包括包含体的溶解变性与蛋白质重折叠两大基本操作单元。
5.基因工程菌的遗传不稳定性及对策。
答：基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性。这种不稳定性有两种主要存在形式：
（1）重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排或修饰，导致其表现功能的丧失；（2）整个重组分子从受体细胞中逃逸。
改善不稳定性的对策：（1）改进载体宿主系统；（2）施加选择压力；(3)控制外源基因过量表达；（4）优化培养条件。
1.酵母作为一个真核生物表达系统的优势。
答：（1）基因表达调控机制比较清楚，并且遗传操作相对较为简单；
（2）具有原核细菌无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；
（3）不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌（如酿酒酵母等）在食品工
业中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统；
（4）大规模发酵工艺简单，成本低廉；
（5）能将外源基因表达产物分泌至培养基中；
（6）酵母是最简单的真核生物，利用酵母表达动植物基因，能在相当大的程度上阐明高等真核生物乃至人类基因表达调控的基本原理以及编码产物结构与功能之间的关系。
2.酿酒酵母与巴斯德毕赤酵母在表达外源基因方面的主要区别。
答：（巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，培养基中的甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。生长迅速、AOX1基因的强启动子及其表达的可诱导性是该酵母作为外源基因表达受体的三大优势。）可有可无。
酿酒酵母宿主载体系统中，外源基因的表达水平不高，酿酒酵母细胞还能使重组异源蛋白超糖基化，使得有些异源蛋白与受体结合而不能大量分泌。巴斯德毕赤酵母可以弥补这些缺陷，巴斯德毕赤酵母表达系统的蛋白质糖基化模式比酿酒酵母更接近于高等哺乳动物，而且能将各种重组异源蛋白分泌至培养基中。
3.酵母人造染色体作为载体的主要用途。
答：构建人的基因组文库。
1.动物转基因技术（P
188）的方法（P
192
）。
答：（1）动物细胞物理转化法：碳酸钙共沉淀法、点击法、脂质体包埋法、DNA显微注射法；
（2）动物病毒转染法：腺病毒、猴肿瘤病毒、牛痘病毒、反转录病毒；
（3）工程胚胎干细胞法；
（4）体细胞转基因克隆法。
2.基因治疗的基本定义及其基本内容。
答：定义：基因治疗的基本定义是用正常基因取代患者细胞中的缺陷基因，以达到战胜分子病之目的。
内容：基因治疗包括基因诊断、基因分离、载体构建、基因转移四项基本内容。
1.高等植物与动物的区别是可以形成愈伤组织。
2.农杆菌可以转化单子叶禾本科植物。
3.植物病毒介导的转染系统的特点。
答：与农杆菌Ti质粒介导的整合转化程序相比，植物病毒表达载体系统具有如下优点：（1）病毒载体在宿主细胞中可多轮复制，使外源基因高水平表达；
（2）病毒增殖速度快，外源基因的拷贝数在很短时间（通常在接种后1-2周内）可达到最大量的积累；
（3）病毒基因组小，易进行重组遗传操作，大多数植物病毒可以通过机械接种的方式感染植物，适合于大规模产业化操作；
（4）植物病毒可以侵染单子叶植物，扩大转基因的适用范围；
（5）病毒颗粒易于纯化，可显著降低下游生产成本。
因此，植物病毒属于外源基因的瞬时高效表达载体。
1.蛋白质工程的定义及它与第一代基因工程的区别。
答：第二代基因工程是在DNA分子水平上位点专一性地改变结构基因编码的氨基酸序列，使之表达出比天然蛋白质性能更为优异的突变蛋白；通过基因编码区的融合操作，合成兼顾多种天然蛋白质性质的杂合蛋白；采用体外分子进化技术，建立突变蛋白文库；或者借助基因化学合成，设计制造自然界不存在的全新工程蛋白。这种由人工突变基因而达到操纵蛋白质结构和性质的过程又称为蛋白质工程。
2.蛋白质工程分子理性设计战略的基本流程。
答：（1）克隆一个酶或功能蛋白的结构基因；
（2）测定其核苷酸编码序列；
（3）演绎出相应的氨基酸序列；
（4）确定蛋白质的生物学性质；
（5）建立蛋白质的三维空间结构；
（6）设计工程蛋白的分子蓝图；
（7）借助于DNA定点突变技术更换密码子；
（8）分析突变蛋白的生物学和化学特性；
（9）确立蛋白质序列-结构-功能三者之间的对应关系；
（10）将此对应关系反馈至第6步，并进行下一轮操作，直到构建出所期望的工程蛋白质。
1.途径工程解决的问题。
答：途径工程是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络和信号传导网络，并通过DNA重组技术合理设计和遗传修饰之，进而完成细胞特性改造的应用性学科。即完成细胞特性改造，满足人类生存要求。
2.途径工程的基本过程。（非重点）
答：途径工程通过定向改变细胞内代谢途径的分布及代谢流重构代谢网络，进而提高代谢物的产量；外源基因的准确导入及其编码蛋白的稳定表达，可以拓展细胞内现有代谢途径的延伸路线，以获得新的生物活性物质或者优良的遗传特性。
途径工程三大基本过程：靶点设计、基因操作、效果分析。