多重序列比对及系统发生树的构建
【实验目的】
1、熟悉构建分子系统发生树的基本过程，获得使用不同建树方法、建树材料和建树参数对建树结果影响的正确认识；
2、掌握使用Clustalx进行序列多重比对的操作方法；
3、掌握使用Phylip软件构建系统发生树的操作方法。
【实验原理】
在现代分子进化研究中，根据现有生物基因或物种多样性来重建生物的进化史是一个非常重要的问题。一个可靠的系统发生的推断，将揭示出有关生物进化过程的顺序，有助于我们了解生物进化的历史和进化机制。
对于一个完整的进化树分析需要以下几个步骤：⑴ 要对所分析的多序列目标进行比对（alignment）。
⑵ 要构建一个进化树（phyligenetic tree）。构建进化树的算法主要分为两类：独立元素法（discrete character methods）和距离依靠法（distance methods）。所谓独立元素法是指进化树的拓扑形状是由序列上的每个碱基/氨基酸的状态决定的（例如：一个序列上可能包含很多的酶切位点，而每个酶切位点的存在与否是由几个碱基的状态决定的，也就是说一个序列碱基的状态决定着它的酶切位点状态，当多个序列进行进化树分析时，进化树的拓扑形状也就由这些碱基的状态决定了）。而距离依靠法是指进化树的拓扑形状由两两序列的进化距离决定的。进化树枝条的长度代表着进化距离。独立元素法包括最大简约性法（M aximum Parsimony methods）和最大可能性法（Maximum Likelihood methods）；距离依靠法包括除权配对法（UPGMAM）和邻位相连法（Neighbor-joining）。⑶ 对进化树进行评估，主要采用Bootstraping法。进化树的构建是一个统计学问题，我们所构建出来的进化树只是对真实的进化关系的评估或者模拟。如果我们采用了一个适当的方法，那么所构建的进化树就会接近真实的"进化树"。模拟的进化树需要一种数学方法来对其进行评估。不同的算法有不同的适用目标。一般来说，最大简约性法适用于符合以下条件的多序列：i 所要比较的序列的碱基差别小，ii 对于序列上的每一个碱基有近似相等的变异率，iii 没有过多的颠换/转换的倾向，iv 所检验的序列的碱基数目较多（大于几千个碱基）；用最大可能性法分析序列则不需以上的诸多条件，但是此种方法计算极其耗时。如果分析的序列较多，有可能要花上几天的时间才能计算完毕。UPGMAM（Unweighted pair group method with arithmetic mean）假设在进化过程中所有核苷酸/氨基酸都有相同的变异率，也就是存在着一个分子钟。这种算法得到的进化树相对来说不是很准确，现在已经很少使用。邻位相连法是一个经常被使用的算法，它构建的进化树相对准确，而且计算快捷。其缺点是序列上的所有位点都被同等对待，而且，所分析的序列的进化距离不能太大。另外，需要特别指出的是对于一些特定多序列对象来说可能没有任何一个现存算法非常适合它。
CLUSTALX和PHYLIP软件能够实现上述的建树步骤。CLUSTALX是Windows界面下的多重序列比对软件。PH YLIP是多个软件的压缩包，功能极其强大，主要包括五个方面的功能软件：i，DNA和蛋白质序列数据的分析软件。ii，序列数据转变成距离数据后，对距离数据分析的软件。 iii，对基因频率和连续的元素分析的软件。iv，把序列的每个碱基/氨基酸独立看待（碱基/氨基酸只有0和1的状态）时，对序列进行分析的软件。v，按照DOLLO简约性算法对序列进行分析的软件。vi，绘制和修改进化树的软件。
【实验内容】
1、使用CLUSTALX软件对已知八条DNA序列（如下）进行多重序列比对；M._mulatta AAGCTTTTCT GGCGCAACCA TCCTCATGAT TGCTCACGGA CTCACCTCTT M._fascicu AAGCTTCTCC GGCGCAACCA CCCTTATAAT CGCCCACGGG CTCACCTCTT M._sylvanu AAGCTTCTCC GGTGCAACTA TCCTTATAGT TGCCCATGGA CTCACCTCTT Homo_sapie AAGCTTCACC GGCGCAGTCA TTCTCATAAT CGCCCACGGG CTTACATCCT Gorilla AAGCTTCACC GGCGCAGTTG TTCTTATAAT TGCCCACGGA CTTACATCAT Pongo AAGCTTCACC GGCGCAACCA CCCTCATGAT TGCCCATGGA CTCACATCCT Saimiri_sc AAGCTTCACC GGCGCAATGA TCCTAATAAT CGCTCACGGG TTTACTTCGT Lemur_catt AAGCTTCATA GGAGCAACCA TTCTAATAAT CGCACATGGC CTTACATCAT
2、使用PHYLIP 软件包构建上述DNA分子系统发生树。
【实验方法】
一、用CLUSTALX软件对已知DNA序列做多序列比对。
操作步骤：
1、以FASTA格式准备8个DNA序列test.seq（或txt）文件。
2、双击进入CLUSTALX程序，点FILE进入LOAD SEQUENCE，打开test.seq（或txt）文件。
3、点ALIGNMENT，在默认alignment parameters下，点击Do complete Alignment 。在新出现的窗口中点击ALIGN进行比对，这时输出两个文件（默认输出文件格式为Clustal格式）：比对文件test.aln和向导树文件test.dnd。
4、点FILE进入Save sequence as,在format 框中选PHYLIP，文件在PHYLIP软件目录下以test.phy存在，点击OK。
5、将PHYLIP软件目录下的test.phy文件拷贝到EXE文件夹中。用计事本方式打开的test.phy文件的部分序列如下：
图中的8和50分别表示8个序列和每个序列有50个碱基。
二、用PHYLIP软件推导进化树。
1、进入EXE文件夹，点击SEQBOOT软件输入test.phy文件名，回车。
图中的D、J、R、I、O、1、2代表可选择的选项，键入这些字母，程序的条件就会发生改变。D选项无须改变。J选项有三种条件可以选择，分别是Bootstrap、Jackknife和Permute。文章上面提到用Bootstra ping法对进化树进行评估，所谓Bootstraping法就是从整个序列的碱基（氨基酸）中任意选取一半，剩下的一半序列随机补齐组成一个新的序列。这样，一个序列就可以变成了许多序列。一个多序列组也就可以变成许多个多序列组。根据某种算法（最大简约性法、最大可能性法、除权配对法或邻位相连法）每个多序列组都可以生成一个进化树。将生成的许多进化树进行比较，按照多数规则（majority-rule）我们就会得到一个最"逼真"的进化树。Jackknife则是另外一种随机选取序列的方法。它与Bootstrap法的区别是不将剩下的一半序列补齐，只生成一个缩短了一半的新序列。Permute是另外一种取样方法，其目的与B ootstrap和Jackknife法不同，这里不再介绍。R选项让使用者输入republicate的数目。所谓republic ate就是用Bootstrap法生成的一个多序列组。根据多序列中所含的序列的数目的不同可以选取不同的re publicate，此处选200，输入Y确认参数并在Random number seed (must be odd) ?的下面输入一个奇数（比如3）。当我们设置好条件后按回车，程序开始运行，并在EXE文件夹中产生一个文件outfile，Out file用记事本打开如下：
这个文件包括了200个republicate。
2、文件outfile改为infile。点击DNADIST程序。选项M是输入刚才设置的republicate的数目，输入D选择data sets，输入200。
设置好条件后，输入Y确认参数。程序开始运行，并在EXE文件夹中产生outfile，部分内容如下：
将outfile文件名改为infile，为避免与原先infile文件重复，将原先文件名改为infile1。
3、EXE文件夹中选择通过距离矩阵推测进化树的算法，点击NEIGHBOR程序。输入M更改参数，输入D选择data sets。输入200。输入奇数种子3。
输Y确认参数。程序开始运行，并在EXE文件夹中产生outfile和outtree两个结果输出。outtree文件是一个树文件，可以用treeview等软件打开。outfile是一个分析结果的输出报告，包括了树和其他一些分析报告，可以用记事本直接打开。部分内容如下：
4、将outtree文件名改为intree，点击DRAWTREE程序，输入font1文件名，作为参数。输Y确认参数。程序开始运行，并出现Tree Preview图。
5、点击DRAWGRAM程序，输入font1文件名，作为参数。输Y确认参数。程序开始运行，并出现Tree Pre view图。
6、将EXE文件夹中的outfile文件名改为outfile1，以避免被新生成的outfile 文件覆盖。点击CONSEN SE程序。输入Y确认设置。EXE文件夹中新生成outfile和outtree。Outfile文件用记事本打开，内容如下：
7 、将EXE文件夹中的intree文件名改为intree1，将outtree改intree。点击DRAWTREE程序，输入fo nt1文件名，作为参数。输Y确认参数。程序开始运行，并出现Tree Preview图。
8、点击DRAWGRAM程序，输入font1文件名，作为参数。输Y确认参数。程序开始运行，并出现Tree Pre view图。
如何建树 step 1. 将16S rDNA序列在NCBI上进行BLAST比对(https://www.doczj.com/doc/c24615818.html,/BLAST/) BLAST是目前常用的数据库搜索程序，它是Basic Local Alignment Search Tool的缩写，意为“基本局部相似性比对搜索工具”(Altschul et al.,1990 [62];1997[63])。国际著名生物信息中心都提供基于Web的BLAST服务器。BLAST算法的基本思路是首先找出检测序列和目标序列之间相似性程度最高的片段，并作为内核向两端延伸，以找出尽可能长的相似序列片段。首先登录到提供BLAST服务的常用网站，比如国内的CBI、美国的NCBI、欧洲的EBI和日本的DDBJ。这些网站提供的BLAST服务在界面上差不多，但所用的程序有所差异。它们都有一个大的文本框，用于粘贴需要搜索的序列。把序列以FASTA格式(即第一行为说明行，以“>”符号开始，后面是序列的名称、说明等，其中“>”是必需的，名称及说明等可以是任意形式，换行之后是序列)粘贴到那个大的文本框，选择合适的BLAST程序和数据库，就可以开始搜索了。如果是DNA序列，一般选择BLASTN搜索DNA数据库。这里以NCBI为例。登录NCBI主页-点击BLAST-点击Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)-在Search文本框中粘贴检测序列-点击BLAST!-点击Format-得到result of BLAST。BLASTN结果如何分析(参数意义)： 例如： >gi|28171832|gb|AY155203.1| Nocardia sp. ATCC 49872 16S ribosomal RNA gene, complete sequence Score = 2020 bits (1019), Expect = 0.0 Identities = 1382/1497 (92%), Gaps = 8/1497 (0%) Strand = Plus / Plus Query: 1 gacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgagcggaaaggccctttcgggggt 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| ||||| Sbjct: 1 gacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgagcggtaaggcccttc--ggggt 58 Query: 61 actcgagcggcgaacgggtgagtaacacgtgggtaacctgccttcagctctgggataagc 120 || ||||||||||||||||||||||||||||||| | |||||| ||||||||||||| Sbjct: 59 acacgagcggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgatctgcctcgtactctgggataagc 118 其中，Score指的是提交的序列和搜索出的序列之间的分值，越高说明越相似。Expect指的是比对的期望值。比对越好，expect越小，一般在核酸层次的比对，expect小于1e-10，就比对很好了，多数情况下为0。Identities指的是提交的序列和参比序列的相似性，如上所指为1497个核苷酸中二者有1382个相同。Gaps指的是一般翻译成空位，指的是对不上的碱基数目。Strand指的是链的方向，Plus / Minus意味着提交的序列和参比序列是反向互补的，如果是Plus / Plus则二者皆为正向。 挑选与目的菌株具有较近亲源关系的模式种（type strain）序列将这些序列用记事本保存成dna.seq文件。 >M.mulatta AAGCTTTTCT GGCGCAACCA TCCTCATGAT >M.fascicularis AAGCTTCTCC GGCGCAACCA CCCTTA TAA T step 2. 用CLUSTALX对已知DNA序列做多序列比对 1 双击clustalx.exe运行程序。 2 点File→Load Sequence，打开dna.seq。
【转载】分子进化树构建及数据分析的简介 分子进化树构建及数据分析的简介 mediocrebeing, rodger, lylover[1], klaus, oldfish, yzwpf [1] lylover. Email: lylover_2005@https://www.doczj.com/doc/c24615818.html, 一、引言 开始动笔写这篇短文之前，我问自己，为什么要写这样的文章？写这样的文章有实际的意义吗？我希望能够解决什么样的问题？带着这样的疑惑，我随手在丁香园（DXY）上以关键字“进化分析求助”进行了搜索，居然有289篇相关的帖子（2006年9月12日）。而以关键字“进化分析”和“进化”为关键字搜索，分别找到2,733和7,724篇相关的帖子。考虑到有些帖子的内容与分子进化无关，这里我保守的估计，大约有3,000~4,000篇帖子的内容，是关于分子进化的。粗略地归纳一下，我大致将提出的问题分为下述的几类：1．涉及基本概念。例如，“分子进化与生物进化是不是一个概念”，“关于微卫星进化模型有没有什么新的进展”以及“关于Kruglyak的模型有没有改进的出现”，等等。 2．关于构建进化树的方法的选择。例如，“用boostrap NJ得到XX图，请问该怎样理解？能否应用于文章？用boostrap test中的ME法得到的是XXX树，请问与上个树比，哪个更好”，等等。 3．关于软件的选择。例如，“想做一个进化树，不知道什么软件能更好的使用且可以说明问题，并且有没有说明如何做”，“拿到了16sr RNA数据，打算做一个系统进化树分析，可是原来没有做过这方面的工作啊，都要什么软件”，“请问各位高手用clustalx做出来的进化树与phylip做的有什么区别”，“请问有做过进化树分析的朋友，能不能提供一下，做树的时候参数的设置，以及代表的意思。还有各个分支等数值的意思，说明的问题等”，等等。 4．蛋白家族的分类问题。例如，“搜集所有的关于一个特定domain的序列，共141条，做的进化树不知具体怎么分析”，等等。 5．新基因功能的推断。例如，“根据一个新基因A氨基酸序列构建的系统发生树，这个进化树能否说明这个新基因A和B同源，属于同一基因家族”，等等。 6．计算基因分化的年代。例如，“想在基因组水平比较两个或三个比较接近物种之间的进化年代的远近，具体推算出他们之间的分歧时间”，“如何估计病毒进化中变异所需时间”，等等。 7．进化树的编辑。例如生成的进化树图片，如何进行后续的编辑，比如希望在图片上标注某些特定的内容，等等。 由于相关的帖子太多，作者在这里对无法阅读全部的相关内容而致以歉意。同时，作者归纳的这七个问题也并不完全代表所有的提问。对于问题1所涉及到的基本的概念，作者推荐读者可参考由Masatoshi Nei与Sudhir Kumar所撰写的《分子进化与系统发育》（Molecular Evolution and Phylogenetics）一书，以及相关的分子进化方面的最新文献。对于问题7，作者之一lylover一般使用Powerpoint 进行编辑，而Photoshop、Illustrator及Windows自带的画图工具等都可以使用。
系统发生树构建的步骤一般有下面几步: I,对文件10.8\protein sequence 的序列进行多序列比对,一般用clustalx/w软件完成.这里我们用软件BioEdit内置的clustalw来做多序列比对; II,对clustalw产生的多序列比对文件进行修剪,去掉比对后相似序列中没有对应的序列，前后全部对齐; III,将修剪后的多序列比对文件转换成系统发生软件所需的文件格式并保存.这里我们是采用mega来做系统发生树的,所以须将修剪后的多序列比对文件转成.meg的文件格式; IV,用系统发生软件构树(采用多种方法UPGMA,N-J, Maximum likelihood等); 具体做法如下: ①将protein sequence 的序列文件导入到BioEdit中做多序列比对,这里有好几种做法: a,将所有的序列文件全部保存在一个txt文件中,然后用BioEdit打开;(该方法比较麻烦) b,用DNASTAR中的Editseq工具将所有文件打开,然后用File菜单中Export all as one…按钮将所有的单蛋白质序列文件保存成一个多蛋白质序列文件,文件格式为.fasta c,直接用BioEdit中File>new alignment>import>sequences alignment file(这里需要注意的是在导入序列文件时要将导入文件的类型选为All Files否则BioEdit将默认显示phy, gb, aln等文件而看不到其他文件);(推荐) 导入后如图:
alignment，如下图： 比对后产生文件,其序列如下:
③对clustalw产生的多序列比对文件进行修剪, 去掉比对后相似序列中没有对应的序列，前后全部对齐,可以直接用BioEdit的edit mode来做也可以用mega5>align>edit/build alignment来做这里采用后者; format来导出文件,其文件内容如图:
构建系统发育树需要注意的几个问题 1 相似与同源的区别：只有当序列是从一个祖先进化分歧而来时，它们才是同源的。 2 序列和片段可能会彼此相似，但是有些相似却不是因为进化关系或者生物学功能相近的缘故，序列组成特异或者含有片段重复也许是最明显的例子；再就是非特异性序列相似。 3 系统发育树法：物种间的相似性和差异性可以被用来推断进化关系。 4 自然界中的分类系统是武断的，也就是说，没有一个标准的差异衡量方法来定义种、属、科或者目。 5 枝长可以用来表示类间的真实进化距离。 6 重要的是理解系统发育分析中的计算能力的限制。任何构树的实验目的基本上就是从许多不正确的树中挑选正确的树。 7 没有一种方法能够保证一颗系统发育树一定代表了真实进化途径。然而，有些方法可以检测系统发育树检测的可靠性。第一，如果用不同方法构建树能得到同样的结果，这可以很好的证明该树是可信的；第二，数据可以被重新取样(bootstrap)，来检测他们统计上的重要性。 分子进化研究的基本方法 对于进化研究，主要通过构建系统发育过程有助于通过物种间隐含的种系关系揭示进化动力的实质。 表型的(phenetic)和遗传的(cladistic)数据有着明显差异。Sneath和Sokal(1973)将表型性关系定义为根据物体一组表型性状所获得的相似性，而遗传性关系含有祖先的信息，因而可用于研究进化的途径。这两种关系可用于系统进化树(phylogenetictree)或树状图(dendrogram)来表示。表型分枝图(phenogram)和进化分枝图(cladogram)两个术语已用于表示分别根据表型性的和遗传性的关系所建立的关系树。进化分枝图可以显示事件或类群间的进化时间，而表型分枝图则不需要时间概念。文献中，更多地是使用“系统进化树”一词来表示进化的途径，另外还有系统发育树、物种树(species tree)、基因树等等一些相同或含义略有差异的名称。 系统进化树分有根(rooted)和无根(unrooted)树。有根树反映了树上物种或基
如何构建系统发育树 Bioinformatics2009-11-03 10:45 阅读159 评论0 字号：大中小小 (2009-06-11 22:44:13) 标签：系统发育树构建系统发育树分子生物学发育分析it 转自丁香园 构建系统发育树需要注意的几个问题 1 相似与同源的区别：只有当序列是从一个祖先进化分歧而来时，它们才是同源的。 2 序列和片段可能会彼此相似，但是有些相似却不是因为进化关系或者生物学功能相近的缘故，序列组成特异或者含有片段重复也许是最明显的例子；再就是非特异性序列相似。 3 系统发育树法：物种间的相似性和差异性可以被用来推断进化关系。 4 自然界中的分类系统是武断的，也就是说，没有一个标准的差异衡量方法来定义种、属、科或者目。 5 枝长可以用来表示类间的真实进化距离。 6 重要的是理解系统发育分析中的计算能力的限制。任何构树的实验目的基本上就是从许多不正确的树中挑选正确的树。 7 没有一种方法能够保证一棵系统发育树一定代表了真实进化途径。然而，有些方法可以检测系统发育树检测的可靠性。第一，如果用不同方法构建树能得到同样的结果，这可以很好的证明该树是可信的；第二，数据可以被重新取样，来检测他们统计上的重要性。 分子进化研究的基本方法 对于进化研究，主要通过构建系统发育过程有助于通过物种间隐含的种系关系揭示进化动力的实质。 表型的(phenetic)和遗传的(cladistic)数据有着明显差异。Sneath和Sokal(1973)将表型性关系定义为根据物体一组表型性状所获得的相似性，而遗传性关系含有祖先的信息，因而可用于研究进化的途径。这两种关系可用于系统进化树(phylogenetictree)或树状图(dendrogram)来表示。表型分枝图(phenogram)和进化分枝图(cladogram)两个术语已用于表示分别根据表型性的和遗传性的关系所建立的关系树。进化分枝图可以显示事件或类群间的进化时间，而表型分枝图则不需要时间概念。文献中，更多地是使用“系统进化树”一词来表示进化的途径，另外还有系统发育树、物种树(speciestree)、基因树等等一些相同或含义略有差异的名称. 系统进化树分有根(rooted)和无根(unrooted)树。有根树反映了树上物种或基因的时间顺序，而无根树只反映分类单元之间的距离而不涉及谁是谁的祖先问题。 用于构建系统进化树的数据有二种类型：一种是特征数据(characterdata)，它提供了基因、个体、群体或物种的信息；二是距离数据(distancedata)或相似性数据(similaritydata)，它涉及的则是成对基因、个体、群体或物种的信息。距离数据可由特征数据计算获得，但反过来则不行。这些数据可以矩阵的形式表达。距离矩阵(distancematrix)是在计算得到的距离数据基础上获得的，距离的计算总体上是要依据一定的遗传模型，并能够表示出两个分类单位间的变化量。系统进化树的构建质量依赖于距离估算的准确性。 一1) 打开clustal X，载入上述序列，“load sequences”→“output format options”： “CLASTAL FORMA T”;CLASTAL SEQUENCES NUMBERS:ON; ALIGNMENT PARAMETERS: “RESET NEW GAPS BEFOR ALIGNMENT” “MULTIPLE ALIGNMENT PARAMETERS”→设置相关参数 2) “DO COMPLETE ALIGNMENT”→FILE→SA VE AS,掐头去尾。 3) 打开MEGA4,FILE→CONVERT TO MEGA FORMA TE→SA VE→FILE→OPEN DA TA→CONTAINING PROTAIN SEQUENCES? NO →PHYLOGENY→BOOTSTRAP TEST OF PHYLOGENY→N J → 设置相关参数。最后看到系统发育树 二这里要介绍的是Bioedit-Mega建树法，简单实用，极易上手。 1 将所测得的序列在NCBI上进行比对，这个就不多讲了。 2 选取序列保存为text格式。 3 运行Bioedit，使用其中的CLUSTAL W进行比对。 4 运用MEGA 4 建树，首先将前面的文件转化格式为mega格式，然后进行激活，最后进行N-J建树。
简单步骤 1 序列的比对，然后将比对好的序列转化成.nex格式 2 运行MrBayes，简单步骤如下：（依次输入命令，完成简单也最常用的分析）：Execute filename.nex，打开待分析文件，文件必须和mrbayes程序在同一目录下。Lset nst=6 rates=invgamma，该命令设置进化模型为with gamma-distributed rate variation across sites和a proportion of invariable sites的GTR模型。模型可根据需要更改，不过一般无须更改。 3 mcmc ngen=10000 samplefreq=10，保证在后面的可能性分布中probability distribution至少取到1000个样品。默认取样频率：every 100th generation。 4 如果分裂频率分支频率split frequencies的标准偏差standard deviation在100,000代generations以后低于0.01，当程序询问：“Continue the analysis?(yes/no)”，回答no；如果高于0.01，yes继续直到该值低于0.01。 5 sump burnin=250（在此为1000个样品，即任何相当于你取样的25％的值），参数总结summarize the parameter，程序会输出一个关于样品（sample）的替代模型参数的总结表，包括mean，mode和95 % credibility interval of each parameter，要保证所有参数PSRF（the potential scale reduction factor）的值接近1.0，如果不接近，分析时间要延长。 6 sumt burnin=250，总结树summarize tree。程序会输出一个具有每一个分支的posterior probabilities的树以及一个具有平均枝长mean branch lengths的树。这些树会被保存在一个可以由treeview等读取的树文件中。
1．准备序列文件 准备fasta格式序列文件（fasta格式：大于号>后紧跟序列名，换行后是序列。举例如下）。每条序列可以单独为一个文件，也可以把所有序列放在同一文件内。 核酸序列： >sequence1_name CCTGGCTCAGGATGAACGCT 氨基酸序列： >sequence2_name MQSPINSFKKALAEGRTQIGF 2．多序列比对 打开MEGA 5，点击Align，选择Edit/Build Alignment，选择Create a new alignment，点击OK。
这时需要选择序列类型，核酸（DNA）或氨基酸（Protein）。 选择之后，在弹出的窗口中直接Ctrl + V粘贴序列（如果所有序列在同一个文件中，即可全选序列，复制）。也可以：点击Edit，选择Insert Sequence From File，选择序列文件（可多选）。
序列文件加载之后，呈蓝色背景（为选中状态）。点击按钮，选择Align DNA （如果是氨基酸序列，则会出现Align Protein）。弹出的窗口中设置比对参数，一般都是采用默认参数即可。点击OK，开始多序列比对。
比对完成后，呈现以下状态。 这时需要截齐两端含有---的序列：选中含有---的序列，按键Delete删除（注意：两端都需要截齐）。截齐之后，保存文件为：filename.mas
3．构建系统进化树 多序列比对窗口，点击Data，选择Phylogenetic Analysis，弹出窗口询问：所用序列是否编码蛋白质，根据实际情况选择Yes或No。此时，多序列比对文件就激活了，可以返回MEGA 5主界面建树了。
系统发生树构建和分析 姓名________ 学号______________ 分组编号_____ 日期________年___月___日 1.参阅ABC网站有关资料，查阅相关文献，说明以下基本概念 1)分子演化和系统发生 2)序列相似性（Similarity）和序列同源性（Homology） 3)直系同源（Ortholog）和旁系同源（Paralog） 4)核苷酸替换模型和氨基酸替换模型 5)突变速率和分子钟 6)进化分支树（Cladogram）和系统发生树（Phylogram） 7)基因树和物种树 8)无根树和有根树 9)分支和节点 10)内部节点和外部节点 11)根节点和叶节点 12)距离法和位点法 13)最大简约法和最大似然法 2.参阅ABC网站中有关资料，查阅相关文献，回答以下问题 1)构建系统发生树的基本步骤 2)构建系统发生树时选择核苷酸序列或氨基酸序列的原则 3)利用自举法（Bootstrap）检验系统发生树稳定性的原理 4)确定无根树根节点的方法 5)如何通过所构建的系统发生树判断“先有物种”还是“先有基因” 6)不同建树方法的基本原理和特点 3.人珠蛋白基因家族系统发生树实例 1)以人珠蛋白基因家族12个成员蛋白质序列，用MEGA邻接法构建系统发生树；选 择不同氨基酸替换模型（Substitution Model），比较所构建的系统发生树的拓扑结 构和稳定性值（Bootstrap value），说明不同替换模型对结果的影响。 2)以人珠蛋白基因家族12个成员编码区序列，用MEGA 邻接法构建系统发生树；， 选择不同核苷酸替换模型，比较所构建的系统发生树的拓扑结构和稳定性值 （Bootstrap value），说明不同替换模型对结果的影响。 3)根据所构建的系统发生树，参阅Burmester 和Hardision论文，说明人珠蛋白基因 家族12个成员之间的演化关系。 4.人、小鼠和大鼠三个物种珠蛋白家族系统发生树实例 1)以人、小鼠和大鼠三个物种珠蛋白家族37个成员编码区序列，采用邻接法、最大 简约法和最大似然法构建系统发育树，选择适当的替换模型和参数，比较采用不同 方法、不同模型和不同参数时所构建的系统发生树的拓扑结构和稳定性值。 2)根据上述人、小鼠和大鼠三个物种珠蛋白家族37个成员编码区序列系统发生树， 参阅相关文献，说明珠蛋白基因家族的起源和演化。 5.血红蛋白alpha亚基系统发生树实例 1)从脊椎动物中选取若干代表性物种，根据传统分类学知识，描述它们之间的系统发 生关系，用MEGA软件中User Tree/Display Newick trees绘制系统发生树。 2)从UniProt中提取上述代表性物种的血红蛋白alpha亚基氨基酸序列，用MEGA 构 建系统发生树；选择适当的方法、模型和参数，以获得稳定性较好的系统发生树。
1.MEGA构建系统进化树的步骤 2.CLUSTALX进行序列比对 1.MEGA构建系统进化树的步骤 1. 将要用于构建系统进化树的所有序列合并到同一个fasta格式文件，注意：所有序列的方向都要保持一致( 5’-3’)。如图： 2. 打开MEGA软件，选择"Alignment" - "Alignment Explorer/CLUSTAL"，在对话框中选择Retrieve sequences from a file, 然后点OK，找到准备好的序列文件并打开，如图： 。 3. 在打开的窗口中选择”Alignment”-“Align by ClustalX” 进行对齐，对齐过程需要一段时间，对齐完成后，最好将序列两端切齐，选择两端不齐的部分，
单击右键，选择delete即可，如图： 。 4. 关闭当前窗口，关闭的时候会提示两次否保存，第一次无所谓，保存不保存都可以，第二次一定要保存，保存的文件格式是.meg。根据提示输入Title，然后会出现一个对话框询问是否是Protein-coding nucleotide sequence data, 根据情况选择Yes或No。最后出现一个对话框询问是否打开，选择Yes，如图： 。 5. 回到MEGA主窗口，在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” -“Neighbor-joining”，打开一个窗口，里面有很多参数可以设
置，如何设置这些参数请参考详细的MEGA说明书，不会设置就暂且使用默认值，不要修改，点击下面的Compute按钮，系统进化树就画出来了，如图： 在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” –“Minimun-evolution”,如图： 在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” –“Maximun-parsimony”,如图： 在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” –“UPGMA”，
多重序列比对及系统发生树的构建 作者：佚名来源：生物秀时间：2007-12-31 【实验目的】 1、熟悉构建分子系统发生树的基本过程，获得使用不同建树方法、建树材料和建树参数对建树结果影响的正确认识； 2、掌握使用Clustalx进行序列多重比对的操作方法； 3、掌握使用Phylip软件构建系统发生树的操作方法。 【实验原理】 在现代分子进化研究中，根据现有生物基因或物种多样性来重建生物的进化史是一个非常重要的问题。一个可靠的系统发生的推断，将揭示出有关生物进化过程的顺序，有助于我们了解生物进化的历史和进化机制。 对于一个完整的进化树分析需要以下几个步骤：⑴要对所分析的多序列目标进行比对（alignment）。⑵要构建一个进化树（phyligenetic tree）。构建进化树的算法主要分为两类：独立元素法（discrete character methods）和距离依靠法（distance methods）。所谓独立元素法是指进化树的拓扑形状是由序列上的每个碱基/氨基酸的状态决定的（例如：一个序列上可能包含很多的酶切位点，而每个酶切位点的存在与否是由几个碱基的状态决定的，也就是说一个序列碱基的状态决定着它的酶切位点状态，当多个序列进行进化树分析时，进化树的拓扑形状也就由这些碱基的状态决定了）。而距离依靠法是指进化树的拓扑形状由两两序列的进化距离决定的。进化树枝条的长度代表着进化距离。独立元素法包括最大简约性法（Maximum Parsimony methods）和最大可能性法（Maximum Likelihood methods）；距离依靠法包括除权配对法（UPGMAM）和邻位相连法（Neighbor-joining）。⑶对进化树进行评估，主要采用Bootstraping法。进化树的构建是一个统计学问题，我们所构建出来的进化树只是对真实的进化关系的评估或者模拟。如果我们采用了一个适当的方法，那么所构建的进化树就会接近真实的“进化树”。模拟的进化树需要一种数学方法来对其进行评估。不同的算法有不同的适用目标。一般来说，最大简约性法适用于符合以下条件的多序列：i 所要比较的序列的碱基差别小，ii 对于序列上的每一个碱基有近似相等的变异率，iii 没有过多的颠换/转换的倾向，iv 所检验的序列的碱基数目较多（大于几千个碱基）；
分子进化与系统进化树的构建 分子进化与系统进化树的构建 分子进化与系统进化树的构建 主要内容： 1、分子进化的研究方法 2、系统进化树的构建方法 3、系统进化树构建常用软件汇集 4、系统进化树构建方法及软件的选择 5、Phylip分子进化分析软件包简介及使用 6、如何利用MEGA3.1构建进化树 声明： 1、本篇涉及的资源主要源于网络及相关书籍，由酷友搜集、分析、整理、审改，供大家学习参考用，如有转载、传播请注明源于基因酷及本篇的工作人员；若本篇侵犯了您的版权或有任何不妥，请Email genecool@https://www.doczj.com/doc/c24615818.html,告知。 2、由于我们的学识、经验有限，本篇难免会存在一些错误及缺陷，敬请不吝赐教：请到基因酷论坛（https://www.doczj.com/doc/c24615818.html,/bbs）本篇对应的专题跟贴指出或Email genecool@https://www.doczj.com/doc/c24615818.html,。 致谢： 整编者：flashhyh 主要参考资料：《生物信息学札记》樊龙江；《分子进化分析与相关软件的应用》作者不详；《进化树构建》ZHAO Yangguo；《如何用MEGA 3.1构建进化树》作者不详；《MEGA3指南》作者不详； 分子进化的研究方法 分子进化的研究方法 分子进化的研究方法 分子进化研究的意义 自20世纪中叶，随着分子生物学的不断发展，进化研究也进入了分子进化(molecularevolution)研究水平，并建立了一套依赖于核酸、蛋白质序列信息的理论和方法。随着基因组测序计划的实施，基因组的巨量信息对若干生物领域重大问题的研究提
供了有力的帮助，分子进化研究再次成为生命科学中最引人注目的领域之一。这些重大问题包括：遗传密码的起源、基因组结构的形成与演化、进化的动力、生物进化等等。分子进化研究目前更多地是集中在分子序列上，但随着越来越多生物基因组的测序完成，从基因组水平上探索进化奥秘，将开创进化研究的新天地。 分子进化研究最根本的目的就是从物种的一些分子特性出发，从而了解物种之间的生物系统发生的关系。通过核酸、蛋白质序列同源性的比较进而了解基因的进化以及生物系统发生的内在规律。 分子进化研究的基础 假设假设：：核苷酸和氨基酸序列中含有生物进化历史的全部信息核苷酸和氨基酸序列中含有生物进化历史的全部信息。。 分子钟理论：在各种不同的发育谱系及足够大的进化时间尺度中，许多序列的进化速率几乎是恒定不变的。如下图： 直系同源与旁系同源 直系同源(orthologs):同源的基因是由于共同的祖先基因进化而产生的； 旁系同源(paralogs):同源的基因是由于基因复制产生的。 两者之间的关系如下图所示： 注：用于分子进化分析中的序列必须是直系同源的用于分子进化分析中的序列必须是直系同源的 用于分子进化分析中的序列必须是直系同源的，才能真实反映进化过程。 分子进化研究的基本方法 对于进化研究，主要通过构建系统发育过程有助于通过物种间隐含的种系关系揭示进化动力的实质。 表型的(phenetic)和遗传的(cladistic)数据有着明显差异。Sneath 和Sokal(1973)将表型性关系定义为根据物体一组表型性状所获得的相似性，而遗传性关系含有祖先的信息，因而可用于研究进化的途径。这两种关系可用于系统进化树(phylogenetictree)或树状图(dendrogram)来表示。表型分枝图(phenogram)和进化分枝图(cladogram)两个术语已用于表示分别根据表型性的和遗传性的关系所建立的关系树。进化分枝图可以显示事件或类群间的进化时间，而表型分枝图则不需要时间概念。文献中，更多地是使用“系统进化树”一词来表示进化的途径，另外还有系统发育树、物种树(speciestree)、基因树等等一些相同或含义略有差异的名称. 系统进化树分有根(rooted)和无根(unrooted)树。有根树反映了树上物种或基因的时间顺序，而无根树只反映分类单元之间的距离而不涉及谁是谁的祖先问题。下图表示了
构建系统进化树的方法步骤 1. 建树前的准备工作 1.1 相似序列的获得——BLAST BLAST是目前常用的数据库搜索程序，它是Basic Local Alignment Search Tool的缩写，意为“基本局部相似性比对搜索工具”(Altschul et al.,1990[62];1997[63])。国际著名生物信息中心都提供基于Web的BLAST服务器。BLAST算法的基本思路是首先找出检测序列和目标序列之间相似性程度最高的片段，并作为内核向两端延伸，以找出尽可能长的相似序列片段。 首先登录到提供BLAST服务的常用网站，比如国内的CBI、美国的NCBI、欧洲的EBI和日本的DDBJ。这些网站提供的BLAST服务在界面上差不多，但所用的程序有所差异。它们都有一个大的文本框，用于粘贴需要搜索的序列。把序列以FASTA格式(即第一行为说明行，以“>”符号开始，后面是序列的名称、说明等，其中“>”是必需的，名称及说明等可以是任意形式，换行之后是序列)粘贴到那个大的文本框，选择合适的BLAST程序和数据库，就可以开始搜索了。如果是DNA序列，一般选择BLASTN搜索DNA数据库。 这里以NCBI为例。登录NCBI主页-点击BLAST-点击Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)-在Search文本框中粘贴检测序列-点击BLAST!-点击Format-得到result of BLAST。 BLASTN结果如何分析(参数意义)： >gi|28171832|gb|AY155203.1| Nocardia sp. ATCC 49872 16S ribosomal RNA gene, complete sequence Score = 2020 bits (1019), Expect = 0.0 Identities = 1382/1497 (92%), Gaps = 8/1497 (0%) Strand = Plus / Plus Query: 1 gacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgagcggaaaggccctttcgggggt 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| ||||| Sbjct: 1 gacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgagcggtaaggcccttc--ggggt 58 Query: 61 actcgagcggcgaacgggtgagtaacacgtgggtaacctgccttcagctctgggataagc 120 || ||||||||||||||||||||||||||||||| | |||||| ||||||||||||| Sbjct: 59 acacgagcggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgatctgcctcgtactctgggataagc 118 Score ：指的是提交的序列和搜索出的序列之间的分值，越高说明越相似；
极为详细的建树方法，新手入门推荐 生物进化树的构建 目录 前言 (2) 一、 NCBI (6) 二、 Mega (9) 三、 DNAMAN (15) 四、DNAStar (18) 五、 Bio edit (21)
前言 1．背景资料 进化树(evolutionary tree)又名系统树(phylogenetie tree)进化树，用来表示物种间亲缘关系远近的树状结构图。在进化树中，各个分类单元（物种）依据进化关系的远近，被安放在树状图表上的不同位置。所以，进化树简单地表示生物的进化历程和亲缘关系。已发展成为多学科(包括生命科学中 的进化论、遗传学、分类学、分子生物学、生 物化学、生物物理学和生态学,又包括数学中的 概率统计、图论、计算机科学和群论)交叉形成的一个边缘领域。 归纳总结生物进化的总趋势有以下几类： ①结构上：由简单到复杂 ②生活环境上：由水生到陆生 ③进化水平上：由低等到高等 一般来说，进化树是一个二叉树。它由很多的分支和节点构成。根据位置的不同，进化树的节
点分为外部节点和内部节点，外部节点就是我们要进行分类的分类单元（物种）。而物种之间的进化关系则用节点之间的连线表示。内部节点表示进化事件发生的地方，或表示分类单元进化的祖先。在同一个进化树中，分类单元的选择应当标准一致。进化树上不同节点之间的连线称为分支，其中有一端与叶子节点相连的分支称为外枝，不与叶子节点相连的分支称为内枝。 进化树一般有两种：有根树和无根树。有根树有一个鲜明的特征，那就是它有一个唯一的根节点。这个根节点可以理解为所有其他节点的共同祖先。所以，有根树能可以准确地反映各个物种的进化顺序，从根节点进化到任何其他节点只有能有一条惟一的路径。无根树则不能直接给出根节点，无根树只反映各个不同节点之间的进化关系的远近，没有物种如何进化的过程。但是，我们可以在无根树种指派根节点，从而找出各个物种的进化路径。 无根树 有根树
1．邻接法邻接法(neighbor-joiningmethod，NJ)由Saitou和Nei(1987)提出，NJ法是基于最小进化原理经常被使用的一种算法，它不检验所有可能的拓扑结构，能同时给出拓扑结构和分支长度。在重建系统发生树时，它取消了UPGMA法所做的假定，认为在进化分支上，发生趋异的次数可以不同。最近的计算机模拟已表明它是最有效的基于距离数据重建系统树的方法之一。该方法通过确定距离最近(或相邻)的成对分类单位来使系统树的总距离达到最小。它的特点是重建的树相对准确，假设少，计算速度快，只得一棵树。其缺点主要表现在将序列上的所有位点等同对待，且所分析序列的进化距离不能太大。故NJ法适用于进化距离不大，信息位点少的短序列。邻接法在距离建树中经常会用到，而不用理会使用什么样的优化标准。完全解析出的进化树是通过对完全没有解析出的“星型”进化树进行“分解”得到的，分解的步骤是连续不断地在最接近(实际上是最孤立的)的序列对中插入树枝，而保留进化树的终端。于是，最接近的序列对被巩固了，而“星型”进化树被改善了，这个过程将不断重复。这个方法相对而言很快，也就是说，对于一个50个序列的进化树，只需要若干秒甚至更少。 2．最大简约法最大简约法(maximum parsimony method，MP)最早是基于形态特征分类的需要发展起来的，具体的算法有许多不同版本，其中有些已被广泛地应用于分子进化研究中。利用MP方法重建系统发生树，实际上是一个对给定OTUs其所有可能的树进行比较的过程。对某一个可能的树，首先对每个位点祖先序列的核苷酸组成做出推断，然后统计每个位点用来阐明差异的核苷酸最小替换数目。在整个树中，所有信息简约位点最小核苷酸替换数的总和称为树的长度(常青和周开亚，1998)。MP法是一种优化标准，这种标准遵循“奥卡姆剃刀原则(Occam’S Razor principle)”：对数据最好的解释也是最简单的，而最简单的所需要的特别假定也最少。MP法基于进化过程中所需核苷酸(或氨基酸)替代数目最少的假说，对所有可能正确的拓扑结构进行计算并挑选出所需替代数最小的拓扑结构作为最优系统树，也就是通过比较所有可能树，选择其中长度最小的树作为最终的系统发生树，即最大简约树(maximum parsimony tree)。与其他建树方法相比，MP法无需引入处理核苷酸或者氨基酸替代时所必需的假设(替代模型)。同时，MP法对于分析某些特殊的分子数据(如插入序列和插入／缺失)有用。在分析的序列位点上没有回复突变或平行突变，且被检验的序列位点数很大的时候，MP法能够获得正确的(真实)系统树。但MP法推导的树不是唯一的，在分析序列上存在较多的回复突变或平行突变，而被检验的序列位点数又比较少的时候，最大简约法可能会出现建树错误。故MP法适用于序列残基差别小，具有近似变异率，包含信息位点比较多的长序列。 3．最大似然法最大似然法(maximum likelihood method，MI。)是20世纪60年代末期由于对地生物信息学分析实践震波和水声信号等处理的需要而发展起来的一种非线性谱估计方法。最早由凯佩用这种方法对空间阵列接收信号进行频率波数谱估值，后来推广到对时问信号序列的功率谱估值。 最大似然法最早应用于系统发育分析是在对基因频率数据的分析上。其原理是考虑到每个位点出现残基的似然值，将每个位置所有可能出现的残基替换概率进行累加，产生特定位点的似然值。MI。法对所有可能的系统发育树都计算似然函数，似然函数值最大的那棵树即为最可能的系统发育树。利用最大似然法来推断一组序列的系统发生树，需首先确定序列进化的模型，如Jukes—Cantor模型、Kimura二参数模型及一般二参数模型等。在进化模型选择合理的情况下，MI。法是与进化事实吻合最好的建树算法。其缺点是计算强度非常大，极为耗时。
M E G A构建系统进化树的步骤(以M E G A7为 例)
MEGA构建系统进化树的步骤（以MEGA7为例） 本文是看中国慕课山东大学生物信息学课程总结出来的 分子进化的研究对象是核酸和蛋白质序列。研究某个基因的进化，是用它的DNA序列，还是翻译后的蛋白质序列呢？序列的选取要遵循以下原则：1）如果DNA序列的两两间的一致度≥70%，选用DNA序列。因为，如果DNA序列都如此相似，它的蛋白质会相似到看不出区别，这对构建系统发生树是不利的。所以这种情况下应该选用DNA序列，而不选蛋白质序列。2）如果DNA 序列的两两间的一致度≤70%，DNA序列和蛋白质序列都可以选用。 1. 将要用于构建系统进化树的所有序列合并到同一个fasta格式文件，注意：所有序列的方向都要保持一致 ( 5’-3’)。 想要做系统发生树先要做多序列比对，然后把多序列比对的结果提交给建树软件进行建树，所以在用MEGA建树时可以输入一个已经比对好的多序列比对，也可以输入一条原始序列，让MEGA先来做多序列比对，再建树（一般我们都是原始序列）。所以我们以后者为例。 2.打开MEGA软件，选择主窗口的”File”→“Open A File”→找到并打开fasta文件，这时会询问以何种方式打开，我们是原始序列，需要先进行多序列比对，所以选择“Align”。如果是比对好的多序列比对可以直接选择“Analyze”。 3.在打开的Alignment Explorer窗口中选择”Alignment”-“Align by ClustalW”进行多序列比对（MEGA提供了ClustalW和Muscle两种多序列比对方法，这
构建系统进化树的详细步骤 1. 建树前的准备工作 1.1 相似序列的获得——BLAST BLAST是目前常用的数据库搜索程序，它是Basic Local Alignment Search Tool 的缩写，意 为“基本局部相似性比对搜索工具”(Altschul et al.,1990[62];1997[63])。国际著名生物信息中心 都提供基于Web的BLAST服务器。BLAST算法的基本思路是首先找出检测序列和目标序 列之间相似性程度最高的片段，并作为核向两端延伸，以找出尽可能长的相似序列片段。 首先登录到提供BLAST服务的常用，比如国的CBI、美国的NCBI、欧洲的EBI和日本的DDBJ。这些提供的BLAST服务在界面上差不多，但所用的程序有所差异。它 们都有一个大的文本框，用于粘贴需要搜索的序列。把序列以FASTA格式(即第一行为说明 行，以“>”符号开始，后面是序列的名称、说明等，其中“>”是必需的，名称及说明等可以是 任意形式，换行之后是序列)粘贴到那个大的文本框，选择合适的BLAST程序和数据库，就 可以开始搜索了。如果是DNA序列，一般选择BLASTN搜索DNA数据库。 这里以NCBI为例。登录NCBI主页-点击BLAST-点击Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)-在Search文本框中粘贴检测序列-点击BLAST!-点击Format-得到result of BLAST。 BLASTN结果如何分析(参数意义): >gi|28171832|gb|AY155203.1| Nocardia sp. ATCC 49872 16S ribosomal RNA gene, complete sequence Score = 2020 bits (1019), Expect = 0.0 Identities = 1382/1497 (92%), Gaps = 8/1497 (0%) Strand = Plus / Plus