?技术与方法?
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2014年第1期
生物大分子间的相互作用是有机体细胞活动的基础，在蛋白质层面上揭示生命活动本质是现代生物学的一个主要目标。1989年诞生的酵母双杂交（Yeast two -hybrid，Y2H）系统以及随后出现的各种衍生系统是研究蛋白质之间以及蛋白质和RNA、小分子化合物之间相互作用的最重要的工具，已成功揭示了大量的蛋白相互作用，在细胞信号转导、蛋白质组学、病理学、药物研发等方面有着广泛应用［1］。本文对Y2H 系统的基本原理、衍生系统和应用进展等方面进行介绍。
1 酵母双杂交系统的原理
酵母GAL4转录因子由两个可以分开的结构域组成：DNA 结合域（DNA binding domain，BD）负责结合基因的上游激活序列，将转录激活域（Transcriptional activation domain，AD）募集到启动
收稿日期：2013-08-03基金项目：特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室开放基金项目（2013K04）作者简介：黄欣媛，女，博士，研究方向：生物化学与分子生物学；E -mail ：huangxycn@https://www.doczj.com/doc/c810045302.html,
酵母双杂交及其衍生系统
黄欣媛1 范红波2
（1.湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，孝感 432000；2.湖北职业技术学院，孝感 432000）
摘 要： 酵母双杂交系统是一种研究蛋白质相互作用的分子生物学方法，过去20多年里，大量衍生系统的出现使得这套双杂交技术体系更加完善和高效，成为研究蛋白质-配体相互作用的重要技术手段，广泛应用于功能基因组学、蛋白质组学、病理学等研究领域。对酵母双杂交及其衍生系统的基本原理和应用进展进行综述。
关键词： 酵母双杂交系统 蛋白质相互作用 双杂交技术体系
The Yeast Two -Hybrid System and Its Several Derived Systems
Huang Xinyuan 1 Fan Hongbo 2
（1. Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables ，Hubei Engineering University ，Xiaogan 432000；2.Hubei
Polytechnic Institute ，Xiaogan 432000）
Abstract: The Yeast two -hybrid（Y2H）system is a molecular biology approach to detect protein -protein interactions. A diverse series of technologies derived from it have emerged in the past 20 years, which makes this two -hybrid methodology system more complete and efficient. They have been among the most important and powerful tools to study ptotein -ligand interactions that widely used in functional genomics, proteomics and pathology study. This article provides an overview on the basic principles and application progress of Y2H system and some derived techniques.
Key words: Yeast two -hybrid（Y2H）system Protein -protein interaction Two -hybrid methodology system
子区域从而激活基因的转录。两者分开时不能激活基因转录，只有BD 和AD 通过一定方式在空间上足够靠近，才能发挥完整的GAL4转录因子活性。基于此特点，Fields 和Song ［2］设想以一对能相互作用的蛋白质为桥梁，将空间上分开的BD 和AD 彼此拉近，从而重建出具有活性的转录因子，以此创立了Y2H 系统。在该系统中，将BD 和AD 基因分别和诱饵蛋白（Bait）和猎物蛋白（Prey）基因构建成融合蛋白表达载体，使其在酵母中共表达出BD -Bait 和AD -Prey，借助Bait 和Prey 的物理性相互作用使BD 和AD 相互靠近而产生具有功能的转录因子，进而激活1个或多个报告基因（如lacZ 、HIS3和URA3等）的转录。
2 酵母双杂交系统的衍生系统
Y2H 系统是在酵母菌这种真核细胞环境中研究
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蛋白相互作用的一种技术，具有操作简便、无需繁琐的蛋白纯化操作、可以检测较弱的相互作用等优点［3］。但是也存在假阳性率较高（检测到的相互作用有20%-50%在真正生理环境下并不发生［4］）、技术灵敏度较低（一次检测只能涵盖5%-20%的真正相互作用［5］）等缺陷。针对此，很多学者不断改进试验设计和操作技术，开发出许多衍生系统，提高了传统Y2H系统的灵敏度和特异性，极大地扩展了Y2H系统的应用范围。
2.1 筛选模式的多元化
在Vidal等［6］建立的反向双杂交系统（Reverse two-hybrid system）中，使用URA3作为报告基因，其表达产物对酵母菌具有毒性，使其不能生长。当Bait和Prey没有相互作用或互相解离时，毒性报告基因不表达，菌株能正常生长。这种反向筛选（负筛选）法可鉴定出阻断蛋白间相互作用的因子，在研究蛋白质重要结构域和作用位点以及影响蛋白质结合或解离的因素等方面发挥重要作用［7］。
研究蛋白质-DNA相互作用的酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system）［8］的原理在于：Prey蛋白可直接与DNA相结合，使得与Prey融合的AD激活报告基因的表达，而无需BD-Bait蛋白参与，故被命名为“单”杂交系统，它为转录因子的分离鉴定研究提供了有效方法［9］。
某些蛋白质的相互作用需要第三个分子如小分子配体、RNA等来介导，三杂交系统（Three-hybrid system）［10］就是研究这些第三分子的技术。第三分子通过对Bait或Prey蛋白进行修饰，或诱导其构象发生改变，从而使两者产生相互作用，进而激活报告基因表达。
双诱饵酵母双杂交系统（Dual bait yeast two-hybrid system）［11］在同一酵母细胞中转入一个AD-Prey和两个不同的BD-Bait，如果一个Bait与Prey 之间有相互作用，则可激活该Bait对应的报告基因的表达，两个Bait都可以和Prey作用的话就会激活所有报告基因。它的优点是仅一次实验就能同时进行两次独立筛选，并可比较出这两对蛋白结合能力的差异。该系统被成功地应用于研究靶蛋白上的作用位点，以及药物对蛋白互作的破坏作用［12］。2.2 报告基因的改进
多个报告基因的引入有利于提高Y2H技术的灵敏度和选择性，如广泛应用的PJ69-4A酵母菌株［13］包含HIS3、ADE2和lacZ三个报告基因。Shaffer等［14］以此酵母菌为基础，改造成BAPJ69-4A菌株，加入URA3作为第4个报告基因，使得基于该菌株的Y2H既可用于正筛选，也可用于负筛选。
lacZ报告基因的转录主要靠定性或定量的β-半乳糖苷酶活性分析来检测，需要使用发色底物X-Gal，而荧光蛋白作为报告蛋白的优点在于不需要添加额外的底物，可以通过流式细胞术直接检测并分离出阳性细胞，无需繁琐的选择性培养基筛选操作。如Chen等［15］将酵母加强绿色荧光蛋白（Yeast enhanced green fluorescent protein，yEGFP）基因、Da-mon等［16］将加强黄色荧光蛋白（Enhanced yellow fluorescent protein，eYFP）基因作为报告基因引入Y2H系统，可用荧光显微镜观察报告蛋白的表达，并可方便地应用流式细胞仪来鉴定筛选蛋白质相互作用［17］。
2.3 载体构建策略的改进
在表达载体构建上的一些改进措施可以降低Y2H系统的假阳性和假阴性率。传统Y2H系统中构建的融合表达载体是将Bait或Prey蛋白与BD或AD的N端融合，Stellberger等［18］设计了两个新载体：pGBKCg和pGADCg，分别用于将BD的C端和Bait，以及AD的C端和Prey蛋白融合。在Y2H筛选中，将这两个载体和已有的两种N端融合载体联用，可形成4种不同的Bait-Prey作用组合，即NN、NC、CC和CN。经过对水痘带状疱疹病毒的70种蛋白质组合成的约4 900个候选作用配对进行测试发现，综合使用4种载体组合所筛选到相互作用是传统Y2H使用单一NN组合的两倍，显著降低了假阴性率。此外，各组合得到的相互作用结果还可以互相印证，进一步削减了假阳性率［19］。
2.4 宿主系统的扩展
细菌双杂交和哺乳动物双杂交的出现将Y2H 的宿主由酵母细胞扩展到细菌和哺乳动物细胞内。细菌双杂交系统（Bacteria two-hybrid system）由Karimova等［20］设计，利用腺苷酸环化酶缺陷型大
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黄欣媛等：酵母双杂交及其衍生系统
肠杆菌中Bait和Prey蛋白的相互作用，重建腺苷酸环化酶催化功能，引起cAMP的合成，进一步活化cAMP/CAP依赖型启动子，激活报告基因转录进而引发信号转导级联反应。该系统最大优点是细菌的转化效率比酵母更高，可综合性分析更大更复杂的蛋白互作网络，因而得到了广泛应用［21］。如Kim等［22］利用细菌双杂交筛选出人CPI-17蛋白的14个作用蛋白，其中桥粒斑珠蛋白可能参与CPI-17介导的内皮细胞骨架重组。经Battesti等［23］改良的细菌双杂交系统可适用于研究带标签的重组蛋白，而且可方便地将其基因转移到带有6-His、钙调蛋白结合肽或pBAD标签的载体上，更利于蛋白质的亲和纯化。
酵母属低等真核生物，对蛋白质的翻译后修饰水平有限，某些蛋白质在酵母中不能被糖基化、磷酸化或不能正确折叠。哺乳动物双杂交系统（Mammalian two-hybrid system，M2H）可适用于检测相互作用依赖于翻译后修饰的蛋白质［24，25］。其基本原理和Y2H系统类似，借由Bait和Prey在哺乳动物细胞中相互作用而激活报告基因的表达。哺乳动物双杂交系统内容丰富，各方法采用的表达载体、宿主细胞以及报告基因等种类各异，如MAPPIT系统（Mammalian protein-protein interaction trap system）［26］利用的是哺乳动物细胞中由蛋白相互作用引起的STAT转录因子的激活；trM2H系统（Tetracycline repressor-based mammalian two-hybrid system）［27，28］利用HEK293细胞中四环素阻遏蛋白因为Bait-Prey相互作用而形成二聚体，再和四环素操纵基因结合，进而激活报告基因GFP（绿色荧光蛋白）表达。哺乳动物双杂交系统目前仍在不断完善和发展中，广泛应用于多种哺乳动物蛋白互作研究［29］。如Guo等［30］利用M2H系统发现了p300蛋白的Ser12以及CBP蛋白的Ser92磷酸化位点分别是调节二者和β-catenin之间相互作用的重要位点。
2.5 核外双杂交系统
传统Y2H检测的相互作用发生在酵母细胞核中，而SOS募集系统（SOS recruitment system）［31］、分裂泛素系统（Split ubiquitin system）［32］以及分裂TEV蛋白酶系统（Split TEV protease system）［33］等核外双杂交系统把相互作用场所转移到了细胞核外。SOS募集系统利用待测蛋白的相互作用，将SOS蛋白从胞浆中募集到细胞膜上，激活RAS信号通路，使得温度敏感型宿主酵母菌株可以在37℃生长。该系统可用于研究膜蛋白以及在胞浆中行使功能的蛋白质，如研究拟南芥PEPINO/PASTICCINO2蛋白的膜定位［34］，水疱性口炎病毒核衣壳蛋白在HeLa细胞胞浆中的互作蛋白［35］等。
分裂泛素系统［32］将整合在膜上的Bait与泛素的C半段以及一个转录因子构建成融合蛋白，Prey 融合于泛素的N半段，Bait和Prey二者的互作将重建出完整泛素分子，使其被胞浆的泛素降解酶识别并切割，释放出和泛素C半段融合的转录因子，进而激活报告基因表达。该系统具有高度的适用性，在研究多种生物的膜蛋白互作中发挥重要作用［36］，如Harty等［37］用该系统分析了内质网膜上蛋白易位通道蛋白Sec61和Ssh1蛋白的相互作用。
由Wehr等开发的分裂烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus，TEV）蛋白酶系统［33］利用蛋白互作重建TEV蛋白酶活性，裂解作为报告蛋白的荧光或发光蛋白原，使其发光进而被检测到。该系统适用于检测哺乳动物细胞胞浆和细胞膜上的蛋白相互作用［38，39］。Gray等［40］用该系统研究了人肾上皮细胞中凋亡相关的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶caspase-3、-6和-7的功能，结果显示三者都被短暂地激活，但是只有caspase-3或-7能够诱导凋亡的发生。
2.6 定量分析技术
Y2H技术的优点之一就是可以对相互作用强度进行定量/半定量检测，主要原理是检测报告基因的激活程度。目前主要的定量方法有β半乳糖苷酶（lacZ基因编码产物）活性分析［41］，酵母菌生长曲线分析（利用HIS3基因产物影响酵母在SD-His培养基中的生长状态）［42，43］，荧光报告蛋白荧光强度检测［15］等。这些方法均检测的是报告基因转录后被翻译而成的蛋白质产物的数量，由于一些mRNA/蛋白稳定性以及翻译活性是可变的，检测蛋白质水平不一定能真实反映出基于报告基因转录活性的mRNA水平。因此Maier等［44］利用实时定量PCR（QT-PCR）法对Y2H系统中报告基因转录成的mRNA表达水平进行定量检测，经验证比传统Y2H
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的灵敏度更高，部分解决自激活（单独的Bait融合蛋白激活报告基因转录）和假阴性问题，可用于检测普通Y2H系统不适用的蛋白相互作用。
2.7 有关试验操作方法的改进和探讨
在试验操作方法上做一些改进可以提高Y2H 的筛选效率。提高酵母转化率会提升杂交信号的强度，更加有利于筛选。Lin等［45］改进了酵母的醋酸锂电转化法，使用标准浓度5倍的转化试剂，即0.5 mol/L的LiAc、50 mmol/L Tris-HCl和5 mmol/L EDTA （pH 7.5），对Y2H常用的3种酵母菌株进行电转化试验，结果使转化率显著提升到1.84×106转化子/μg DNA。
不同实验室由于使用不同的双杂交系统，或不同载体、菌株和报告基因，造成各自结果之间差异很大［46］。Liu等［47］的研究表明，培养基的不同配制方法和酵母氮源的来源不同也会影响信号的强度，以及结果是否呈现为阳性或阴性，因而认为更换培养基配方可能会减少各独立试验之间的信号差异，研究报告中培养基配制方法必须详细描述以利于不同试验结果的准确对比和进行重复研究。
在大规模的Y2H矩阵筛选操作方面，为使结果更加严谨，Worseck等［48］提出以下要求：（1）载体上使用很弱的启动子，使Bait和Prey融合蛋白极低水平表达，即用Western Blot检测酵母总蛋白裂解液也不能够检出；（2）使用最严谨的报告基因（如HIS3），即使是长期培养后，报告基因也不能在没有Prey-Bait相互作用时激活；（3）为检测较弱的相互作用，试验操作中必须使用新鲜的酵母菌，并进行重复试验。
3 酵母双杂交的应用
Y2H及其衍生系统的应用范围广泛，由最初的研究蛋白质之间相互作用扩展到研究蛋白质和DNA、RNA以及其他小分子等配体间的相互作用。在细胞信号转导、免疫学、病理学以及蛋白质组学等领域发挥重要作用。
3.1 筛选已知蛋白质在cDNA文库中的相互作用对象
应用Y2H系统筛选cDNA文库中和已知蛋白有相互作用的蛋白质已经成为研究已知蛋白新功能主要途径。主要操作流程为：以已知蛋白作为Bait，在指定的cDNA文库中筛选出有报告基因激活的阳性酵母克隆，从中分离纯化出Prey载体，测定其DNA序列，在GeneBank中获取该序列信息，即可获知Prey蛋白的相关信息。Yoon等［49］用Y2H系统筛选出拟南芥中赤霉素受体GID1直接作用的信号转导蛋白DELLA，以及一种抑制这种相互作用的化合物：TSPC（3-（2-thienylsulfonyl）pyrazine-2-carbonitrile），该研究对于研究植物中赤霉素信号通路具有重要意义。Kim等［50］为研究黑腹果蝇中刺激转录延伸的关键因子Cyclin T/CDK9异源二聚体的组装方式，利用大规模Y2H筛选法鉴定出该复合物的温度敏感型变异体，表明两者结合的关键在两者作用界面的α2和α3螺旋上，该突变体通过影响Cyclin T 的构象直接或间接干扰Cyclin T和CDK9的结合。3.2 绘制蛋白质相互作用网络图谱
机体内蛋白质之间的复杂的相互作用网络是相互作用物组（Interactome）的一个重要组成部分，对该网络作图也是蛋白质组学的重要研究内容。目前开发出的一些高通量Y2H方法，可以对多达数千的候选蛋白进行筛选，是绘制蛋白质相互作用网络图谱的重要手段。在这一技术的辅助下，一些模式生物的蛋白互作组草图相继被绘制，如：酵母［51，52］、黑腹果蝇［53］、人类［54，55］及秀丽新杆线虫［56］等。现今对蛋白互作组图谱的描绘越来越精细，如对胞内核心信号通路——MAPK信号通路所涉及的蛋白互作网络进行分析，对于更好地揭示细胞信号转导机制具有重要意义。Bandyopadhyay等［57］用Y2H筛选出人MAPK相关蛋白和其他胞内蛋白之间的2 269对相互作用，对其进行作图，经分析发现其中641对互作在酵母中也存在，这种保守性证明这些作用对在信号网络中起核心作用。Singh等［58］也对水稻的MAPK互作组进行了系统性的图谱绘制，找出了MAPK的74个非冗余作用对象，对这些蛋白进行基因本体分类分析发现其归属于34种功能类别，提示MAPK参与多种重要生理功能。
3.3 研究疾病作用原理
利用Y2H系统研究一些疾病相关蛋白的作用靶标可以为更好地揭示疾病的发病机制提供思路。Chen等［59］发现被SARS病毒侵染的宿主细胞中，
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黄欣媛等：酵母双杂交及其衍生系统
病毒的解螺旋酶可以和Ddx5（Asp-Glu-Ala-Asp box polypeptide 5）蛋白结合，抑制Ddx5的表达可以抑制SARS病毒的复制，提示Ddx5在SARS病毒-宿主相互作用中起重要作用。Silva等［60］利用Y2H系统筛选出登革热病毒糖蛋白NS1在人肝脏中的一个新作用蛋白C1q，后续试验表明，NS1和C1q的作用在补体系统和登革热病毒感染病理进程中起重要作用。
在癌症机理研究方面，Lopez-Mateo等［61］利用Y2H筛选出抑癌蛋白p53的一个作用蛋白：转录因子CREBZF。CREBZF的表达可增强p53的转录活性，保护HCT116细胞免受紫外线诱导的细胞死亡，还使得细胞对5-氟尿嘧啶这种能活化p53的抗癌化学治疗药物敏感，提示CREBZF对p53的抑癌活性起正调作用，是一个重要的癌症调节因子。
3.4 筛选药物作用靶点以及新药开发
Y2H及其衍生系统在药物研究方面有着非常广泛的应用，如筛选和验证药物的作用靶点、研究药物对蛋白互作的调控作用、筛选和设计新药等［62］。在研究抗体性药物的作用位点方面，Vielemeyer等［63］报道了以Y2H技术为基础的一种高效的方法：以单链抗体（scFv）作为Bait，筛选高复杂度的cDNA文库，对得到的cDNA片段进行多重比对可获知其上的选择性相互作用域（SID）信息，从而高效地定位抗体靶标蛋白上的表位区域。他们筛选到AA2和ROF7这两种scFv的专一性作用靶标：小GTP酶Rab6和Rab1。这种结合具有构象特异性，只有当靶标蛋白包含整个SID核心区域才能够被筛选到。由此可见，该方法具有很高的特异性。也可将已知蛋白作为Bait，筛选与之结合的scFv。如Ding等［64］成功筛选出3种与人IL-8特异性结合的scFv。
在抗病毒药物开发方面，Urano等［65］利用SOS 募集系统从20 000个候选的小分子中筛选出抑制人免疫缺陷病毒（HIV）Gag蛋白装配的化合物BMMP （2-（benzothiazol-2-ylmethy-lthio）-4-methylpyrimidine），若以BMMP为基础，可设计开发出新的抗HIV病毒药物。
4 结语
Y2H是试验技术发展和酵母遗传学相结合的产
物，其原理在于通过一对蛋白的相互作用将转录因子活性进行重建，这种自我重组装/功能重建的概念催生了一大批相关的衍生技术，揭示了细胞中大量复杂的生物大分子互作网络，为进一步解码这些作用网络的功能提供基础［66］。这些相关的改进包括：设计新的筛选方案、改进载体和菌株、使用酵母以外的生物作为宿主、反向筛选法、分析蛋白质和DNA、RNA或其他配体相互作用、检测胞浆或细胞膜上蛋白互作、开发其他的可以被分裂拆开的报告蛋白（如泛素、荧光蛋白、荧光素酶和腺苷酸环化酶等）等。Y2H及其衍生系统共同组成一套内容丰富的“双杂交”技术体系，是研究生物大分子相互作用的重要手段。Y2H系统创始人Fields展望了这一技术体系的前景［66］：随着试验技术的进步和研究者的不断努力，以及生物分子优良的工具属性被深入揭示，双杂交这一技术体系会不断向前发展，内涵会更加丰富，应用平台会更加广阔。
参 考 文 献
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（责任编辑狄艳红）
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的 结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113 个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而 转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不 能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只 有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细 胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建 成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱 饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立 为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂 交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活 报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性 原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只 有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备， 并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基 的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别
目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
酵母双杂交系统原理 https://www.doczj.com/doc/c810045302.html, 2005-6-5 16:04:32 来源：丁香园 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
酵母双杂交系统及其应用 Y east Two-hybrid System and Its Application 1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生物学特性 （1）单细胞真核生物 尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。 （2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少； 1996年已完成酵母全基因组测序（ 1.5 x 107 bp），是第一个被测序的真核生物。大约有6000个基因。目前已经建立了一个6000个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。其中5000多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。 （3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖 在指数生长期每90分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。 （4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析 酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。 有两种单倍体细胞类型，分别为a型和α型。在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/α双倍体细胞。在营养匮乏时，a/α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。 一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒 bud，芽, 蓓蕾starvation，饥饿, 饿死 ascus，n.[微生物]子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂 haploid，n.[生物]单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的 diploid，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体 ascospore，n.[植]囊孢子 rupture，v.破裂, 裂开, 断绝(关系等), 割裂。n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂 spore，n.孢子vi.长孢子germinate，v.发芽, 发育, 使生长
酵母双杂交系统的发展和应用 随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY 载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。 基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。
酵母双杂交技术的研究与应用 摘要：酵母双杂交系统是在20世纪90年代初发展起来的利用遗传学方法在酵母真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的一种高度灵敏的分子生物学技术，它可以有效分离新基因或新的能与一种已知蛋白相互作用的蛋白质及其编码基因，被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域，已成为分子生物学研究领域的重要实验手段之一，获得了许多有价值的重要发现。 关键词：酵母双杂交系统；蛋白质组学；功能基因组学Abstract:Yeast two-hybrid system is a highly sensitive molecular biology technique,which uses genetic methods to study protein-protein interaction in eukaryotic yeast cells,developed in the early 1990s.It can effectively separate new genes or new protein which has interaction with a known protein and protein-coding genes, is widely used in the field of proteomics, cellular signal transduction and functional genomics, has become one of the important experimental methods in the molecular biology areas, gained a lot of valuable important discovery. Key words:Yeast two-hybrid system;Proteomics;Functional Genomics.
酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
酵母双杂交系统及其应用 Yeast Two-hybrid System and Its Application 1. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生物学特性 （1）单细胞真核生物 尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。 （2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少； 1996 年已完成酵母全基因组测序（1.5 x 10 7 bp ），是第一个被测序的真核生物。大约有6000个基因。目前已经建立了一个6000 个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。其中5000 多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。 （3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖 在指数生长期每90 分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。 （4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析 酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。 有两种单倍体细胞类型，分别为a 型和α型。在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/ α双倍体细胞。在营养匮乏时，a/ α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4 个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒bud，芽, 蓓蕾starvation ，饥饿, 饿死ascus，n.［微生物］子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂 haploid，n.［生物］单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的diploid ，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体ascospore，n.［植］囊孢子rupture，v.破裂, 裂开, 断绝（关系等）, 割裂。n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂 germinate，v.发芽, 发育, 使生长 spore，n.孢子vi. 长孢子
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术 1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb） 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。
噬菌体载体构建基因组文库
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4 LexA DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。cDNA 文库或DNA 与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA
模块七蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理 1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5）通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成，还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。 现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物
酵母双杂交 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立i 。 典型的真核生长转录因子，如GAL4 GCN4等都含有二个不同的结构域：DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。 基本原理 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而 且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白—蛋白的相互作用。主要有二类载体：a 含DNA -binding domain 的载体；b 含DNA-activating domain 的载体。 上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读 框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱 动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequenee)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用bin di ng-doma in 基因有：GAL4(1-147); LexA (E coli 转录抑制因子)的DNA-bd 编码序列。常用的activating-domain 基因有：GAL4(768-881)和 疱疹病毒VP16的编码序列等。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点：〈1〉易于转化、便 于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。 〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA-结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd);另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活
模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白
LexA酵母双杂交系统简介 一、LexA酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。 根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。 如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。 二、商品化酵母双杂交系统的组成 1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库 2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株） 3. 大肠杆菌菌株： KC8株 4. 对照质粒：
20世纪80年代中、后期，真核转录因子得到大量深入的研究，这类研究促成了酵母双杂交系统的诞生。研究发现，真核转录因子的DNA结合区（BD）和转录结合区(AD)在功能上和实质上都是可分的。BD能把蛋白定位到基因组特定DNA序列上，AD能够使转录装置激活基因转录。1985年研究证明，将2种不同蛋白的BD与AD重组，仍能产生有活性的转录因子。后来，一些研究人员发现AD与BD不必在1条多肽上。当这两个区域单独存在时均没有转录激活功能，但当它们在空间上彼此联系时，则能够激活基因转录。Fields和Song证实利用这一特性建立了酵母双杂交系统。 酵母双杂交的原理：将2个目的蛋白分别与AD和BD融合产生新的融合蛋白，如果这2个目的蛋白能够互相作用，则该相互作用会促使AD和BD互相靠近而产生有活性的转录因子，进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。 Gal4和LexA系统：Gal4和LexA系统均是依赖转录激活报告基因来检测蛋白相互作用的。 Gal4和LexA系统可用于 1、检测2个已知蛋白间的相互作用 2、从表达文库中筛选相互作用蛋白 3、用于鉴定蛋白相互作用区域 造成假阳性的原因有很多，归纳起来主要有以下几点 1、诱饵蛋白本身有激活作用； 2、靶蛋白本身就比较“黏”，不需诱饵蛋白的介导便可与报告基因的上游激活序列有直接作用，进而激活报告基因的转录；或者，靶蛋白同启动子区域上结合的其他蛋白质（而非诱饵蛋白）发生了相互作用，导致转录激活； 3、不在细胞同一时相、同一组织表达的蛋白质，相互之间也可能发生作用，尽管如此，这种相互作用是机械的而不是生理意义上的 4、还有一些假阳性结果产生的途径尚不能解释 假阴性的成因主要有： 1、Gal4和LexA系统要求被测蛋白定位于细胞核，然而有些蛋白却有强疏水结构域，还有些蛋白携带定位于细胞其他细胞器的强信号，这样，涉及后2类蛋白的相 互作用在Gal4和LexA系统中就检测不到 2、Gal4和LexA系统依赖转录激活报告基因而检测蛋白相互作用，而如果蛋白是抑制基因表达的，报告基因就不能被激活转录，双杂交系统就检测不到该蛋白相互作用了。 正是为了解决，Gal4和LexA系统这些固有的问题，以下系统才得以发展： 酵母双杂交系统常用的DNA结合结构域有GAL4和LexA，常用的转录激活结构域有GAL4、VP16或B42。 酵母菌株：为双杂交系统而改造的酵母菌株包含不同拷贝的上游激活序列。菌株L40多用于Lex40系统，该菌株lacZ报告基因（编码B-半乳糖苷酶）上游包括8拷贝的上游激活序列。菌株HF7c一般用于基于GAL4的酵母双杂交分析，在lacZ报告基因的上游只有3拷贝的GAL4上游激活序列。 酵母双杂交系统的报告基因通常由一些营养选择标记（如HIS3基因的转录激活能使酵母在缺乏组氨酸的培养基上生长）或编码酶的基因（MEL1基因的转录激活能使酵母产生a-半乳糖苷酶）组成。 目前, 酵母双杂交系统及其衍生方法广泛用于研究蛋白- 蛋白之间的相互作用、蛋白与其它分子相互作用, 筛选未知蛋白, 研究蛋白的功能等领域。利用它已揭示了大量未知蛋白质的相互作用。现在该系统已经尝试在药物机理研究方面的应用, 且有望用于研究蛋白质多复合
?技术与方法? 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期 生物大分子间的相互作用是有机体细胞活动的基础，在蛋白质层面上揭示生命活动本质是现代生物学的一个主要目标。1989年诞生的酵母双杂交（Yeast two -hybrid，Y2H）系统以及随后出现的各种衍生系统是研究蛋白质之间以及蛋白质和RNA、小分子化合物之间相互作用的最重要的工具，已成功揭示了大量的蛋白相互作用，在细胞信号转导、蛋白质组学、病理学、药物研发等方面有着广泛应用［1］。本文对Y2H 系统的基本原理、衍生系统和应用进展等方面进行介绍。 1 酵母双杂交系统的原理 酵母GAL4转录因子由两个可以分开的结构域组成：DNA 结合域（DNA binding domain，BD）负责结合基因的上游激活序列，将转录激活域（Transcriptional activation domain，AD）募集到启动 收稿日期：2013-08-03基金项目：特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室开放基金项目（2013K04）作者简介：黄欣媛，女，博士，研究方向：生物化学与分子生物学；E -mail ：huangxycn@https://www.doczj.com/doc/c810045302.html, 酵母双杂交及其衍生系统 黄欣媛1 范红波2 （1.湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，孝感 432000；2.湖北职业技术学院，孝感 432000） 摘 要： 酵母双杂交系统是一种研究蛋白质相互作用的分子生物学方法，过去20多年里，大量衍生系统的出现使得这套双杂交技术体系更加完善和高效，成为研究蛋白质-配体相互作用的重要技术手段，广泛应用于功能基因组学、蛋白质组学、病理学等研究领域。对酵母双杂交及其衍生系统的基本原理和应用进展进行综述。 关键词： 酵母双杂交系统 蛋白质相互作用 双杂交技术体系 The Yeast Two -Hybrid System and Its Several Derived Systems Huang Xinyuan 1 Fan Hongbo 2 （1. Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables ，Hubei Engineering University ，Xiaogan 432000；2.Hubei Polytechnic Institute ，Xiaogan 432000） Abstract: The Yeast two -hybrid（Y2H）system is a molecular biology approach to detect protein -protein interactions. A diverse series of technologies derived from it have emerged in the past 20 years, which makes this two -hybrid methodology system more complete and efficient. They have been among the most important and powerful tools to study ptotein -ligand interactions that widely used in functional genomics, proteomics and pathology study. This article provides an overview on the basic principles and application progress of Y2H system and some derived techniques. Key words: Yeast two -hybrid（Y2H）system Protein -protein interaction Two -hybrid methodology system 子区域从而激活基因的转录。两者分开时不能激活基因转录，只有BD 和AD 通过一定方式在空间上足够靠近，才能发挥完整的GAL4转录因子活性。基于此特点，Fields 和Song ［2］设想以一对能相互作用的蛋白质为桥梁，将空间上分开的BD 和AD 彼此拉近，从而重建出具有活性的转录因子，以此创立了Y2H 系统。在该系统中，将BD 和AD 基因分别和诱饵蛋白（Bait）和猎物蛋白（Prey）基因构建成融合蛋白表达载体，使其在酵母中共表达出BD -Bait 和AD -Prey，借助Bait 和Prey 的物理性相互作用使BD 和AD 相互靠近而产生具有功能的转录因子，进而激活1个或多个报告基因（如lacZ 、HIS3和URA3等）的转录。 2 酵母双杂交系统的衍生系统 Y2H 系统是在酵母菌这种真核细胞环境中研究