Tuesday
PCR
1)Prepare a 0.2 ml centrifuge tube for each sample.
2)Add reagent as Table 1.
Table 1 Reaction system (50μl total)
Components V olumes (μl)
Template (human genomics DNA) 1
10×Taq buffer 5
MgCl2 4
10 mM dNTP 1
Forward primer (10uM) 1
Reverse primer (10uM) 1
Taq DNA polymerase 1
ddWater 36
3)Set program as Table 2 on PRC instrument.
4)Verify the PCR product (~1000bp) by electrophoresis.
Plasmid Purification
1)Assemble a column stack by placing a Spin Column CP3 into a collection tube. Add 500
μl Balance Liquid (BL) to Spin Column CP3 and spin at 12000 rpm for1 min at room temperature. Discard the liquid in collection tube. And replace CP3to collection tube. 2)Transfer 1 ml bacterial cells to 1.5 ml centrifuge tube and spin at 12000 rpm for1 min at
room temperature. Discard supernatant.
3)Resuspend the bacterial pellet in 250 μl of Buffer P1. The bacteria should be resuspended
completely by vortexing or pipetting up and down until no cell clumps remain.
4)Add 250 μl of Buffer P2, mix thoroughly by vigorously inverting the sealed tube
4–6times, and incubate at room temperature for 2 min.
Do not vortex, as this will result in shearing of genomic DNA.
5)Add 250 μl of Buffer P3, mix immediately and thoroughly by vigorously inverting 4–6
times. Centrifuge at 14000 rpm for 10 min.
6)Transfer supernatant to CP3 promptly. Do not allow the pelleted debris to fall into the
column. . Centrifuge at 12000 rpm for 1 min. Discard the liquid in collection tube. And replace the CP3 to collection tube.
7)Add 600 μl Washing Buffer PW to CP3 and centrifuge at 12000 rpm for 1 min. Discard
the liquid in collection tube. And replace the CP3 to collection tube.
8)Repeat steps 7.
9)Centrifuge at 12000 rpm for 2 min, and air-dry for 10 min.
10)Insert the CP3 into a 1.5 ml centrifuge tube. Add 35 μl of Nuclease-Free Water to the CP3
and incubate at room temperature for 2 min.
11)Centrifuge at 12000 rpm for 2 min.
Nanodrop Analysis
For DNA
1) Raise the sampling arm and pipette the 2 μl water onto the lower measurement pedestal. 2) Select the Nucleic Acid application from the main menu. If the wavelength verification
window appears, ensure the arm is down and click OK.
3) Select the Sample Type to be measured from the Type drop-down list. The default setting
is DNA-50. Simply wipe the upper and lower pedestals using a dry laboratory wipe and the instrument is ready to measure the next sample. 4) P ipette the 2 μl water again. Click the Blank .
5) Simply wipe the upper and lower pedestals. P ipette the 2 μl water onto the measurement
pedestal. And click Measure .
6) Simply wipe the upper and lower pedestals and Pipette next sample, click measure again. 7) Clean with 2 μl water after use and make sure to place cover back on.
Agarose Gel Electrophoresis
Preparation of agorose gel:
Agarose 1×TAE EB DNA Fragment
0.8% Gel 0.2g 25 ml 2 μl500bp~15kb
1% Gel 0.25 g 25 ml 2 μl250bp~12kb
1.2% Gel 0.3 g 25ml 2 μl150 bp~6kb
1.5%Gel 0.375g 25ml 2ul 80bp~4kb
1 g per 100 ml = 1% gel
1)Weigh out the required quantity of agarose powder.Place it into an Erlenmeyer flask.
2)Add the appropriate quantity of 1×TAE.
3)Microwave on high just until you start to see the appearance of boiling. Remove the flask.
Carefully, swirl the agarose mixture.
4)Return the flask the microwave. Microwave it again until you see boiling. Repeat the
swirling. Continue this cycle until there is no sign of any solid bits of agarose remaining.
5)Add 2 μl Ethidium bromide (EB) to the liquid gel. Ethidium bromide, a fluorescent dye
used for staining nucleic acids.
6)Allow the agarose to cool to 50 o C to 65 o C. If you don’t it will warp the gel boxes.
7)Pour the agarose into a gel tray with the well comb in place and allowed to solidify at
room temperature.
8)After the gel has solidified, the comb is removed.
Loading Samples and Running an Agarose Gel
1)Add loading buffer to each sample. eg. 1 μl of 6 × loading buffer to 1-2 μl plasmind or 5
μl PCR production.
Note: Loading buffer serves two purposes: 1) it provides a visible dye that helps with gel loading and will also allows you to gauge how far the gel has run while you are running your gel; and 2) it contains a high % glycerol, so after adding it your sample is heavier than water and will settle to the bottom of the gel well, instead of diffusing in the buffer.
2)Once solidified, place the agarose gel into the gel box (electrophoresis unit).
3)Fill gel box with 1×TAE until the gel is covered.
4)Carefully load 3 μl D NA ladder into the first lane of the gel. eg. 100 bp DNA ladder for
PCR production. 1000 bp DNA ladder for plasmid.
5)Carefully load your samples into the additional wells of the gel.
6)Run the gel at 80-150V until the dye line is approximately 75-80% of the way down the
gel.
Note: Black is negative, red is positive. (The DNA is negatively charged and will run towards the positive electrode.) Always Run to Red.
7)Using any device that has UV light, visualize your DNA fragments.
Analyzing Your Gel:
Using the DNA ladder in the first lane as a guide (the manufacturer's instruction will tell you the size of each band), you can interpret the bands that you get in your sample lanes to determine if the resulting DNA bands that you see are as expected or not.
Purification of PCR Products
1)Column Balancing: put the CB2 column into a collection tube, and add 500ul BL,
centrifuge 1 min at 12000rpm, discard the liquid in the collection tube, and then put the CB2 back to collection tube.
2)Add 5 volumes buffer PB into PCR products.
3)Add the solution in step 2 into a balanced column, incubate in room temperature for 2
min, then centrifuge 1 min at 12000 rpm, discard the liquid in the collection tube.
4)Add 600ul buffer PW, centrifuge 1 min at 12000 rpm, discard the liquid in the collection
tube, and then put the CB2 back to collection tube.
5)Repeat step 4.
6)Put the CB2 back to collection tube, centrifuge 2 min at 12000 rpm to remove PW
completely. Open the lid of CB2 for several minutes to dry it. (It is recommened to warm
a tube of ddwater while waiting column drying.)
7)Put the CB2 column into a new 1.5ml centrifuge tube, add at least 30ul warmed water,
incubate for 2 min, and centrifuge 2 min at 12000rpm to collect the DNA.
Double Cutting of PCR Products
Prepare a 1.5 ml centrifuge tube for each sample.
Reaction system (40ul total)
Components Volumes (ul)
PCR product 30 10x Buffer2.1
4 XhoI 1 NheI 1 ddwater 4 Total
40
After all components added, centrifuge the tubes and incubate them at 37 o C for 30 min. During the half hour, you’d better prepare an agarose gel for gel extraction (tiangen kit).
Transformation for Plasmid
1) Take out the competent cells (DH5α) from the -80 o C fridge, and put it on the ice to thaw. 2) Add approximately 50ng plasmid to 50ul competent cells, stay on ice for 30min. 3) Heat-shock the cells for 60 seconds at 42°C without shaking. Then put them on ice 3min
quickly.
4) Use the glass bar to spread the competent cells evenly. 37 o C ，Invert the selective plate(s)
and incubate at 37 o C overnight 5) Store the plate at 4°C.
Components Volumes (ul)
pcDNA-GFP 2ug 10x Buffer2.1
4 XhoI 1 NheI 1 ddwater to 40ul Total
40ul
Thursday
DNA Gel Exaction
1)Column Balancing: put the CA2 column into a collection tube, and add 500ul BL,
centrifuge 1 min at 12000rpm, discard the liquid, and then put the CB2 back to collection tube.
2)Cut the DNA band from the agarose gel, and then put it into the new tube (remember
weigh it in advance), weigh them.
3)Add the equal volume solution PN as the weigh of DNA band (if the DNA band is 0.1g,
we can add 100ul solution PN). Then incubate them at 50 o C, confirm the gel is dissolve.
4)Add the solution(the room temperature is better) in step 3 into a balanced column,
incubate 2 min, then centrifuge 1 min at 12000rpm, discard the liquid in the collection tube.
5)Add 600ul buffer PW, centrifuge 1 min at 12000 rpm, discard the liquid in the collection
tube, and then put the CA2 back to collection tube.
6)Repeat step 5.
7)Put the CA2 back to collection tube, centrifuge 2 min at 12000 rpm to remove PW
completely. Open the lid of CA2 for 15 min to dry it.
8)Put the CA2 column into a new EP tube, add at least 30ul pre-warmed water (the water
can be warmed in advanced), incubate for 3 min, and centrifuge 2 min at 12000rpm to collect the DNA.
Ligation
Prepare a 0.2 ml centrifuge tube for each reaction.
Ligation system (10 μl)
Component Volumes (μl)
PCR product- Xho I- Nhe I7.5
Plasmid- Xho I- Nhe I 1
10 ×T4 DNA ligase buffer 1
T4 DNA ligase 0.5
Incubate tubes at 25 o C for 30 min.
《用流程复制》年会培训心得——左手建立流程右手复制人才 培训时间：2015/2/27-3/1 培训地点：沈阳市辽宁大厦新南苑 培训讲师：章义伍 流程管理的最高境界就是让员工们没有犯错的机会。整个培训学习课程是从这句话开始的，也是流程管理的通俗诠释。用流程复制说的其实就是两件事，一个是建立流程，一个是应用流程快速的复制人才，让企业的流程变成培训机制，快速复制人才，降低企业的用工风险，不至于因员工离职而导致企业的损失。 首先老师讲到基因，由于基因的不同，企业价值观和文化的差异，导致中外企业的发展差距，美国企业是大国家里大企业（麦当劳、可口可乐、联合利华、中华牙膏、肯德基等），中国企业是大国 家里小企业（非常可乐、小护士、大政府小微企业30亿产值一下），韩国企业是小国家里大企业（三星、现代）。这几种国家里企 业的对比不难看出，企业的基因是起到决定性作用的。在两种不同的商业基因作用下，产生出两种不同的商业模式，一个是表现为能人打天下，忙碌的救世主的能人模式；一个是表现为流程打天下，整体的优秀的系统模式。企业发展不能靠能人要靠团队，不能靠经验要靠系统。 企业成长的阶梯分为四个阶段：人治、法治、心治、无为而治。在人治阶段关键成功因素有领路人的眼光、魄力、用人，是靠老红军式的有经验的优秀个人成就的。在法治阶段关键成功因素有
战略、人员、运营流程，是靠规范化的流程来成为做事的主体，制度来管人和加以配合。心治阶段的关键成功因素是以价值观为魂，软力量植入的合力形成的团队，用价值观引导人，用文化影响。无为而治阶段关键成功因素是挑战、变革、把握转折点，应用制度的推力和文化的拉力来发展企业。卓越的企业不是靠能人，不是靠关系，也不是靠使命，而是靠一套完善的体系来支撑，系统是大规模的互动和相依。系统可以大面积复制人才，强化团队；经验时代，人走经验走；系统时代，人走流程在。 企业初级基因：关系管理、无法复制、灵活、直觉、短线、商机、价格战；优质基因：知识管理、快速复制、系统、科学、长远、高附加值。管理者的本质是经营者的替身。领导者的痛：问题总是重复出现、讨好能人怀疑能人、无休止的忙碌、企业不大不强不久。30年前过去的成就：灵活的头脑、精明的手腕、勤劳的品 质、坚强的意志。当前的挑战：高劳动力成本、生产资料更贵、人民币升值、劳资对抗激烈。赢在转折点：组织扁平化、减员求利润、挑剔的客户、更激烈的竞争。时间正在悄悄的淘汰过去的成功者，时间也在悄悄地催生新的成功者。为什么我们的企业既不大，也不强，更难久？公司治理结构陷入家族制陷阱，战略不专注，无法复制人才，规范化程度低，价值观差异，制度保障不力。 左手建立流程，右手复制人才。通过学习我制作企管部后勤保安的工作流程，应用到实际工作中。 范例：
本文以大肠杆菌DH10B为例介绍外源基因在大肠杆菌中表达全过程 克隆步骤包括：模板制备（基因组DNA提取）-感受态细胞的制备-PCR-纯化回收-酶切-连接-转化-挑菌摇菌-质粒抽提-酶切鉴定-测序 1) 基因组DNA提取（以家蚕为例） 1. 取家蚕五龄后部丝腺约0.5g，于10ml匀浆器内，加2mlDNA抽提缓冲液，在 冰上充分研磨，转入5ml的离心管； 2. 加入RnaseA（10ul）至终浓度20ug/ml，37℃水浴1h； 3. 加入ProteinaseK（25ul）至终浓度100ug/ml，55℃水浴2h； 4. 分装到1.5ml eppendorff管，0.6ml/管； 5. 加入等体积的平衡酚（pH8.0），充分混匀，5000g，15min，取上清； 6. 重复5，再抽提1次； 7. 用等体积的酚/氯仿（1/1，v/v），氯仿各抽提1次 8. 将上清移入新离心管，加入1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），2倍体积的 无水乙醇，充分混匀，4℃过夜 9. 用牙签将絮状沉淀物挑出。用75%冰酒精洗涤3次，37℃控干； 10. 200μl 0.1 TE(pH8.0)溶解DNA； 11. 检测OD值； 12. 做好标记，以供进一步实验之用。 2) 感受态细胞的制备 1. -20℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏（划板），37℃，8-12小时； 2. 用灭菌牙签挑取单菌落，放入3ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜； 3. 取100μl过夜培养物接种到另一3 ml LB培养基中，37℃振荡培养2～2.5 h， 使OD值在0.6左右（把握好浓度，OD值可以不用测）；将菌液分装到1.5ml EP 管中（在超净台完成） 4. 5000 g离心4 min收集菌体，将菌体重悬于800 μl 75 mmol/L冷CaCl2中， 冰浴30 min；（CaCl2要用高纯度的，切记！） 5. 4℃，5 000 g离心4 min，弃上清； 6. 加入200μl 75 mmol/L冷CaCl2，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放4 h 后用于转化，或加0.1倍体积甘油混匀，－70℃保存备用。可以保存至少6个月。 3) PCR 1、PCR反应体系： ddH2O 37.7 μL 10×PCR buffer 5 μL （25mM） dNTP 4 μL 引物1/2 1μL/1μL Taq酶 0.3μL 模板 1μL PCR反应体系总体积 50 μL 充分混匀，稍离心。 2、PCR反应条件
对克隆技术的看法高中英语作文 克隆技术，从出现的时候就已经备受争议了。克隆技术的出现到底是好还是不好呢?下面是小编为你整理的对克隆技术的看法高中英语作文，希望你喜欢! 对克隆技术的看法高中英语作文篇1 Nowadays, the controversial issue of cloning has been in the limelight and has aroused wide concern in the public. Its quite understandable that the views of this issue vary from person to person. Some people are in favour of cloning, who firmly believe that scientists can bring the extinct animals back to life by cloning. Its indisputable that cloning is a great process to produce quantities of commercial plants as well as new species of plants. However, the cloning of the sheep Dolly attracted publics attention but arouse a storm of objections. For instance, if heaps and heaps of evil leaders like Hillary attempt to clone themselves, a disaster will break out in the world. In addition, the objectors insist that cloning has a huge impact on genetic diversity. As for me, I suggest that cloning plays an important role
分子克隆技术 一、填空题 1.PCR反应中加入矿物油的作用是___________________________。 2.分子克隆实验中外源DNA和载体片段连接之前，要对载体进行去磷酸化处理，我 们在本次试验中去磷酸化使用的碱性磷酸酶是___________________________。它 的目的是___________________________。 3.用α互补筛选转化子是，带有外源片段的菌落显___________________________色。 4.Southern杂交中进行与杂交的目的是___________________________。 5.凝胶糖凝胶电泳时加入loading buffer作用是___________________________和 ___________________________。 6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素主要有___________________________、 ___________________________、___________________________、 ___________________________、___________________________。 二、简答题 1.简述PCR反应体系中都有哪些成分及各成分的作用。 2.为得到质量较好的水稻RNA，抽提前应做如何准备？RNA抽提过程中、RNA的 保存及以后对RNA的操作过程中应特别注意什么？ 3.简述为防止放射性同位素外照射及内照射对人体造成伤害，在操作放射性同位素 时，我们可以采取哪些措施进行防护？ 4.简述影响电转化感受态细胞转化效率的因素有哪些？ 5.质粒抽提时用到的SolutionI，SolutionII，SolutionIII及异丙醇分别起什么作用？操 作时应注意什么？ 三、分析问答题 1.描述并图示pUC19载体DNA及其在HindIII位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA 和水稻总DNA及它们的HindIII和BamH1酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型。 2.利用质粒载体克隆外源DNA片段主要包括哪些步骤？涉及到哪些工具酶？要获得 理想的结果，各步骤操作中应主要注意哪些事项？ 3.在Southern杂交实验中，同一根杂交管内的膜曝光的····（原卷此处不清晰）冲 洗后，有些组X光片信号很强，有些组信号很弱，有的样品点样孔附近有较强的 信号，但是有的地方信号较弱，请分析造成这种结果的可能原因。 4.下面是本次课生物技术班某组β-active基因RT-PCR（反转录前没有对总RNA进 行去除DNA 的处理）试验的琼脂糖凝胶电泳图，凝胶上共点了6个样，PCR使用 的模板从左至右分别是：该组提取的水稻总DNA，该组提取的水稻总RNA，该组 的4个反转录产物。（原卷本题图不清晰） 请问： 提取的RNA的质量如何？ RT-PCR是否成功？为什么会出现这样的结果？ 有哪些地方需要改进？
笔记3（分子克隆2——主要步骤） 分子克隆可以分为以下几个步骤： 分离制备待克隆的DNA片段————将靶DNA片段与载体在体外进行连接————重组DNA分子转入宿主细胞————筛选、鉴定阳性重组子————重组子的扩增。 1.带有目的基因的DNA片段的获得： 可以用限制内切酶降解基因组DNA，再配合使用其他实验手段得到待定的DNA片段，可以用超速离心的方法分离出具有特定核苷酸组成的DNA片段，可以用mRNA做模板，用反转录酶合成互补DNA，即cDNA，也可以用化学合成的方法直接合成一段DNA。 2.重组DNA分子的构建： 重组DNA分子中包括两部分，一部分是外源DNA，即目的DNA片段，另一部分是载体DNA。用作载体的，有质粒、噬菌体或病毒DNA。它们的基本特征是能够独立复制。如果用同一种限制性内切酶切割这两种DNA，则它们的末端完全相同，由于有互补的单链末端序列存在，在连接酶的作用下，就可以形成重组DNA 分子。在没有互补单链末端的情况下，也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后再进行连接。
3.重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选： 重组DNA分子必须进入宿主细胞中，才能得到扩增和表达．这个过程叫做转化。大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主细胞。除此以外．其他细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞，可以根据实验的需要加以选择。在被转化的宿主细胞中，不同的单个细胞(在平板上表现为单个菌落，亦称克隆)中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒，因此必须进行筛选，以便确定哪些是重组克隆。筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法，依载体的性质而定。 4.特定重组克隆的鉴别： 由于重组克隆往往是较多的，而在某一克隆实验中，我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个，所以需要进一步鉴别。使用的方法主要有核酸杂交法和免疫化学法。 此外，找出了目的克隆之后，还需要根据实验的目的，进一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。主要有酶切图谱的制定，基因在DNA 片段上的精确定位，确定是否有内含子，DNA序列分析，离体翻译实验，外源基因在某些宿主细胞中的表达及产物的提纯等。
克隆的利弊高中英语作文优秀范文 克隆让我们见识到了技术的发展，克隆有什么利弊呢？下面是为你整理的克隆的利弊高中英语作文，希望对你有帮助! With the repid development of technology, clone comes to the world. It can duplicate creature, which means it can make contribution to the production. People can pay a little and get a lot in the end. However, it also has disavantages. I think as the development of the high-tech, people can use clone to copy humen beings. It’s so horrible for me to know that there is someone the same with me. But in general, clone has more advantages than disadvantages. 随着科技的迅速发展，克隆来到了这个世界。克隆技术可以复制生物，这意味着它可以为生产做贡献。人们可以付一点，最后得到很多。但是它也是有缺点的。我觉得随着高科技的发展，人们可以使用克隆技术来复制人类。是多么的可怕认识到有一个和自己在一模一样的人。不过总的来说，克隆的优点多于缺点。 克隆的利弊高中英语作文篇2Advanced technology has already pushed human being to edges,such as the production of weapons of mass destruction,the destruction of Ozone by Freon ,and the application of clone.The heated deabte over
分子克隆技术步骤 在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA 片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 克隆在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖( 细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning) 含义指在生物体 外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。 将DNA 片段( 或基因)与载体DNA 分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA 和cDNA 克隆两类。 cDNA 克隆是以mRNA 为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA) ，再与载体DNA 分子连接引入寄主细胞。每一cDNA 反映一种mRNA 的结构，cDNA 克隆的分布也反映了mRNA 的分布。特点是：①有些生物，如RNA 病毒没有DNA ，只能用cDNA 克隆； ②cDNA 克隆易筛选，因为cDNA 库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA 克隆只含一个mRNA 的信息； ③cDNA 能在细菌中表达。cDNA 仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。 1. 方法： (1) DNA 片段的制备：常用以下方法获得DNA 片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA 切成一定大小的DNA 片段； ②用物理方法( 如超声波) 取得DNA 随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA 反转录产生cDNA 。 (2) 载体DNA 的选择： ①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA 呈环状，大小为1-200 千碱基对(kb) 。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA 可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb 以下的DNA 片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA 库和次级克隆。 ②噬菌体DNA ：常用的λ噬菌体的DNA 是双链，长约49kb，约含50 个基因，其中50% 的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA 两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA 库。 M13 噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有 F 基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF) 在 寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA 的M13 噬菌体，又能方便地制备单链DNA ，用于DNA 顺序分析、定点突变和核酸杂交。 ③拷斯(Cos) 质粒：是一类带有噬菌体DNA 粘性末端顺序的质粒DNA 分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb 的外源DNA 片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA ，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。 (3) DNA 片段与载体连接：DNA 分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA 片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA 可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA 往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA 片段可在某些DNA 连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA 片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。 连接反应需注意载体DNA 与DNA 片段的比率。以λ或Cos 质粒为载体时，形成线性多连体DNA 分子，载体与DNA 片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。 (4) 引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA 或噬菌体DNA(M13) 与氯化钙处 理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA 被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重
常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。
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是XX最新发布的《克隆英语作文》的详细范文参考文章，觉得有用就收藏了，为了方便大家的阅读。篇一：关于克隆的英语作文 关于克隆的英语作文 Today the problem of cloning has been brought into people hold different each phenomenon exists for a number of reasons. 今天,克隆已经成为关注的焦点问题。不同的人持有不同的观点。然而每个现象都有它存在的原因。 Cloning strives to cure diseases by obtaining the stem cells,as we all know
cloning would increase the chances for a tissue match from 25 percent to nearly 100Percent. 克隆努力获得干细胞治疗疾病,我们都知道克隆使组织匹配的机会从25%提高到近100%。 I am unique in the world and I am proud of another I appears,is there any need for me to exist? 最全面的范文参考写作网站我自豪为我的存在是独一无二的，如果出现了另一个我，我的存在还有什么意义。 As far as I am concerned,I don’t th ink that cloning human beings is may bring about many unexpected should
[对克隆技术的看法高中英语作文]对克隆技术的看法 克隆技术，从出现的时候就已经备受争议了。克隆技术的出现到底是好还是不好呢?下面是小编为你整理的对克隆技术的看法高中英语作文，希望你喜欢! 对克隆技术的看法高中英语作文篇1 Nowadays, the controversial issue of cloning has been in the limelight and has aroused wide concern in the public. It’s quite understandable that the views of this issue vary from person to person. Some people are in favour of cloning, who firmly believe that scientists can bring the extinct animals back to life by cloning. It’s indisputable that cloning is a great process to produce quantities of commercial plants as well as new species of plants.
However, the cloning of the sheep Dolly attracted public’s attention but arouse a storm of objections. For instance, if heaps and heaps of evil leaders like Hillary attempt to clone themselves, a disaster will break out in the world. In addition, the objectors insist that cloning has a huge impact on genetic diversity. As for me, I suggest that cloning plays an important role on improving our quality of life. Needless to say, that cloning is an effective access to cure serious illnesses that at present have no cure. What’s more, not only can cloning assist us to acquire unknown knowledge about the creature, but it also is a wonderful breakthrough. Thought now there are lots of questions about cloning, by no means should we give in to the unsolved problems. 如今，关于颇受争议的克隆问题已经明确地引起了大众广泛关注。而人们对于这个问题的看法也各不相同，这完全可以理解。 有些人很支持克隆，他们坚定地相信科学家们可以通过克隆技术将灭绝的动物重现天日。而且无需置疑的是克隆技术能帮助大量生产经济作物和新品种。
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
-------------精选文档----------------- 关于克隆的英语作文 Today the problem of cloning has been brought into focus.different people hold different opinions.however each phenomenon exists for a number of reasons. 今天,克隆已经成为关注的焦点问题。不同的人持有不同的观点。然而每个现象都有它存在的原因。 Cloning strives to cure diseases by obtaining the stem cells,as we all know cloning would increase the chances for a tissue match from 25 percent to nearly 100Percent. 克隆努力获得干细胞治疗疾病,我们都知道克隆使组织匹配的机会从25%提高到近100%。 I am unique in the world and I am proud of that. If another I appears, is there any need for me to exist? 我自豪为我的存在是独一无二的，如果出现了另一个我，我的存在还有什么意义。 As far as I am concerned,I don’t think that cloning human beings is sensible. It may bring about many unexpected problems. We should respect life and let everything stay as it is. 就我个人而言,我认为克隆人类是不明智的。它会带来许多意想不到的问题。我们应该尊重生命,让一切顺其自然。 可编辑
分子克隆技术实验讲义 黑龙江大学生命科学学院 2016年3月 甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定 一、实验目的 1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。 2、学习和掌握质粒、T载体的特点。 3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。 4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。 5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。 7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。 8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。
二、相关知识 （一）T载体的制备 pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了Eco RⅤ识别位点，用Eco RⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。 （二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆） 把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。 相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。 （三）大肠杆菌感受态细胞的制备 外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞（competent cell）是经过一定方法处理后，具有接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。 相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；（3）感受态细胞定义及其功能；（4）转化定义及方法（DMSO、MnCl2、TB aq、PEG）等。 （四）重组DNA的转化及重组子的鉴定 将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反应后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易操作和进行下一步的分析，若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子，这样重组DNA分子的量就多了；二是对重组DNA 分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子，未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降
分子克隆实验标准步骤 一、 常规分子克隆实验流程： 二、 分子克隆实验标准步骤（含实验编号）： 1. PCR 扩增目的基因（编号Clone SOP-1） 以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例 体系（50ul ）： 10×KOD buf 5ul dNTP(2mM) 5ul Mg 2+ 3ul Primer1 1ul Primer2 1ul Template50-200ng KOD0.5ul ddH 2O up to 50ul 程序： 95℃2min 98℃10s 58℃30s 35cycle 68℃2kb/min 68℃7min 12℃∞
2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2） 琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。 胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。 ③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀 的胶层。④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。 3.试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3） 以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例 使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 ①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL， 12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） ②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中， 称取重量。 ③向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN 溶液），60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。 注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA 的能力较强。 ④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑥重复操作步骤⑤。 ⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附 柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 ⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或 ddH2O，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。 4.酶切反应（编号Clone SOP-4） 以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes（Thermo）为例 双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）： 10×FastDigest? buffer or 10×FastDigest? Green buffer 5ul FastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ul FastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ul DNAN ddH2Oupto50ul 酶切体系混合均匀后置于37℃条件下反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。 5.酶切产物的回收（编号Clone SOP-5） 以本实验室常用Axygen?AxyPrep?PCRClean-UpKit（Axygen）为例 ①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A
克隆的好处与坏处 好处 论据一：美国，瑞士等国已经能利用克隆技术培植的人体皮肤进行植皮手术。曾经有一位美国妇女在一次煤气炉意外爆炸中受伤，75%的体表被严重烧伤。医生取下一小块未遭损坏的皮肤，送到一家生化科技公司。一个月以后，该公司利用先进的克隆技术，培植出了一大块健康的新皮肤，使患者迅速得以痊愈。这一全新技术避免了异体植皮可能出现的排异反应，给人类带来了福音。科学家们预言，在不久的将来，他们还将借助克隆技术制造出人的耳朵、软骨、肝脏，甚至心脏，动脉等人体组织和器官，供医院临床使用。 论据二：在繁殖许多有价值的基因方面，克隆技术是也有大用武之地。例如，在基因工程操作中，科学家们为了让细菌等微生物“生产”出名贵的药品，如有希望使侏儒症患者重新长高的生长激素以及能抗多种病毒感染的干扰素等等，分别将一些相应的人体基因转移到不同的微生物细胞中，再设法使这些微生物细胞大量繁殖。与此同时，人体基因数目也随着微生物的繁殖而增加。在人体基应被大量克隆时，微生物也随之大量的“生产”出人们所需要的名贵药品了。 论据三：在基础生命科学方面，克隆技术使得对基因功能研究从以往只能在小鼠身上进行，到现在在多种动物身上均可得到实现，这有利于更加清晰地揭示基因功能和生命本质；克隆技术提供了研究哺乳动物细胞发育全能型以及核质关系最有效的手段之一；克隆技术可以克隆出各种濒临珍稀动物，从而提供基因型完全一致的实验动物，这有利于找到疾病的有效治疗方法，揭示发病的机制，并有助于抗衰老及其机制的研究。 总结（好处）：
一、无排斥反应的器官移植。 二、濒危物种保护。 坏处： 一、克隆技术现在还不成熟，克隆人可能有很多先天性生理缺陷。 二、克隆人的身份难以认定，他们与被克隆者之间的关系无法纳入现有的伦理体系。 三、人类繁殖后代的过程不需要两性共同参与，将对现有的社会关系、家庭结构造成难以承受的巨大冲击。 四、克隆技术有可能被滥用，成为恐怖分子的工具。 五、从生物多样性上来说，大量基因结构完全相同的克隆人，可能诱发新型疾病的广泛传播，对人类的生存不利。 六、克隆人可能因自己的特殊身份而产生心理缺陷，形成新的社会问题。 从道德价值的角度： 一、从社会伦理角度，克隆人是对人类发展的一种过强的干预，可能影响人种的自然构成和自然发展。 二、从家庭伦理角度，会加剧家庭多元化倾向，瓦解正常的人伦秩序，改变人的亲系关系，丧失基本的归属感。 三、从性伦理学角度，完全改变了人类自然的、基于性爱的生育方式，使人口的产生与性爱分离，破坏人类的感情。 四、从生命伦理学角度，破坏了人拥有独特基因的权利，有可能导致人种的退化，还会使正常的生与死的观念发生动摇。 从生态层面：
一、扩增 1、LB培养基5ml； 2、抗生素：1000X，即1:1000比例。种类根据细菌抗性决定； 3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中； 4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。 二、纯化质粒DNA 1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚； 2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。取三次； 3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min； 4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒； 5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)； *备注：S1：S2：S3=5:5:7 6、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液； 7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液； 8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。重复一遍； 9、空管离心12000xg，1min； 10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率） 四、跑胶回收：sost回收失败 1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。 插入：配胶方法 大块胶60ml；小块胶25ml； 需要配置大块胶、大孔胶； Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min； 趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml； 倒入槽里。 2、跑胶：单位厘米/5-10v。所以大槽25cm，150v即可。小槽100v即可。 3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）； 4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；