实验名称:
蛙类离体心脏灌流
课程名称：生理学实验
指导教师：龙天澄张碧鱼陈笑霞
实验人：叶永锋08344０３１
学院：海洋学院
实验时间：２009年１２月09日
一、【目的要求】
1、学习斯氏离体蛙心灌流法.
2、了解心肌的生理特性.
３、观察Nａ＋,K＋，Cａ２+及肾上腺素(Ａdr），乙酰胆碱（ACh)等对离体心脏活动的影响。
二、【原理】
将离体蛙心（失去神经支配的蛙心）保持在适宜的环境中，在一定的时间内仍然能够保持节律性收缩，心脏正常的节律性活动需要一个适宜的理化环境，离体心脏也是如此，离体心脏脱离了机体的神经支配和全身体液因素的直接影响,可以通过改变灌流液的某些成分,观察其对心脏活动的作用。心肌细胞的自律性、兴奋性、传导性及收缩性,都与钠、钾及钙等离子有关.血钾浓度过高时（高于7。9mmol/Ｌ）,心脏兴奋性、自律性、传导性及收缩性都下降,表现为收缩力减弱、心动过缓和传导阻滞，严重时心脏可停搏于舒张期。血钙浓度升高时，心脏收缩力增强,过高可使心室停搏于收缩期。血钙浓度降低,心肌收缩力减弱.血中钠离子浓度的轻微变化，对心肌影响不明显,只有发生明显变化时，才会影响心肌的生理特性。肾上腺素可使心率加快、传导加快及心肌收缩力增强，乙酰胆碱则与肾上腺素的作用相反。
三、【实验仪器】
青蛙、常用手术器械、蛙板(或蜡盘）、蛙心夹、计算机采集系统、张力传感器、支架、双凹夹、双针形露丝刺激电极、滴管、培养皿（或小烧杯）、纱布、棉线、橡皮泥、任氏液。蛙心套管(斯氏套管或八木氏套管)、套管夹、0．６5％NaCl、5％ＮaCＩ、2％CaCl2、1%K Ｃｌ、1：5 ０00肾上腺素、1：１0 00０乙酰肌碱、３00U/mL肝素。
四、【方法与步骤】
１、斯氏蛙心插管法
(1）一只青蛙，双毁髓后背位置于蜡盘中,按
前面的方法暴露心脏。仔细识别心脏周围的大血
管(见右图)。在左主动脉下方穿一线，于动脉圆
锥处结扎(动物个体小时,结扎位置可靠上些）。
再从左右两主动脉下方穿一线，并打一活结备
用。左手提起主动脉上的结扎线，右手用眼科剪
在结扎线下方、沿向心方向将动脉上壁剪一斜
口。选择大小适宜的蛙心套管,然后将盛有少量
(套管内2～3 cm高度)任氏液（内加入一滴肝素
溶液）的斯氏蛙心套管，山开口处插入动脉圆锥（见右图).当套管尖端到达动脉圆锥基部时，应将套管稍稍后退，使尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进,经主动脉瓣插入心室腔内(于心室收缩时插入，但不可插得过深，以免心室壁堵住套管下口)。此时可见套管中血液冲人套管,并使液面随心脏搏动而亡下移动,表明操作成功(否则需退回并重新插入).用滴管吸去套管中的血液,更换新鲜任氏液。稳定住套管后,轻轻提起备用线,将左、右主动脉连同插入的套管用双结扎紧（不得漏液），再将结线固定在套管的小玻璃钩上,然后剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管和心脏，看清静脉窦的位置，于静脉窦下方剪断有牵连的组织，仅保留静脉窦与心脏的联系,使心脏离体(切勿损伤静脉窦）。用任氏液反复冲洗心室内余血,
使套管内灌流液不再有残留血液。保持套管内
液面高度一致(1。５～2 cm),即可进行实验。
(2)将插好离体心脏的套管固定在支架上，
用蛙心夹夹住少许心尖部肌肉（不可夹得过
多，以免因夹破心室而漏液)。再将蛙心夹上
的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连（如右
图)。注意:勿使灌流液滴到传感器上。调节显
示器上心脏收缩曲线的幅度适中。
2、实验观察
（1）记录正常心搏曲线
(２）改用０。６5％NaCI溶液灌流,并作好加药标记,观察心搏变化。待曲线氏插管装置出现明显变化时,立即吸去套管中的灌流液,同时做好冲洗标记,并用新鲜任氏液清洗2-3次，待心搏恢复正常。注意：换液时切勿碰套管，以免影响描记曲线的基线，同时保持灌流液面一致(以下同）。
观察可得，NaCI溶液会阻遏心脏搏动。
（3）向套管内加2~６滴５%NaCＩ(较细的套管需少加)溶液，作好加药记号,观察心搏曲线的频率及振幅变化。当曲线出现明显变化时,应立即吸去套管中的灌流液，并做好冲洗标※记,迅速用新鲜任氏液清洗2～3次,待心搏恢复正常。
（4)同法向套管内加入1～3滴２％ＣａCI:溶液，观察并记录心搏曲线的变化.当出现明显变化时，立即更换任氏液，待心搏恢复正常（如果恢复迟缓，可多次冲洗）.
（５）向套管中加１—2滴１％KCl溶液，记录心搏曲线的变化。当心搏曲线变化时,同法更换灌流液，待心搏恢复正常。
(6)同法记录套管中加入ｌ~2滴的肾上腺素溶液(1：１0 000）后心搏曲线的变化.
（7）同法记录套管中加入１—2滴乙酰胆碱溶液（1：10 000)后心搏曲线的变化.
3、实验结果与分析
将记录到的各段心搏曲线附在实验报告中，计算给药前后曲线的频率、振幅和基线变化。测量结果填入表中.
五、【实验结果】
1、正常博击曲线图
2、滴加0。６5％NaCl溶液图
分析：滴加0。６５%NａCl溶液后，心跳减弱,这是由于用0．65%NａCl溶液灌注蛙心时，由于灌注液中缺乏Ca2＋，以致心肌细胞动作电位2期内流Ca2+减少,细胞质Ca2＋浓度减少，心肌的收缩活动也随之减弱。
3、滴加5％NａCｌ溶液
分析:由于细胞外液中钠浓度差梯度的变化一般对心肌活动影响不明显。因此上图的心率变化与图2滴加0。6５%NaＣl溶液里变化并不是很大，两个不同浓度的相同溶液作用机理是一样的，在此一不作过多相同分析。但如果实验中滴加溶液顺序不一样，若先滴加５％ＮａCl。再滴加０.６5％ＮaCl溶液，所得的心搏变化就不如图3那样明显了,收缩力仅出现很微弱的变化.
4、滴加2%CaCl溶液
分析：细胞外Ｃa2＋在细胞膜上对Ｎa+内流有竞争性抑制作用,称为膜屏障作用。［Ca2＋]０增高时，Na+内流受抑制，细胞0期除极速度与幅度减小，使兴奋性及传导性均降低。[Ca２+]２+内流增多，因此慢反应细胞0期去极化加快加强，传导性增高,而快反应细胞0增高使Ｃa
平台期缩短，有效不应期缩短，复极加速。Ｃａ2＋内流增多,使心肌收缩能力增强。［Cａ2＋］0降低时，所引起的变化与高钙时相反。因此加入CａCｌ２后,心率减少、振幅减少,基线上移。
5、滴加1%KCｌ溶液
分析：滴加1%KCl后的心搏曲线发现，曲线的频率逐渐减小，愈来愈疏,幅度逐渐下降,最后停止在基线处，即心脏停博于舒张状态.因为当细胞K+浓度增高时，K+与Ca2+有竞争性
拮抗作用，K+抑制细胞膜对Ca２+的转运，使进入细胞内Ca2+减少,心肌的兴奋-收缩偶联过程减弱，心肌收缩力降低。所以心搏曲线振幅减小。
6、滴加1:1００00肾上腺素溶液
分析：滴加肾上腺素后，蛙心收缩增强，心脏舒张完全,描记的心搏曲线幅度明显增大。其作用机理是，肾上腺素可与心肌细胞膜上的B受体结合，提高心肌细胞和肌浆网膜Ｃa2＋通透性，导致肌浆中Ｃａ２+浓度增高，使心肌收缩增强。另外，肾上腺素还有降低肌钙蛋白与Cａ2+亲和力，促使肌钙蛋白对Ca2+的释放速率增加,提高肌浆网膜摄取Ca2＋的速度，刺激Ｎａ+与Ca2＋交换，使复极期向细胞外排出Ｃa2＋的作用加速，这样，将使心肌舒张速度增快,整个舒张过程明显增强。
7、滴加1：10０00乙酰胆碱溶液
分析：上图可示，蛙心收缩减弱,心率减慢，最后出现蛙心停止舒张阶段。其机理为：乙酰胆碱与心肌细胞膜M受体结合,一方面提高心肌细胞膜K+通道的通透性,促使K+外流，
将引起：1)窦房强细胞复极时K＋外流增多，最大复极电位绝对值增大；Ik衰减过程减弱，自动除极速度减慢.这两方面因素导致窦房自律性降低,心率减慢。2）复极过程中K＋外流增加,动作电位2、3期缩短,Cａ２+进入细胞内减少,使心肌收缩减弱；另一方面乙酰胆碱可直接抑制Cａ2+通道，减少Ca2＋内流,进而使心肌收缩减弱。
表一：各测量结果比较
表错误!未定义书签。改变灌流成分对蛙离体心脏活动的影响
六、【注意事项】
1．制备蛙心标本时，勿伤及静脉窦。
2 ．上述各实验项目，一旦出现作用应立即用正常任氏液换洗，以免心肌受损,而且必须待心搏恢复正常后方能进行下一步实验。
3. 复习心肌生物电的产生机制及各种离子对心脏活动的影响.
4。尽量选用健壮、体大的雄性蟾蜍,手术过程中注意保护心脏，避免损伤。
5。实验中及时用任氏液冲洗心脏，待曲线恢复平稳后再进行下一步操作。
6。每次更换任氏液都必须保持灌流液液面高度恒定,以免因灌流量变化而影响结果.
７。严格控制每次药品加入量,先加一滴，效果不明显再加一滴。
８。滴加药品和换取正常任氏液，须及时标记，以便观察分析。
9. 吸滴瓶中的任氏液和吸蛙心套管内溶液的吸管应区分专用，不可混淆使用，以免影响实验结果。
【思考题】
1. 离体蛙心制备好后，有时候馆内的液面上下移动很不明显,是何原因?如何处理？
答:离体蛙心制备好后，蛙心插管内的液体应随蛙心室的收缩和舒张活动而上下移动。其实质是:在心室收缩时,心室容积减少,室内压升高，将心室内的液体压入插管内，管内液面上升;在心室舒张的时候，心室容积增大，心室内压减少，将插管内液体吸入心室，管内液面下降.
但是有时候蛙心插管内液面波动不明显，其主要原因是:
⑴插管内尖端出现血凝块。插管内液体不能顺畅的进出心室腔内。解决方法为用长吸管将血凝块吸出,在吸出血凝块后，应立即用新鲜任氏液换洗插管内液体几次，直至蛙心颜色变淡,插管内无血液和小血块为止.
⑵插管尖端不在心室腔内,而是在心房或者脉间结缔组织等地方。解决方法为将插管重新插入心室，确定无误后，再结扎固定。
⑶插管进入心室腔内过深，以致尖端抵住了心室壁。解决方法为将插管稍稍外提,使插管口正好处于心室腔内，且开口正对着液体喷射的轴流方向.
⑷蛙心由于长期心肌失血，导致活力下降。解决方法为向插管内滴加少许肾上腺素或者对其进行外加力使其起搏,使其活动增强。
⑸房室传导阻滞.在插管的操作中，由于操作失误，对心脏造成的损害过大,最后导致房室传导阻滞.由于这种伤害是不可逆转的,所以必须改换蛙心重做实验。
２．实验过程中，为什么必须保持蛙心插管内液面高度的恒定?液面过高或过低会产生怎样的影响?
答:在实验过程中,蛙心插管内液面高度发生变化，心脏收缩曲线会相应发生变化。心肌缩短幅度和速度受到前负荷和后负荷的影响。插管液面高度所产生的压力，在心室舒张期末期相当于心肌的前负荷，心室开始收缩的时候,此液体所产生的压力又成为心肌收缩时的后负荷。故高度的改变，进而引起的前后负荷的改变将改变心肌收缩的幅度和频率.
当液面过高时.心缩曲线幅度将降低。因为过高的液面,将使心室前负荷超过了最适前负荷，将导致粗细肌丝过于疏远,而导致收缩的潜力减少，心肌收缩不再增加或下降。而类似的，过高的后负荷，也使心肌收缩的幅度和速度大大下降。而当液面过低时,心室收缩的幅度也会减少。因为前负荷过小,将导致粗细肌丝过于接近，而导致收缩的潜力减少，实际上，此时由于前负荷的减少导致心室收缩的效力的减少比前负荷增加而导致的还有明显。类似的，后负荷相应的减少也会导致心室收缩的减弱。所以，在实验中保持最适的液面高度。是取得较好实验结果的前提。
3．各种离子成分改变蛙心收缩的原理是什么？
答：由于心肌细胞生物电活动和收缩过程与离子密切相关,因此，细胞外液中离子浓度升高或降低均会影响到心肌的电生理特性和收缩性。
（1）钾离子的影响 K+与静息电位的形成有关.细胞外液K+浓度[K+］0变化对心肌生理特性的影响较为复杂。高钾：[K＋］０轻度或中度增高时,膜内、外K＋浓度差减小,静息电位绝对值减小,与阈电位差距缩短，因此,兴奋性增高。 [K+]０显著升高时，由于静息电位绝对值减小过多(膜内达-５5mV左右），Na＋通道失活,因而兴奋性降低甚至消失。另外，还使０期去极化速度和幅度减小，传导性降低，导致兴奋传导减慢,甚至传导阻滞。此外，[K+］０增高还可提高膜对K+的通透性,加速K+外流，动作电位平台期缩短,因此,不应期缩短。此外由
于平台期缩短，减少了Cａ2＋的内流，加上细胞外K+与Ｃa2+在膜上有竞争性抑制作用，导致心肌收缩功能减弱;
（2）钙离子的影响细胞外Ca2+在细胞膜上对Na＋内流有竞争性抑制作用,称为膜屏障作用。[Ｃa2+］ 0增高时,Na+内流受抑制,细胞0期除极速度与幅度减小，使兴奋性及传导性均降低。[Ca２＋]０增高使Ca2＋内流增多,因此慢反应细胞0期去极化加快加强,传导性增高，而快反应细胞平台期缩短，有效不应期缩短,复极加速。Ｃa2＋内流增多，使心肌收缩能力增强。［Ca2+］ 0降低时，所引起的变化与高钙时相反。
（3）钠离子的影响细胞外液中钠浓度差梯度的变化一般对心肌活动影响不明显。只有当[Ｎａ+]０明显增高时，膜内外钠的浓度差梯度增大，因此,快反应细胞Na＋内流加快，0期去极速度和幅度均增加,导致传导性和自律性增高。同时，Nａ＋内流的增多促进细胞内Ca2＋的外运使细胞内Ｃa2＋浓度降低，因此，心肌收缩能力减弱。反之，当[Na＋］ 0降低，使心肌传导性和自律性降低，心肌收缩能力增强。
八、【参考文献】
【１】项辉，龙天澄等. 生理学实验指南［M］。科学出版社，200８ : 21－ 3８．【2】朱大年。生理学[M］。人民卫生出版社,2008:6—8．