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SDS-PAGE所有详细试剂配方

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SDS-PAGE

30%聚丙烯酰胺溶液-----30%(w/v)Acrylamide

【组分浓度】

各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)

30%Acr-Bis(29:1) 1000ml 100ml

29%Acrylamide(丙烯酰胺) 290g 29g

1%BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺) 10g 1g

【配制方法】

将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热(37℃左右)的去离子水中,充分搅拌溶解,补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质,储于棕色瓶,4℃避光(用铝箔纸包扎起来)保存。严格核实PH不得超过7.0,因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。如有沉淀,可以过滤。

【保存条件】

4℃避光(用铝箔纸包扎起来)保存

【注意事项】

丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收,其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能含有少量未聚合材料。

1MTris-HCL(pH6.8)(浓缩胶buffer)

【组分浓度】1MTris-HCL

名称用量备注

Tris 12.1g

去离子水80ml

浓盐酸9ml (36%的浓盐酸)预实验已确定

去离子水加入去离子水定容至100ml后,室温保存

【配制方法】

称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水,充分搅拌溶解,加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH 值(7.4-大约0.7mL,7.6-大约0.6mL,8.0-大约0.42mL),将溶液定容至1L,高温高压灭菌后,室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。

【保存条件】

室温保存。

【注意事项】

对人体有刺激性,请注意适当防护。

1.5MTris-HCL(pH8.8)(分离胶buffer)

【组分浓度】1.5MTris-HCL

名称用量备注

Tris 18.17g

去离子水80ml

浓盐酸3ml (36%的浓盐酸)预实验已确定

去离子水加入去离子水定容至100ml后,室温保存

【配制方法】1L

称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水,充分搅拌溶解,加浓HCL调节所需要的pH值=8.8,将溶液定容至1L,高温高压灭菌后,室温保存。(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL 混合,加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。)

【保存条件】

室温保存

【注意事项】

应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。

10%十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%(w/v)SDS

【组分浓度】10%(w/v)SDS

名称用量备注

SDS 10g

去离子水80ml 加入去离子水定容至100ml后,室温保存

【配制方法】

称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中,加入约16ml的去离子水,68℃加热溶解,滴加浓盐酸调节PH至7.2,定容至20ml后,室温保存

【保存条件】

室温保存

【注意事项】

对人体有害,请注意防护。

10%过硫酸铵溶液-----10%(w/v)AP

【组分浓度】10%(w/v) 过硫酸铵

名称用量备注

过硫酸铵0.1g

去离子水1ml 现配现用

【配制方法】

称取0.1g过硫酸铵置于1.5ml离心管,加1mL去离子水吹打溶解,4℃保存

【保存条件】

4℃保存

【注意事项】

10%过硫酸铵溶液在4℃保存时,可使用2周左右,超过期限会失去催化作用

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液----- 5×Tris-Glycine buffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)【组分浓度】

各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)

1000ml 500ml

0.125M Tris 15.1g

1.25M glycine(甘氨酸) 94.0g

0.5%(W/V)SDS 5.0g

【配制方法】

称取15.1gTris,94.0g甘氨酸(glycine),5.0gSDS,用800ml蒸馏水或去离子水溶解,充分搅拌溶解,定容至1000ml,室温保存。得0.125mol/L Tris-1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释5倍。

【保存条件】

室温保存,两年有效。

【注意事项】

配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。

电泳缓冲液可以回收,回收后可再使用1-2次,但为了取得最佳的电泳效果,应使用新电泳液。

5×SDS-PAGE加样缓冲液----- 5×SDS-PAGE Loading Buffer

【组分浓度】0.25MTris-HCL(pH6.8);

10%(W/V)SDS;

0.5%(W/V) BPB(溴酚蓝);

50%(V/V) 甘油;

5%(W/V)β-巯基乙醇(2-ME)

各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)

5ml 3ml

1MTris-HCL(pH6.8) 1.25ml

SDS 0.5g

BPB(溴酚蓝) 25mg

甘油 2.5ml

(0.5mL/份)分装,室温保存,使用前加25μL 2-ME/小份,保存一个月左右。

β-巯基乙醇(2-ME) 0.25ml

【配制方法】

量取1.25mL 1MTris-HCL(pH6.8),0.5g SDS,25mg BPB,2.5mL甘油,置于10mL塑料离心管中,加去离子水溶解后,定容至5mL,小份(0.5mL/份)分装,于室温保存。使用前将25μL的2-ME加入到每小份中。加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。

【保存条件】

-20℃保存,至少一年有效。

【注意事项】

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)中含少量DTT和巯基乙醇,有轻微刺激性气味,必须完全溶解后再使用。摘自Takara 商品目录--实验室常规试剂配制方法

TEMED原液直接使用

考马斯亮蓝R-250染色液

【组分浓度】0.1%(w/v)考马斯亮蓝R-250,25%(v/v)异丙醇,10%(v/v)冰醋酸

各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)

1000ml 400ml 备注

考马斯亮蓝R-250 1.0g0.4g

异丙醇250ml100ml 搅拌溶解,可用甲醇替代

冰醋酸100ml40ml 搅拌均匀

去离子水650ml260ml 搅拌均匀,滤纸除去颗粒物,室温保存

考马斯亮蓝染色脱色液

【组分浓度】10%(v/v)醋酸,5%(v/v)乙醇

名称用量备注

冰醋酸100ml

乙醇50ml

去离子水850ml 充分混匀后使用

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