总RNA的提取（Trizol法提取）
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提
取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；
3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP
管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；
4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙
醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；
5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g
（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；
6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
PCR
实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。
1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液：
TaKaRa Taq TM或TaKaRa E X Taq TM的配方
Pyrobest TM DNA Polymerase的配方
①反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50μl以节约试剂；
②将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；
③如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 ~50μl 的矿物油
防止样品在PCR的过程中蒸发；
2.按以下程序进行PCR扩增。
PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。
反应结束后，抽取扩增样品5μl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
RT-PCR
Protocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)
1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液
1.反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50μl以节约试剂；
2.将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；
3.如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 ~50μl 的矿物油防
止样品在PCR的过程中蒸发；
2．按以下条件进行反应
反应结束后，抽取扩增样品5μl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
琼脂糖核酸电泳
1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架
好梳子；
2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确
称量琼脂糖干粉，加入到配胶用（专物专用）的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml）；
3.（称重）放入到微波炉内加热熔化（补水至原重）。冷却片刻（琼脂糖凝胶
凝点为56℃左右），加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；
4.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；
5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气
泡，应设法除去；
6.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后（反复
吹打，移液枪枪头始终保持在液面下），用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内（可用手扶住枪头）；
7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠
近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可；
8.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳（对于以分离获取大基因片段如
质粒，MARKER可适宜跑出胶外）；
9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子
量标准Marker比较被扩增产物的大小。
胶回收纯化DNA
（1、胶回收后跑电泳没有条带，最可能的原因：起始上样量不足（我们一般至少要100ulPCR产物）；胶回收试剂盒存在质量问题，等等。
2、胶回收没有条带，可能产物浓度较低，这种情况下进行连接转化，是可以得到阳性菌落的。但是，你要自己能保证前期试验没有任何问题。
3、TAKARA有个核酸共沉剂，如果PCR只有单一条带，可以用它进行纯化，回收率很高。）
1.琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；
2.按照每100mg加400μl的量加入binding buffer，放入到EP管振荡器中，45℃～
55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）；
3.取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm 离心
1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；
4.加500μl的wash buffer至柱中，8,000rpm 离心1分钟。弃管中的溶液；
5.重复操作4步的操作1次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒，
除去痕量的wash buffer；
6.将纯化柱放入一个新的EP管。加30~40μl H2O或者elution buffer至纯化柱膜
的中央，在37℃或50℃下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。
7.注：若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100μl液量加
400μl的binding buffer,其余的步骤不变。
大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）
此方法适用于小量质粒DNA的提取（在提取土壤中微生物基因组时，考虑到大片段，采用蛋白酶K与20%SDS裂解菌体）提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。
1.取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉
淀尽量干燥（再次离心，完全去除培养基上清）；
2.将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100 μl溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L
EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，剧烈振荡（这一步至关重要，确保菌体重悬）；
3.加入200 μl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管
口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋（强调柔和，静置2min为佳），置于冰浴中；
4.加入150 μl预冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5
ml冰乙酸，28.5 ml H2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次—（时间短，不剧烈震荡，当基因组片段大小断裂为50~100bp时，无法PDS共沉淀），使溶液III 在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟；
5.在最大转速（12000g）下离心5min，取上清液（转移时悬空滴加可以有效防
止枪头上的杂质进入）于另一新EP管（勿贪多，取到白色絮状杂质沉淀）；
6.用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合（就不怕断链？）于室温放
置2分钟，最大转速（12000g）离心5分钟（本实验分两次）；
7.小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于
管壁的液滴除尽；
8.加1ml 70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将
开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～10分钟），用适量的ddH2O溶解；
9.用0.5μl的RNase 37℃温育5~10分钟（30min）；
10.电泳鉴定。（1. A260/A280>1.8表示DNA/RNA的纯度高。若数值<<1.8，表示纯度低，
这时由OD260测得的DNA含量较不可信，核酸溶液中含有较多蛋白质，因此最好将前述所得核酸再重新抽取。2. 测定260 nm 吸光值，OD=1.0代表值如下：（1）ds DNA （double stranded DNA）= 50 mg/ml （2）ss DNA （single stranded DNA or simg le-stranded RNA）= 40 mg/ml）
11.质粒不相容性——电泳出现三条以上条带
乙醇沉淀DNA
1.加入1/10体积的乙酸钠（3 mol∕L，PH=5.2）（一价盐在100mmol/L回收率最
高，二价盐为50mmol/l，与盐种类无关）于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3 mol∕L；
2.加入2倍体积用冰预冷的乙醇（去除盐类、挥发性好，除残酚）混合后再次
充分混匀置于-20℃中15~30分钟；
3.12,000 g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
4.加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸
去管壁上所有的液滴；
5.于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；
6.加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。
酶切
1.酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。
2.在离心管中加入如下成分：
10×Buffer 1μl
待切样品xμl
酶0.5-1μl
加水补足10μl
3.混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。
4.将离心管置于37℃中温育1-3hr，若待切样品为PCR产物，则可将反应时间
适当延长。
5.用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。双酶切可选用二者活性都较高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反应(内切酶专一性降低)。）
连接
1.连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。
2.在离心管中加入如下成分：
10×连接Buffer 1μl
待连接的样品（胶回收产物或PCR产物，载体与片段的mol比为1∶3-5）
（我们是用的PCR扩增产物10μl，载体未知）
连接酶0.5-1μl
加水补足10μl
3.混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。
4.将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求
而定，一般为22℃ 1-3hr或16℃连接过夜）。
连接完的样品可直接用于转化，也可放4℃冰箱短期保存。
感受态细胞的制备
1.挑取适当菌株的E.coli单菌落接种于2ml SOB培养液（含酵母提取液）中，
37℃摇床过夜。
2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50ml SOB中，18℃剧烈震荡，直到A600
达到0.6。（.4）
3.将培养物转移到50ml离心管中，4℃ 4,000rpm/min（2800）离心10min（5min）。
同时在冰浴上配置TB溶液。
4.弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。
5.取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀，再加入15ml TB（1/3体积的起始培养
液），冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min离心10min。
6.弃上清，沉淀重悬于4ml TB（1/12.5体积的起始培养液），冰浴10min。
7.加入280μl DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴10min。
8.将菌液分装于EP管中，-80℃或液氮冻存。
9.取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH2O（阴性对照）和1μl纯质粒（阳性
对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。
SOB的配制：
蛋白胨20g
酵母提取物5g
NaCl 0.58g
KCl 0.186g
100×Mg++溶液10ml
溶解并加水定容至1L，121℃×20min高压蒸汽灭菌
100×Mg++溶液：
MgCl2﹒6H2O
MgSO4﹒7H2O
溶解并加水定容至100ml，121℃×20min高压蒸汽灭菌
TB溶液的配制：
1M KCl 5ml
0.55M MnCl2 2ml
0.5M CaCl2 0.6ml
0.1M K-Pipes(pH 6.7) 2ml
ddH2O 10.4ml
Total 20ml
注：上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理
0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制：
称取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中，此时粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固体调节PH值，只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解，此时当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。
转化
1.取100μl感受态细胞（-80℃）于冰浴上（4℃）融化。
2.加入1μl纯质粒或连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30 min。
3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2 min。
4.加入0.9ml SOC，于37℃恒温摇床上200rpm×1hr（150）温育（30min~45min）。
5.将菌液4000rpm/min离心3min，留200μl上清将菌体打散，均匀涂布于含适当
抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃倒置培养过夜。
i.注：新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。
i i.当转化的是TA克隆连接产物时可在菌液中加入8μl 1M IPTG和40μl
20mg/ml X-gal以进行蓝白斑筛选。
重组子的筛选和鉴定
重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过PCR进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的PCR产物。
1.用牙签挑取平板上的菌落接种于2ml含适当抗生素的LB培养基中，37℃摇
床培养过夜。
2.次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm×3min离心，弃上清，加入20μl ddH2O和
20μl酚/氯仿，震荡混匀，13,000rpm×5min离心。
3.取上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒DNA作为阴性对照，根据质粒大小
初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。
4.用碱法小量制备可能是重组子的质粒DNA。
5.选取适当的酶，对重组子进行酶切分析，酶切体积均为10μl体系。酶切样品
进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。
6.酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。
7.若用PCR法鉴定，则在第2步时每个样本取0.5-1.0μl菌液为模板进行PCR
反应，每管反应体系最低可少至10μl，PCR产物电泳，能得到所需条带的样本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。
真核细胞的转染
该操作以Invitrogen公司的脂质体转染试剂LipofectAMINE 为例，其它转染试剂可参照各自的使用说明书进行。
1.在6孔板中接种1-3×105细胞/孔，加入2ml完全培养基，置CO2孵箱中37℃
培养过夜。
2.待细胞长到50-80%单层时，在无菌离心管中配制如下溶液：
i.溶液A：将1-2μg待转染的超纯DNA稀释到100μl无血清培养基中
ii.溶液B：将2-25μl LipofectAMINE稀释到100μl无血清培养基中
3.混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置15-45min。
4.用2ml无血清培养基轻轻洗涤细胞，加入0.8ml无血清培养基/孔，将脂质体
复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置CO2孵箱中37℃孵育2-24hr。
5.用完全培养基替换转染液，继续培养。
6.24-72hr后检测蛋白质的表达或传代并加入选择性抗生素以筛选稳定表达株。
转染细胞的稳定筛选
1．确定抗生素作用的最佳浓度：
不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。
1)提前24小时在96孔板或24孔板中接种细胞8孔，接种量以第二天长成
25%单层为宜，置CO2孵箱中37℃培养过夜。
2)将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0, 50, 100, 200,
400, 600, 800 和1000μg/ml）。
3)培养10-14天以绝大部分细胞死亡浓度为准,一般为400-800μg/ml,筛选稳
定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半. 2．转染按前面的步骤进行。
3．转染72小时后按1:10的比例将转染细胞在6孔板中传代，换为含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。在6孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。
1)滤纸片法：用消毒的5x5mm滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上
10-15秒，取出粘附有细胞的滤纸片放于24孔板中继续加压培养。细胞在24孔板中长满后转入25cm2培养瓶中,长满后再转入75cm2培养瓶中培养。
2)有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10倍稀释（10-2—10-10），将每
一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，7-10天后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。
4. ELISA或Western blot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。
重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量
按Qiagen公司的操作手册进行，具体步骤如下。
一、重组蛋白质的诱导表达
1.挑取转化有质粒的单菌落，接种于3ml 选择性LB液体培养基中，37 o C，250
rpm/min振摇培养过夜。
2.次日将培养过夜的菌液500 μl再接种于10 ml（1:20）选择性LB液体培养基
中，37 o C，250 rpm/min振摇培养至光密度（OD600=0.6）时，取1 ml样本作为诱导前标本，10000g离心1 min收集菌体沉淀，－20 o C冻存备用。
3.加入1 mol/L IPTG于菌液中，使IPTG终浓度为1 mM，37 o C，250 rpm/min
振摇培养4～5小时。取1 ml样本作为诱导后标本，同上法收集菌体沉淀，－20 o C冻存备用。
4.将诱导前后菌体沉淀用20 ~ 40 μl PBS（pH= 8.0）重悬，加入等体积的2×SDS
上样缓冲液，煮沸加热5 min，SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，考马斯亮蓝染色3小时后，脱色观察结果。
5.选取诱导成功的细菌克隆，扩大诱导规模，收集菌体沉淀，于－20 o C保存，
准备做下一步分析及纯化。
二、重组蛋白质的分离纯化
重组蛋白质的可溶性鉴定
1.将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液1 (Lysis buffer under native
conditions )中，然后在－80 o C低温冰箱中放置10 min。
2.冰中解冻。
3.在冰浴上用超声破碎仪破菌6次，每次10 sec，间歇10 sec，电压200-300 V。
4.10000g，4o C，离心20 min，取上清（为溶液A），－20 o C保存；另将沉淀用
同样裂解液1溶解（为溶液B），同样－20 o C保存，供后继分析使用。
5.将上述A、B溶液和诱导前后的细菌进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，
比较分析重组蛋白质的溶解性。如果诱导表达的蛋白质位于A溶液中，则为可溶性蛋白；如果是在B溶液中，则为非可溶蛋白。
重组蛋白质为非可溶性蛋白（变性条件下）的分离纯化
1.将菌体沉淀溶于适量裂解液2（Lysis buffer under denaturing conditions）中，
室温下搅拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。
2.10000g，4 o C，离心30 min，收集上清液。
3.将Ni-NTA Agarose充填柱子，并连接于Pharmarcia低压液相层析系统，用5
倍柱体积的裂解液2平衡Ni-NTA Agarose，调节A280值至零线。
4.将适量上清液上样到Ni-NTA Agarose柱子中，并用lysis buffer冲洗至A280
值低于0.01。
5.分别用5～10倍柱体积的清洗液1 和清洗液2（Wash buffer 1 and 2）清洗柱
子，直至A280值低于0.01。
6.用洗脱液（Elution buffer）洗脱重组蛋白质，在A280值监测下，收集出现峰
线后含有重组蛋白的所有洗脱液。
三、重组蛋白质的复性、冻干和定量
纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析，最终用0.01×PBS透析，透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用BIO-RAD公司蛋白质定量试剂(protein assay)比色测定蛋白质的含量。
肿瘤细胞体外传代培养及保种
一. 细胞复苏与培养
将液氮或-80o C保存的肿瘤细胞于37o C 水浴, 快速溶化, 用8.0ml培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液, 于1500转/分, 离心3分钟。弃上清, 再吸取8.0ml培养基质混匀细胞沉淀, 再1500转/分, 离心3分钟, 弃上清, 细胞沉淀用1.0ml培养基混匀, 备用。另取一个75cm2方瓶, 加入14.0ml培养基质, 将上述制备的含肿瘤细胞悬液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37o C，5%CO2孵育箱中培养。
若此肿瘤细胞悬浮生长, 大约3－4 天细胞基质会变黄, 5.0ml细胞悬液可传代一个方瓶培养, 可用3－4个方瓶培养, 一个方瓶中呈对数生长的肿瘤细胞可达1—1.5×107 个, 根据试验所需, 可决定传代的次数。若此肿瘤细胞呈贴壁生长, 经过3—4天, 肿瘤细胞生长至80%—95% 单层时, 弃上清, 用0.5mM 的EDTA(难消化的肿瘤细胞用0.25%胰酶1.0ml), 处理肿瘤细胞大约3—5分钟, 用倒置显微镜观察，当90% 的肿瘤细胞变圆时, 即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml离心管中, 于1500转/分下，离心3分钟, 弃上清, 加少许培养基混匀, 可传代3个75cm2方瓶扩大培养。
二. 细胞冻存
将对数生长的肿瘤细胞用1个75cm2 方瓶按上述方法收集, 于1500转/分离心3分钟,弃上清, 用保种液(含10% DMSO的小牛血清)3.0ml混匀, 分别加入到2—3只保种管中, 写上肿瘤细胞名称, 时间, 保种者姓名, 放-80o C 保存, 次日将它们转移到液氮中保存(注: -80o C下可保存细胞半年至一年, 液氮可保存细胞5—10年, 甚至更长的时间)。以上所有物品均需经过高温灭菌( 121o C, 30分钟)，培养基质则经过过滤(0.22uM)除菌, 所有操作均必须遵守无菌操作技术, 避免细菌、真菌、病原体、衣原体等污染。
肿瘤动物模型的建立
将对数生长的肿瘤细胞收集, 用无血清基质10.0ml, 于1500转/分, 离心
3min, 连续洗3次, 最后用无血清基质混匀, 用血球计数器计算肿瘤细胞数量(平均5个中方格的细胞计数×104 即是肿瘤数/毫升)。计算完肿瘤细胞总数, 再将肿瘤细胞密度调至4×106 个/ml, 每只小鼠腋下接种50ul(即2×105个肿瘤细胞), 2周左右可扪及肿瘤小节结。一般选取6—8周的小鼠，不同的肿瘤细胞接种的数量和动物不一样, 比如LL/2, B16, Hep 可接种C57和BALB/C 小鼠, NS-1, EL-4, C26, Meth A可接种BALB/C 小鼠, H22接种昆明鼠。从肿瘤接种后可扪及小结节开始, 每3天用游标卡尺量肿瘤纵横大小(单位: mm), 至少连续一个月时间。注意要设计不同的实验组和对照组, 每组动物数一般为5—10只, 一般接种肿瘤6—8周后，小鼠的肿瘤可生长至直径为15—20mm (即小鼠会濒临死亡)时, 可眼球取血，分离血清并保存血清, 处死小鼠, 取肿瘤组织照相, 取部分肿瘤组织作冰冻组织切片(或-80℃保存), 作相应的免疫组织化学染色, 取部分肿瘤组织用3%中性的甲醛固定, 石腊包埋, 作常规HE染色.
小鼠尾静脉注射方法
在靠近实验台边缘处, 用大培养皿扣住小鼠, 左手抓住小鼠尾巴, 用酒精棉球擦尾巴, 可见到两侧静脉; 注射前应确认针管内无气泡, 注射时由尾尖开始, 顺向刺入。失败后再逐渐移向根部重刺, 若准确刺入静脉内, 推进时无阻力, 一般可注入0.1—0.5ml。
肿瘤蛋白疫苗预防性动物实验
一般肿瘤蛋白疫苗首次免疫剂量10ug/只小鼠, 与相应佐剂混匀, 在背部皮下注射, 第2次免疫间隔2周, 同样加佐剂在皮下注射；第3次免疫间隔2周, 同样加佐剂在皮下注射；第3次免疫后2周, 用ELISA检测其血清效价，当效价达到要求时；在接种肿瘤细胞前3天,于腹腔或尾静脉加强注射20ug /只。
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养
1.将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。
（注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）
2.用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污
血冲洗干净为止。
3.用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20
分钟，并不时上下摇动脐带。
4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无菌离心管中，用无
菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。
5.将收集液离心（2000转/分）3分钟。
6.倒去上清，加入10ml M199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细
胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。
（注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。）
7.培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细
胞和死细胞，加入10 ml新鲜的M199培养基。
8.以后每2天换一次培养基（每次换掉2/3的培养基）。
9.一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。
10.倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液（0.25%胰酶
+0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。
11.用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50 ml无菌离心管中，
2000转/分，离心3分钟。
12.倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养.
13.一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。
实验动物免疫方案
1、抗原: 蛋白质、多肽、细胞器、细胞、组织等。
2、免疫方式：皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌肉注射等。
3、不同动物免疫所需抗原量（以蛋白免疫为例）
>18-20kDa <18-20kDa
动物抗原量最佳抗原量抗原量最佳抗原量
兔子20-200 100 50-400 200
小鼠2-40 15 4-60 40
大鼠10-50 30 20-150 50
绵羊100-1000 200 200-1000 400
母鸡20-200 100 50-400 200
单位：微克
4、免疫方案（以免疫兔子为例）：
天数0 14 28 38 56 66 87
注射x x x x
采血2ml 2ml 2+20ml 2+50-70ml
5、注意：
?第一次免疫用完全佐剂与免疫原混合，以后加强免疫用不完全佐剂与免疫原
混合，采取多点，时间间隔式免疫法。
?如果用细胞免疫兔子，那么每次免疫所需细胞量为2-3 x 107 cells。
?在连续免疫完三次后，需要少量取血进行ELISA检测，检测所免疫动物的抗
体滴度，一般滴度能达到1:10,000-50,000。在处死所免疫的动物前一周应加强一次免疫。
?如果用小鼠免疫，可以尾静脉小量采血（大约50μl），最后取眼球大量采血
（大约500-1000μl）；如果用兔子免疫，可以耳缘静脉小量取血(大约2mL)，最后心脏大量取血(50-100mL)
?按血清制备的标准方法将血清分离，并且分装成小份，储藏在-80o C。
血清制备
1.取血后，37o C下，让血液凝固1到2小时（不加抗凝剂）；
2.4o C冰箱过夜（让血块固缩）；
3.当血清自然析出后，4o C，3000转/分，离心10分钟，分离血清，弃去
不溶物；
4.将血清移至一干净试管，并分装成小份，储藏在-80o C。
ELISA
一、包被抗原
1.用50mM的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为10-20 μg/ml，
加100 μl/孔到96孔酶标板，4 o C放置过夜。
2.第二天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150 μl 1％BSA 37 o C
封闭1小时。
3.PBST洗涤3次后，每孔加入100 μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样
品，37 o C孵育2小时。
4.PBST洗涤5次后，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗，37 o C孵育1小时。
5.PBST洗涤5次后，显色剂显色20 min后，酶标仪上读取A405吸收值。
二、包被细胞
1.在96孔培养板上接种细胞数为1 x 104 cells/well，37℃过夜培养。
2.第二天用PBS洗涤培养板2-3次。
3.加入125 μl/well 10% Formalin（1:10稀释）, 室温下固定15 min。
4.用ddH2O洗涤培养板3次，并晾干，储藏在2-8o C备用。
5.用PBST洗涤3次，每孔加入150 μl 1％BSA 37 o C封闭1小时。
6.PBST洗涤3次后，每孔加入100 μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样
品，37 o C孵育2小时。
7.PBST洗涤5次后，加入100 μl稀释后的HRP标记的二抗,37 o C孵育1小时。
8.PBST洗涤5次后，显色剂显色20 min后，酶标仪上读取A405吸收值。
50mM的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,
Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。
ABTS作为底物进行显色反应(10ml)：
?0.2M Na2HPO4 2.4ml
?0.1M 柠檬酸2.6ml
?ddH2O 5ml
?ABTS 5mg
?H2O2(30%) 4 ul（用前加入）
注意：
?一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。
?不同的显色系统对应不同的光吸收值。
血清学筛选克隆新抗原/新基因
一、E.coli/ phage 裂解液预吸附血清
1.将E.coli /phage lysate以1:10-20稀释在TBST溶液中。
2.将4张82mm的nitrocellulose membranes（NC）浸入稀释后的E.coli/ phage
lysate中，室温下水平摇动30分钟，取出NC并使膜沥干。
3.用50ml TBST溶液洗膜3次，每次10分钟。
4.用滤纸轻轻吸去膜上的液体。
5.将膜放入50ml封闭液中，室温下水平摇动最少30分钟。
6.将膜从封闭液中取出，用50ml TBST溶液洗膜3次，每次10分钟。
7.将血清按1:5稀释在TBST溶液中，将一张膜放入溶液中，37℃下轻轻水平
摇动10分钟。
8.从血清稀释液中取出膜并丢弃,加入另外一张新膜,37℃下轻水平摇10分钟.
9.重复步骤8，直至所有4张膜都处理完。
10.除去最后一张膜，收集血清（primary antibody），分装成小份储存于-80℃冰
箱中待用。
注意：
?该步处理过程是为了去除血清中能与细菌和噬菌体裂解蛋白进行免疫反
应的抗体，这样可以减少假阳性率；
?一抗不能反复冻融，化冻后不要再次冰冻，可放于4℃作短暂保存；
?可以是病人血清，也可以是免疫血清，如果是病人血清，则需要至少10
个病人血清进行混合；
二、噬菌体筛选
1.准备NZY agar plates（至少用前24小时倒好），用前在37℃培养箱中烘烤1-2
小时以去除水滴。
2.将过夜培养的XL1-blue MRF’细菌2000转/分，离心10分钟，将细菌溶解在
10mM MgSO4中，调整细菌浓度为OD600=0.5。
3.融化NZY top，并将NZY top放在50℃水浴中。
4.将适量的XL1-blue MRF’细菌溶液与一定稀释度的phage文库混合，37℃下
共同作用15分钟。
?直径90mm平板：200μl XL1-blue 细菌+适量的phage文库
?直径150mm平板：600μl XL1-blue 细菌+适量的phag文库
（噬菌斑数量一般保持在3000pfu/90mm; 12000pfu/150mm）
5.将步骤4中的混合液与NZY top溶液混合（200μl混合液+3-4mlNZY top溶
液；600μl混合液+8-10 ml NZY top溶液），倒入到NZY agar plates中，室温下放10分钟左右，然后倒置放于37℃下培养。
6.当噬菌斑刚好可看到时（大约5-8小时），从培养箱中拿出平板。
7.将NC放入10mM IPTG溶液中完全浸湿，在空中使膜沥干，并做好3个不
对称的标记。
8.将IPTG处理好的NC贴在平板上，不留气泡，然后倒置放于37℃下培养。
9.过夜培养后，第二天早上取出平板，用镊子将膜轻轻掀起，注意不要将培养
基粘在膜上。
10.将膜放于50ml TBST溶液中，水平脱色摇床上震荡洗膜3次，每次10分钟。
11.将膜放入50ml封闭液中，水平摇动，封闭4-6小时。
12.在封闭液中加入适当滴度的一抗，水平摇动处理过夜。
13.将膜放于50ml TBST溶液中，洗膜3次，每次10分钟。
14.在封闭液中加入适当滴度的二抗（各个公司的二抗使用滴度不同），室温水
平摇动1-2小时。
15.将膜放于50ml TBST溶液中，洗膜3次，每次10分钟，最后用50ml TBS
溶液洗膜15-20分钟，取出膜空气中沥干。
16.将膜放入BCIP-NBT显色液中避光显色，水平摇动直到阳性斑点可见为止。
17.从显色液中取出膜放在TBS溶液中，空气中使膜干燥。
18.根据所做的标记,将膜与平板对齐,将平板上对应的阳性克隆区域的培养基挖
出放入500μl SM buffer中,并加入25 ml chloroform,4℃贮存（最多可贮6月）。
19.第一轮筛选得到阳性克隆需要进行第二轮筛选以去除假阳性并获得阳性单
克隆噬菌体。过程如第一轮筛选，只不过用直径90mm平板；具体过程见步骤4，这时所加入的噬菌体溶液是第一轮筛选得到的噬菌体上清（见步骤18），在用前要滴定好噬菌体的滴度，噬菌斑的数量以可区分出单个克隆，同时密度不能太稀为标准（一般100-200 pfu/90mm）。
20.按第一轮相似的过程进行实验，最后显色，确定真正的阳性克隆，并将阳性
单克隆所在的培养基挖出放入500μl SM buffer中，并加入25 ml chloroform，4℃贮存（最多可贮存6月）。
注意：
?封闭液一般可用：5%的脱脂牛奶或1%的BSA溶解在TBST溶液中。
?第一轮筛选用150mm的平板；第二轮筛选用90mm的平板，一般需要筛选
至少1 x 106 pfu。
?认真做好三个不对称的标记，特别在第二轮挑选阳性克隆时要仔细将膜与平
板吻合好，不能挑错。
三、单克隆剪切
1.取第二轮筛选得到的阳性克隆贮存液上清。
2.将过夜培养的XL1-blue MRF’细菌2000转/分离心10分钟，将细菌溶解在
10mM MgSO4中，调整细菌溶度到OD600=1.0。
3.在一个EP管中加入：200μl XL1-blue MRF’细菌+250ul phage stock（步骤1）
+1 ul ExAssist helper phage。
4.将以上三种样品混合，37℃下共同保温15分钟。
5.将样品混合物加入到3 ml LB培养基中，37℃震荡培养3-4小时。
6.将试管放于65-70℃水浴20分钟，3000转/分，离心15分钟。
7.将上清转入新的离心管中，已发生剪切的phage particles在上清中（上清可
在4℃下储存1-2月）。
8.将100ul phage 上清+200ul SOLR cells（OD600=1.0）混合，37℃保温15分钟。
9.取步骤8中溶液5-10 ul涂于LB-amp agar plates（amp=50ug/ml），过夜培养。
10.第二天细菌长出，随机挑取单克隆接种到LB-amp培养基中培养过夜。
11.过夜培养细菌分为三部分：（1）提取质粒做双酶切，鉴定外源基因的大小；
（2）送样品进行DNA测序（3）加入30-40%的甘油进行保种，分装成小份储存于-80℃备用。
附录：
1、SM buffer (1L):
(5.8 g NaCl+2.0 g magnesium sulfate+50 ml 1M Tris (pH=7,5)+0.1 g gelatin)
2、AP-buffer:
(100 mM Tris HCI (pH 9.5) ; 100 mM NaCl ; 5 mM MgCl2)
3、10xTBS（1L）：
（0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)；1.5 M NaCl）
4、LB Broth（1L）：
（10 g NaCl+10 g of tryptone+5 g of yeast extract）
ELISPOT
1.PBS溶解抗原为30 μg/ml，加100 μl/孔于PVDF膜铺底的96孔灭菌板过夜；
2.第二天吸去包被液后，加5％FCS的PRMI 1640培养基100 μl封闭1小时，
37 o C；
3.准备脾细胞悬液（用氯化铵去除红细胞，制备成单个脾淋巴细胞悬液）；
4.从1 × 106/孔开始，按1:3的稀释度开始逐孔稀释做不同浓度梯度，并做3个
实验室常用器材使用方法及注意事项
实验室常见仪器使用方法及注意事项 一、常见的仪器 （一）初中化学实验常见仪器 反应容器可直接受热的：试管、蒸发皿、燃烧匙、坩埚等能间接受热的：烧杯、烧瓶、锥形瓶（加热时，需加石棉网） 常存放药品的仪器：广口瓶（固体）、细口瓶（液体）、滴瓶 （少量液体）、集气瓶（气体） 用加热仪器：酒精灯 计量仪器：托盘天平（称固体质量）、量筒（量液体体积） 仪分离仪器：漏斗 取用仪器：药匙（粉末或小晶粒状）、镊子（块状或较大颗粒）、胶头滴管（少量液体） 器夹持仪器：试管夹、铁架台（带铁夹、铁圈）、坩埚钳其它仪器：长颈漏斗、石棉网、玻璃棒、试管刷、水槽 不能加热：量筒、集气瓶、漏斗、温度计、滴瓶、表面皿、广口瓶、细口瓶等 1、试管 （1）、用途： a、在常温或加热时，用作少量试剂的反应容器。 b、溶解少量固体。 c、收集少量气体的容器 d、用于装置成小型气体的发生
器。 （2）、注意事项： a、加热时外壁必须干燥，不能骤热骤冷，一般要先均匀受热，然后才能集中受热， 防止试管受热不均而破裂。 b、加热时，试管要先用铁夹夹持固定在铁架台上（短时间加热也可用试管夹夹持）。 试管夹应夹在的中上部（或铁夹应夹在离试管口的1/3处）。c、加热固体时，试管口要略向下倾斜，且未冷前试管不能直立，避免管口冷凝水倒流 使试管炸裂。 d、加热液体时，盛液量一般不超过试管容积的1/3（防止液体受热溢出），使试管与桌面 约成45°的角度（增大受热面积，防止暴沸），管口不能对着自己或别人（防止液体喷出伤人）。反应时试管内的液体不超过试管容积的1/2。 2、烧杯用途：①溶解固体物质、配制溶液，以及溶液的稀释、浓缩 ②也可用做较大量的物质间的反应 注意事项：受热时外壁要干燥，并放在石棉网上使其受热均匀（防止受热不均使烧杯炸裂）， 加液量一般不超过容积的1/3（防止加热沸腾使液体外溢）。
实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用
事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。
●针刺伤事件有处理登记 ●传染病、特殊感染病例报告登记 ●再生医疗器械消毒流程正确： 1.医疗垃圾需分类放置。 2.污染敷料（血液、体液）与使用后的一次性换药包 需用黄色袋。 3.非污染物（使用后的输液袋、注射器）需用兰色袋。 4.使用后的针头需锐器桶盛放，玻璃安瓿需用黄色袋。 ●中心静脉穿刺处无红肿和渗液 ●无菌物品及器械： 使用方法正确，消毒灭菌达标，标识清楚。 ●屏障隔离： 1.符合要求，隔离标识正确，物品单独使用。 2.隔离患者的物品消毒符合规范。 3.沾染了放射性、化疗药物的废弃物处理符合规范。 4.血液制品袋用后按医疗垃圾单独放置，保存24小时 备查。 ●体温表消毒方法： 1．每周浸泡用肥皂水清洗两次（周一、周四），用75%酒精浸泡,不填加，每周更换两次。 2．遇有传染病人用过的体温表，需用0.05％有效氯消毒半小时，然后用清水洗净晾干，放入酒精浸泡。
3．病人处不可放置体温表，随用随取，及时消毒。 4．每月监测体温表检测，并登记。方法如下：将体温表中的汞柱甩至35℃以下，放入36℃以上、42℃以 下水温中浸泡3分钟，取出后体温表中汞柱误差在 0.2之间为合格。 ●血压计终末消毒方法： 1．污染的血压计袖带使用0.05％有效氯即刻消毒，消毒半小时后用清水洗净晾干备用。污染的血压计用 0.05％有效氯擦拭消毒。 2．无法撤掉的要关闭阀门后，再进行消毒。 3．传染病人固定专用血压计，定时每周消毒一次。 4．血压计袖带每周清洁消毒一次，方法如下：用清水或肥皂水清洗后晾干，再用紫外线双面消毒半小时。 ●简易呼吸器消毒： 1.接口与面罩用酒精擦拭，球囊污染用肥皂水清洗。 2.人工呼吸器使用后消毒，避污保存。 3.气管插管导丝使用后灭菌保存。 ●呼吸机冷凝水终末消毒： 1．配制0.1%有效氯装在密闭容器中，积水器中冷凝水达1/2满时倾倒，将冷凝水倒入容器中，半小时后 倒入卫生间污水系统。 2．呼吸机管路积水瓶处于直立状态，避免冷凝水倒灌
实验室灭菌指南 消毒灭菌方法 目前常用的消毒灭菌方法多采用物理方法(如干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤除菌法、射线杀菌法等)和化学方法(消毒剂、抗生素)两大类。 1干热灭菌法 是利用恒温干燥箱内120oC～150oC的高热，并保持90～120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的的一种方法。 主要适用于不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，且不易被高温损坏的玻璃器皿、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品的灭菌。用此方法灭菌的物品干燥，易于贮存。 酒精灯火焰烧灼灭菌法也是属于干热灭菌的方法之一，在进行动物细胞体外培养工作时，常须利用工作台面上的酒精灯火焰对金属器具及玻璃器皿口缘进行补充灭菌。 2湿热灭菌法 压力蒸汽湿热灭菌法是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。 适合于布类工作衣、各种器皿、金属器械、胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和某些培养液的灭菌。高压蒸汽灭菌器的蒸汽压力一般调整为1.0～1.1kg/cm2，维持20～30min即可达到灭菌效果。 3射线灭菌法 利用紫外线灯进行照射灭菌的方法。紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。紫外线的作用机制是通过对微生物的核酸及蛋白质等的破坏作用而使其灭活。 适合于实验室空气、地面、操作台面灭菌。灭菌时间为30min。用紫外线杀菌时应注意，不能边照射边进行实验操作，因为紫外线不仅对人体皮肤有伤害，而且对培养物及一些试剂等也会产生不良影响。 4过滤除菌法 是将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。过滤除菌法大多用于遇热易发生分解、变性而失效的试剂、酶液、血清、培养液等。
常用的消毒方法 目前常用的消毒方法主要有：热力消毒和灭菌（湿热）、化学药物消毒和灭菌（含氯消毒剂、环氧乙烷、过氧乙酸、戍二醛、甲醛、乙醇等），以及紫外线消毒和电放辐射灭菌。现分述如下： 一、湿热消毒和灭菌 湿热灭菌原理主要是通过凝固菌体蛋白质而杀死微生物。湿热杀死微生物的能力比干热强，因为湿热消毒可以使菌体蛋白质含水量增加，从而易于被热力所凝固，加速了微生物的死亡。 （一）煮沸消毒 煮沸消毒是最早使用的方法之一，其优点是方法简单，应用方便，不需要特殊设施，花费不多而效果可靠。缺点是消毒物品被浸湿，而且处理后再污染的可能性增多。 煮沸消毒适用于消毒食具、食物、棉织品、金属及玻璃制品等。当水温达到100℃时细菌繁殖体几乎立刻死亡，通常在水沸腾后再煮5-15分钟即可达到消毒目的。细菌芽胞抗热能力较强，有些芽胞煮沸数小时才能将其杀灭，因此煮沸消毒一般不能达到灭菌的效果。 煮沸消毒时应注意：
1．消毒时间应从水煮沸后算起； 2．煮沸过程中不要加入新的消毒物品； 3．被消毒物品应全部浸入水中； 4．碗盘等不透水物品应垂直放置，以利对流； 5．消费物品不应放置过多，一般不应超过容器高的四分之三； 6．消毒导热不良的物品时应适当延长煮沸时间。 （二）压力蒸汽灭菌 压力蒸汽灭菌是热力灭菌中使用最普遍、效果最可靠的一种方法。其优点是穿透力强、灭菌效果可靠，能灭杀所有微生物。穿透力强的原因主要是蒸汽凝结时释放出的潜热和凝聚收缩后产生的负压加速了蒸气对物品的穿透，使物品的深部也能很快达到灭菌所需的温度。 压力蒸汽灭菌的持续时间应从灭菌器内达到要求温度时算起，至灭菌完成时为止。总时间包括： 1．热力穿透时间；2．消毒维持时间，即杀灭微生物所需时间，一般用杀灭嗜热脂肠杆菌芽胞所需时间来表示（在121℃里需12分钟、132℃时需2分钟、115℃需30分钟）；3．安全时间（一般为消毒维持时间的一半）。其中热力穿透时间是指灭菌柜内达到灭菌温度至消毒物品中心部位亦达到灭菌温度所需时间，该时间长短取决于消毒物品的性质、包装大小、安放情
实验室常用蒸发浓缩方法 氮吹仪 原理：将氮气快速、连续、可控地吹向加热样品的表面，使待处理样品中的水分迅速蒸发、分离，实现样品无氧浓缩。 应用：农残分析，药物筛选，液相、气相、质谱分析前处理。 优点： 干燥速度快 缺点： 样品温度高 样品处理量少 存在将样品中物质吹到实验室中的风险，必须在通风橱中操作 需要消耗氮气，增加额外成本 可燃溶剂存在爆炸危险 整个过程需要监控 旋转蒸发仪 原理：基本原理即是减压蒸馏，可降低液体的沸点，那些在常压蒸馏时未达到沸点就会受热分解、氧化或聚合的物质就可以在分解之前蒸馏出来，“旋转”可以使溶剂形成薄膜，增大蒸发面积。另外，在高效冷却器（一般是冷凝管）作用下，可将热蒸汽迅速液化，加快蒸发速率。 应用：萃取液的浓缩，有机物提取，色谱分离接收液的蒸馏。 优点： 蒸发速度相对较快 样品量大 控制水浴温度可控制热量输入 真空度可控制 整个过程可见，好控制 缺点： 只能处理单一样品 需要清洗玻璃装置 密封件寿命有限，需要定期更换 样品会泄露到空气中，造成污染
离心浓缩仪 原理：负压降低溶剂沸点，冷阱捕获蒸发出来的气体，使蒸发过程快速进行，离心力可保证样品沉积在管底，不会产品气泡和交叉污染。 应用：DNA/RNA的浓缩，药物代谢物的浓缩，液相色谱的前后处理，免疫球蛋白的浓缩等。 优点： 安全 样品处理量大 多种离心管可选择 样品沉积在离心管底部，好回收 最大程度减少发泡与交叉污染 可通过红外方式提高加热效率 精确控制真空度 蒸发温度低 可通过编程实现多组分分离 缺点： 速度较慢 蒸发过程可见程度有限 冷冻干燥机 原理：预冻样品中的水分，在真空状态下直接升华，可利用冷阱捕获蒸发出来的气体，使蒸发过程快速进行。 应用：菌种、疫苗、蛋白、核酸、药物等对温度和氧敏感性生物样品的干燥，冻干后的样品易于保存和运输。 优点： 安全 水分去除率非常高
各种消毒方法及注意事项 日常消毒方式方法，应避免过度消毒，受到污染时应随时进行清洁消毒，并加强通风。消毒方法如下： 1、表面（如楼梯扶手、门把手、课桌椅、体育器材等人体常接触的物体或位置）：可使用含氯消毒剂（有效氯浓度250 mg/L～500 mg/L）擦拭，消毒作用30 分钟，再用清水擦净。 2、地面：可使用含氯消毒剂（有效氯浓度250 mg/L～500mg/L）用喷洒或拖布湿式拖拭，消毒作用30 分钟，再用清水洗净。 （三）、常见消毒剂及配制使用 1、有效氯浓度500 mg/L 的含氯消毒剂配制方法： （1）、84 消毒液（有效氯含量5%）：按消毒液比水为1:100 比例稀释。（2）、次氯酸钠原液（有效氯含量5-10%）：按消毒液比水为1：200 的比例稀释。 配置的溶液需要搅拌混匀后使用。 2、75%酒精消毒液：直接使用。 3、其他消毒剂按产品说明书进行配制和使用。 （四）、注意事项 1、含氯消毒剂(含84 消毒液) （1）、含氯消毒剂有很强的刺激性与腐蚀性，必须按照说明书要求，严格按比例加水稀释后方能使用。 （2）、含氯消毒剂配置和使用时必须佩戴口罩、手套、护目镜、工作服或一次性防护服，严禁儿童触碰。 （3）、含氯消毒剂不能和酒精、碱性活洗剂（洗衣粉）、洁厕剂等混存混用。（4）、含氯消毒剂有漂白作用，不可用于丝绸、毛、尼龙、皮革表面以及彩色织物的浸泡，对金属表面也有腐蚀，消毒后要擦拭干净。其中84 消毒液的漂白作用与腐蚀性较强，最好不要用于衣物的消毒，必须使用时浓度要低，浸泡的时间不要太长。 （5）、含氯消毒剂需加盖保持容器密闭，并存放在避光阴凉处，否则会造成氯
常用消毒与灭菌方法 含氯消毒剂 C.10．1 适用范围 适用于物品、物体表面、分泌物、排泄物等的消毒。 C.10.2 使用方法 C.10.2.1 消毒液配制 根据新产品有效氯含量，按稀释定律，用蒸馏水稀释成所需浓度。具体计算方法及配制步骤按C.9.1.2.1进行。 C.10.2.2 消毒方法 C.10.2.2.1 将待消毒的物品浸没于装有含氯消毒剂溶液的容器中，加盖。对细菌繁殖体污染物品的消毒，用含有效氯500mg/L的消毒液浸泡＞10min，对经血传播病原体、分支杆菌和细菌芽孢污染物品的消毒，用含有效氮2000mg/L～5000mg/L消毒液，浸泡＞30min。 C.10.2.2.2 擦拭法大件物品或其他不能用浸泡消毒的物品用擦拭消毒，消毒所用的浓度和作用时间同浸泡法。 C10.2.2.3 喷洒法对一般污染的物品表面，用含有效氯400 mg/L~700 mg/L的消毒液均匀喷洒，作用10min~30min；对经血传播病原体、结核杆菌等污染表面的消毒，用含有效氯2000mg/L的消毒液均匀喷洒，作用＞60min。喷洒后有强烈的刺激性气味，人员应离开现场。
C10.2.2.4干粉消毒法对分泌物、排泄物的消毒，用含氯消毒剂干粉加入分泌物、排泄物中，使有效氯含量达到10000mg/L，搅拌后作用＞2h；对医院污水的消毒，用干粉按有效氯50mg/L用量加入污水中，并搅拌均匀，作用2h后排放。 C10.3 注意事项 C10.3 .1粉剂应于阴凉处避光、防潮、密封保存；水剂应于阴凉处避光、密闭保存。使用液应现配现用，使用时限≤24h。 C10.3.2 配置漂白粉等粉剂溶液时，应戴口罩、手套。 C10.3.3 未加防锈剂的含氯消毒剂对金属有腐蚀性，不应做金属器械的消毒。加防绣剂的含氯消毒剂对金属器械消毒后，应用无菌蒸馏水冲洗干净，干燥后使用。 C10.3.4 对织物有腐蚀和漂白作用，不应做有色织物的消毒。 .16 煮沸消毒 C.16.1 适用范围 适用于金属、玻璃制品、餐饮具、织物或其他耐热、耐湿物品的消毒。 C.16.2 使用方法 将待消毒物品完全浸没水中，加热水沸腾后维持≥15min。
法医实验室几种常用DNA提取方法及比较(一)Chelex100法 原理：Chelex100是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基 二乙酸盐离子，起着螯合基团作用，对多价金属离子有极强亲和力。在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离。检材基质中一般含有大量金属离子，在低离子强度及加热条件下，金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA，也可以抑制PCR反应，所以在提取DNA时，加入Chelex100，螯合了金属离子，防止了DNA降解，提高了PCR扩增成功率。 方法：剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材，置于 0.5ml离心管内，加入适量纯水，室温浸泡，13,000rpm离心5min，上清丢弃，管底留约20μl左右液体及检材基质，加入100-200μl 5%Chelex100(有时需加适量PK)56℃15min至数10小时不等，100℃8min，13,000rpm离心5mim，上清备用。 评述： 1、Chelex100法已经成为DNA提取的基本方法，Chelex100法是万能的。目前，我们一切 纯化方法都在Chelex100法的基础上进行，Chelex100法又不是万能的。 2、Chelex100法提取前的检材清洗非常重要，因为现场检材往往均较脏，脏东西可以抑制 PCR反应，所以往往不止清洗一次，清洗检材时可能损失部分DNA。所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA之间的关系。特别强调清洗时应“把根留住”，很多情况下已知样本DNA检验失败的原因是把根没有留住。DNA检验时还有另外一句名言：“一个萝卜一个坑”，防止混乱检材。肝素抑制PCR反应，血红素抑制PCR反应，所以长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝的情况下，多洗是检验成功所必须的。血红素对普通Taq酶的抑制作用是明显的，而目前mtDNA 扩增一般用普通Taq酶，所以同一样品除进行STR检验外尚需进行mtDNA检测时，尽量去除干净血红素，显得尤为重要。现场提取毛发或样本毛发，用毛根进行STR检验时，纯水清洗也非常重要，如果没有清洗干净，毛根DNA本身很少，很易检出为混合型。 因为现场毛发及样本毛发很易粘附另一人成份。毛根清洗的特点为振荡洗涤，不离心，多换水。 3、清洗后检材中加入5%Chelex100量视检材而定。检材参考加入量 0.5×0.5cm血斑150ul-200ul 二步法精斑100ul 毛根10ul 烟头30-50ul 4、对于组织，难溶检材，有疑问检材，均可加入终浓度为100ug/ml左右PK，有时间隔一 段时间，补加适量PK，PK(蛋白水解酶K)作用最佳pH为8.0。 5、加入Chelex100后，56℃浸泡时间，血斑≥15min;组织≥30min，二步法精斑≥1h。 6、PCR扩增前应离心。PCR扩增时不应吸入Chelex100，因为Chelex100为PCR抑制剂。 7、Chelex100使用浓度5%，有些人用10%，有些人用20%，各人爱好。配制好5%Chelex100 pH
3常用消毒方法及注意 事项 -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
常用消毒方法及注意事项 内容一：84消毒液正确使用方法及注意事项 一、84消毒液的正确使用方法： 首先清洗时带好手套和口罩，避免直接接触。此外在清洗一般物体表面时，与水（冷水）的配比为1:100，消毒时间约为20分钟，而且擦拭、喷洒、拖洗消毒后要用清水洗净。 在用84清洗白色织物时，浓度要低，一般是1:160，配比好后将衣物放入水中，切不可将84消毒液直接倒在衣物上或用84消毒液清洗有色衣物，浸泡时间不宜过长，20分钟即可，且在浸泡消毒后仍要用清水多次冲洗。 学校在除臭消毒时，清理下水管道、厨房水槽、沟渠、垃圾桶等，可直接倒入84消毒原液两瓶盖或者有原液喷洒在物品的表面，10分钟后再用清水冲洗干净。许多人正是忽略了清水二次清理这一步而导致84中的刺激性气味刺激了呼吸道，对人体造成了损伤。 学校可以借鉴医院清洗医院污染物品时配比为1:50，且消毒时间长至30分钟。在浸泡、喷洒消毒后用清水再清洗1-2遍洗净晾干。84消毒液使用后会残留在物体表面，挥发进入空气中，其刺激性气味会刺激人的呼吸道，其中的氯也会对水源造成污染，增大了致癌、致畸的风险，对人体造成危害，因此医院在用84消毒液稀释液清扫完地面、扶手时，要再用清水擦拭2遍以防残留物对人体造成损害。
在使用84消毒液后，还要注意开窗通风，使空气流通尽快散尽残留的刺激性气味。在清理完器具用品后，最好在太阳下晾晒一会。 二、84消毒液使用不当的后果: 若家庭中在使用84消毒液后未进行二次清洗和通风，那么在吸入84消毒液挥发出来的气体后，机体可能会出现咳嗽、胸闷、呼吸困难等症状表现。此时应将患者迅速的转往空气新鲜处，保持患者的呼吸道通畅，再即刻联系就医。 有一则新闻，家住北京的王女士在清洁马桶时将洁厕灵和84消毒液一起倒入马桶中，结果在清洗一段时间后晕倒，被送入医院抢救。 只是清洗马桶，为什么会造成这么严重的后果呢因为洁厕灵的成分中含有盐酸，84消毒液的主要成分是次氯酸钠，二者混合会发生化学反应，产生有毒的氯气。氯气通过呼吸道侵入人体并溶解在黏膜所含的水分里，生成次氯酸和盐酸，对上呼吸道黏膜造成损伤：次氯酸使组织受到强烈的氧化；盐酸刺激黏膜发生炎性肿胀，使呼吸道黏膜浮肿，大量分泌黏液，造成呼吸困难。 三、注意事项: 大家切记不要将84消毒液与酸性清洁产品混用，在不了解产品的成分时，每次只使用一种清洁产品，确保不会发生化学反应，危害人体。在储存酒精、84消毒液时，无论量多量少，切记不要二者混储，必须分开储存，并妥善
有机实验室常用仪器与使用 旋转蒸发仪 旋转蒸发仪，主要用于在减压条件下连续蒸馏大量易挥发性溶剂。尤其对萃取液的浓缩和色谱分离时的接收液的蒸馏，可以分离和纯化反应产物。旋转蒸发仪的基本原理就是减压蒸馏，也就是在减压情况下，当溶剂蒸馏时，蒸馏烧瓶在连续转动。结构:蒸馏烧瓶可是一个带有标准磨口接口的梨形或圆底烧瓶，通过一高度回流蛇形冷凝管与减压泵相连，回流冷凝管另一开口与带有磨口的接收烧瓶相连，用于接收被蒸发的有机溶剂。在冷凝管与减压泵之间有一三通活塞，当体系与大气相通时，可以将蒸馏烧瓶，接液烧瓶取下，转移溶剂，当体系与减压泵相通时，则体系应处于减压状态。使用时，应先减压，再开动电动机转动蒸馏烧瓶，结束时，应先停机，再通大气，以防蒸馏烧瓶在转动中脱落。作为蒸馏的热源，常配有相应的恒温水槽。 催化氢化装置 催化氢化是有机化学实验中的一项重要内容之一。这一反应的具体内容是气态氢在催化剂存在下，与有机化合物进行加成或还原反应，从而生成新的有机化合物。它的优点是： （1）有些反应，如碳碳不饱和键的加氢，应用其他方法比较复杂和困难，而应用催化氢化反应，则可以方便的达到目的。 （2）它对醛酮，硝基及亚硝基化合物都能起还原作用，生成相应的醇和胺，不需要任何还原剂和特殊溶剂。氢气本身极其便宜，因而成
本低操作方便。 （3）反应完毕后，只需滤去催化剂，蒸发掉溶剂即可得到所需产物，后处理方便，产品纯度、收率都比较满意。 根据氢化时选用的压力不同，可将催化氢化分为常压氢化，低压氢化（4-5atm）及高压氢化（＞6atm）。而高压氢化则需要非常特殊的装置，（由于有较高压力），这些已超出本书的范围，但不论是在任何压力进行氢化，都不得使用明火，包括电火花。 催化氢化装置：主要包括氢化用的圆底烧瓶，气压计，量（贮）气管和平衡瓶。贮气管的体积一般在100mL到2L之间，可根据反应的规模大小选择合适的贮气量；在平衡瓶里所装的液体通常是水或汞。在反映过程中，氢气的压力大小可以通过平衡瓶的高度来调节。反应结束后，再通过平衡瓶来测量参加反应的氢气的体积。气压计可以保证在反应前后，氢气都在相同的压力下（一般为1atm）进行体积测量。 压缩气体钢瓶 在有机化学实验中，有时会用到气体来作为反应物。如氢气、氧气等，也会用到气体作为保护气，例如氮气、氩气等，有的气体用来作为燃料，例如煤气、液化气等。所有这些气体都需要装在特制的容器中。一般都是用的压缩气体钢瓶。将气体以较高压力贮存在钢瓶中，既便于运输又可以在一般实验室里随时用到非常纯净的气体。由于钢瓶里装的高压的压缩气体，因此在使用时必须严格注意安全，否则将会十分危险。
八种消毒方法的对比 之前，有网友一起讨论，空气消毒用什么方法比较好，其实没有 所谓的最好，只是看看哪种最适合您。为此，我整理了8 种空气消毒方法，主要从消毒原理已经消毒效率进行评价，供各位朋友参考选择：常见应用方法： 1、臭氧消毒法：臭氧是一种淡蓝色气体，具有很强的氧化能力，分解产生的氧原子可以氧化并穿透细菌细胞壁而杀死细菌。但不能除尘，室 内必须没有人，并容易损坏一些易氧化的物品，对表面微生物作用较小。臭氧对人的呼吸道有一定的影响。尽管应用广泛，但越来越多的报导不 主张使用臭氧消毒方法。消毒效率在91~92%之间。 2、紫外照射法：如果应用在空调系统中效果非常差，因为空气流速高，细菌受照的剂量非常小，不能除尘。WHO 和欧盟GMP 都已经宣布其 为通常不被接受的方法，更不能作为最终灭菌。消毒效率在 82~84%。 3、甲醛熏蒸法：甲醛是一种化学试剂，已经宣布致癌，消毒效率大 概在77~78%。 4、超低阻高中效过滤器：这是一种物理阻隔的方法，常规风口上的 阻力是粗效的三分之一，但效率很高，对于大于0.5 微米的效率可达
80%，重量轻，安装方便。消毒效率在92~98%（一次通过的除菌效率） 5、高效过滤器：也是物理阻隔，没有副作用，卫生部消毒规范指出洁净室空气灭菌只用空气净化过滤方式。这种消毒效率可达99.9% 甚至更高（一次的效率） 由于细菌不会单独存在，都需要附着在粒子上，因此，高效其实是最好的消毒，控制好人员的规范其实才是最重要的，其他消毒只是一种辅助。 除此之外，再汇总几个消毒方法，供参考吧： 6、等离子法：这种方法是在气体在加热或者强电磁场作用下产生高度电离的电子云，其中的活性自由基和射线对微生物有一定的杀菌作用，但效率很低70%以下。 7、电子灭菌灯：一种物理方法，没什么破坏，消毒效率平均85%。 8、负离子法：在电场、紫外、射线和水的撞击下使空气电离而产生，可吸附尘埃粒子变成重离子而沉降，缺点是有二次扬尘，在空调系统中不会使用。消毒效率73%左右
医院常用消毒与灭菌方法 拖把： 应有明显标识，严格分区使用。 1）一般办公室、病室、治疗室、换药室走廊每次使用后用清水冲洗，悬挂晾干备用。 2）病室、治疗室、换药室等地面有分泌物、血液、排泄物时，先用1000mg/L有效氯适量到在污染地面30min后，用拖把拖干净，再用500mg/L有效氯消毒剂浸泡30min后，清洗干净，晾干备用。 3）传染病区，使用后先消毒，用1000mg/L有效氯消毒液浸泡30分钟，再用水清洗干净，然后用500mg/L有效氯消毒液浸泡30分钟，悬挂晾干备用。 针灸针： 高压蒸汽消毒；一定要消毒彻底，以免交叉感染！ 体温表消毒方法： 1．每周浸泡用肥皂水清洗两次（周一、周四），用75%酒精浸泡,不填加，每周更换两次。 2．遇有传染病人用过的体温表，需用0.05％有效氯消毒半小时，然后用清水洗净晾干，放入酒精浸泡。 3．病人处不可放置体温表，随用随取，及时消毒。 4．每月监测体温表检测，并登记。方法如下：将体温表中的汞柱甩至35℃以下，放入36℃以上、42℃以下水温中浸泡3分钟，取出后体温表中汞柱误差在0.2之间为合格。 血压计终末消毒方法： 1．污染的血压计袖带使用0.05％有效氯即刻消毒，消毒半小时后用清水洗净晾干备用。污染的血压计用0.05％有效氯擦拭消
毒。 2．无法撤掉的要关闭阀门后，再进行消毒。 3．传染病人固定专用血压计，定时每周消毒一次。 4．血压计袖带每周清洁消毒一次，方法如下：用清水或肥皂水清洗后晾干，再用紫外线双面消毒半小时。 简易呼吸器消毒： 1. 接口与面罩用酒精擦拭，球囊污染用肥皂水清洗。 2. 人工呼吸器使用后消毒，避污保存。 3. 气管插管导丝使用后灭菌保存。 呼吸机冷凝水终末消毒： 1．配制0.1%有效氯装在密闭容器中，积水器中冷凝水达1/2满时倾倒，将冷凝水倒入容器中，半小时后倒入卫生间污水系统。 2．呼吸机管路积水瓶处于直立状态，避免冷凝水倒灌 公用水杯、痰杯、拖鞋： 用后使用0.05％有效氯消毒。 便器消毒： 1. 浸泡便器消毒液每日更换，配置成0.1％有效氯完全浸泡再消 毒液中，一小时后清洗晾干备用。 2. 公用便器每次用后消毒，消毒后及时晾干备用。 3. 自备便器每周集中消毒一次。 止血带消毒： 止血带消毒液每日更换，配置成0.05％有效氯，每次使用后完全浸泡在消毒液中，半小时后清洗晾干备用。 雾化器消毒： 1. 使用后用0.05％有效氯擦拭，管道每次使用后用 0.05％效 氯消毒半小时后清洗晾干备用。 2. 一次性雾化管道每次使用后清洁，需60℃以上热水冲洗，面 罩避污保存。
实验室常用灭菌方法 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
实验室常用灭菌方法 1.高压蒸汽灭菌 为湿热灭菌方法的一种。是微生物培养中最重要的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水在煮沸时所形成的蒸汽不能扩散到外面去，而聚集在密封的容器中，在密闭的情况下，随着水的煮沸，蒸汽压力升高，温度也相应增高。(PV=nRT) 高压蒸汽是最有效的灭菌法，能迅速地达到完全彻底灭菌。一般在15磅/英寸2压力下（℃），15～30分钟，所有微生物包括芽孢在内都可杀死。它适用于对一般培养基和玻璃器皿的灭菌。 进行高压蒸汽灭菌的容器是高压蒸汽灭菌锅。高压蒸汽灭菌锅是一个能耐压又可以密闭的金属锅，有立式与卧式两种。 可以用电热、煤气、蒸汽等。锅上装有压力表，有的还装有温度计，能及时了解锅内压力及温度。锅上还设有排气口，其作用是在密闭之前，利用蒸汽将锅内的冷空气排净，另外还装有安全活门，如果压力超过一定限度，活门即可自动打开，放出过多的蒸汽。 2.干热灭菌 微生物培养中常用的干热灭菌是指热空气灭菌。一般在电烘箱中进行。干热灭菌所需温度较湿热灭菌高，时间也较湿热灭菌长。这是因为蛋白质在干燥无水的情况下不容易凝固。一般须在160℃左右保持恒温3～4小时，方能达到灭菌的目的。 干热灭菌适用于空玻璃器皿的灭菌，凡带有橡胶的物品和培养基，都不能进行干热灭菌。 3.间歇灭菌 各种微生物的营养体在100℃温度下半小时即可被杀死。而其芽孢和孢子在这种条件下却不会失去生活力。间歇灭菌就是根据这一原理进行的。 间歇灭菌的方法是用100℃、30分钟杀死培养基内杂菌的营养体，然后将这种含有芽孢和孢子的培养基在温箱内或室温下放置24小时，使芽孢和孢子萌发成为营养体。这时再以100℃处理半小时，再放置24小时。如此连续灭菌3次，即可达到完全灭菌的目的。 间歇灭菌通常在流动蒸汽的灭菌锅中进行，也可用普通铝锅代替。这种灭菌方法多用于明胶、牛乳等物质的灭菌，这类物质在100℃以上的温度下处理较长时间，会被破坏，而用间歇灭菌法就既起到了杀菌作用，又使被处理的物质免遭破坏。 4.紫外线灭菌
化学实验基本操作 一．常见物质分离操作： 1．过滤过滤是除去溶液里混有不溶于溶剂的杂质的方法。 过滤时应注意： ①一贴：将滤纸折叠好放入漏斗，加少量蒸馏水润湿，使滤纸紧贴漏斗内壁。 ②二低：滤纸边缘应略低于漏斗边缘，加入漏斗中液体的液面应略低于滤纸的边缘。 ③三靠：向漏斗中倾倒液体时，烧杯的夹嘴应与玻璃棒接触；玻璃棒的底端应和过滤器有三层滤纸处轻轻接触；漏斗颈的末端应与接受器的内壁相接触，例如用过滤法除去粗食盐中少量的泥沙。 2．蒸发蒸发是将溶液浓缩、溶剂气化或溶质以晶体析出的方法。 加热蒸发皿使溶液蒸发时、要用玻璃棒不断搅动溶液，防止由于局部温度 过高，造成液滴飞溅。当蒸发皿中出现较多的固体时，即停止加热， 3.结晶结晶是溶质从溶液中析出晶体的过程，可以用来分离和提纯几种可溶性固体的混合物。结晶的原理是根据混合物中各成分在某种溶剂里的溶解度的不同，通过蒸发减少溶剂或降低温度使溶解度变小，从而使晶体析出。例如用结晶的方法分离NaCl和KNO3混合物。 4．蒸馏蒸馏是提纯或分离沸点不同的液体混 合物的方法。用蒸馏原理进行多种混合液体的分离， 叫分馏。
操作时要注意： ①在蒸馏烧瓶中放少量碎瓷片，防止液体暴沸。 ②温度计水银球的位置应与支管底口下缘位于同一水平线上。 ③冷凝管中冷却水从下口进，从上口出。 5．分液和萃取分液是把两种互不相溶、密度也不相同的液体分 离开的方法。萃取是利用溶质在互不相溶的溶剂里的溶解度不同，用一 种溶剂把溶质从它与另一种溶剂所组成的溶液中提取出来的方法。选择 的萃取剂应符合下列要求：和原溶液中的溶剂互不相溶；对溶质的溶解 度要远大于原溶剂。 在萃取过程中要注意： ①将要萃取的溶液和萃取溶剂依次从上口倒入分液漏斗，其量不能超过漏斗容积的2/3，塞好塞子进行振荡。 ②振荡时右手捏住漏斗上口的颈部，并用食指根部压紧塞子，以左手握住旋塞，同时用手指控制活塞，将漏斗倒转过来用力振荡。 ③然后将分液漏斗静置，待液体分层后进行分液，分液时下层液体从漏斗口放出，上层液体从上口倒出。例如用四氯化碳萃取溴水里的溴。 6．升华升华是指固态物质吸热后不经过液态直接变成气态的过 程。利用某些物质具有升华的特性，将这种物质和其它受热不升华的物 质分离开来，例如加热使碘升华，来分离I2和SiO2的混合物。
几种常用的消毒方法 一、普通喷雾消毒法 指用普通喷雾器喷洒消毒液进行表面消毒的处理方法，各种农用和医用喷雾器均可应用。 1.适用范围普通喷雾消毒法适用于对物体(品)表面、室内墙面和地面、室外建筑物和帐篷表面、地面、车辆外表面、装备及植被等实施消毒。 2.使用要求先从足下喷洒，开辟无害化通道至操作端点，而后按先上后下、先左后右的顺序依次喷洒。 3.注意事项 (1)喷洒有刺激性或腐蚀性消毒剂时，消毒人员应配戴防护口罩、眼镜，穿防护服。 (2)室内喷雾时，喷前将食品、衣被及其他不需消毒的物品收叠放好，或用塑料膜覆盖防湿。 (3)室外喷雾时，消毒人员应站在上风向。 二、气溶胶喷雾消毒法
指用气溶胶喷雾器喷雾消毒液进行空气或物体表面消毒的处理方法，雾粒直径20μm以下者占90%以上。由于所喷雾粒小，浮于空气中易蒸发，可兼收喷雾和熏蒸之效。喷雾时，可使用QPQ-1型喷雾器及产生直径在20μm以下雾粒的其他喷雾器。 1．适用范围适用于对室内、坑道、车辆、帐篷内空气和物体表面实施消毒。 2．使用要求消毒前关好门窗，喷雾时，按自上而下、由左向右顺序喷雾。喷雾量以消毒剂溶液可均匀覆盖在物品表面或消毒液的雾团充满空间为度。作用30～60min 后，打开门窗通风，驱除空气中残留的消毒液的雾粒及气味。 3．注意事项同普通喷雾消毒法，特别注意防止消毒剂气溶胶进入呼吸道。 三、擦拭消毒法 指用布或其他擦拭物浸以消毒剂溶液，擦拭物体表面进行消毒的处理方法。 1.适用范围适用于对家具、办公用具、生活用具、玩具、器械、车辆和装备等物体表面,以及医院和实验室环境表面实施消毒处理。
2.使用要求消毒时，用干净的布或其他物品浸消毒剂溶液，依次往复擦拭拟消毒物品表面,作用至所用消毒剂要求的时间后，再用清水擦洗，去除残留消毒剂，以减轻可能引起的腐蚀、漂白等损坏作用。 3.注意事项 (1)不耐湿物品表面不能应用该方法实施消毒处理； (2)擦拭时应防止遗漏； (3)污物可导致消毒剂有效浓度下降，因此表面污物较多时，应适时更新消毒液，防止污物中的病原体对消毒剂溶液的污染。 四、浸泡消毒法 指将待消毒物品全部浸没于消毒剂溶液内进行消毒的处理方法。 1．适用范围用于对耐湿器械、玻璃器皿、餐(饮)具、生活用具及衣物等实施消毒与灭菌。 2．使用要求对导管类物品应使管腔内同时充满消毒剂溶液。消毒或灭菌至要求的作用时间，应及时取出消毒物品用清水或无菌水清洗，去除残留消毒剂。
常用灭菌方法简介 一、辐射灭菌法 本法系指灭菌物品置于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生 的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。本法最常用的60Co-γ射线 辐射灭菌。医疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品 等均可用本法灭菌。 采用辐射灭菌法灭菌后的产品其SAL应《10-6。γ射线辐射灭菌所控制的参数 主要是辐射剂量（指灭菌物品的吸收剂量）。该剂量的制定应考虑灭菌物品的 适应性及可能污染的微生物最大数量及最强抗辐射力，事先应验证所使用的剂 量不影响被灭菌物品的安全性、有效性及稳定性。常用的辐射灭菌吸收剂量为 25KGy。对最终产品、原料药、某些医疗器材应尽可能采用低辐射 剂量灭菌。灭 菌前，应对被灭菌物品微生物污染的数量和抗辐射强度进行测定，以评价灭菌 过程赋予该灭菌物品的无菌保证水平。 灭菌时，应采用适当的化学或物理方法对灭菌物品吸收的辐射剂量进行监控， 以充分证实灭菌物品吸收的剂量是在规定的限度内。如采用 与灭菌物品一起被 辐射的放射性剂量计，剂量计要置于规定的部位。在初安装时剂量计应用标准 源进行校正，并定期进行再校正。 60Co-γ射线辐射灭菌法常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus pumilus)。 二、干热灭菌法 本法系指将物品置于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中，利用干热空气 达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法 灭菌的物品灭菌，如玻璃器具、金属材质容器、纤维制品、固体试药、液状 石蜡等均可采用本法灭菌。 干热灭菌条件一般为160~170℃*120min以上、170~180℃*60min以上或250℃*45min 以上，也可采用其他温度和时间参数。应保证物品灭菌后的SAL《10-6。干热 过度杀灭后物品的SAL应《10-12，此时物品一般无需进行灭菌前污染微生物的 测定。250℃*45min的干热灭菌也可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用具 中的热原物质。 采用干热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列过密，以保证
实验室常用的基本操作 玻璃仪器的基本操作 1、认领仪器按照仪器单领取和认识基础化学实验中的常用仪器。
2、玻璃仪器的洗涤
（1）震荡水洗 （2）内壁附有不易洗掉的物质，可用毛刷刷洗 倒废液——注入一半水——选好毛刷，确定手拿部位刷洗——如是反复 （3）刷洗后，再用水连续振荡数次，必要时还应用蒸馏水淋洗三次洗净状态下，水均匀分布不挂水珠（如左图所示）； 未洗净状态下，器壁挂着水珠（如右图所示）。玻璃仪器里如附有不溶于水的碱、碳酸盐、碱性氧化物等可先加盐酸溶解，再用水冲洗；附有油脂等污物可先用热的纯碱液洗，然后用毛刷刷洗，也可用毛刷蘸少量洗衣粉刷洗；对于口小、管细的仪器，不便用刷子洗，可用少量王水或重铬酸盐洗液涮洗；用以上方法清洗不掉的污物可用较多王水或洗液浸泡，然后用水涮洗。（ (1)不要未倒废液就注水 (2)不要几支试管一起刷） 3、仪器的干燥 （1）晾干（左图）与烤干（右图）
（2）吹干（左图）与烘干（右图） （3）气流烘干（左图）与快干（右图） 4、常见玻璃仪器的使用 （1）量筒与量杯 （2）移液管 移液管使用注意事项： 应根据不同的需要选用大小合适的移液管，如取1.5ml的溶液，显然选用2ml移液管要比选用5ml移液管误差小；吸取溶液时要把移液管插入溶液，避免吸入空气而将溶液从上端
溢出；移液管从液体中移出后必须用滤纸将管的外壁擦干，再行放液；不可用移液管直接从瓶中移取溶剂或溶液，剩余溶剂或溶液不可倒回贮液瓶，应作废弃物处理。 （2）滴定管 操作步骤：洗涤——涂凡士林——检漏——装入操作液——滴定管排气——滴定操作 （3）容量瓶 容量瓶使用前应检查容量瓶的瓶塞是否漏水，合格的瓶塞应系在瓶颈上，不得任意更换。容量瓶刻度以上的内壁挂有水珠会影响准确度，所以应该洗得很干净。称量的任何固体物质必须先在小烧杯中溶解或加热溶解，冷却至室温后才能转移到容量瓶中。容量瓶绝不应加热或烘干。容量瓶定容完再翻转摇匀，若翻转摇匀后定容，会因加的水或溶剂过多，导致溶液浓度偏小。
健康教育资料 家庭常用消毒知识 随着生活水平的提高，人们健康意识逐步增强，越来越多的人们开始注重家庭的消毒卫生，消毒剂也逐渐走进人们的日常生活。然而由于一些人对消毒剂的性能和危害不甚了解，在实际应用过程中，达不到真正的消毒效果，甚至出现个别人误服误用消毒剂而出现意外伤害事例的发生。因此，开展家用消毒剂的宣传教育十分必要。 一、家庭消毒原则 1、一般情况下，家庭只需要清洁卫生，无须进行消毒； 当家中出现病人时，尤其是传染病病人时，或者外人来访后，才有必要进行消毒。 2、对于一般家庭,在选择消毒方法时应尽量选用物理消毒的方法,如蒸煮、暴晒。餐具消毒宜首选煮沸消毒,或者消毒柜。衣物、被褥主要采用在阳光下曝晒的方法。室内空气消毒主要采取定期开窗通风。洗手时,如果没有接触患者,使用普通肥皂和流动水即可。 3、对经常接触的物体表面，如门把手、楼梯扶手、脚垫、水龙头等重点部位进行消毒，不要全房大面积喷洒消毒剂。 4、对于洗脸面盆和座便器，只需要对表面适量喷洒消毒，消毒后用大量自来水冲洗，否则会腐蚀管网；地漏及下水道,不
要专门加消毒剂消毒,因为对地漏或下水道消毒通常起不到消毒防病的目的,还会腐蚀管网,带来后患。 5、不要遗漏重点物品的消毒，如洗碗布，由于使用频繁，经常处于湿润状态，而且接触饭菜等有机物比较多，十分有利于细菌的滋生，因此应经常暴晒、煮沸消毒。 6.宠物的窝巢应经常进行消毒。 二、家庭用消毒剂选用原则 1、选择合适的消毒剂。根据消毒剂杀灭微生物的能力，我国把消毒剂分为灭菌剂、高水平消毒剂、中水平消毒剂和低水平消毒剂。消毒剂杀菌能力越强，相应对人体的危害也越强；一般家庭中没有病人时，也就没有很明显的致病微生物，选用中水平或低水平消毒剂就可以了，如75%酒精，0.5%碘伏等。84消毒液为高水平消毒剂，由于浓度相对较低，为家庭常用消毒剂。 2.选择安全的消毒剂。“安全”至少包括三个含义：对人体健康安全，对消毒对象安全，对环境安全。绝大多数消毒剂对人体的皮肤、眼睛、呼吸道均有程度不同的刺激性和腐蚀性,还可以引起过敏反应,甚至造成急性中毒；有些消毒剂的氧化能力很强，会使金属腐蚀、橡胶老化、织物褪色，购买时应详细阅读说明书，重点了解注意事项的内容，根据需要消毒对象的特性选择消毒剂。为安全起见，甲醛、戊二醛、漂白粉、漂白粉精、优氯净、过氧乙酸、高浓度的过氧化氢不适宜家用。 3.选择有效的消毒剂。很多消毒剂不稳定，存放一定时期后，