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ｍＲＮＡ和蛋白的表达
实时ＲＴ—ＰＣＲ技术检测显示，ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞中ｅｚｒｉｎｍＲＮＡ的表达水平是ＳＫＯＶ３细胞的（８１．７４±５．３４）倍，ＨＯ一８９１０ＰＭ细胞中ｅｚｒｉｎｍＲＮＡ的表达水平是ＨＯ一８９１０细胞的（２．６１±０．１４）倍，两者分别比较，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。蛋白印迹法检测显示，ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞中ｅｚｒｉｎ蛋白的表达强度明显高于ＳＫＯＶ３细胞，ＨＯ一８９１０ＰＭ细胞中ｅｚｒｉｎ蛋白的表达强度明显高于Ｈ０－８９１０细胞。见图ｌ，２。因此选取其中ｅｚｒｉｎｍＲＮＡ和蛋白表达差异相对较大的ｌ对细胞系，即ＳＫＯＶ３和ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞用于以下实验。
１：ＳＫＯＶ３细胞２：￥ＫＯＶ３ｉｐ细胞
圈１蛋白印迹法检测ＳＫＯＶ３和ＳＫＯＶ３ｉｐ
细胞中ｅｚｌ＇ｉｎ蛋白的表达
１：Ｈ０－８９１０细胞２：ＨＯ－８９１０ＰＭ细胞
图２蛋白印迹法检测ＨＯ－８９１０和ＨＯ－８９１０ＰＭ
细胞中ｅｍ＇ｉｎ蛋白的表达
二、ＳＫＯＶ３ｉｐ和ＳＫＯＶ３细胞中与ｅｚｒｉｎ基因表达相关的ｍｉＲＮＡ的筛选及验证
ｍｉＲＮＡ芯片筛选结果见表２。采用生物信息学工具预测并比对ｍｉＲＮＡ芯片筛选结果，其中，ｍｉＲ一１８３可能是直接调控ｅｚｒｉｎ基因（ＴＡＲＧＥＴＳＣＡＮ、ＭＩＣＲＯＣＯＳＭ和ＰＩＣＴＡＲ数据库预测）表达的潜在靶基因；ｍｉＲ－２２可能是调控Ｓｉｘｌ（ＰＩＣＴＡＲ数据库预测）和ＲｈｏＡ（ＭＩＣＲＯＣＯＳＭ数据库预测）基因表达的潜在靶基因，因此推测，ｍｉＲ－２２可能是间接调控ｅｚｒｉｎ基因表达的潜在靶基因。实时ＲＴ—ＰＣＲ技术检测显示，ｍｉＲ一１８３和ｍｉＲ－２２在ＳＫＯＶ３和ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞中的表达差异，与ｍｉＲＮＡ芯片筛选结果一致，ＳＫＯＶ３细胞中ｍｉＲ．１８３和ｍｉＲ－２２的表达水平分别是ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞的（５．８４±０．６６）和（６．６７±０．６７）倍，两者分别比较，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。
表２ｍｉＲＮＡ芯片筛选在ＳＫＯＶ３和ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞中
差异表达的ｍｉＲＮＡ
ｍｉＲＮＡ
ｓＫＳＯＫＯｖ３Ｖ３（ｉｐ倍／）
ｍｉＲＮＡ
ｓＫＳＯＫｖ３０Ｖ３（ｉｐ倍／）
ｍｉＲ－８８６－５Ｐ０．００３ｍｉＲ－６４０２．６２２
ｎｉＲ－８０２Ｏ．００６ｍｉＲ．１２８５２．６１８
ｍｉＲ＿８８６．３Ｐ０．０２３ｍｉＲ－５１９ｅ２．５９２
ｍｉＲ－６２４０．０３２ｒＩＩｉＲ＿５５３２．５３４
ｍｉＲ－２２Ｏ．１６２ｍｉＲ．１８２７２．５３４
ｍｉＲ－３３９－５ｐ０．２１８ｍｉＲ－３０ａ２．４９８
ｍｉＲ一１８３０．２６２ｍｉＲ．４９４２．４５６
ｍｉＲ．１２５５ｂ０．２９５ｍｉＲ．１４６ｂ－３ｐ２．４２０
ｍｉＲ－３ｌＯ．４０６ｍｉＲ－５０９－５ｐ２．２９９
ｌｅｔ－７ｆ０．４４０ｍｉＲ－９３３２．２８１
ｌｅｔ－７ａ０．４６８ｍｉＲ－２５｝２．２３４
ｍｉＲ．１２８４３．４２３ｍｉＲ－６０ｌ２．２２ｌ
ｍｉＲ．１２“３．４２２ｍｉＲ－７６５２．１９９
ｍｉＲ—９２３３．２６５ｍｉＲ－９２１２．１９９
ｍｉＲ－５１３ａ－Ｓｐ３．１９８ｍｉＲ－５８３２．１８１
ｍｉＲ．ＢＡＲｌ２－３Ｐ３．１９５ｌｅｔ－７ｅ２．１６９
ｍｉＲ－９３９３．１０３ｍｉＲ－３６１－５ｐ２．１２０
ｍｉＲ－５５０３．０１０ｍｉＲ－３２?２．０８６
ｍｉＲ．１８４２．９４ｌｍｉＲ－４９８２．０４９
ｍｉＲ－５５ｌｂ２．７３７ｍｉＲ－２７ａ?２．Ｏ牾
ｍｉＲ．１８３?２．６９８ｍｉＲ－５４９２．０４２
ｍｉＲ－６６５２．６３５
三、ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞转染效果的验证
实时ＲＴ—ＰＣＲ技术检测显示，转染组用ｍｉＲ－１８３和ｍｉＲ－２２转染ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞４８ｈ后，其ｍｉＲ－１８３和ｍｉＲ－２２的表达水平分别为空白对照组的（３３８±１０）和（１９１±２６）倍，两组分别比较，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；而阴性对照组分别为空白对照组的（１．０８±０．０４）和（０．９３±０．０４）倍，两组分别比较，差异均无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。证实ｍｉＲ一１８３和ｍｉＲ－２２的转染效果满意，可以进入后续实验。
四、转染后ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞中ｅｚｒｉｎｍＲＮＡ和蛋白的表达
实时ＲＴ—ＰＣＲ技术检测显示，转染组转染ｍｉＲ．１８３后ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞中ｅｚｒｉｎｍＲＮＡ的表达水平是空白对照组的（１．０３±０．１０）倍，两者比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；阴性对照组是空白对照组的（１．０５±０．０２）倍，两者比较，差异也无统计学意义（尸＞０．０５）。
蛋白印迹法检测显示，转染组分别转染ｍｉＲ一１８３和ｍｉＲ－２２后ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞中ｅｚｒｉｎ蛋白的表达强度均明显低于空白对照组和阴性对照组。见图３。
讨论
肿瘤浸润转移是一个复杂的病理过程，包括局
史堡塞』芒整盘查；Ｑ！Ｑ生！Ｑ旦筮笪盔筮！Ｑ翅￡匦！』Ｑ堕燮堡ｚ！堡垡：坐！！鲢！！Ｑ！Ｑ：！些箜：丛生！Ｑ
ｌ：空白对照组２：阴性对照组３：转染组转
染ｍｉＲ一１８３４：转染组转染ｍｉＲ－２２
图３蛋白印迹法检测转染后３组
ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞中ｅｚｒｉｎ蛋白的表达
部浸润、淋巴血管生成、远处转移等，最后从微小的转移灶增殖形成较大的转移灶，即转移瘤，它是恶性肿瘤患者死亡的重要原因。
ｅｚｒｉｎ作为一个肿瘤浸润转移相关基因，其在不同肿瘤中发挥的作用也有一定的差异‘２。１¨。在胰腺癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胃癌、肝癌、前列腺癌等肿瘤中，ｅｚｒｉｎ基因的表达与肿瘤的侵袭能力呈正相关－２４０｜。但值得思考的是，Ｖａｌｄｍａｎ等。１０１发现，虽然ｅｚｒｉｎ基因的过度表达是前列腺癌的不良因素，但在一些良性化生上皮和精囊腺组织中ｅｚｒｉｎ基因也呈高表达，提示ｅｚｒｉｎ基因可能具有组织细胞特异性，具有多样化的生物学功能。另一有趣的发现是，绒毛膜癌组织中ｅｚｒｉｎ基因的表达与其侵袭力呈负相关，进一步提示ｅｚｒｉｎ基因具有组织特异性－１１Ｊ。ｅｚｒｉｎ基因在卵巢癌中的表达在不同的研究小组中得出的结果也有一定的差异。１２－１４］．ｏＭｏｉｌａｎｅｎ等。１２ｏ认为，ｅｚｒｉｎ基因的表达缺失是卵巢浆液性癌的一个不良预后因素；而Ｃｈｅｎ等‘乃１研究发现，ｅｚｒｉｎ基因在卵巢癌中呈高表达，在有转移的卵巢癌组织中其表达水平更高。Ｓｏｎｇ等－Ｍｏ和Ｋ６ｂｅｌ等‘１５ｏ研究也发现，ｅｚｒｉｎ基因的过度表达能明显促进卵巢癌细胞的浸润转移，是预后的一个不良因素。Ｋｏｂｅｌ等。１５１分析上述结果出现差异的可能原因如下：Ｍｏｉｌａｎｅｎ等所使用的石蜡切片取自１９６４－－１９９９年，部分切片可能贮存过久，而且患者的诊断标准和接受的治疗也可能存在一定的差异；另外，Ｍｏｉｌａｎｅｎ等使用的是组织芯片技术分析ｅｚｒｉｎ基因的表达，与传统的免疫组化技术相比，免疫组化方法能更好地分析蛋白的定位和表达。尽管研究显示，ｅｚｒｉｎ基因的过度表达是恶性肿瘤（包括卵巢癌）浸润转移的关键，但是针对ｅｚｒｉｎ基因的上游调控机制却知之甚少‘４’１４，１８珈Ｊ。而只有真正弄清其调控机制，才有可能最终控制恶性肿瘤的浸润转移。本研究旨在初步探讨ｅｚｒｉｎ基因的上游调控机制。
本研究结果表明，侵袭力强的卵巢癌细胞中ｅｚｒｉｎ基因高表达，这与Ｃｈｅｎ等。１３１和Ｋｓｂｅｌ等‘”ｏ的研究结果一致。但本研究发现，虽然ｅｚｒｉｎｍＲＮＡ和蛋白水平在高侵袭力的卵巢癌细胞中均呈高表达，但是ｍＲＮＡ的差异幅度明显高于蛋白的差异幅度，提示ｅｚｒｉｎ基因可能受转录和翻译水平的双重调节。ｍｉＲＮＡ是近年来发现的一类能在转录后水平调节基因表达的重要分子，近３０％的人类基因受ｍｉＲＮＡ的调控‘１６ｏ。因此推测，ｍｉＲＮＡ的异常表达直接参与了ｅｚｒｉｎ基因表达的调节。为了系统地筛选出可能调控ｅｚｒｉｎ基因表达的相关ｍｉＲＮＡ，本研究选取了１对ｅｚｒｉｎ基因表达差异明显的卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３和ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞，用高通量ｍｉＲＮＡ芯片检测结合生物信息工具预测，结果显示，三大数据库均显示ｍｉＲ一１８３是调控ｅｚｒｉｎ基因表达的潜在靶基因，且ｍｉＲＮＡ芯片和实时ＲＴ—ＰＣＲ技术检测均显示ｍｉＲ．１８３在高侵袭力的ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞中呈低表达，ｍｉＲ一１８３的过度表达能明显下调ｅｚｒｉｎ蛋白的表达，而其ｍＲＮＡ水平无明显变化。这与Ｗａｎｇ等¨引在肺癌中的研究结果一致，该研究发现ｍｉＲ．１８３在高侵袭力的肺癌细胞系中呈低表达，ｍｉＲ－１８３的过度表达能有效抑制肺癌细胞的浸润迁移能力及ｅｚｒｉｎ蛋白的表达，推测ｍｉＲ一１８３可能通过下调ｅｚｒｉｎ蛋白的表达而发挥其抑制肺癌细胞浸润迁移的功能。最近文献报道，ｍｉＲ一１８３的过度表达也能抑制宫颈癌细胞系ＨｅＬａ细胞的浸润迁移。２１‘。对于ｍｉＲ一１８３是否在卵巢癌细胞中也具有抑制侵袭转移的功能以及是否通过ｅｚｒｉｎ基因介导则有待进一步研究证实。
ｍｉＲＮＡ除了直接调控ｅｚｒｉｎ基因的表达外，推测其还可能通过调节ｅｚｒｉｎ上游的一些编码基因，从而间接调控ｅｚｒｉｎ基因的表达。既往文献报道，Ｓｉｘｌ和ＲｈｏＡ能够调节ｅｚｒｉｎ基因的表达水平一’ｌ８｜，有趣的是ｍｉＲ－２２可能是调控Ｓｉｘｌ和ＲｈｏＡ基因表达的潜在靶基因，且本研究中ｍｉＲＮＡ芯片筛选结果和实时ＲＴ．ＰＣＲ技术检测结果均显示ｍｉＲ－２２在ｅｚｒｉｎ基因高表达的ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞中呈低表达。因此推测，ｍｉＲ－２２或许能通过间接作用调控ｅｚｒｉｎ基因的表达。本研究的转染实验证实了该猜测，ｍｉＲ－２２过度表达能明显抑制ｅｚｆｉｎ蛋白的表达。但是ｍｉＲ－２２是通过Ｓｉｘｌ和ＲｈｏＡ还是通过其他旁路作用下调ｅｚｒｉｎ蛋白的表达，则有待进一步证实。另外，鉴于ｍｉＲ一２２在高侵袭力的卵巢癌细胞中呈低表达，ｍｉＲ－２２是否具有ｅｚｒｉｎ基因介导的抑制卵巢癌细胞浸润转移功能，也有待证实。
本研究首次用ｍｉＲＮＡ芯片技术结合生物信息
学工具预测，初步系统分析并筛选了ｅｚｒｉｎ基因上游
与ezrin基因表达相关的微小RNA的筛选及在卵巢上皮性癌浸
润转移中的作用
作者：李俊， 梁山辉， 鹿欣， LI Jun， LIANG Shan-hui， LU Xin
作者单位：复旦大学附属妇产科医院妇科,上海,200011
刊名：
中华妇产科杂志
英文刊名：CHINESE JOURNAL OF OBSTETRICS AND GYNECOLOGY
年，卷(期)：2010,45(10)
参考文献(21条)
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本文链接：https://www.doczj.com/doc/c512262641.html,/Periodical_zhfck201010015.aspx