卵黄杭体是治疗鸡新城疫（ND）和传染性法氏囊病(IBD）的一种特效药。 卵黄抗体的作用 诊断作用：卵黄抗体具有沉淀素的特性，当诊断时，若怀疑鸡群发生传染性法氏囊病，可采取病料5克，加灭菌生理盐水10毫升，研磨，加抗菌剂抑菌，置于冰箱过夜，作为未知抗原，制作备用琼脂板，打成梅花状七孔后，同时加入未知病料抗原和已知的卵黄抗体各一份，约0.5毫升，25℃放置24小时～72小时，出现肉眼可见白色沉淀线，为阳性反应。强阳性反应时,24小时后就可见到沉淀线，即可判定试验鸡群发生了传染性法氏囊病。https://www.doczj.com/doc/c0438883.html, 治疗作用：当鸡群发生新城疫或传染性法氏囊病时，可立即皮下注射卵黄抗体1～2毫升，肉鸡可口服卵黄抗体2毫升／只，能阻止病毒进入细胞，形成再感染，中和病毒数量，经2小时就可发现鸡群精神好转，食欲增加，粪便恢复正常。目前，是治疗鸡新城疫、传染性法氏囊病的特效药物。 预防作用：卵黄抗体的使用，在免疫学理论中可成为被动免疫。当免疫缺陷、疫苗缺乏及免疫失败时，可利用卵黄抗体注射、口服替代主动免疫接种，发挥抗病作用。 制作方法：将新城疫I系苗、传染性法氏囊强毒苗连续注射健康无病产蛋鸡三次，第一次1个免疫量，第二次2个免疫量，第三次3个免疫量。待3周后收集母鸡所产的蛋，无菌术取蛋黄，加灭菌生理盐水稀释成1:20的混悬液，测定效价，加入抑菌剂，然后进行分装，在0℃以下保存备用。 卵黄抗体成分与效价卵黄抗体也称母源抗体,IgG抗体。是母体血液中小分子抗体IgG 通过胎盘、输卵管、滋养层传给后代。保存入卵的蛋黄中，若孵化出鸡雏，则对新城疫、传染性法氏囊有特异的抵抗作用。这种抵抗作用称为抗体，其分子结构称为单体Ig,由2条多肽重链和2条多肽轻链组成。沉淀系数7S，分子量160000 ～180000，含糖2.5%。现已发现有四种IgGT型重链同种异型，也称作四个亚型并含硫的半胱氨酸。具有抗感染、抗菌、抗病毒作用。由于氨基酸排列顺序具有高度可变性，能接触到抗原的物质，并发生特异结合，产生中和作用，从而体现特异作用。 卵黄抗体好与否的标准是用HA和HI试验测定的稀释倍数，称为效价，Iog2的指数越大，效价越高，通常把1:64效价称为高免卵黄抗体，其半衰期为4天左右，因此，用卵黄抗体替代主动免疫时间在2周～4周，应科学选择使用日期，注意半衰期，计算保护期，当降到临界线时，应及时补充。中国禽病网 应用方法 解冻．：一般包装有500毫升,250毫升、100毫升瓶装。要把药瓶放在新鲜井水中，浸泡2小时～4小时以上，反复振摇。用肉眼观察，瓶内无冰碴为宜。 注射：可将解冻后的卵黄抗体，在室温下放置半小时，接近室温时（15℃～20℃），再皮下注射1毫升～2毫升。先注射健康鸡群，再注射假定健康群，最后注射病鸡群。注射1只鸡要换1个针头。 注意事项卵黄抗体是生物制品，高温会失效，为方便生产与使用，须冷冻保存和运输，一般在-18℃条件下保存，运输时应特别注意温度变化，冷藏包装运输。 使用卵黄抗体前，一定要了解鸡群是否接种过同种疫苗，并要注意间隔时间；同时，应测定其效价，计算使用量和保护期。 在使用卵黄抗体防治鸡新城疫或传染性法氏囊病时，不得产生依赖思想，同时还要做好卫生、饲养管理和消毒工作，采取综合的防治措施，才能收到满意的效果。
抗鸡球虫卵黄抗体制备及初步应用 作者：钱玮霖指导老师：徐前明 （安徽农业大学植保学院合肥 230061） 摘要：本项目旨在研制抗鸡球虫卵黄抗体，为防治鸡球虫病提供一种新的手段。利用对临床所分离的球虫，经超声波裂解制备粗抗原，然后将所得抗原分别于弗氏完全佐剂和不完全佐剂混合，经肌肉注射方式对鸡蛋进行免疫，收集免疫后的卵黄；采用饱和硫酸铵法分离卵黄中的抗体，并用聚乙二醇浓缩获得较高浓度的抗体；采用凝集试验确定其抗体水平，并采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法进行抗体纯度分析；最后将所分离的抗鸡球虫卵黄抗体用于鸡感染球虫保护试验。结果表明：（1）临床所分离得球虫多为混合感染，达3种以上；（2）蛋鸡经免疫后，经凝集试验可证实其抗体水平可达1:28，SDS-PAGE电泳显示：纯化后抗体大小为67.0kD 和23kD，且纯度较高。基于上述情况，认为本试验制备出抗鸡球虫卵黄抗体方法并初步阐明了其抗鸡球虫的基本功能。 关键词：鸡球虫病；卵黄抗体；保护试验 引言 鸡球虫病广泛存在于养鸡业中，常造成大批死亡，其死亡率可最高达80％，且病愈鸡生长严重受阻，抵抗力降低，易继发其他疾病。每年，全世界因为鸡球虫病造成的损失高达数十亿美元[1]。因此，鸡球虫病是养鸡业中危害最严重的疾病之一。在我国，特别是在南方地区，由于气温高、湿度大，这种环境利于球虫卵囊的孢子发育，本病常常呈暴发性流行，危害更加严重。 然而，目前对鸡球虫病的防治措施绝大部分多依赖于药物的预防和治疗上,即化学合成药物和抗生素两大类，自从1936年首次出现专用抗球虫药以来，已报道的抗球虫药达40余种，但是因为球虫对药物极易产生抗药性，大量使用化学药物势必会造成严重的药物残留问题等，这也是当今养禽业所遇到最棘手的问题之一。上述问题存在，为临床防治鸡球虫病提出紧迫任务。 卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护，在雏鸡疾病预防中具有重要作用。这种策略得到良好的运用，如鸡法氏囊卵黄抗体在一定程度上解决了临床治疗该病难题，为生产作出了一定的贡献。 卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而IgY是γ卵黄球蛋白。因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离 IgY[2]。多年来，已建立了许多较为高效而经济的方法，这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。工业上大规模生产IgY的方法有：超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法[3]。 开展抗球虫卵黄抗体的研究对家禽球虫病的预防及治疗具有重要意义：(1)该方法建立，为临床防治鸡球虫病提供新思路和策略，可在一定程度上减少抗生素的使用和减少化
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
高免卵黄抗体应用研究现状及发展趋势 李文学,青学刚,刘刚 (四川省农业科学院蚕业研究所,四川南充637000) 摘要 介绍了近年来卵黄抗体在家禽、家畜、水产、蚕桑等养殖业方面的应用研究进展,提出了卵黄抗体在动物疫病防控方面的可行性和发展方向。关键词 卵黄抗体;免疫;应用研究 中图分类号 S852.4+ 3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2010)24-12981-02Advances i n Applica tion Studies and D evelopm en t Trend of H igh T iter Egg 2yolk I mm unoglobuli n s L IW en 2xue et a l (Sericultural Research I nstitute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Nanchong,Sichuan 637000) Abstract The advances in app lication studies of egg 2yolk i mmunoglobulins in the field of poultry,ivest ock,aquatic and silkwor m were intro 2duced.A t the same ti m e,the feasibility of using egg 2yolk i m munoglobulins in the field of ani mal disease p reventi on was put f or ward,and the de 2velopment trend of the egg 2yolk i m munoglobulins in silkwor m was p rospected .Key words Egg 2yolk i m munoglobulin;I mmunology;App licati on study 基金项目 四川省财政育种工程2009年度青年基金项目(2009QNJJ 2 028)。 作者简介 李文学(1981-),男,四川成都人,硕士,助理研究员,从事 蚕桑生物技术研究。 收稿日期 2010205204 家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物,目前不仅在遗传学、生理病理学等基础理论研究方面对其有深入的研究,而且作为一种重要的经济类绢丝昆虫、吐丝结茧,为人们提供了环保、舒适的丝绸面料。然而在广大农村,各种病虫害严重危害了家蚕的健康,蚕病引起的经济损失相当严重。在现阶段,蚕病防治仍采取“预防为主、综合防治”的基本方针,对病毒(核型多角体病毒、质型多角体病毒、浓核病毒等)、细菌、真菌等病原微生物引起的病害缺乏针对性以及强效性药物治疗。作为种养产业的家禽、家畜、水产业,在由病原微生物引起的重大传染病预防、防治方面却成功取得了实质性的药物治疗成绩,如卵黄抗体(Egg Y olk I m munogl obulins,I gY )是当今生物科学研究中的重大发现之一 [1] 。自1893年Kle m 2 perer 首次报道鸡蛋中存在抗体以来,人们便对I gY 进行不断 深入地研究,作为被动免疫方式使用的I gY,在家禽、家畜、水产等养殖业的重大传染病控制和治疗方面均取得了成功,发挥了重要作用。家蚕不同于高等动物的免疫体系,有其独特的免疫系统和免疫机制。家蚕无T 和B 淋巴细胞,无免疫球蛋白及完整的补体系统,缺乏特异的抗原-抗体反应。在家蚕病害防治方面,通过被动免疫方式,添食或注射高免I gY 研究能否取得成功值得探索。 1 I g Y 的特性与作用机理 运用I gY 对发育成熟的母鸡进行免疫学注射试验,15d 左右即可产生特异性卵黄免疫球蛋白,且较快达到效价最高值,产生的免疫应答效价可维持数月或1年。鸡的I gY 类似于哺乳动物的免疫球蛋白G ,分子量约180k D 。I gY 含氮量为14.8%,其氨基酸组成、含糖量与人和兔的免疫球蛋白存在显著差异。I gY 在常温下可保持6个月左右的活性,性能比较稳定;在4℃条件下可保存6～7年,活性下降不超过 5%。I gY 可耐热、耐酸碱,在pH 值4.0～11.0时稳定,在pH 值低于3.0和高于12.0时,其活性迅速降低;在65℃高温时,I gY 的活性亦可保持24h 以上,70℃加热90m in 后,其 活性迅速下降。而且,I gY 溶液在39.2×107 Pa 时仍保持活性,这表明I gY 有较强的抗高压能力。此外,I gY 可抵御来自幼龄动物的胃酸屏障以及肠道环境中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等的消化降解作用。 I gY 是动物机体内免疫应答系统所产生的特异性抗体, 它能抵御相应的病原微生物,保护生物机体健康安全,通过以下几方面机理发挥作用 [2] :①特异性I gY 蛋白能直接粘附 于其病原菌的细胞壁上,改变病原菌细胞的完整性,直接抑制病原菌的生长。②I gY 蛋白可粘附于细菌菌毛上,使病原菌不能粘附于肠道粘膜上。而诸如大肠杆菌、沙门氏菌等病原微生物首先需要粘附于动物肠道粘膜细胞上,才能进行增殖病原、毒素产生及感染动物的过程。③一部分特异性I gY 蛋白在动物肠道内环境被消化酶消化降解为小结合片段 (B inding frag ment ),这些片段含有抗体的末端高度可变的小 肽,即Fab 部分。这些小肽先是很容易地被肠道所吸收,进入血液后与特定病原菌的粘附因子结合,使得该病原菌不能粘附于动物体内的易感细胞,而失去病原菌致病性,从而对非肠道病原菌起到抑菌效果。同时,这些Fab 部分还能与被感染动物机体内血液中的球蛋白末端相结合,使机体免被破坏,而特异性I gY 蛋白的稳定区或Fc 部分则被留在肠道内。 2 I g Y 的应用 2.1 I g Y 在禽病防治中的应用 目前国内应用较广泛的I gY 有:抗鸡脑脊髓炎病、抗鸡病毒性关节炎、抗鸡传染性喉 气管炎高免I gY 、抗传染性法氏囊病、抗鸡新城疫、抗鸡减蛋综合征I gY 、抗鸭疫里氏杆菌病、抗鸭病毒性肝炎、抗番鸭细小病毒、抗小鹅瘟等I gY 。I gY 还应用于一些疑似病、新病的预防、治疗研究中。 范玉芳等[3] 选择临床无白痢的鸡场,用从11个发病鸡场收集分离的法氏囊病强毒制备的灭活苗,采用皮下注射接种方式,剂量为2.5m l/只,每10d 注射接种1次,直至抗体效价达1∶128以上时,收集制备卵黄液,经无菌及安全检测合格后供试验备用。结果表明,注射鸡体12h 后开始有抗体产生,体内可维持5～7d,至第8天时抗体全部转阴。对缺乏母源抗体的雏鸡,应用该抗体进行早期预防,可提高被动免疫水平。早期仅使用0.5ml/只即可起到紧急预防作用,治愈有效率高达91%以上,这与王泽霖等[4] 的研究结果吻合。
精制与粗制卵黄抗体的优劣势分析随着养殖业的发展，疾病种类越来越多，某些病原体的变异也越来越快，疾病互传的可能性也越来越大，迫切需要有相应的快速有效的对策来控制疾病的发展，降低死亡，减小损失。毋庸置疑，外源性的特异性抗体是治疗某些特定传染病的最直接最快速最有效的方法。卵黄抗体作为一种价廉易得的外源性特异性抗体，其使用效果已经在临床兽医学上得到了验证和认同。但在畜牧生产实践中，越来越多的人却对卵黄抗体的使用效果产生了怀疑，到底出现了什么问题？ 本文试从精制和粗制卵黄抗体的优劣势分析来探讨这一问题的根源。 鸡、鸭、鹅等禽类的蛋在营养成分上大致相同，主要由蛋黄、蛋清（即蛋白）和蛋壳构成。其中蛋黄约占32%，蛋清约占57%，其余11%为蛋壳。其中蛋黄又由如下图所示的成分所构成： 抗体(免疫球蛋白，Ig)是机体受到外来抗原物质刺激后，机体免疫系统细胞产生的可以特异性地识别和结合外来抗原并使之失活的一类球蛋白。家禽经特定抗原免疫后，可产生相应的特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体在卵细胞中逐渐蓄积，并储存于卵黄中，这种抗体称为卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk，IgY)，它是卵黄中唯一的免疫球蛋白，具有特异性和针对性，无毒副作用。下图为抗体结构：
从图中可以看出，在治疗疾病使用卵黄抗体时，起到关键作用的是卵黄中的免疫球蛋白（IgY)，IgY的作用非常广泛，其中最主要的作用有以下几种： 特定的卵黄抗体能黏附于特定病毒的衣壳上，直接抑制病毒的生长繁殖（抑制作用）； 黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于粘膜上皮细胞，失去感染能力（阻滞作用）； 能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用（调理作用）； 中和细菌、霉菌等毒素的毒性（中和毒素）； 与病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力（中和病毒）。 但大量调查发现，目前市面上可见的家禽用粗制卵黄抗体几乎都是地下作坊生产的“三无”产品，生产环境及产品质量令人堪忧。这些粗制抗体不仅抗体效价难以保证，而且通常会污染禽呼肠孤病毒、禽淋巴白血病病毒、网状内皮增生因子、大肠杆菌、沙门氏菌、支原体等外源性致病原。在注射抗体预防或者治疗疾病时，极有可能造成垂直传播病原或其他一些细菌、病毒的扩散甚至疾病的爆发，带来严重的经济损失。 此外，由于粗抗生产者往往试图通过添加大剂量的甲醛，青、链霉素等措施来延长其产品的保质期，增加所谓的使用安全性，但结果往往是造成更大的应激和严重的药物残留。这就是粗制抗体的购买者和使用者对粗制抗体的使用效果产生疑问的重要原因之一。 精制就是将蛋黄中的免疫球蛋白进行分离纯化的过程。已知蛋黄是由水溶相（Water soluble fraction, WSF）和水不溶相（Water insoluble fraction, WIF）构成的乳浊液。WIF主要为脂蛋白构成，而蛋黄抗体存在于蛋黄的WSF中。WSF中的脂蛋白类含量甚微，
卵黄抗体 科技名词定义 中文名称：卵黄抗体 英文名称：vitelline antibody 定义：从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，多为IgG。禽类免疫后在其卵黄中产生的大量高纯度IgG，其对某些禽类疫病具有明显治疗和紧急预防作用。 所属学科：免疫学（一级学科）；畜牧免疫（二级学科） 概述 卵黄抗体（yolk antibody, IgY）：通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗，这类制剂称为卵黄抗体。 IgY的性质 IgY的性质与哺乳动物的IgG相似。正常鸡IgY的分子量约为180KDa，由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成，分子量分别为60-70KDa和22-30KDa。其等电点约为5.2。IgY 与一般哺乳动物IgG相比，IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。在低于75℃条件下，IgY具有良好的热稳定性。IgY制剂在4℃贮存5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显变化或下降，65℃时可保持24h以上，70℃时加热90min后其活性才明显下降60℃，30min条件下巴氏消毒不影响IgY；高于80℃，大部分IgY失去活性。IgY 在pH4.0-11.0时比较稳定，pH3.0-3.5时活性迅速下降，pH12时活性亦有所下降。IgY 对胃蛋白酶有较高的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感。将胃蛋白酶和IgY在pH2.0温育1h 后，几乎所有活性丧失，但在pH4.0时1h后可保持91%的活性，甚至温育10h后仍有63%活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8h，活性分别保持39%和41%。 IgY的作用机理 特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fe部分)留在肠内。 IgY在动物疾病防治方面的应用
鸡IBD和ND高免蛋卵黄抗体的测定 田 冰 (郑州牧业工程高等专科学校,郑州450008) 鸡传染性法氏囊病(IBD)和新城疫(ND)是养鸡业两大烈性传染病。特别是IBD,自1989年以来在我国各地呈持续性暴发流行,给养鸡业造成巨大损失,而利用高滴度的卵黄抗体对易感鸡进行被动免疫或对发病鸡进行特异性治疗,是防制本病的重要措施。为提高IBD、ND的母源抗体水平,掌握卵黄抗体消长规律,并为保护雏鸡和制备双价高免卵黄抗体提供数据,进行了此项试验。 1 材料和方法 1.1 实验鸡 成年商品罗斯蛋鸡200只,曾按常规进行MD、ND免疫。ND血凝抑制(HI)抗体滴度为7log2,IBD琼扩抗体阴性。 1.2 疫苗 IBD弱毒疫苗分别为吉林生物制药厂和郑州生物制药厂生产。IBD-ND油乳剂灭活二联疫苗由河南省农科院畜牧兽医研究所提供。 1.3 免疫方法 首次免疫用IBD弱毒疫苗4羽份饮水,同时用IBD-ND灭活二联疫苗皮下注射1ml。首免后1周进行二免,即用IBD弱毒疫苗10羽份饮水,同时用灭活二联疫苗皮下注射1.5ml。 1.4 抗体测定 首次免疫前和免疫后1,2,3,4,5周及2个月、4个月分别收集试验鸡所产的蛋,测定其IBD 和ND卵黄抗体。IBD卵黄抗体的测定用琼扩法,琼脂板采用含有8%氯化钠的磷酸盐缓冲液100ml加入1g优质琼脂粉煮沸溶制而成的,卵黄用生理盐水倍比稀释,操作和判定按常规方法进行。ND卵黄抗体的测定用β-微量血凝抑制(HI)试验。IBD抗原和阳性血清由哈尔滨兽医研究所提供,ND浓缩抗原及阳性血清由河南农业大学传染病组提供。每次试验随机抽取鸡蛋12枚。 2 结果 2.1 IBD抗体测定结果 免疫前所有实验鸡的卵黄IBD琼扩抗体均为阴性。首免后1周个别鸡(2/12)出现低滴度抗体(1∶2)。首免后2周除4只鸡蛋仍无可测性卵黄抗体外,其余8只均已出现卵黄琼扩抗体,且已达1∶128以上。首免后4～5周卵黄抗体达最高峰,半数以上的卵黄抗体滴度在1∶512以上,并维持2个月以上。免疫后4个月仍维持在1∶256～512。 2.2 新城疫HI抗体测定结果 免疫前鸡群的新城疫卵黄HI抗体滴度在7 log2左右。油乳剂灭活二联苗免疫后1周,抗体水平无明显变化,免疫后2周HI抗体明显上升(9 log2),免疫后3周达11log2以上,并维持2个月。免疫后4个月略有下降,但仍维持在10log2左右。 3 小结和讨论 产蛋鸡IBD弱毒疫苗饮水同时用油乳剂灭活苗免疫后1 周,几乎没有可测性IBD卵黄琼扩抗 体出现。再次免疫后(首免后2周)有66.6%的鸡 出现1∶16以下的卵黄琼扩抗体。免疫后3周均 达1∶128以上,免疫后4个月仍维持在1∶256以 上。因此,为了获得高滴度的IBD卵黄抗体应对 产蛋鸡同时用IBD弱毒疫苗和油乳剂灭活疫苗分 别进行两次免疫,间隔1周。同时,根据卵黄抗体 消长规律,最好在免疫后4周,至少也要到免疫后 3周再开始收集鸡蛋,这样才能保证用于孵化或 制备高免卵黄抗体的鸡蛋含有足够高的抗体。 经过新城疫Ⅱ系和Ⅰ系疫苗免疫过的成年产 蛋鸡,再用IBD-ND油乳剂二联苗免疫后,1周 内ND的HI抗体滴度无明显变化;免疫后2周 (二免后1周)则明显上升,由免疫前的7log2上 升至9log2;免疫后3周上升至11log2,并维持2 个月以上;至4个月时仍维持在10log2左右。这 种具有高抗体的种蛋所孵出的雏鸡,其新城疫的 首免时间应适当推迟为宜。 另外,由于条件所限,本项试验未能对高免鸡 所产的蛋进行孵化,进而测定雏鸡的母源抗体消 长规律,还有待进一步研究。 ? 2 3 ? 河南农业科学
卵黄抗体的制作 This manuscript was revised by the office on December 10, 2020.
卵黄抗体的制作 卵黄抗体是治疗鸡新城疫（ND）和传染性法氏囊病（IBD）的一种特效药，于20世纪90年代，利用免疫学理论研究生产的新药，具有特异性诊断、治疗和预防作用。目前，已广泛应用于鸡新城疫和传染性法氏囊病的防治上，均收到了良好效果。制作方法将新城疫I系苗、传染性法氏囊强毒苗连续注射健康无病产蛋鸡三次，第一次1个免疫量，第二次2个免疫量，第三次3个免疫量。待3周后收集母鸡所产的蛋，无菌采取蛋黄，加灭菌生理盐水稀释成1∶20的混悬液，测定效价，加入抑菌剂，然后进行分装，在0℃以下保存备用。卵黄抗体成分与效价卵黄抗体也称母源抗体、IgG抗体。是母体血液中小分子抗体IgG通过胎盘、输卵管、滋养层传给后代。保存入卵的蛋黄中，若孵化出鸡雏，则对新城疫、传染性法氏囊有特异的抵抗作用。这种抵抗作用称为抗体，其分子结构称为单体Ig，由2条多肽重链和2条多肽轻链组成。沉淀系数7S，分子量，含糖%。现已发现有四种IgGT型重链同种异型，也称作四个亚型并含硫的半胱氨酸。具有抗感染、抗菌、抗病毒作用。由于氨基酸排列顺序具有高度可变性，能接触到抗原的物质，并发生特异结合，产生中和作用，从而体现特异作用。卵黄抗体好与否的标准是用HA和HI试验测定的稀释倍数，称为效价，Iog2的指数越大，效价越高，通常把1∶64效价称为高免卵黄抗体，其半衰期为4天左右，因此，用卵黄抗体替代主动免疫时间在2周~4周，应科学选择使用日期，注意半衰期，计算保护期，当降到临界线时，应及时补充。卵黄抗体的作用诊断作用：卵黄抗体具有沉淀素的特性，当诊断时，若怀疑鸡群发生传染性法氏囊病，可采取病料5克，加灭菌生理盐水10毫升，研磨，加抗菌剂抑菌，置于冰箱过夜，作为未知抗原，制作备用琼脂板，打成梅花状七孔后，同时加入未知病料抗原和已知的卵黄抗体各一份，约毫升，25℃放置24小时~72小时，出现肉眼可见白色沉淀线，为阳性反应。强阳性反应时，24小时后就可见到沉淀线，即可判定试验鸡群发生了传染性法氏囊病。治疗作用：当鸡群发生新城疫或传染性法氏囊病时，可立即皮下注射卵黄抗体1-2毫升，肉鸡可口服卵黄抗体2毫升/只，能阻止病毒进入细胞，形成再感染，中和病毒数量，经2小时就可发现鸡群精神好转，食欲增加，粪便恢复正常。目前，是治疗鸡新城疫、传染性法氏囊病的特效药物。 预防作用：卵黄抗体的使用，在免疫学理论中可成为被动免疫。当免疫缺陷、疫苗缺乏及免疫失败时，可利用卵黄抗体注射、口服替代主动免疫接种，发挥抗病作用。应用方法解冻：一般包装有500毫升、250毫升、100毫升瓶装。要把药瓶放在新鲜井水中，浸泡2小时~4小时以上，反复振摇。用肉眼观察，瓶内无冰碴为宜。注射：可将解冻后的卵黄抗体，在室温下放置半小时，接近室温时（15℃~20℃），再皮下注射1毫升~2毫升。先注射健康鸡群，再注射假定健康群，最后注射病鸡群。注射1只鸡要换1个针头。口服：将解冻后的卵黄抗体以1∶10的比例，加入凉开水或新鲜井水及适量的抗生素，制成混悬液，让鸡在半小时内饮完，并要备足饮水器，让鸡都有位置饮水。注意事项卵黄抗体是生物制品，高温会失效，为方便生产与使用，须冷冻保存和运输，一般在-18℃条件下保存，运输时应特别注意温度变化，冷藏包装运输。使用卵黄抗体前，一定要了解鸡群是否接种过同种疫苗，并要注意间隔时间；同时，应测定其效价，计算使用量和保护期。卵黄抗体兑
V o l .26N o.12000202 华 东 理 工 大 学 学 报 Journal of East Ch ina U niversity of Science and T echno logy 收稿日期:1999203212作者简介:杨曜中(1941～),男,江苏人,副教授,从事应用生物化学 研究。 文章编号:100623080(2000)0120053204 鸡卵黄抗体的制备及其不均一性 杨曜中, 宋聿文, 欧 伶, 范龙彬, 袁勤生 (华东理工大学生物化学系,上海200237) 摘要:介绍了免疫期卵黄液中白蛋白(牛)抗体效价和亲合力的变化。研究了pH 对稀释卵黄液去脂效果,以及硫酸铵浓度对IgY 浓缩、纯化效果的影响。探讨了抗白蛋白IgY 的异质性。实验表明稀释卵黄液酸化处理和IgY 盐析的最适合条件分别是pH 5.1和2.2m o l L 。经免疫亲和柱层析或金属(Fe 3+)螯合亲和柱层析后,白蛋白抗体样品均出现多个不同层析行为的抗体峰。实验提示免疫卵黄液中不仅可能存在不同亲合力、特异性的白蛋白抗体,还可能存在反映基本结构、理化性质差异的白蛋白抗体。 关键词:白蛋白抗体;鸡卵黄液;IgY ;免疫亲和柱层析;Fe 3+金属螯合亲和柱层析中图分类号:Q 511文献标识码:A 鸡卵黄抗体(IgY )是极具开发潜力的抗体资源[1]。国内已有不少单位正在开展鸡卵黄抗体应用的基础研究[2～6]。已经证实卵黄抗体就是由血液转移入卵黄液的IgG 类抗体。所以,专一性结合抗原 的鸡卵黄抗体可以由相应抗原免疫鸡制得。在国内的研究报导中,极大部分是以病毒、细菌、细胞等颗粒性抗原为免疫原,采用鸡腹部皮内免疫注射。一般来说,可溶性抗原(尤其是低相对分子质量可溶性抗原)的免疫原性比颗粒性抗原差,更难诱导、激活鸡免疫系统的抗体产生。本实验以牛血清白蛋白为免疫原,以福氏佐剂为免疫佐剂,对鸡背部皮下多点免疫注射后,研究免疫卵黄液中白蛋白抗体的效价和亲合力,为免疫卵黄液中可溶性抗原类目抗体的产生积累经验。实验着重探讨了pH 对稀释卵黄液去脂效果、硫酸铵盐浓度对抗体浓缩、纯化效果的影响,从而建立了一种简便而经济的卵黄抗体制备方法。从卵黄中分离得到的IgY 是一种多克隆抗体。通过免疫所得的多克隆鸡卵黄抗体(IgY )是不均一的,除含有与抗原相关不同亲合力和特异性的IgY 分子之外,尚可能含有反映IgY 基本结构上差异的IgY 分子,为进一步开展IgY 的分型研究奠定基础。 1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂 蛋鸡由闵行区种禽场提供,鸡IgG 抗血清由上海生物化学研究所张祖传研究员提供;除Sep haro se 4B 为进口分装外,其余试剂均为国产生化或分析 纯。 抗体稀释液(PB ST ):0.12m o l L 磷酸盐,0.04m o l L N aC l ,1m o l L Tw een 220,pH 7.4。1.2 分析方法 白蛋白抗体活性按文献[7]的间接酶免分析法。抗体效价(T itre )以EL ISA 值(A 492)≥0.10时的最大抗体稀释度来表示[8]。使用2m o l L M gC l 2为免疫复合物解离剂,抗体亲合力(A )以有、无2m o l L M gC l 2存在时的抗体活性之比来表示[9] ,即A = OD 492(2m o l L M gC l 2) OD 492(PB ST )。卵黄液中脂 质量测定按氯仿2甲醇提取法[10]。蛋白量测定按L ow ry 改良的福林2酚法[11] ,以牛血清白蛋白 (B SA )为标准蛋白。1.3 鸡的免疫 取30周龄蛋鸡,背部皮下多点免疫注射。初次免疫采用佛氏完全佐剂乳化的白蛋白(牛),以后均用佛氏不完全佐剂乳化的白蛋白(牛)。开始连续免疫3次,每2周1次,每次剂量为400Λg 。第10周中旬、第11周各加强免疫1次,每次剂量为800Λg 。鸡卵黄产生抗体的效价和亲和力见图1。1.4 鸡卵黄抗体的提取 取鸡卵黄液,用6倍去离子水搅拌下稀释,用0.1m o l L HC l 调至pH 5.1。4°C 过夜,12000r m in 、4°C 离心25m in 。除去沉淀,上清液中加入硫酸铵至2.21m o l L 饱和度,加入最终浓度为0.5g L 的 3 5
文献综述 卵黄抗体的研究进展 郑译 西南大学荣昌校区动物医学系，重庆，荣昌402460 摘要：抗体（免疫球蛋白，Ig）是指机体受到外来抗原物质刺激后，B细胞识别抗原后活化、增殖分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的能与相应抗原特异性识别和结合的一类球蛋白。 关键词：卵黄抗体；免疫程序；研究进展 卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk，IgY）经特定抗原免疫后的母鸡可产生相应的特异性抗体，有研究证实[1]，产蛋鸡的卵黄对抗体有浓集作用，使其不断储存于卵黄中，这种抗体称为卵黄抗体。 1 卵黄抗体的概念 卵黄抗体，英文名（vitelline antibody） 定义：从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，多为IgG。禽类免疫后在其卵黄中产生的大量高纯度IgG，其对某些禽类疫病具有明显治疗和紧急预防作用。 卵黄抗体是用特定抗原多次免疫产蛋母鸡，使机体产生相应的特异性抗体，并转移、贮存在卵黄中，经提取纯化的免疫球蛋白 卵黄抗体（Egg yolk antibodies eyAb），也称卵黄免疫球蛋白(Egg yolkimmunogbhin，IgY)。科学家在鸟类的血液循环壁发现三种免疫球蛋白(IgG、IgA 与IgM)，母鸡在细胞分裂产蛋的过程中，会将其免疫球蛋白转移至鸡蛋，母鸡血浆中之IgA与IgM，会在输卵管中与其他的蛋白质结合而构成鸡蛋蛋白的部分。 IgG：免疫球蛋白G (Immunoglobulin G，IgG)的缩写。IgG是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%。其中40～50％分布于血清中，其余分布在组织中。 IGA：一种免疫球蛋白。异常情况下，在肾脏受到各种炎症反应刺激等因素下，导致IGA过度沉积在肾脏肾小球系膜区等部位，与抗原一起形成免疫复合物，造成肾脏结构病理损害，引起的一系列临床症状，称为IGA肾病。 IGM：免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)的缩写。根据结构的不同将免疫球蛋白分为五种，IgM是三种免疫球蛋白之一，其他还有lgA、lgG、IgD和lgE.。
卵黄抗体的制作 卵黄抗体是治疗鸡新城疫（ND）和传染性法氏囊病（IBD）的一种特效药，于20世纪90年代，利用免疫学理论研究生产的新药，具有特异性诊断、治疗和预防作用。目前，已广泛应用于鸡新城疫和传染性法氏囊病的防治上，均收到了良好效果。制作方法将新城疫I系苗、传染性法氏囊强毒苗连续注射健康无病产蛋鸡三次，第一次1个免疫量，第二次2个免疫量，第三次3个免疫量。待3周后收集母鸡所产的蛋，无菌采取蛋黄，加灭菌生理盐水稀释成1∶20的混悬液，测定效价，加入抑菌剂，然后进行分装，在0℃以下保存备用。卵黄抗体成分与效价卵黄抗体也称母源抗体、IgG抗体。是母体血液中小分子抗体IgG 通过胎盘、输卵管、滋养层传给后代。保存入卵的蛋黄中，若孵化出鸡雏，则对新城疫、传染性法氏囊有特异的抵抗作用。这种抵抗作用称为抗体，其分子结构称为单体Ig，由2条多肽重链和2条多肽轻链组成。沉淀系数7S，分子量160000-180000，含糖2.5%。现已发现有四种IgGT型重链同种异型，也称作四个亚型并含硫的半胱氨酸。具有抗感染、抗菌、抗病毒作用。由于氨基酸排列顺序具有高度可变性，能接触到抗原的物质，并发生特异结合，产生中和作用，从而体现特异作用。卵黄抗体好与否的标准是用HA和HI试验测定的稀释倍数，称为效价，Iog2的指数越大，效价越高，通常把1∶64效价称为高免卵黄抗体，其半衰期为4天左右，因此，用卵黄抗体替代主动免疫时间在2周~4周，应科学选择使用日期，注意半衰期，计算保护期，当降到临界线时，应及时补充。卵黄抗体的作用诊断作用：卵黄抗体具有沉淀素的特性，当诊断时，若怀疑鸡群发生传染性法氏囊病，可采取病料5克，加灭菌生理盐水10毫升，研磨，加抗菌剂抑菌，置于冰箱过夜，作为未知抗原，制作备用琼脂板，打成梅花状七孔后，同时加入未知病料抗原和已知的卵黄抗体各一份，约0.5毫升，25℃放置24小时~72小时，出现肉眼可见白色沉淀线，为阳性反应。强阳性反应时，24小时后就可见到沉淀线，即可判定试验鸡群发生了传染性法氏囊病。治疗作用：当鸡群发生新城疫或传染性法氏囊病时，可立即皮下注射卵黄抗体1-2毫升，肉鸡可口服卵黄抗体2毫升/只，能阻止病毒进入细胞，形成再感染，中和病毒数量，经2小时就可发现鸡群精神好转，食欲增加，粪便恢复正常。目前，是治疗鸡新城疫、传染性法氏囊病的特效药物。预防作用：卵黄抗体的使用，在免疫学理论中可成为被动免疫。当免疫缺陷、疫苗缺乏及免疫失败时，可利用卵黄抗体注射、口服替代主动免疫接种，发挥抗病作用。应用方法解冻：一般包装有500毫升、250毫升、100毫升瓶装。要把药瓶放在新鲜井水中，浸泡2小时~4小时以上，反复振摇。用肉眼观察，瓶内无冰碴为宜。注射：可将解冻后的卵黄抗体，在室温下放置半小时，接近室温时（15℃~20℃），再皮下注射1毫升~2毫升。先注射健康鸡群，再注射假定健康群，最后注射病鸡群。注射1只鸡要换1个针头。口服：将解冻后的卵黄抗体以1∶10的比例，加入凉开水或新鲜井水及适量的抗生素，制成混悬液，让鸡在半小时内饮完，并要备足饮水器，让鸡都有位置饮水。注意事项卵黄抗体是生物制品，高温会失效，为方便生产与使用，须冷冻保存和运输，一般在-18℃条件下保存，运输时应特别注意温度变化，冷藏包装运输。使用卵黄抗体前，一定要了解鸡群是否接种过同种疫苗，并要注意间隔时间；同时，应测定其效价，计算使用量和保护期。卵黄抗体兑水后，应呈混悬液，不要添加电解质，破坏其结
单克隆抗体的制备及应用 The latest revision on November 22, 2020
单克隆抗体的制备及应用 单克隆是由杂交瘤产生的、只针对复合上某一单个。技术(monoclonalantibodytechnique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。1单克隆抗体的优点与局限性： 1.1单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA 等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 1.2单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与、细胞融合、选择杂交瘤细胞及检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 2.1抗原准备 抗原，是指能够刺激产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 2.2动物的选择与 2.2.1动物的选择纯BALB/c小鼠，较温顺，离窝的范围小，体弱，食量及排污较小，一般洁净的实验室均能饲养成活目开展杂交瘤技术的实验室多选用BALA/c小鼠。 2.2.2免疫方案选择合适的免疫方案对于杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据的特性不同而定。 （1）可溶性抗原性较弱，一般要加，应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml，0.2ml/点），3周后第二次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml），3周后第三次免疫，剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后测其），2～3周加强免疫，剂量50～500μg宜，ip或iv（内
单克隆抗体的制备及 应用
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 1.1 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。1.2 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 2.1 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 2.2动物的选择与免疫