第二军医大学
硕士学位论文
慢性哮喘小鼠气道血管生成的变化及其在气道重建中的意义
姓名：郭志福
申请学位级别：硕士
专业：内科学（呼吸系病）
指导教师：李强
20040501
】ｒ．＝军置［＾掣
英文缩写ＯＶＡ
ＢＡＬＦ
ＶＢＧＦ
ＥＬＩＳＡ
ＨＥ
ＰＢＳ
ＴＢＳ
ＤＡＢ
ＮＳ
ｍ１
ｕ１
ｍｇ
Ｐｇ
ｉ＇／ｍ
ｈ
ｍｌｎ
斗ｇ
哪
ｒｌｒｎ
ＯＤ
英文缩写
英文全称
Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ
ＢｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒＬａｖａｇｅＦｌｕｉｄ
ＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ
ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｃｎｔＡｓｓａｙ
ＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎＥｏｓｉｎ
ＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＢｕｆｆｅｒＳａｌｉｎｅ
Ｔｒｉｓ．ＢｕｔｔｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ
Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ
ＮｏｒｍａｌＳａｌｉｎｅ
Ｍｉｌｌｉｌｉｔｒｅ
Ｍｉｃｒｏｌｉｔｒｅ
Ｍｉｌｌｉｇｒａｍ
Ｐｉｃｏｇｒａｍ
ＲｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓｐｅｒＭｉｎｕｔｅ
Ｈｏｕｒ
Ｍｉｎｕｔｅ
Ｍｉｃｒｏｇｒａｍ
Ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ
Ｎａｎｏｍｅｔｅｒ
ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔ
中文名称
卵白蛋白
支气管肺泡灌洗液
血管内皮生长因子
酶联免疫吸附试验
苏木素．伊红
磷酸盐缓冲液
Ｔｒｉｓ缓冲液
二氮基联苯胺
生理盐水
毫升
微升
毫克
皮克
每分钟转数
小时
分钟
微克
微米
纳米
光密度
，￡＝丰盛．走掣母ｒ．七学芷趣：定
中文摘要
背景：
血管反应是炎症过程的中心环节。一些炎症反应特别是慢性炎症可刺激血管生成，新生成的血管又有助于组织的炎症反应，二者互为因果，形成恶性循环，使得局部炎症反应更为强烈和持久。哮喘的本质是气道慢性炎症性疾病，长期反复发作将导致气道结构的不可逆性改变，称为气道重建。研究证实，气道血管生成／血管重建也是哮喘的一个重要病理特征。
目的：
通过观察慢性哮喘小鼠气道血管生成的变化，初步探讨其在气道重建中的意义，为哮喘气道血管生成的深入研究提供依据。
方法：
１、慢性哮喘小鼠模型的建立
通过多次抗原致敏和反复抗原滴鼻激发建立慢性哮喘小鼠模型。２４只ＢＡＬＢ／ｃ小鼠随机分为３组，每组８只，即正常对照组、慢性哮喘组和地塞米松治疗组。哮喘组第０、７、１４天给予０．０１％ＯＶＡ（每１０ｍｌ含ＯＶＡｌｍｇ、氢氧化铝８ｍ１）２００Ｉｚｌ腹腔注射致敏，第２１～３０、４８、６２、７４～７６天０．２％ＯＶＡ抗原液５０山滴鼻激发，共１５次：对照组同时给予等体积ＮＳ腹腔注射和滴鼻。地塞米松治疗组每次激发前ｌｈ腹腔注射２ｍｇ／ｋｇ地塞米松；其余２组同时腹腔注射等体积ＮＳ。
末次激发后２４ｈ眼球取血处死动物并留取血清，随即行右侧肺灌洗留取ＢＡＬＦ，左肺及气管置于１０％中性福尔马林溶液固定，２４ｈ内完成石蜡包埋，常规制备病理切片行ＨＥ染色和抗Ⅷ因子免疫组化染色。
２、气道血管密度的计算及形态学参数的测量
每个标本观察５张免疫组化切片，每张切片在显微镜（×１０００）下于粘膜下层、粘膜固有层处血管尽可能多的区域选ｌＯ个视野，计数５０个视野（１ＩｌⅡ１１２）中阳性反应的管腔样结构的总数作为血管密度（血管数／ｍｍ２）。
于ＨＥ染色病理片上，采用德国ＬｅｉｃａＱ５００ＭＣ图像分析系统，测定不含软骨的完整支气管横断面的基底膜周径Ｐｂｍ（ｐｍ）、管壁面积ＷＡｔ（ｍｎ２），计算ＷＡｔ／Ｐｂｍ（１ａｍ２／“ｍ）。
３、ＢＡＬＦ中ＶＥＧＦ、Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ水平的检测
ＥＬＩＳＡ法检测ＢＡＬＦ中ＶＥＧＦ、Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ浓度。
结果：
１、气管血管密度慢性哮喘组明显高于正常对照组（２０３．７５０－ａ：２４．３３０／ｒａｍ２坩９９．０００士２０．６６７／ｍｍ２，Ｐ＜０．０１）。
２、支气管管壁面积／基底膜周径（ＷＡｔ／Ｐｂｍ）慢性哮喘组明显高于正常对照组（１７．０９－士１．６０９ｍ２／ｒｔｒｎＷ１２．７１＋１．０５９ｘｎ２／“ｒｎ，Ｐ＜０．０１）。慢性哮喘小鼠支气管上皮细胞增生，基底膜增厚，平滑肌增生以及气道内分泌物积聚。
３、ＢＡＬＦ中ＶＥＧＦ、Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ水平慢性哮喘组ＶＥＧＦ、Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ浓度和ＶＥＧＦ／Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ比值均明显高于正常对照组（１３３．８２１＋１４．２３８ｐ∥ｍｌｗ５８．３４２－－ｉ：１８．４７８ｐｇ／ｍｌ，３０２４．５５０＝｝＝８３１．９１７ｐｇ／ｍｌＶＳ１９１６．９２５士４１２．９１６ｐｇ／ｍ１，均Ｐ＜０．０１）。
４、气管血管密度与ＷＡｔ／Ｐｂｍ及ＢＡＬＦ中ＶＥＧＦ、Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ水平的关系慢性哮喘小鼠气道内血管密度与ＷＡｔ／Ｐｂｍ（，＝Ｏ．７３８，Ｐ＜０．０５）、ＶＥＧＦ（ｒ＝０．７０１，尸＜Ｏ．０１）、ＶＥＧＦ／Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ（，＝０．５６２，Ｐ＜０，０５）均呈正相关。
５、地塞米松治疗对慢性哮喘小鼠气道血管生成的影响地塞米松治疗组ＷＡｔ／Ｐｂｍ（（１４．２６－ａ：０．９９）ｌａｍ２／｝Ｊａｎ）和血管密度（１２３．６２５：ｖ－２．３．９４６／ｍｍ２）均明显低于慢性哮喘组（均Ｐ＜０．０１），高于正常对照组（均Ｐ＜０．０５）。与慢性哮喘组相比，ＶＥＧＦ水平明显降低（８４，６４０－ａ：１７．０３４ｐｅｄｍａ，．Ｐ＜Ｏ．０１），Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ水平（２５４１．４５０±４０２．６６２ｐｇ／ｍ１）无明显变化，ＶＥＧＦ厄ｎｄｏｓｔａｔｉｎ比值明显降低（户＜Ｏ．０５）。
结论：
１、慢性哮喘小鼠气道血管生成明显增加，且与气道壁厚度呈正相关，提示血管生成可能在哮喘气道重建中具有重要意义。
２、慢性哮喘小鼠ＢＡＬＦ中ＶＥＧＦ、Ｅｎｄｏｓｍｔｉｎ、ＶＥＧＦ／Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ比值均明显升高，
与气道内血管生成促进因子和抑制因子比例失衡有关。
３、糖皮质激素能部分抑制慢性哮喘小鼠ＢＡＬＦ中ＶＥＧＦ／Ｅｎｄｏｓｔａｆｉｎ比值升高和气道血管生成，并进而改善慢性哮喘的气道结构重建。
关键词：
支气管哮喘。气道重建，血管生成，ＶＥＧＦ，Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ，地塞米松
司ｒ士．，ｅ日Ｃ女ｅ甓
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ
Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ＇ａｓｔｈｍａｉｓｔｈｏｕｇｈｔｔｏｂｅａｃｈｒｏｎｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒｏｆｔｈｅａｉｒｗａｙｓｉｎｗｈｉｃｈｍａｎｙｃｅｌｌｓ，ｓｕｃｈａｓｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ，ｍａｓｔｃｅｉｌｓ，ＴＩｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，ａｉｒｗａｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｔｓ，ｅｔｃ．，ａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｅｌｅｍｅｎｔｓｐｌａｙａｒｏｌｅ．Ｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ＇ｂｅｔｗｅｅＲｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒ
ｅｌｅｍｅｎｔｓｗｉｌｌｐｅｒｐｅｔｕａｔｅｔｈｅａｉｒｗａｙｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｌｏｎｇｓｔａｎｄｉｎｇａｎｄｒｅｃｕｒｒｅｎｔｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｗｉｌｌｉｎｅｖｉｔａｂｌｙｒｅｓｕｌｔｉｎｐｅｒｍａｎｅｎｔｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆａｉｒｗａｙｓｓｕｃｈａｓｄｅｓｑｕａｍａｆｉｏｎａｎｄｈｙｐｅｒｐｔａｓｉａｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｈｒａａｅｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ，ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｔ
ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ／ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａｏｆａｉｒｗａｙｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｓ，ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ／ｍｅｔａｐｌａｓｉａｏｆｇｏｂｌｅｔ
ａｎｄｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｏｆａｉｒｗａｙｃｅｌｌｓ，ｓｕｂｍｕｃｕｓｇｌａｎｄｓｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａａｎｄｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ，ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ
ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅｅｔｃ．，ｋｎｏｗｎａｓａｉｒｗａｙｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ａｎｄａｔｌａｓｔｌｅａｄｔｏｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅａｉｒｗａｙｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．
Ｖａｓｃｕｌａｒｒｅａｃｔｉｏｎｓａｒｅｃｅｎｔｒａｌｅｖｅｎｔｓｉｎａｌｌｋｉｎｄｓｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｓ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄ
ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｒｅｃｏｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｃａｎｐｒｏｍｏｔｅａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄｎｅｗ
ｖｅｓｓｅｌｓｍａｙｅｎｈａｎｃｅｔｉｓｓｕｅｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｓｏｍｅｆｏｒｍｓｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｃｈｒｏｎｉｃ
ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｃａｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｖｅｓｓｅｌｇｒｏｗｔｈ．Ｎｅｗｖｅｓｓｅｌｓｍａｙｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏａｔｉｓｓｕｅ’Ｓａｌｔｅｒｅｄ
ｓｅｖｅｒｅ，如ｍａ她ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｓｏｉｔｉｓｌｉｋｅｌｙｔｈａｔｔｈｅｉｒｃｏｅｘｉｓｔｅｎｃｅｍａｙｌｅａｄｔｏｍｏｒｅ
ａｎｄｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｉｔｈａｓｂｅｅｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ
ｔｈｅａｒｅｐｒｏｍｉｎｅｎｔｆｅａｔｕｒｅｓｏｆａｓｔｈｍａｔｉｃｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｂｕｔｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ
ｔｈｅｃｈａｎｇｅｓａｒｅｊｕｓｔｂｅｇｉｎｎｉｎｇｔＯｂｅｃｈａｎｇｅｓａｓｗｅｌｌａｓｐｏｓｓｉｂｌｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｔｒａｔｅｇｙｔａｒｇｅｔｅｄ
ｅｌｕｃｉｄａｔｅｄ．
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅａｉｒｗａｙａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｅｌｕｃｉｄａｔｅｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｔｈｅａｉｒｗａｙｒｅｍｏｄｅｌ证舀砥ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｇｌｕｃｏｃｏｎｉｃｏｉｄｏｎｉｔｉ１１ａｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌ．
Ｍ［ｅｔｈｏｄｓ
１．Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅ
Ｗｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｂｙｒｅｐｅａｔｅｄｌｙｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄｔｏａｌｌｅｒｇｅｎ（ＯＶＡ）ｗｉｔｈａｄｊｕｖａｎｔｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｉｎｗｈｉｃｈｃｈｒｏｎｉｃａｉｒｗａｙｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｓｍａｉｎｔａｉｎｅｄｂｙ
ｗｉｔｈＯＶＡｗｉｔｈｏｕｔａｄｊｕｖａｎｔｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｌｙ．Ｔｗｅｎｔｙ－ｆｏｕｒＢＡＬＢ／ｃｒｅｐｅａｔｅｄｌｙｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ
ｍｉｃｅｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｓｅｑｕａｌｌｙ：ｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｇｒｏｕｐ，
石＝车匿＾学
ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ仃ｅａｔｅｄｃｈｒｏｍｅａｓｔｈｍａｔｉｃｇｒｏｕｐ，Ｍｉｃｅｉｎｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｇｒｏｕｐｗｅｒｅｇｉｖｅｎ２００¨ＩＯ．０１％ＯＶＡ（１ｍｇＯＶＡａｎｄ８ｍｌＡＩ（ＯＨ）３ｐｅｒｌＯｒｎｌ）ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｏｎｄａｙｓ０，
７，１４．Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｔｈｅｙｗｅｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｌｙ谢ｍ５０山０．２％ＯＶＡｗｉｔｈｏｕｔａｄｊｕｖａｎｔｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙｏｎｄａｙｓ２１～３０、４９．６２ａｎｄ７４～７６．Ｍｉｃｅｉｎｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ、Ｖｅｒｅｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｗｉ也ｅｑｕａｌｖｏｌｕｍｅｏｆＮＳｏｎｔｈｅｓａｍｅｄａｙｓ．Ｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅｉｎｄｅｘａｒｎｅｔｈａｓｏｎｅｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｒｅｃｅｉｖｅｄ２ｍｇ／ｋｇｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ
ｍｉｃｅｉｎｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｌｈｂｅｆｏｒｅｅａｃｈｃｈａｌｌｅｎｇｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｌｅ
ａｎｄｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｇｒｏｕｐｗｅｒｅｇｉｖｅｎｅｑｕａｌｖｏｌｕｍｅｏｆＮＳｉｎｔｒａｐｅｄｔｏｎｅａｌｌｙｏｎｔｈｅＳａｍｅ
ｔｉｍｅ．
Ｔｗｅｎｔｙ—ｆｏｕｒｈｏｕｒｓａｆｔｅｒｔｈｅｌａｓｔｃｈａｌｌｅｎｇｅｔｈｅｍｉｃｅｗｅｒｅｋｉｌｌｅｄｂｙｆｉｇｈｔｅｙｅｒｅｍｏｖａｌ．Ｂｌｏｏｄ
ｗｅｒｅｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄａｎｄｓｅｒｆ．Ｒ／ｉｓｗｅｒｅｓｔｏｒｅｄａｔ－２０＂Ｃ．ＲｉｇｈｔｌｕｎｇｓｗｅｒｅｌａｖａｇｅｄａｎｄＢＡＬＦ
ｗｃｒｃｒｅｓｅｒｖｅｄｓｉｍｉｌａｒｌｙ．Ｌｅｆｔｌｕｎｇｓａｎｄｔｒａｃｈｅａｅｗｅｒｅｆ政ｅｄｗｉｔｈ１０％ｂｕｆｆｅｒｅｄｆｏｒｍａｌｉｎａｎｄｅｍｂｅｄｄｅｄｉｎｐａｍｆｆｍｉｎ２４ｈ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｓｌｉｄｅｓｗｅｒｅｍａｄｅｆｒｏｍｌｅｆｔｌｕｎｇｓａｎｄｔｒａｃｈｅａｅａｎｄｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ．Ａｌｓｏａｎｔｉ－ＦａｃｔｏｒⅧＡｇａｎｔｉｂｏｄｙｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｖｅｓｓｅｌｓ．
２．Ｃｏｕｎｔｏｆｄｅｎｓｉｔｙｏｆｖｅｓｓｅｌｓｉｎｔｒａｃｈｅａｅａｎｄｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆａｉｒｗａｙｗａｌｌ
Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｖｅｓｓｅｌｓｉｎｌａｍｉｎａｐｒｏｐｒｉａａｎｄｓｕｂｍｕｃｏｓａｏｆｔｒａｃｈｅａｅｉｎｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｌｉｄｅｓｗｅｒｅｃｏｕｎｔｅｄｍｉｃｍｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ（ｘｌｏｏｏ）．Ｆｏｒｅａｃｈｍｏｕｓｅｆｉｖｅ
ｎｕｍｂｅｒｏｆｖｅｓｓｅｌｓｗａｓａｓｍｏｓｔｓｌｉｄｅｓａｎｄｔｅｎｎｏｂ?ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｈｉｇｈｐｏｗｅｒｆｉｅｌｄｓｗｈｅｒｅｔｈｅ
ａｓｐｏｓｓｉｂｌｅｉｎｅａｃｈｓｌｉｄｅａｓｓｅｓｓｅｄ．ｎｌｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｄｄｅｄｔｏｇｅｔｈｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓｔｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆｖｅｓｓｅｌｓ（ｎｕｍｂｅｒｏｆｖｅｓｓｅｌｓ／ｍｍ２）．
Ｂｒｏｎｃｈｉａｌｗａｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔｃａｒｔｉｌａｇｅｉｎｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎｓｔａｉｎｅｄｓｅｃｔｉｏｎｓｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｕｓｉｎｇａＬｅｉｃａＱ５００ＭＣｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ．ｎｅａｉｒｗａｙｗａｌｌｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅｐｅｒｉｍｅｔｅｒ（Ｐｂｍ）ａｎｄｔｏｔａｌｂｒｏｎｃｈｉａｌｗａｌｌａｒｅａ（ＷＡｔ）ｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄａｎｄＰｂｍ／ＷＡｔｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．
３．ＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＶＥＧＦａｎｄＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｉｎＢＡＬＦ
ＴｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＶＥＧＦａｎｄＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｉｎＢＡＬＦｏｆｌｅｆｌｌｕｎｇｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ．
Ｒｅｓｕｌｔｓ
１．ＴｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆｖｅｓｓｅｌｓｉｎｔｒａｃｈｅａｌｌａｍｉｎａｐｒｏｐｒｉａａｎｄｓｕｂｍｕｃｏｓａＴｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆ
ｔｈｅｎｏｒｍａｉｃｏｎｔｒｏｌ（２０３．７５０－圭２４．３３０ｖｅｓｓｅｌｓｄｍｍ２ＶＳ９９．０００±２０．６６７ｖｃｓｓｃｌｄｍｍ２．Ｐ＜Ｏ．０１）．
２．ＷＡｔ，ＰｂｍｏｆｂｒｏｎｃｈｉａｌｗａＩｌｓｎｌｅＷＡｔ／Ｐｂｍｏｆｔｈｅｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｎｌａｔｉｃｍｉｃｅｗｅｒｅ（１７．０９士Ｉ。６０）ｌａｍ２／ｍｒｎａｎｄｔｈｅｒｅｗａＳａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅｇｒｏｕｐｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ（１２．７１士１．０５）岫竹岬ｉｎｔｈｅｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐ＜Ｏ．０１）．Ｈｙｐｃｒｐｌａｓｉａｏｆａｉｒｗａｙｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ，ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａｏｆａｉｒｗａｙｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｓａｎｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｉｎａｉｒｗａｙｌｕｍｅｎｓｗｅｒｅａｌｓｏｓｅｅｎｉｎｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅ．３．ＴｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＶＥＧＦａｎｄＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｉｎＢＡＬＦＴｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＶＥＧＦｉｎＢＡＬＦｏｆｔｈｅｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｍｉｃｅａｎｄｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅｗｅｒｅ５８．３４２土１８．４７８ｐｇ／ｍｌ，１３３．８２１士１４．２３８ｐｇ／ｍｌａｎｄｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｗｅ，ｒｅ１９１６．９２５士４１２．９１６ｐｇ／ｒｒｄ，３０２４．５５０士８３１．９１７ｐｇ／ｍｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｒｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｓｏｆＶＥＧＦ，ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎａｎｄＶＥＧＦ／ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｉｎＢＡＬＦｉｎｃｈｒｏｎｉｃａａｔｈｍａｔｉｅｍｉｃｅｇｒｏｕｐｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｉｎｔｈｅｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ａｌｌＰ＜０．０１）．
４．ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆｖｅｓｓｅｌｓａｎｄＷＡｔ／Ｐｂｍ，ＶＥＧＦａｎｄＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｉｎＢＡＬＦＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆｖｅｓｓｅｌｓａｎｄＷＡｔ／Ｐｂｍｉｎｔｈｅｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅ（ｒ＝Ｏ．７３８，尸＜０．０５）．ＴｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＶＥＧＦｉｎＢＡＬＦａｎｄｔｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆｖｅｓｓｅｌｓｗａｓｓｉｍｉｌａｒ（，＝０．７０１．Ｐ＜０．０１）．ＴｈｅｒｅａｌｓｏＷａｓａｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＶＥＯＦ／Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎａｎｄｔｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆｖｅｓｓｅｌｓ（，＝Ｏ．５６２，尸＜Ｏ．０５）．
５．ＥｆｆｅｃｔｏｆｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅＯｉｌｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅＴｈｅＷＡｔ／Ｐｂｍ【（１４．２６ｔ：０．９９）“ｒｎ２／ｇｒｎ］ａｎｄｄｅｎｓｉｔｙｏｆｖｅｓｓｅｌｓ［（１２３．６２５土２３．９４６）ｖｅｓｓｅｌｓ／ｒａｍ２］ｉｎｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｔｒｅａｔｅｄｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅｇｒｏｕｐｗｅｒｅｂｏｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｉｎｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅｇｒｏｕｐｒｅｃｅｉｖｅｄＮＳｉｎｔｍｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ（ｂｏｔｈＰ＜０．０１）．ｂｕｔｓｔｉｌｌｍｏｒｅｔｈａｎｔｈａｔｉｎｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ｂｏｔｈ尸＜Ｏ．０５）．ＶＥＧＦ（８４．６４０士１７．０３４ｐｇ／ｍ１．Ｐ＜Ｏ．０１）ｂｕｔｎｏｔＥｎｄｏｓｔａｔｉｎＷａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅＢＡＬＦｏｆｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｔｒｅａｔｅｄｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅｇｒｏｕｐｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｉｎｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅａｎｄＳＯＷａＳｔｈｅＶＥＧＦ／Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ伊＜０．０５）．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ
１．Ａｉｒｗａｙａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｔｈｅｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｎｄｔｈｅｒｅｉｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆｖｅｓｓｅｌｓａｎｄｔｈｅｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇｏｆａｉｒｗａｙ
苎！兰竺Ｌ一曼唑苎塑－●＿＿－＿＿－＿＿＿＿＿＿＿＿－＿—＿＿－＿＿－—●－＿—＿＿●●＿＿＿＿＿＿＿＿－＿——－＿＿＿———＿——＿－－＿＿－＿＿－＿＿－●—————一一
’’。’一…一’２?ＶＥＧＥＥｎｄｏｓｔａｆｉｎａｎｄＶＥＧＦ／Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎａ∞ｓｉｇｔｌｉｆｉｃａｎｆｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎＢＡＬＦｉｎｃｈ咖ｌｉｃ
ａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅａｎｄｔｈｅｒｅａｒｃｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ
ｄｅｎｓｉｔｙｏｆｖｅｓｓｅｌｓ
ａｎｄｔｈｅＶＥＧＬＶＥＧＦ／ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｉｎＢＡＬＥＩｔｓｅｅｍｓｔｈａｔｔｈｅ
ａｉｒｗａｙａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｍｉｇｈｔｂｃ
ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅｉｍｂａｌａｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅａｎｇｉｏｇｅｎｉｃａｎｄ
ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃａｉｒｗａｙ．
３－Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｃａｒｌｒｅｖｅｉ－ｓｅＶＥＧＦ／ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｉｎＢＡＬＦｐａｒｄｙａｎｄａｔｔｅｎｕａｔｅｔｈｅａｉｒｗａｙａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｃｈｒｏｎｉｃａｓｔｈｍａｔｉｃｍｉｃｅ，ａｎｄＳＯｌｅａｄｓｔｏｔｈｅｒｅｓｔｏｒｅｏｆａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｉｒｗａｙｗｅｌｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｒｏｎｃｈｉａｌａｓｔｈｍａ，
Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，
Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ，Ａｉｒｗａｙｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，
ＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ，Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ
第＝年霉＾掌司ｒ．士．掌芷铡＝戈
日Ｕ吾
支气管哮喘，简称哮喘，是呼吸系统常见病、多发病之一，世界范围内平均发病率约１０％，某些地区高达３０％。在我国，哮喘的发病率为ｌ％～４％。虽然对哮喘的基础和临床研究已取得很大进展，但目前的状况仍不令人满意。在过去的１０～２０年中，许多地区哮喘的患病率、死亡率呈逐年增高趋势，部分地区增加近ｌ倍，对人类健康构成了极大威胁。因此对哮喘进行进一步研究具有深远的意义【‘‘２１。
目前认为哮喘是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、Ｔ淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等）和细胞组份参与的气道慢性炎症性疾病。这些细胞和细胞组份相互作用形成恶性循环，使气道炎症持续存在，成为哮喘的基本病理改变和反复发作的主要病理生理机制。在病程早期，解剖学上很少发生器质性改变；长期反复发作将导致气道结构发生改变，包括气道上皮细胞脱落／增生、基底膜增厚、上皮下纤维化、平滑肌增生／月巴大、杯状细胞增生／化生、粘液腺增生，月巴大、血管生成／血管重建等，称为气道重建（图１），最终导致持续地气道高反应性和不可逆性气道阻塞【卜６】。虽然以吸入性糖皮质激素和Ｂ。受体激动剂为基础的治疗可以使哮喘发作得到较好的控制，但即使在疾病的早期使用亦不能有效阻止气道重建的进展【４－５】。因此近几年其重要性受到广泛重视，逐渐成为哮喘研究中的热点。
图１．慢性哮喘的病理改变
第９页
．膏＝埠最＾掌司ｒ－士学地寅墩
材料和方法
（一）材料
１、动物
清洁级４～６周龄雌性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠２４只，有限责任公司提供。饲养于空调房间（２５＂Ｃ±）／１２ｈ无光照。
２、主要仪器
ＦＡｌ００４Ｎ型电子天平
ＴｌＧＬ－１６Ｇ型高速低温离心机
Ｔ℃Ｌ．１６Ｇ型台式低温离心机
ＬｅｉｅａＲＭ２１４５型石蜡切片机
ＬｅｉｃａＥＧｌ１４０石蜡包埋机
ＯｌｙｍｐｕｓＣＨ光学显微镜
ＭｕｌｆｉｓｋａｎＡｓｃｅｎｔＶ１．２３型酶标仪
可调式微量移液器
上菱ＢＣＤ－－２３０ＷＤ型冰箱
ＷＴＢ．ＢｉｎｄｅｒＢＤ型精密恒温箱
眼科手术器械
３、主要试剂
卵白蛋（ＧｒａｄｅＶ，９８％１
氢氧化铝（ＰＨ５．７，１．６２％）
生理盐水注射液
地塞米松注射液（５ｍｇ／ｍｔ／支）
小鼠ＶＥＧＦＥＬＩＳＡ试剂盒体质量１５９～２１９，
，无卵蛋白饮食，
上海斯莱克实验动物
每天１２ｈ自然光光照
上海精密科学仪器有限公司
上海安亭科学仪器厂
上海医用分析仪器厂
德国Ｌｅｉｃａ公司
德国Ｌｅｉｅａ公司
日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司
美国Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ公司
美国Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ公司
上海上菱电器股份有限公司
德国Ｂｉｎｄｅｒ公司
上海手术器械厂
美国Ｓｉｇｍａ公司
上海生物制品研究所
上海百特医疗药品有限公司
上海信谊制药厂深圳市晶美生物工程有限公司
｜仁卓皇Ｅ大学习ｒ．士学盥：程－艾
小鼠ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎＥＬＩＳＡ试剂盒
兔抗小鼠Ⅷ因子多克隆抗体
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ试剂（即用型）
３’，３’．二氨基联苯胺（ＤＡＢ）染色剂无水乙醇
ＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／ｌ，ＰＨ７．４１
ＴＢＳ（０．０１ｍｏｌ／１，ＰＨ７．８）
Ｈａｒｒｉｓ苏木素染液
酸化伊红醇液
二甲苯
中性树胶
去离子水
（二）实验方法
１、动物处理
１‘ｌ动物分组
美ｍＣｙｔｉｍｍｕｎｅ公司
丹麦Ｄａｋｏ公司
丹麦Ｄａｋｏ公司
美［］Ｓｉｇｍａ公司
上海化学试剂四厂上海长海医院病理科惠赠
上海长海医院病理科惠赠
上海长海医院病理科惠赠
上海长海医院病理科惠赠
上海长海医院病理科惠赠
上海长海医院病理科惠赠上海长海医院中心实验室自制
２４只ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，按随机数字表法随机分为３组：正常对照组、慢性哮喘组、地塞米松治疗组，每组８只。
１．２建立慢性哮喘动物模型
参考Ｔｅｍｅｌｋｏｖｓｋｉ、Ｋｕｍａｒ、商艳等口４ｔ６】，建立慢性哮喘小鼠模型，见图２。慢性哮喘组、地塞米松治疗组于第０、７、１４天腹腔注射０．０１％ＯＶＡ（每１０ｍｌ含ＯＶＡｌｍｇ、氢氧化铝８ｍ１）２００¨１致敏，于第２１～３０、４８、６２、７４～７６天滴鼻激发共１５次；正常对照组同时给予相同体积ＮＳ腹腔注射及滴鼻。地塞米松治疗组于激发前１ｈ腹腔注射２ｍｇ／ｋｇ地塞米松；其余２组于激发前１ｈ腹腔注射同等体积ＮＳ。小鼠出现烦躁不安、呼吸急促、腹肌痉挛为阳性反应。
※※强盍，Ａ－★★
，＿＿＾。－、二
ＩＴｔ４ｚｌ３１●●‘２１４Ｔ‘
※致敏★激发
ｌ－３标本采集
末次激发后２４ｈ摘右眼球取血处死动物，血标本１８００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ．取血清分装，．２０＂（２保存。眼科剪剖开胸腔，暴露气管、双肺：靠近左肺门处结扎左主支气管。于气管靠近头端剪一斜行切口，钝头ｌ酽注射器针头行气管插管，０．５ｍｌＮＳ灌洗右肺，回收灌洗液，反复３次，收集ＢＡＬＦ１．０ｍｌｔＩ．２ｍｌ，１５００ｒ／ｍｉｎ室温下离心５ｍｉｎ，取上清分装，．２０＂（２保存。另取左肺和气管置于１０％中性福尔马林固定，２４ｈ内完成石蜡包埋。
２、病理切片的处理
左肺和气管石蜡包埋，４１ａｍ连续切片，常规制备病理切片（每个标本至少获取７～８张理想切片），分别行旺染色和抗Ⅷ因子免疫组化染色（＞ｔ５张），计算气管内血管密度并测量气道形态学参数。
２．１ＨＥ染色
石蜡切片常规脱蜡至水
Ｊ
自来水洗２ｍｉｎ
｛
蒸馏水洗２ｍｉｎ
ｌ
Ｈａｒｒｉｓ苏木素液５ｒａｉｎ＿＋
｛
自来水洗ｌｍｉｎ
｛
７５％盐酸乙醇分化３０秒
ｌ
自来水洗ｌｍｉｎ
ｌ
温水（５０℃－４－）５ｍｉｎ
蒸馏水ｌｍｉｎ
９５％乙醇１ｍｉｎ
酸化伊红醇液１ｍｉｎ～２ｍｉｎ
９５％乙醇ｌｍｉｎ
无水乙醇ｌｍｉｎ
ｌ
二甲苯一石碳酸液（３：１）ｌｍｉｎ
＇
二甲苯ｌｍｉｎＸ２次
ｌ
中性树胶封固、烤片
２．２抗Ⅷ因子免疫组化染色（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ法）
石蜡切片常规脱蜡至水
ＰＢＳ冲洗３ｍｉｎｘ３次
０．３％Ｈ２０２浸泡２０ｍｉｎ，抑制内源性过氧化物酶
ＰＢＳ冲洗３ｍｉｎ×３次
兔抗小鼠Ⅷ因子多抗（１：２００）５０／．ｄ，３７＇（２，６０ｍｉｎ
ＰＢＳ冲洗３ｍｉｎＸ３次
审ｒ蕾．掌矗｝寓域
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ试剂５０山，３７℃，３０ｒａｉｎ
ｌ
ＰＢＳ冲洗３ｍｉｎ×３次
｛
Ｏ．０５％ＤＡＢ显色８ｒａｍ－１２ｍｉｎ
～一
ｌ
苏木素衬染，热水蓝化
Ｉ
吹干，中性树胶封固，烤片
２．３气管内血管密度计算
免疫组化以血管内壁出现棕黄色或黄色颗粒状物为阳性反应。ＰＢＳ代替一抗作阴性对照。每个标本观察５张切片，每张切片在显微镜（ｘ１０００）下于粘膜下层、粘膜固有层血管尽可能多的区域选１０个视野，计数５０个视野中（１ｍｍ２）阳性反应的管腔样结构的总数。计数采取盲法，由两位不知实验分组的医师于不同日独立完成，并经一致性检验分析观察者之间的结果有无差异。
２．４气道形态学参数测量
参照文献‘”’２钔，于髓染色病理片上，采用德国ＬｅｉｃａＱ５００ＭＣ图像分析系统。测定完整的无软骨支气管横断面的基底膜周径Ｐｂｍ（ｇｒａ）、管壁面积ＷＡｒ（ｇｉｎ２），计算ｗＡ卯ｂｍ（岫２／岬）表示气道壁厚度。
３、ＢＡＬＦ中Ｅｎｄｏｓ诅ｔｉｎ、ＶＥＧＦ含量检测
３．１ＢＡＬＦ中Ｅｎｄｏｓｍｔｉｎ含量检测
采用ＥＵＳＡ方法，按照试剂盒说明书进行操作，简述如下：
准备试剂、标本置于室温
ｌ
１：１９去离子水稀释浓缩洗涤液，样品稀释液溶解标准品冻干粉、生物素化鼠Ｅｎｄｏ蛐
多抗及碱性磷酸酶偶联链霉素亲和素复合物
ｌ
Ｊ窿军压＾掌司ｒ．士学芷碰：定
ｌ
加样品及待测样本１００¨ｌ／孔
ｌ
加入２５叫孔生物素化的鼠Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ多抗，封板，室温孵育３ｈ
ｌ
显色剂Ａ、Ｂ置于室温
；
２５０皿，孔洗板６次，第６次以洗涤液浸泡１０ｒａｉｎ
４
加入５０州孔稀释的碱性磷酸酶偶联链霉素亲和素复合物，封板，室温４５ｍｉｎ
ｌ
洗板同上
ｌ
加２００山／孔显色剂，室温避光２０ｍｉｎ至标准孔第２孔ＯＤ值为１．“１．８，加终止液５０州孔
ｌ
置于４９０ｎｍ测吸光值
｛
根据标准品测定结果，绘制标准曲线，推导回归方程；计算被测标本Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ含量３．２ＢＡＬＦ中ＶＥＧＦ含量检测
采用ＥＬＩＳＡ方法，按照试剂盒说明书进行操作，筒述如下：
准备试剂、标本，倍比稀释标准品，加标准品及样品同上
ｌ
封板，３７＂Ｃ孵育９０ｍｉｎ；配制生物素化抗体工作液
Ｉ
２５０肚ｌ，孔洗涤液洗板６次
ｌ
除空白孔，加生物素化抗体工作液１００肛ｌ／孔，封板，３７＂Ｃ孵育６０ｒａｉｎ
司Ｌ士学盘‘摧：定
洗板同上
ｌ
除空白孔，加酶结合物工作液１００ｐｔｑＬ，封板，３７℃孵育３０ｍｉｎ
ｌ
洗板同上
ｌ
加入底物显色剂１００ｕｌ／孔，３７＂Ｃ避光孵育１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ
４
终止液ｌＯＯｐＶ孔，混匀
４
置于４５０ｎｍ测吸光值
ｌ
根据标准品测定结果，绘制标准曲线，推导回归方程；计算每个标本ＶＥＧＦ含量（三）统计学处理
采用ＳＰＳＳｌｌ．０统计软件包进行分析。数据以均数４－标准差（王虹）表示，正态分布及方差齐性时，组间均数比较采用单因素方差分析（ｏｎｅｗａｙ．ＡＮＯＶＡ），两两比较采用ＬＳＤ法（ＬｅａｓｔＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）；否则采用秩和检验。不同观察者的血管计数采用Ｋａｐｐａ统计量进行一致性检验。相关分析采用Ｐｅａｒｓｏｎ法。Ｐ＜０．０５时认为差异有统计学意义，Ｐ＜０．０１时认为差异有显著统计学意义。
屯正常对照组：１３．慢性哮喘组，与Ａ相比，血管数目明显增多；ｃ地塞米松治疗组，与Ｂ相比血
管数明显减少Ｅｎｖｉｓｉｏｎ法ｘ１０００
圈４．各组小鼠气管血管生成改变
第１９页