分子生物学期末复习资料检疫1111班
考试题型：1、单项选择（1分/题，共50题）；2、多项选择（分/题，共10
题）；3、名词解释（2分/题，共5题）；4、问答题（共15分，4题）；5、论述题（共10分，1题）
第二章基因与基因组
一、基因的概念
（一）基因概念的发展
1、孟德尔：一个因子决定一种性状。
2、摩尔根：性状单位，突变单位和交换单位。
3、顺反子：功能单位，决定一条多肽链的表达
4、操纵子：基因表达调控单元（原核）
?结构基因、调节基因（可表达）
?控制基因（启动基因和操纵基因）
（二）现代基因概念的发展
1、重叠基因：一个基因包含或部分包含另一基因
2、断裂基因：内部含间隔区，即由外显子和内含子互相间隔组成的嵌合体
3、跳跃基因：转座元件，可移动遗传元件
4、假基因：拟基因，没有功能，序列与功能基因相似。
（三）基因的分子生物学定义
是编码多肽链或RNA的DNA片段，包括编码序列：外显子(exon)、插入序列：内含子(intron)、侧翼序列：含有调控序列
（四）基因组
基因组：一个细胞或病毒的全部遗传信息
二、病毒基因组
1、病毒基因组核酸的类型（7种）
双链DNA（dsDNA）病毒；单链DNA（ssDNA）病毒；双链RNA（dsRNA）病毒；单链正链RNA病毒；单链正链RNA病毒；逆转录RNA病毒；逆转录DNA病毒
2、病毒基因组的特点
?一种核酸，DNA/RNA ，线性或环形
?大小相差很大；
?一般为单拷贝；
?一条或几条核酸链；
?连续或间隔；
?编码序列大于90%；
?相关基因往往丛集形成一个功能单位或转录单元；
?有重叠基因。
三、原核生物基因组
1、原核生物基因组特点
（1）一般由一条环状双链DNA分子组成；
（2）通常只有一个DNA复制起点；
（3）结构基因大多组成操纵子；
（4）编码序列不重叠
（5）没有内含子
（6）编码序列（结构基因）在基因组中所占比例较大，基因密度非常高（非编码—调控序列）
（7）结构基因多为单拷贝，rRNA基因为多拷贝；
（8）有编码同工酶的同基因（isogene）
（9）转座现象：插入序列和转座子等
（10）具有多种功能识别区域（往往具有特殊的序列，并且含有反向重复序列。）
2、质粒（Plasmid）
（1）质粒是存在于细菌染色体外的(也可整合），具有自主复制能力的环状双链DNA分子；大小为2-3 kb。
（2）质粒的特性
在宿主细胞内可自主复制；细胞分裂时恒定地传给子代；所携带的遗传信息能赋予宿主特定的遗传性状；质粒可以转移。
四、真核生物基因组
（一）真核生物基因组的组成
1、基因和基因相关DNA序列：包括编码的DNA序列和非编码的DNA序列（如
内含子、基因片段和假基因等）
2、基因外DNA序列：包括各种重复序列以及非编码的单拷贝、低拷贝序列（二）真核生物基因组DNA序列的分类
1、高度重复序列（重复次数>106次,约占5％）
（1）卫星DNA：大卫星DNA；小卫星DNA；微卫星DNA。
（2）反向重复序列
2、中度重复序列（短散在重复片段；长散在重复片度）
3、低度重复序列（单拷贝序列，大多数编码蛋白质的结构基因属于单拷
贝单拷贝序列）
（三）真核生物基因组的结构特点
①基因组庞大
②大部分为非编码序列
③大量重复序列
④转录产物为单顺反子
⑤断裂基因
⑥功能相关的基因构成基因家族
⑦存在逆转录转座子
⑧大量顺式作用元件
⑨ DNA 多态性⑩端粒结构
五、基因组学
1、人类基因组计划
“四图”：遗传图、物理图、转录图、序列图
2、结构基因组与功能基因组学
3、后基因组学研究的重要领域
第四章基因表达调控（重点）
★本章考试重点考的内容：（只是一些重点，其他还得看书！）
1、名词解释：操纵子；启动子；组成型基因（管家基因）；弱化子（衰减子）；
顺式作用元件；反式作用因子等
（1）操纵子：原核生物中为功能相关的几个蛋白质编码的一组结构基因，加上启动序列、操纵序列以及其它调节序列串联组成的转录单位。（2）启动子（启动序列）：DNA聚合酶结合位点周围的一组转录调控组件，至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件。
（3）组成型基因（管家基因）：控制代谢过程中必须的、其合成速率不受环境变化或代谢途径影响的蛋白质即组成型蛋白质合成的相关基因。或
在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达得基因。
（4）弱化子（衰减子）：一些操纵子中位于操纵区和结构基因之间的一段能终止转录作用的DNA序列。这种终止作用是可以被调节的。
（5）顺式作用元件：真核生物中对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处一个DNA分子上的基因。
（6）反式作用因子：真核生物中编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不在同一个DNA分子上的一类蛋白质调节因子，也称为转录因子。
2、问答题或论述题：
（1）原核生物基因表达调控特点。
①原核生物的转录和翻译过程几乎同步进行；
②原核基因表达得调控可以在DNA、转录和翻译三个不同层次进行，主
要的调节方式为转录水平上的调控，有正负调控两种机制；
③原核生物的转录及其调控主要以操纵子为单位进行。
（2）论述乳糖操纵子的结构及正负调控机制。
①乳糖操纵子的结构（看书）；
②阻遏蛋白的负性调节：lacⅠ表达的阻遏蛋白与lacO结合，阻止RNA
聚合酶起始转录结构基因，异乳糖可结合阻遏蛋白，使其变构而
与lacO解离。
③CAP的正性调节：cAMP与CAP结合，启动正性调节，CAP-cAMP复合物
结合在乳糖启动序列附近的CAP位点，促进结构基因转录。
④协调调节：当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；但如
果没有CAP来加强转录活性，即使阻遏蛋白从操纵序列上解离仍
几无转录活性。
有葡萄糖而没有乳糖的调节下：在葡萄糖代谢的影响下cAMP浓度低，CAP-cAMP复合物少而无法启动正调节。没有乳糖二无法产生异构
乳糖，阻遏蛋白与lacO结合，乳糖操纵子不表达。
乳糖和葡萄糖都存在的条件下：在葡萄糖代谢的影响下cAMP浓度低，CAP-cAMP复合物少而无法启动正调节。有乳糖可产生异构乳糖，
异乳糖可结合阻遏蛋白，使其变构而与lacO解离，而乳糖操纵
子不表达。
有乳糖而无葡萄糖的条件下：无葡萄糖cAMP浓度高，CAP-cAMP复合物结合在乳糖启动序列附近的CAP位点，有乳糖可产生异构乳糖，异
乳糖可结合阻遏蛋白，使其变构而与lacO解离，乳糖操纵子表
达。
（3）论述色氨酸操纵子的结构与调控机制。
①色氨酸操纵子包括：启动子、调节基因及五个结构基因，分别编码色氨
酸合成有关的五种酶。
②色氨酸操纵子具有负控阻遏调节系统：环境中有色氨酸时，色氨酸与阻
遏蛋白结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合关闭色氨酸mRNA
的转录。
③色氨酸操纵子还具有弱化子调节系统：弱化子是具有终止作用的DNA序
列，这种终止作用是可以被调节的。
弱化子调控的过程：色氨酸操纵子具有前导序列，弱化子位于前导序列上。
前导序列可分为1、2、3、4区，其中可出现1区和2区配对，3
区和4区配对或2区与3区配对的两种情况。当出现1区与2区
配对，3和4区配对时是终止转录信号，而2区与3区配对是可
以继续转录下去。当环境中色氨酸浓度高时，形成1区与2区配
对，3和4区配对，当环境中色氨酸浓度低时，形成2区和3区
配对，RNA聚合酶可以通过弱化子，使转录继续进行。这个阶段
的调控是trp操纵子的细微调控。
一、概述
1、基因表达调控
（1）基因表达过程内受到精密的调控，以保证功能的有序性。
（2）对环境的适应，相关的应答
（3）时间特异性
（4）空间特异性/细胞特异性
（5）多层次：基因水平；转录水平；转录后水平；翻译水平；翻译后。2、原核与真核生物
最常见的调控：转录过程的调控
3、基因表达方式（组成型表达& 诱导和阻遏表达）
（1）组成性基因表达（基本的基因表达）
管家基因的表达，它只受启动子与RNA聚合酶相互作用的影响
管家基因/持家基因(housekeeping gene) ：
①指在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行表达的基因；
②其基因表达产物通常是对生命过程必需的或必不可少的，且较少受环境因素的影响。
（2）诱导和阻遏表达
诱导（induction）：是指在特定环境因素刺激下，基因被激活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。
DNA损伤→修复酶基因激活
乳糖→利用乳糖的三种酶表达
阻遏（repression）：是指在特定环境因素刺激下，基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。
色氨酸—色氨酸合成酶系
4、调控特点
（1）原核生物
①转录水平调节为主；
②σ因子决定RNA聚合酶识别特异性；
③多个翻译起始区：一条多顺反子mRNA, 多个SD序列
④操纵子（元）模型的普遍性（on-off）：多顺反子转录，通过调控单个
启动基因的活性来完成协调表达
⑤操纵子类型：诱导型：乳糖操纵子（阻遏蛋白与阻遏机制，负性调节
主导）；阻遏型
（2）真核生物
①活性染色体结构变化：对核酸酶高度敏感、拓扑结构变化、DNA碱基修
饰、组蛋白减少；
②正性调节占主导；
③转录与翻译分隔进行；
④转录后修饰、加工。
二、原核生物基因表达调控
（一）基本概念
1、结构基因&调节（控）基因
①结构基因: 编码蛋白质或RNA的任何基因。
原核生物的结构基因一般成簇排列，真核生物独立存在。
②调节基因：编码基因调节物（ RNA或蛋白质）的编码基因。
其编码产物与DNA上的特定位点结合调控基因表达。
2、操纵基因&阻遏蛋白
操纵基因（operator gene，O）：调节蛋白特异性结合的一段DNA序列；调节蛋白（阻遏蛋白）结合在操纵基因的序列上，会影响其下游基因
转录的强弱
3、组成型蛋白&调节蛋白
（1）组成型蛋白
（2）调节蛋白：可影响基因的表达
正调节蛋白（激活蛋白）；负调节蛋白（阻遏蛋白）；
阻遏蛋白（repressor）: 调节基因编码，阻止基因表达的蛋白质，可与操纵基因结合来阻止转录或结合RNA来阻止蛋白质的翻译。
（二）原核生物操纵子模型
（1）操纵子学说---转录水平的调控
操纵子(operon)：原核生物基因表达和调控的一个完整单元，包括调节基因，启动子和操纵基因(Operator) 及相邻的结构基因。操纵基
因受调节基因产物的控制。
（2）操纵子特性：
①操纵子转录、翻译出的蛋白质通常是：在一个代谢途径中催化不同反应
步骤的酶；
②操纵子转录的频率随着细胞生长环境的不同而改变；
③操纵子分为结构区和调控区两部分。
调控区包括聚合酶结合的启动基因（promoter,P）与阻遏蛋白结合的操纵基因。
（3）正调控系统和负调控系统
操纵子调控系统的基本类型：
负性调控：减弱或阻止其调控基因转录，
可诱导负调控系统；可阻遏负调控系统
正性调控：增强或起动其调控基因转录，
可诱导正调控系统；可阻遏正调控系统
（4）基本概念（具体的看课本！）
操纵子；结构基因；调节基因；启动子；操纵基因；诱导物/效应物；
辅阻遏物：使阻遏蛋白具有活性或使活性蛋白失去活性的物质；
正调控；负调控。
（三）乳糖操纵子模型(lac operon)（具体看课本123--127！）
1、乳糖操纵子(lac operon)的结构
Z编码β-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖
Y编码β-半乳糖苷透过酶：使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。
A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。
结构基因：三个
调控序列
?调节基因（lac I）
?操纵基因lac O（operator）:回文序列，提供给阻遏蛋白识别的位点?启动子：lac P（promotor）
?CAP结合位点：代谢基因激活蛋白；原核生物，分解代谢都有此位点
乳糖为诱导物
2、乳糖操纵子的调节机制
阻遏蛋白和CAP的双重调控
阻遏蛋白的负性调节
CAP的正性调节
协调调节
(四)色氨酸操纵子（具体看课本127—131！）
1、负责色氨酸的生物合成
足够的色氨酸时，操纵子自动关闭；缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达；色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。
由于trp体系参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。2、色氨酸操纵子的结构
3、色氨酸操纵子的特点
(1) trpR(89’)和trpABCDE(25’)不连锁；
(2) 操纵基因在启动子内
(3) 有衰减子(attenuator)
前导区内，类似终止子的一段DNA序列，辅助阻遏作用的转录调控
(4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被前导顺序(Leader)所隔开
4、色氨酸操纵子表达的调控方式
阻遏系统：通过阻遏蛋白的负调控
弱化系统：通过衰减子作用
前导肽/衰减子的序列结构
转录的弱化效应（转录衰减机制
（五）阿拉伯糖操纵子（arabinose operon）
1、Ara操纵子模型
（1）基因组成
结构基因：araA、araB和araD
分别编码L－阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶和L－核酮糖－5－磷酸－4－差向异构酶。
基因E、F：负责转运阿拉伯糖进入细胞。
2、AraC蛋白的正、负调节作用
（1）AraC蛋白的负调节作用
没有阿拉伯糖时，AraC蛋白同时与araC位点及远距离的-280区结合，造成DNA链的扭曲，不能起始mRNA的转录。
（2）AraC蛋白的正调节作用
正调节蛋白是激活蛋白，它存在时，被控制的基因表达。
Ara存在时，AraC蛋白与阿拉伯糖形成C蛋白·阿拉伯糖复合物，复合物与启动子区的AraC位点结合，激活PBAD，活化RNA聚合酶，使结构基因mRNA 正常转录，产生上述3种酶，完成调控。
★有葡萄糖，cAMP↓，没有cAMP-CAP
AraC蛋白：抑制形似（Pr），与AraC位点结合
RNA聚合酶很少再与Pc结合，araC基因受到抑制
整个系统几乎处于静止状态。
没有葡萄糖，也没有阿拉伯糖
有cAMP-CAP与操纵区位点相结合，AraC蛋白仍以Pr形式为主，无法与操纵区B位点相结合，无araBAD mRNA转录。
无葡萄糖，有阿拉伯糖时，大量araC基因产物以Pi形式存在，并分别与操纵区B、A位点相结合，在cAMP-CAP的共同作用下，araC和
araBAD基因大量表达，操纵子充分激活。
没有葡萄糖，也没有阿拉伯糖，因为没有诱导物，尽管有cAMP-CAP与操纵区位点相结合，AraC蛋白仍以Pr形式为主，无法与操纵区B
位点相结合，无araBAD mRNA转录。
无葡萄糖，有阿拉伯糖时，大量araC基因产物以Pi形式存在，并分别与操纵区B、A位点相结合，在cAMP-CAP的共同作用下，araC和
araBAD基因大量表达，操纵子充分激活。
（3）ara操纵子的调控有三个特点：
第一，araC表达受到AraC的自动调控。
第二，AraC既可充当阻遏物，也可作为激活剂。
第三，AraC与CAP结合可充分诱导ara操纵子。
三、真核生物基因表达的调控
（一）真核生物表达调控的特点
1.多层次调控（5个水平）；
2.顺式作用元件/反式作用因子的转录调节模式；
3.基因表达以正调控为主；
4.细胞特异性/组织特异性表达；
5.转录与翻译在不同的区域进行；
6.无操纵子和衰减子；
7.个体发育复杂；
8.受环境影响较小。
★真核生物的调控也主要发生在转录水平上
顺式作用元件（cis-acting element）
定义：真核生物中对自身基因表达有调节活性的DNA序列。
包含启动子、增强子、沉默子和绝缘子等类型；通常不编码蛋白
质，多位于基因旁侧或内含子中。
反式作用因子（trans-acting factor）
定义：指真核生物中一类可通过与特异的顺式作用元件相互作用，使邻近基因开放开放或关闭，即对转录起促进或阻遏作用
的蛋白质因子，也称转录因子
（二）DNA和染色体水平调控
1、DNA的甲基化
2、组蛋白的修饰
3、染色质的结构变化
4、基因丢失和基因扩增
5、基因重排
（三）转录水平上的调控
真核生物的调控也主要发生在转录水平上：
顺式作用元件（cis-acting element）；反式作用因子（trans-acting factor），转录调控是通过两者的相互作用来实现的。
1、顺式作用元件的分类
启动子；增强子；沉默子；绝缘子；转座子；其他应答元件。
启动子（promoter）：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列位于基因的上游RNA聚合酶通过与它的结合而启动基因的转录
增强子(enhancer)：能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列，顺式作
用元件（DNA序列）。
沉默子(silencer)：某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。
绝缘子(Insulator)：一种负调控元件，参与基因表达的负调控。
?阻止基因表达调控的传递（激活或阻遏），其作用可不受序列方向影响，能远距离发挥作用。
转座子（transposon）：能将自己插入基因组中新的位置的DNA序列。
2、反式作用因子(trans-acting factor)
包括：转录因子、RNA聚合酶、调控蛋白等。
★反式作用因子的调控作用：
①蛋白质和DNA相互作用；
②蛋白质和配基结合；
③蛋白质之间的相互作用;
④蛋白质的修饰。
（四）真核基因表达的转录后水平调控
mRNA前体：hnRNA
加工：加帽、加尾、剪接、修饰和编辑等过程
5′端加帽(cap)和3′端多聚腺苷酸化(polyA)的调控意义
使mRNA稳定，在转录过程中不被降解
mRNA的选择剪接
外显子选择、内含子选择、互斥外显子、内部剪接位点
产生不同mRNA，翻译出不同的肽链
mRNA 运输的控制
（五）真核基因表达的翻译水平调控
1、5’UTR结构与翻译起始点调节
2、蛋白质磷酸化对翻译效率的影响（起始因子的磷酸化）
3、3’UTR结构与mRNA稳定性调控
（六）真核基因表达的蛋白质加工水平调控（翻译后水平）
1、新生肽链的水解：酶解
肽链N端的第一个氨基酸：稳定化氨基酸（Met、Ser、Thr、Ala、Val、Cys、
Gly、Pro）与去稳定氨基酸
2、肽链中氨基酸的共价修饰：磷酸化、甲基化、酰基化
3、通过信号肽(signal peptide)分拣、运输、定位
第五章基因重组与基因工程
一、基因重组
（一）基因重组和相关概念
1、基因重组：是指不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接而成新组合的DNA
分子的过程。
2、基因重组技术：是指采用酶学方法将不同来源的DNA按照人们的设计方案在
体外切割与连接，拼装组合成新的杂合DNA分子的技术。（二）基因重组的分类
1、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。
是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
重组酶：RecA蛋白等
2、细菌的基因转移与重组
（1）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。（2）转化作用
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。
（3）转导作用
当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用
(transduction)。以病毒等为媒介的DNA转移与重组。
3、位点特异重组
位点特异重组(site-specific recom-bination) 是由整合酶催化，在两个DNA 序列的特异位点间发生的整合。
（1）λ噬菌体DNA的整合
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；
反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。
（2）细菌的特异位点重组
沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变。
（3）免疫球蛋白基因的重排
免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(?和?)，一个编码重链。
（4）转座重组
由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。
①插入序列转座
插入序列(insertion sequences, IS)组成：
二个反向重复序列(inverted repeats, IR) 侧翼的正向重复序列
一个转座酶（transposase)编码基因
②转座子转座
转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。
二、基因工程
（一）相关概念
1、克隆(clone)：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。
2、基因工程(genetic engineering) ——实现基因克隆所用的方法及相关的工
作，又称重组DNA技术。
3、工具酶
（1）限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。
特异识别及切割4?8个bp长度且具有回文序列的DNA片断
回文序列(palindrome)：是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复
★限制酶识别及切割位点：
主要产生3种末端结构：5ˊ－粘性末端；3ˊ－粘性末端；平端或钝端。
粘性末端(sticky end)：是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出和3
ˊ－末端突出的碱基序列相互间具有互补性。
★同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。
在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；
切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端，称为同识异切。
（2）DNA聚合酶
4、载体
（1）载体(vector)：是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运送
到宿主细胞的运载工具。其化学本质为DNA分子。（2）常用载体：质粒DNA；噬菌体DNA；病毒DNA。
（3）载体必须具备的基本条件：
具有独立复制能力；具有遗传表型或筛选标记；有足够的容量以容纳外源DNA片段；可导入受体细胞；具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)。（4）载体的分类
①克隆载体：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体，即用来克隆
和扩增DNA片段的载体。
有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA三类。
②表达型载体：为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体称为表
达型载体。
5、目的基因
（1）目的基因的获取
①人工（化学）合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。
②基因组DNA文库(genomic DNA library)；③cDNA文库(cDNA library)；
④聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)。
（2）基因组DNA文库
存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合
（3）聚合酶链反应（PCR）
在体外，以含目的基因DNA为模板，在DNA引物、dNTP、TaqDNA Pol等存在下，构成一个反应体系。经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环（25?30次），扩增目的基因。
（二）基因工程的基本步骤和原理
1、目的基因的制备；
2、基因载体的选择；
3、目的基因和载体的剪切；
4、目的基因与载体的连接；
5、宿主细胞的转化（重组DNA分子导入宿主细胞，从而获得新的遗传特性）；（1）受体菌条件：安全；处于感受态(competent)
用特殊方法处理（CaCL2）后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力，这种细胞称感受态细胞
（2）导入方式：转化(transformation)；转染(transfection)；感染
(infection)，转导。
6、重组体的筛选和鉴定
（1）插入失活
当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上
（2）蓝-白筛选（重点！！！）（看书165）
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
（3）标志补救
（4）分子杂交法: 原位杂交; Southern印迹
7、克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化
★克隆基因表达的条件：
⑴基因的编码区不能被插入序列中断;
⑵基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞RNA聚合酶有效地识别;
⑶ mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不为宿主细
胞的蛋白酶所降解。
三、基因工程技术在医学中的应用
（一）基因诊断
?分离、扩增待测的DNA片断；分或鉴定DNA的异常
产前诊断；携带者测试；症候前诊断；遗传病易感性
（二）基因治疗
1、定义:有功能缺陷的细胞，补充相应功能的基因以纠正或补偿其基因的缺陷。
2、方式：体细胞基因治疗；性细胞基因治疗
（三）基因工程疫苗
利用基因工程方法表达出病原微生物一段基因序列，将表达的产物（多数无毒、无感染性、免疫性强）作为疫苗。
（四）基因工程制药
（五）转基因动物
转基因动物：是指人类按照自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内，通过与染色体基因组进行稳定的整合，将生物性状传递给后代动物。
第六章疾病的分子生物学
一、基因与疾病
基因突变:由于体内外各种因素改变了某基因特定的DNA序列碱基组成和排列顺序，导致DNA一级结构发生改变，改变了基因结构；其分子机制可以
是替换、插入或缺失，因而产生不同的突变类型。
（一）基因突变的诱发因素和分子机制
1、物理致癌：如电磁波、放射性同位素、紫外线等
2、化学致癌
（1）直接致癌物：烷化剂、亚硝酰胺类
（2）间接致癌物：多环芳烃类烤制、熏制鱼类，亚硝胺类油煎食品，酸菜
3、病毒致癌
（1）DNA病毒
（2）RNA病毒—逆转录病毒
（二）基因突变的类型与后果
1、突变类型
（1）点突变:是单个碱基的改变；转换（transition）& 颠换（transversion）（2）缺失:是一个或多个核苷酸的丢失
（3）插入: 是一个或多个核苷酸的增加
（4）倒位: 是一段核苷酸序列方向倒转
2、突变的后果
（1）编码序列中遗传密码的改变
①错义突变：指DNA改变后mRNA中相应密码子发生改变，编码另一种氨基
酸，使蛋白质中的氨基酸发生改变。
②无义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子
变成一个终止密码子的基因突变
③同义突变：密码子发生改变, 但所编码的氨基酸不变
④移码突变：指DNA链上插入或丢失1个、2个甚至多个碱基（但不是三
联体密码子及其倍数），在读码时，由于原来的密码子移位，导致在插入
或丢失碱基部位以后的编码都发生了相应改变。
（2）非编码序列的突变
剪切错误；启动子/终止子区域序列改变；“帽子/尾”的变化
二、肿瘤分子生物学
肿瘤：是由于细胞的增殖与分化失常所导致的细胞或组织恶性生长的现象
（一）肿瘤的细胞生物学特征
肿瘤细胞的基本特征
细胞失去控制，恶性增殖；细胞分化障碍；细胞凋亡受阻；与周邻细胞关系改变，发生侵袭和转移。
（二）癌基因Oncogenes
1、正常细胞内以及致癌病毒体内所固有的；控制细胞生长和分化的基因；它的
结构异常或表达异常，能引起细胞恶性转化（癌变）的基因。
2、癌基因是正常细胞编码关键性调控蛋白的基因，是细胞内正常基因。
因此习惯上将RNA肿瘤病毒中所含的致癌基因称为病毒癌基因（V-onc）。
而将生物正常细胞基因中的癌基因称为细胞癌基因（C-onc）或称为原癌基因。
3、癌基因家族
（1）src家族（酪氨酸蛋白激酶）
定位：c-src，20号染色体，17个外显子。
编码：60kDa,具酪氨酸蛋白激酶（TPK)活性。
作用：与细胞无限生长关系密切；通过激酶的磷酸化作用，改变对底物的活性；加速生长信号在胞内的传递。
（2）ras家族
成员：H-ras病毒、K-ras病毒、N-ras神经母细胞瘤
编码：4个外显子组成，蛋白质为21Kd
特点：编码的氨基酸顺序有85％的同源性，主要
位于细胞膜的内侧面，属G蛋白
作用：参与细胞增殖信号的细胞内转导过程，是维
持细胞生长和分化的重要信号转换器。
（3）myc家族myb家族
数量：c-myc,N-myc、L-myc、R-myc
编码：3个外显子组成，Exon1不编码，缺少ATG，但多个终止密码子；另外两个外显子表达62-64kDa或66-67kDa的蛋白
特点：位于核内，属于DNA结合蛋白类，与DNA复制起动有关
4、功能
调节细胞生长与增殖；调节细胞分化有些癌基因的产物参与基因表达的调控。
（三）抑癌基因（tumor suppressor gene）
抑癌基因(suppresser gene)又称抗癌基因(anti-onc)是存在于正常细胞内的一类可抑制细胞生长的基因，并有潜在抑癌作用。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。
抑癌基因及其表达产物
抑癌基因与调控细胞分裂和分化过程相关，可能与生长因子、某些蛋白激酶类活性密切相关，只是抑癌基因给予细胞的信号与原癌基因相反。
（四）癌基因与抑癌基因的致癌协同作用
1、多步致癌学说（肿瘤瘤发生学说）
2、多种致癌因素综合作用的结果
物理因素(如紫外线、电离辐射等)；化学因素(如黄曲霉毒素)；生物因素(DNA 或RNA致癌病毒)
3、多阶段变化便形成了肿瘤
启动阶段；发展阶段（促癌阶段）；转移扩散阶段（转化阶段）；
癌基因激活：点突变、插入启动子/增强子、基因重排、基因扩增；
抑癌基因失活：突变/缺失，磷酸化状态异常，癌基因产物的抑制作用。
三、遗传性疾病的分子生物学
（一）概念
由于生殖细胞或受精卵的遗传物质在结构和功能上发生了改变，而导致后代个体所患的疾病称为遗传病。
（二）分类
1．单基因病: 由单个基因或一对等位基因的缺陷或突变引起。
如：软骨发育不全，苯丙酮尿症
2.多因子疾病: 受多对基因控制并易受环境因素影响的疾病。
如：高遗传度（唇腭裂），低遗传度（冠心病、肿瘤）
3.染色体病：数目异常、结构异常。如：21三体综合征
（三）特征
1、垂直传递即世代之间遗传，上代传下代；
2、遗传物质突变，包括染色体畸变；
3、突变发生在生殖细胞或受精卵；
4、疾病终身表现。
第八章常用分子生物学技术
一、核酸分子杂交技术
（一）核酸探针(probe)
1、标记的DNA或RNA，一小段用同位素、生物素或其他活性物质标记其末端或
全链的已知序列的多聚核苷酸，能与靶序列互补结合，从而判断
是否有同源的核酸分子存在。
2、来源与性质分类
cDNA探针；基因组DNA探针；核苷酸探针；NA探针
（二）核酸分子杂交技术
应用核酸分子双链结构以及核酸双链结构的变性和复性的性质，使来源不同的DNA或RNA片段按碱基互补关系形成杂化双链分子的过程。
（三）核酸分子杂交的分类
1、液相杂交：待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应；
2、固相杂交：待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针
进行杂交反应。
（1）常用固相杂交支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜等
（2）常用固相核酸杂交方法
Southern 印迹杂交法（Southern blotting ）；Northern 印迹杂交法（Northern blotting ）；斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/ Slot blot hybridization）；菌落杂交（colony hybridization）；夹心杂交法（sanwich hybridization）；原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）
二、DNA序列测定
（一）DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
1、原料：单链模板DNA；引物；DNA聚合酶Ⅰ；
底物：dATP、 dGTP、 dCTP、dTTP、ddNTP
2、基本原理（课本231）
（二）化学裂解法(Maxam-Gillbert法)
基本原理：基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断
裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数
分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同
的DNA片段，将这些片段经电泳分离。
分析前，用同位素标记DNA的5′末端，经放射自显影即可在
X胶片上读出DNA链的序列。
三、聚合酶链反应（PCR技术）（重点！！！）
PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量扩增。
（一）PCR定义/原理
1、引物；反应体系；高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段的循环周期使模
板以几何级扩增
2、PCR特点
快速、特异、灵敏、简便。可用于极微量，甚至单个DNA模板的体外分子克隆3、PCR体系基本组成
（1）模板DNA
PCR模板可以是DNA或RNA。
以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102?105个拷贝；
（2）特异性引物
引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为15?30个碱基。
★设计引物的原则：
二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补
长度为18 ~ 25个核苷酸
二条引物之间避免形成引物二聚体
引物的碱基组成应平衡
引物退火温度计算：T m=2（A+T）+4（C+G）
引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）（3）耐热DNA聚合酶（Taq酶）
（4）底物dNTPs：PCR一般用50?200μmol/L的dNTP；且4种dNTP浓度应相等（5）Mg2+：PCR技术常用10?50mmol/L Tris-HCl、?、偏碱缓冲液；并含有一定量的Mg2+浓度。
（6）参数
①变性温度与时间：一般选择94摄氏度，30秒
②退火温度与时间
取决于引物长度、浓度和G+C含量，一般选择：T m - 5℃
③延伸温度与时间：一般选择70℃ ?75℃
④循环次数：取决于模板浓度，一般循环30～35次