细胞间的相互作用与肿瘤的浸润转移研究进展
姜凯, 黄志强
解放军总医院肝胆外科,北京 100853
摘要 肿瘤细胞的浸润转移过程是十分复杂的,这一过程包括了一系列的肿瘤细胞与肿瘤细胞、肿瘤细胞与宿主细胞、肿瘤细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)间的相互作用(interaction),在多种细胞因子的参与调节下,使某些肿瘤细胞能够发生成功的转移或 和迅速的生长。就肿瘤细胞的生物学特性、细胞间的相互作用,对肿瘤的浸润转移与术后早期复发的影响研究进展,做一系统综述。
肿瘤防治杂志,2003,10(5):549-552 关键词 肿瘤 病理学;肿瘤浸润 病理学;肿瘤转移;综述文献
中图分类号 R329.24;R73-37 文献标识码 A 文章编号 1009-4571(2003)05-0549-04
Advances in the Study of Cellular Interaction in Tumor Invasion and Metastasis JIANG Kai,H U ANG Zhi qiang.Dep artment o f Hepatobiliary Surgery,The General Hospital o f PLA,Beijing100853,China Abstract:The course of the tumor invasion and metastasis is very complicated.It includes a series of cellular in teraction among tumor cell,host cell and extracellular matrix.The cellular interaction enables the tumor cell to metastasize successfully and grow rapidly,regulated by some cell factors.The author reviews the advances in the study of biological characteristics of the tumor cell and cellular interaction in tumor invasion,metastasis and early postoperative recurrence.
China J Cancer Prev Treat,2003,10(5):549-552 Key words: neoplasms pathology;tumor infiltrating pathology;neoplasm metastasis;review literature
肿瘤的浸润(invasion)和转移(metastasis)是恶性肿瘤最主要的生物学特征,也是恶性肿瘤生长过程中必然出现的生物学现象,它不仅贯穿于原发恶性肿瘤的自然病程,而且存在于新转移瘤的发生、生长的各个环节,直接影响肿瘤患者的预后。尽管目前对肿瘤的化疗、放疗、生物治疗及非手术综合治疗已取得了很大的进步,但仍未能阻止肿瘤的浸润和转移的过程。作为绝大多数肿瘤首选治疗手段的外科手术,虽使一部分早期肿瘤患者得到了良好的疗效,然而,相当部分的患者却避免不了术后复发甚至广泛的转移。其原因可能在于某些肿瘤早期即发生了肿瘤细胞的转移而尚无临床表现,或者是外科治疗手段促进了肿瘤浸润、转移、生长过程而使其术后很快出现复发转移征象。
血液系统、淋巴系统、直接种植是恶性肿瘤细胞常见的三大转移途径,不同的肿瘤因其原发部位和生物学特性的差异而表现出不同的主要转移途径。但目前一般认为肿瘤的浸润转移过程包括以下几个环节:1)肿瘤细胞表面再生黏附分子降低,细胞之间粘附性减
第一作者简介 姜凯(1967-),男,山东诸城人,主治医师,医学博士,主要从事肝脏与胆管肿瘤的诊断与治疗。
E mail:kaijiang@https://www.doczj.com/doc/c515240034.html, 小,使肿瘤细胞脱落。原发部位的肿瘤的生长,对其周围组织、血管、淋巴管的浸润破坏,使某些具有较强转移能力的肿瘤细胞逃逸;2)肿瘤细胞进入血液或 和淋巴系统内转移;3)少部分的肿瘤细胞经过与血液和淋巴循环中的某些免疫细胞、细胞分子相互作用而生存下来;4)得以生存的肿瘤细胞在特异的部位附着于血管或淋巴管的内皮细胞(endothelial cell)或基底膜(basal membrane);5)最终突破基底膜而游出血管或淋巴管;6)转移部位的肿瘤细胞休眠或继续生长。实际上,肿瘤细胞的浸润转移过程是十分复杂的,这一过程包括了一系列的肿瘤细胞与肿瘤细胞、肿瘤细胞与宿主细胞、肿瘤细胞与细胞外基质(extracellular ma trix,EC M)间的相互作用(interaction),尤其是多种细胞因子的参与调节,才使某些肿瘤细胞能够发生成功的转移或 和迅速的生长。
1 肿瘤细胞的生物特性及其相互作用
随着对肿瘤的临床病理学与肿瘤细胞学的深入研究,人们对肿瘤细胞生物特性的认识,不再是仅局限于相对独立地观察细胞形态或行为差别等方面,而是逐渐深入到其内在本质来看待细胞的生物学特性。
1.1 肿瘤的异质性
20世纪70年代末提出了?肿瘤异质性#(tumor heterogeneity)概念,对肿瘤浸润、转移、或治疗过程中遇到的某些生物学现象做出了较为恰当的解释。而且,就其关于肿瘤细胞亚群间具有表现遗传型异质特性的现象,逐步为后来的实验研究结果反复证实。肿瘤异质性是指同一肿瘤体内的不同细胞亚群之间在形态学、核型、生长速度、细胞表面受体及抗原表达、免疫学特性、转移能力、逃避宿主免疫监视和攻击的能力及对治疗的敏感性等方面的差异。这一概念强调了肿瘤体内不同亚群的存在,及其生物学行为的差别。造成肿瘤异质性的原因尚不清楚,目前一般认为,这些亚群最初可能是来自于同一祖先细胞(progenitor cell),由于在肿瘤细胞的不断分裂、生长过程中,基因突变的不稳定性导致变异株的产生,相继出现以某个变异细胞株为主体的亚群,因而表现出多克隆起源的倾向[1]。
在肿瘤浸润转移的多个环节中,转移瘤的形成是对原发肿瘤细胞亚群高度选择的结果,即并非所有的肿瘤细胞亚群均能发生浸润转移,只有极少数基因突变高度不稳定、或占优势的亚群才能形成转移瘤。研究发现,在新形成的转移瘤中,仍然存在肿瘤细胞亚群间的差别,其可能来源于不同亚群、或转移亚群的变异株,转移瘤内新变异株的产生使肿瘤细胞更具侵袭性并发生进一步的转移[2]。肿瘤异质性的特征为肿瘤细胞的浸润转移创造了基本条件,不仅原发肿瘤具有异质性特征,转移瘤的细胞亚群随着子代细胞的产生并不断出现异质性表现,因而给肿瘤的治疗带来了更大的困难。
1.2 肿瘤细胞亚群的生态特性
在对肿瘤异质性的认识过程中,于20世纪80年代末又出现了另外一种观点,即了解肿瘤细胞的行为特征,不能只根据对组成肿瘤的细胞亚群特性的简单描述,而是需要将肿瘤细胞群体视为一个完整的?生态系统#(?ecosystem%)。我们可以从某一肿瘤体内分离培养浸润转移力强,而且相对稳定的细胞克隆,但是,这些克隆却不能表现出原克隆群体的整体特征。因此,肿瘤细胞亚群的生物学行为,不仅取决于肿瘤细胞亚群自身特征,而且还取决于肿瘤细胞亚群间的相互作用产生综合性生物学行为的能力,所以提出肿瘤是一个?细胞社会# (?cell society%)的概念。大量的实验结果从不同侧面描述了肿瘤细胞社会的本质含义,如不同亚群细胞的混合,引起亚群间、亚群与细胞外基质成分间的相互作用,来共同调节肿瘤细胞的生长、浸润、转移能力,以及变异株的产生、治疗的敏感性等行为[3]。
1.3 肿瘤细胞间的相互作用
肿瘤的异质性显示了内部不同亚群的存在,无论是单克隆或多克隆起源的亚群,还是优势亚群或非优势亚群,在细胞社会中共同的相互作用下,对肿瘤的浸润转移更为有利。即使是无明显转移能力的肿瘤细胞,倘若与转移性肿瘤细胞混合,则表现出较强的转移能力[4]。给大鼠静脉注射大剂量(1&104~5&104个细胞)相对具有转移能力的同源大鼠乳腺肿瘤细胞,没有或很少出现肺转移瘤;若注射最大剂量(1&106个细胞)无转移能力的同源细胞,也无肺转移瘤出现;将少量前者与后者混合注射,却出现大量的肺转移瘤;如果给皮下已经种植过乳腺非转移性亚群168系细胞的大鼠静脉注射转移性亚群410 4系细胞,在出现的肺转移瘤中发现168系与410 4系细胞克隆,如果第2次注射为168系细胞或生理盐水,则不发生转移。该实验的重要发现在于,转移瘤体内出现了非转移性肿瘤细胞的变异株。多数作者认为,变异株的产生是由于转移性亚群的掺入,使本来基因型稳定的非转移性亚群发生异型化,即使是非转移性肿瘤细胞与正常细胞的基因整合后,可使杂交后代表现出转移特性[5]。因此,肿瘤细胞间的相互作用加强了肿瘤的异质特性,使细胞亚群呈现多样化,提高了细胞群体的转移能力,从而促进了肿瘤转移的发生与形成。
认识肿瘤的异质性与肿瘤的细胞社会特征,尤其是肿瘤细胞间的相互作用,可以从局部与整体相结合的观点出发,深入研究它们在肿瘤细胞浸润转移过程中的作用与协同效应,对重新估价肿瘤细胞的生物学行为、治疗反应,以及对指导临床病理学对肿瘤预后的判断等都有重要意义。
2 肿瘤细胞与宿主细胞间的相互作用
肿瘤细胞与起源组织细胞间的相互作用能够增强肿瘤细胞的浸润转移能力。1889年,Paget提出关于肿瘤细胞(种子)转移的器官(土壤)特异性的?种子?土壤#学说(?seed soil%hypothsis),强调了肿瘤细胞在生长过程中的各个阶段与?正常#细胞间的相互作用,尤其是特定宿主环境对其基本行为特性的重要影响。
2.1 肿瘤浸润转移的器官特异性
动物实验观察中,肿瘤细胞的原位与异位种植比较,原位种植的更容易发生转移。将BACB cfC3H大鼠乳腺癌细胞分组种植于同系雌性大鼠乳腺脂肪垫内和皮下组织内比较转移发生率,前者发生明显的肺转移;用CAB J大鼠特发的SP1系乳腺肿瘤细胞实验的结果是一致的,只有在脂肪垫内种植才能发生肺转移。与此相反,从转移瘤发生的特异器官,可以判断肿瘤的原发部位。比如,大鼠结肠肿瘤MC A 38系细胞种植于大鼠盲肠壁内出现肝转移,而种植于皮下组织时只能发生肺部转移。
人类肿瘤细胞在裸鼠体内极易生长,但一般不发生特发转移,倘若不考虑肿瘤细胞与起源组织间的相互作
用,可能是由于常规采用异位皮下组织瘤细胞注射方法所造成的[5]。研究发现,如果在裸鼠肾包膜下注射人肾癌细胞,几乎均能成功地发生特发转移,对于人膀胱癌细胞的实验结果也是如此。人黑色素瘤MeWo系细胞种植于裸鼠真皮下时,发生淋巴结转移率为70%(7 10),肺转移率为80%(8 10平均14个灶);而皮下组织种植时,淋巴结转移(10%,1 10)与肺转移(50%,5 10,平均6个灶)明显减少。同样,人胰腺肿瘤ASPC 1系细胞种植于裸鼠胰腺十二指肠段内,几乎所有的裸鼠均发生广泛的转移,包括肺、肾、肠系膜淋巴结、膈肌及腹膜转移,皮下种植时却无转移灶出现。
临床观察的结果也证实了Paget学说的正确性, Tarin等[6]将腹部肿瘤患者的癌性腹水进行颈静脉转流,在死亡者的尸检中,除发现原发部位及淋巴结的广泛转移外,并未发现肺转移的任何征象,事实上,大量的肿瘤细胞首先经过的是肺脏的毛细血管床;Ya manaka等[7]也发现肝癌患者手术中大量癌细胞进入血液,术后出现广泛的肝内复发转移,而很少见其他部位的转移。说明肿瘤浸润转移的器官特异性同样适用于解释人体肿瘤的特异转移现象。
2.2 转移瘤形成的器官依赖性
一般认为,肿瘤转移的器官特异性可能与肿瘤细胞首先进入的毛细血管的解剖位置有关,然而,大量的实验发现,肿瘤仍以特异的方式在异位移植组织内形成转移瘤[8,9]。例如,将裸鼠的部分肺、卵巢、肾组织种植于同系裸鼠的皮下或肌肉组织内,两周后,经裸鼠的尾静脉分别注射两种肿瘤细胞,注射黑色素瘤B16 F10系细胞组,异位肺组织转移发生率为71.4%(20 28),异位肾组织发生率仅为14.3%(4 28),此结果与裸鼠的原位肺肾转移发生率相一致;注射肿瘤M5076系细胞组,裸鼠原位卵巢、肝脏、脾脏内形成转移,肺内无转移,异位卵巢转移发生率为50%(5 10),异位肺内发生率只有10%(1 10)。1960年,Kinsey曾经报道过DBA大鼠黑色素瘤591系可在异位肾、脾、心脏、皮肤或甲状腺内形成转移瘤的现象。而且,兔肿瘤V2系细胞在肝内较肺内的生长速度更快,大鼠Walker256系细胞肺内与淋巴结内种植组较皮下种植组、及经颈动脉注射的小鼠肝癌细胞肝内较其他部位的细胞生长指数显著增高。
因此,动物实验中转移瘤的形成具有器官依赖性,与器官的解剖位置无明显的直接关系。肿瘤转移的器官特异性机制不能简单地解释为原发肿瘤的循环连锁转移或微循环系统的解剖结构之原因,其中必然涉及与其他许多肿瘤细胞内在的与宿主环境中的因素间的相互作用[10],如肿瘤细胞浸润、转移、生长所必需的细胞外基质成分、特异的细胞因子或生长因子,以及各种正常细胞的协同作用等,起源组织内可能更具备肿瘤细胞所需的这些条件。肿瘤细胞到达最合适的部位,对靶器官趋向(chemotaxis)信号做出反应,粘附于血管内皮细胞或基底膜,细胞动力的增强,游出血管,得以迅速增殖、生长。对细胞外基质及某些重要活性因子的认识,有利于进一步探讨肿瘤浸润转移的机制,为阻断转移中关键的环节寻找有效的方法或途径。
3 细胞外基质与肿瘤细胞的相互作用及其生物效应
肿瘤细胞在浸润转移的系列相互作用中,从逃离原发肿瘤到达转移部位生长,其中贯穿于整个过程的关键环节是肿瘤细胞的粘附(adhesion)、细胞外基质降解酶的产生和释放、肿瘤细胞的动力(motility)。近几年来,关于肿瘤细胞与细胞外基质间的相互作用对肿瘤浸润转移的影响,一直是肿瘤生物学研究的热点课题,尤其是肿瘤细胞在粘附细胞外基质过程中对其自身动力的影响问题。
3.1 肿瘤细胞粘附与细胞外基质成分
肿瘤细胞与细胞外基质的相互作用导致细胞外基质成分变化,对肿瘤细胞成功的逃逸和在特异部位的着床起重要作用。肿瘤细胞亚群配对混合实验发现,其中一个细胞亚群之所以明显支配另一个亚群,是由于二者的混合比例相对稳定,且优势亚群中细胞外基质成分也较另一亚群的明显占优势[4]。正常情况下,细胞与细胞外基质或其他细胞的选择性黏附作用是胚胎发育及成熟组织结构与功能的维持的基本需要。细胞外基质调节细胞形态变化,同样调节着各类正常细胞的生物学行为。正常细胞粘附过程中出现转化异常的现象提示,异常的细胞行为是与恶性肿瘤细胞的出现相关的。这种异常行为直接影响着细胞外基质降解酶的产生和释放,使肿瘤细胞浸润穿透正常组织的间质和基底膜,有助于转移瘤的形成。
细胞外基质主要由胶原(collagen)、蛋白多糖(pro teoglycan)和糖蛋白(glycoprotein)等三类大分子物质组成,其中每一类的组成成员均以组织特异性形式(tis sue specific fashion)产生,并以间质形式共同构成组织细胞的三维空间结构,维持胚胎的发育及正常组织的功能,并调节着细胞的形态、粘附、生长和分化。利用合成蛋白多肽和单克隆抗体检测显示,这些细胞外基质成分明显地促进细胞间的粘附;分子生物学技术也明确了多种参与细胞粘附调节的细胞表面受体和细胞内蛋白,如糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)与细胞表面蛋白多糖结合和降解在细胞粘附中的作用,从配体-受体(li gand receptor)的作用机制角度,阐述了细胞外基质促进细胞的粘附,调节细胞构架组成和形态的作用[10,11]。
3.2 肿瘤细胞动力与细胞外基质成分
肿瘤细胞与细胞外基质成分粘附的相互作用直接
影响着肿瘤细胞的动力。研究表明,细胞外基质蛋白成分中,如纤联蛋白(fibronectin)、层粘蛋白(laminin)、玻联蛋白(vitronectin)、血小板反应蛋白(throm bospondin)及多种胶原(collagen),在体外直接促进肿瘤细胞的粘附与运动。观察发现,肿瘤细胞通过趋向作用直接向含该成分密度高的方向迁移,且速率较对照组明显加快,那么,体内接近肿瘤细胞处的特异细胞外基质成分密度的局部变化同样会影响肿瘤细胞的迁移[11,12]。透明质酸(hyaluronan),即原始糖胺聚糖(primitive glycosaminoglycan),在细胞迁移活跃的发育组织中含量丰富。过去认为,组织内透明质酸对细胞动力的影响在于调节局部组织的降解与破坏,然而,大量的研究结果表明,透明质酸还能够识别肿瘤细胞表面的特异受体如CD44、RHAMM等,直接影响组织内肿瘤细胞的粘附和扩散[13]。另外,某些与细胞外基质相关大分子物质,其阻止细胞黏附作用的另一面是增强了局部细胞的分离,这种效应同样适用于肿瘤细胞的动力调节。硫酸软骨多糖(chondroitin sulfate proteogly can)与肌腱蛋白(tenascin)是与细胞外基质密切相关的,它们能够阻止培养细胞的粘附,同时又促进培养基中划痕边缘迁移细胞的分离,对肿瘤细胞的实验观察与此结果是相一致的。尽管细胞的粘附与动力紧密相连,但是,并不是所有与细胞外基质有关的细胞粘附刺激因子都能在体外促进细胞的扩散,原因可能是体内细胞迁移的动力还涉及细胞内的信号传导问题,如G 蛋白 细胞外基质(G protein ECM)、肌动蛋白 磷脂酰肌醇循环(actin PI cycle)的信号传导系统对细胞动力的调节[14,15]。
3.3 细胞外基质内主要蛋白水解酶
肿瘤细胞在与细胞外基质粘附相互作用的过程中,产生并释放大量蛋白水解酶,破坏包括血管内皮、基底膜在内的各种细胞外基质结构,进入血液或淋巴循环,并到达特异部位继续生存。这些蛋白水解酶主要有三大类,即金属蛋白酶(metalloproteinase)、丝氨酸蛋白酶(serine poteinase)和半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase),其含量一般随肿瘤细胞的恶性程度而增加[16,17]。一些实验结果显示,对该类酶的抑制可以阻断肿瘤细胞的浸润转移能力。
肿瘤细胞内不同亚群的共存、或转移能力不同的细胞亚群混合,使转移能力低的细胞也表现出较强的浸润转移能力,其原因可能与不同亚群间的细胞外基质成分及降解酶的互补作用,使其转移能力发生了改变有关。因此,研究阻断细胞外基质成分与肿瘤细胞的相互作用的环节,可能对抑制肿瘤细胞浸润转移更有意义。
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收稿日期:2002-09-29 修回日期:2002-10-11
(编辑:李胜)
肿瘤细胞的研究进展 关键词：循环肿瘤细胞、研究进展、治疗 学号:24520132204189 姓名：蔡茂宇 摘要：循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是指进入人体外周血的肿瘤细胞。是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因. 近些年, 随着技术的不断改进, CTCs检测作为一种新型的非侵入性诊断工具, 在早期发现患者术后复发与远处转移、评估疗效与预后等方面的应用价值已成为临床研究的热点. 本文简要综述近年CTCs检测的研究进展及其临床应用状况早在1869年, Ashworth发现血液中的一种血细胞同尸检发现的肿瘤细胞相似, 首次提出CTCs的概念. 目前CTCs定义为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞. 进入循环未被清除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓, 并在一定条件下发展为转移灶. 近年来, 随着人们对肿瘤转移机制研究的深入, 以及检测技术的不断改进, CTCs的检测已取得了 一些突破性的进展, 部分检测方法在稳定性、敏感性及特异性等方面均已较理想, CTCs的临床应用研究也已取得明显进展. 目前CTCs的检测方法众多,根据检测原理可分两大类: 细胞计数法(cytometric methods)和核酸检测法(nucleic-acid based methods). 前者主 要包括各种免疫细胞化学技术、流式细胞术等; 后者主要包括聚合酶链反应、逆转录聚合酶链反应及其各种改进的技术等. 免疫细胞化学法(immunocytochemistry, ICC) ICC是指以显色剂标记的特 异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和细胞化学的呈色反应, 对相应抗 原进行定位、定性和定量测定的技术. 其检测的肿瘤标志物主要分3类: (1)上皮细胞角蛋白(CK), 如CK19、CK20; (2)上皮细胞膜特异性抗原, 如黏蛋白 类, 包括EMA、HMFG、HEA-125等; (3)肿瘤相关糖蛋白(TAG). ICC检测的主要 优点是可进行细胞大小和形态学的分析, 缺点是敏感性低, 只能从(1-10)×105个正常细胞中发现1个肿瘤细胞, 且应用免疫细胞化学法检测循环血中肿瘤细 胞时, 每个载玻片上所能检测的细胞样本量仅为5×105个细胞, 难以从外周血中大量的单核细胞中检测出极少量的肿瘤细胞, 因此单纯应用免疫细胞化学法 敏感性低,难以满足临床诊断需要. 为了能大范围检测外周血中稀少的肿瘤细胞,近年来又相继研发出光纤阵列扫描术 (fiber array scanning technology, FAST), 激光扫描细胞计量仪(laserscanning cytometry, LSC)等, 能够在传统的显微镜技术基础上高速扫 描并快速、准确的定位免疫荧光标记的肿瘤细胞, 使检测的敏感性和实效性显著提高. 流式细胞术(flow cytometry, FCM) FCM是一项集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学及单克隆抗体技术为一体的新型技术. 其优点是可以定量计数肿瘤细胞数量, 检测数据较精确, 还可对细胞进行多参数分析. 何成 全等应用流式细胞术检测66例胃癌患者外周血中CK19、CK20的表达. 结果66 例胃癌患者CK19、CK20、CK19+CK20阳性表达率分别为53.1%(35/66)、 56.1%(37/66)、46.9%(31/66), 检测的阳性率与患者的TNM分期及转移程度相关, 且检测胃癌远处转移的敏感度高达90.0%. 认为应用FCM检测CK19、CK20 的表达对胃癌微转移的诊断具有一定临床意义. 但由于FCM检测靶细胞的敏感
课程考核论文 课程名称：肿瘤干细胞的研究进展成绩：
肿瘤干细胞的研究进展 摘要：肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力和分化潜能，能产生异质性细胞的细胞。本文简要阐述了肿瘤干细胞的来源、分离技术及鉴定，并对以肿瘤干细胞分化、临床应用前景和问题进行了综述。 关键词：肿瘤、干细胞、应用 肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSC)理论认为，肿瘤组织中绝大多数细胞增殖能力有限，不能自我更新，不会导致肿瘤的复发、转移；CSC只占肿瘤细胞中的极少部分，却是肿瘤发生、发展的关键。CSC研究有可能阐明肿瘤的发生机制，使肿瘤治愈，从而引发肿瘤学领域的革命性变革，意义重大。本文拟就CSC 的起源和鉴定等作一简要综述。 一、肿瘤干细胞的来源 肿瘤干细胞起源目前有两种学说：(1)由于正常干细胞突变形成肿瘤干细胞；(2)一些已经开始分化的原始细胞或成熟细胞去分化变为幼稚细胞并具有分裂能力。Sell 认为恶性肿瘤的产生和发展是由于干细胞的分化受阻，而不是成熟细胞的去分化；干细胞是起始事件或“第一次打击”(即获得永生性)突变的靶标，干细胞本身具有永生性，只需获得异常增殖的突变即可；体细胞的突变不会形成肿瘤，是因为成熟细胞的半衰期短，一个正常细胞形成转化细胞至少需要几年至几十年，在促进事件或”第二次打击”(即获得异常增殖能力)，细胞通常早已死亡。尽管缺乏直接的实验证据，但也有研究人员认为CSC是正常SC同其他细胞融合的结果。因为骨髓细胞容易与其他类型的细胞发生融合，Marx等_6认为，Houghton等在胃上皮细胞观察到的骨髓细胞是骨髓细胞与上皮细胞融合所形成的。细胞融合因子CD 是乳腺癌干细胞的阳性标记，暗示CSC可能具有与其它细胞融合的能力。Bjerkvij等观察到在病理条件下，SC和已经出现肿瘤相关基因突变的细胞发生融合，这种融合后的细胞具有sC的特性。胚胎干细胞是指胚胎内细胞团或原始生殖细胞，具有发育全能性，在理论上可以诱导分化为机体内所有类型的细胞，在体外可以大量扩增、筛选、冻存和复苏而不会丧失其原有的特性。有研究人员认为肿瘤中存在一些具有增殖和分化潜能的细胞，该细胞与正常组织细胞有着相似的自我更新途径，可能是正常SC分化停滞的结果。Karoubi[8 研究证实肺腺癌与正常肺组织均表达共同的胚胎SC标记物OCT4A和OCT4B，提示CSC是胚胎SC起源的可能。 二、肿瘤干细胞的分离与培养 肿瘤干细胞的分离及体外培养是进行肿瘤干细胞生物特性研究的首要步骤。目前还没有很成熟或经典的分离方法，不少实验室通过各种不同的途径完成了这一工作，归纳起来主要是利用肿瘤干细胞表面分子标记物和生物特性实现
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法 09级生科3班余振洋200900140156 一、【实验原理】 1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物： 恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。 8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。 2．关于筛选方法： 下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。 1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物 端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。 2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物 快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染 FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA
抗肿瘤转移机制的实验方法学研究进展肿瘤转移是是恶性肿瘤的一个重要表现，是指肿瘤细胞从原发部位侵入血管、淋巴管或体腔，在新的部位由于血管生成而继续生长，从而形成与原发瘤相同类型肿瘤的过程。主要经淋巴管、血道转移，它的出现往往标志着预后不良，大多数的癌症患者死亡与肿瘤转移密切相关[1]。肿瘤转移是一个多阶段的复杂过程，大体归纳如下：即机体内原发部位的肿瘤细胞在生长过程中细胞内部的骨架发生重排、变形，从而脱落侵入细胞外基质（ECM ），酶解ECM 进入循环系统，在循环系统释放的血管生成因子与内皮细胞特异性受体结合后，生成新的血管，瘤细胞在血管构建的“骨架”上增殖，形成一个新的癌巢，再脱离出循环系统，在机体某个点定居下来，并逐渐增殖成长为一个新的肿瘤瘤块的一系列过程。如果肿瘤细胞反复转移，后果则相当的严重。这是目前肿瘤难治的一个主要原因，所以研究抗肿瘤药物抗肿瘤转移的机制，从而筛选、开发出新的能促进机体抗肿瘤转移的药物是非常重要的。 抗肿瘤转移机制的药理实验方法主要涉及到以下几个方面： 1. 建立肿瘤转移的动物模型一般以大鼠、裸鼠为常用动物模型。将目标瘤细胞如SGC-7901 胃癌细胞株、S180肝癌细胞株等置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，培养箱条件为37 C, 5%CO2进行细胞培养，0.1%胰酶消化传代后制备细胞悬液，之后将细胞悬液以皮下注射或腹腔注射的方式，将肿瘤移植入动物体内。黄挺[2]等人采用皮 下接种W256 癌肉瘤的方法建立了Wistar 大鼠的肝癌转移模型；魏锦来[3]通过腋下接种SGC-7901 细胞悬液的方式建立了裸鼠的胃癌原位移植瘤动物模型。此外还有尾静脉注射、裸鼠脑部右尾状核注射人肿瘤组织制备的细胞悬液等方式接种。现阶段裸鼠的应用对于肿瘤方面的研究更有意义，因为裸鼠体表无毛，其先天性缺乏T 淋巴细胞，免疫功能低于别的实验动物，更容易进行异种肿瘤的移植。而大鼠由于价格相对便宜而应用较为广泛。此外也可用C57BL/6 小鼠等动物建立动物模型。均应在无菌条件下进行造模，以免细菌等微生物产生污染。 2. 观察转移情况 肿瘤转移的动物模型建立以后，需对动物进行分组实验研究。一般分为空白对照组、药物组、阳性药对照组等。薛晓红等人在进行乳宁冲剂及其拆方对裸鼠移植瘤肺转移的抑制作用及机制时[4]，将裸鼠分为6组，每组8 只，7 周后处死裸鼠，取出原发部位肿瘤和肺，分别称重、检测原发部位肿瘤体积和肺部肿瘤转移情况。观察转移情况的方法是：将
肝癌细胞培养 一、培养基 1、RPMI-1640+10%胎牛血清培养基 2、DMEM+15%胎牛血清培养基 成分表
二、实验前准备工作: 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。 1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。 （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
2、橡胶制品清洗消毒： 0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用 3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）： 使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。 三、细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。 实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台（1）取一15ml离心管用滴管在其内滴加5--9ml培养液（取8ml）。 （2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s 内完成。 （3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。 （4）低速离心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培养液再清洗离心一次。 （5）离心后倒掉上清液，在离心管中滴加3ml培养液（RPMI-1640），混匀（可用滴管轻柔吹打）。 （6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加15滴10%小牛血清，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。2-3天换一次培养基。 四、细胞传代： 当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。 （1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。（细胞贴壁生长）。 （2）向瓶内加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化（将培养瓶翻转过来，以保证细胞没有脱壁）。 备注：若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液8ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。 （4）倒出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量（约2ml），轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再加3ml培养液+15滴小牛血清。 （5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。 （6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1000r／min) 5min。 （7）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。
肿瘤转移是恶性肿瘤生物学特征之一!也是肿瘤临床治疗的难题"肿瘤转移是癌细胞与宿主细胞相互作用的连续复杂过程"首先’原发肿瘤细胞从原部位脱落’侵入细胞外基质()*+,与基底膜(-+,中大分子蛋白黏附"其次’激活细胞合成并分泌各种降解酶类’降解-+及)*+’穿过脉管壁进入循环系统’在循环中逃避免疫系统攻击’最后穿过脉管’外渗达继发部位形成克隆’增殖形成转移灶./0"现就其主要方面综述如下# /细胞运动机制与转移 肿瘤细胞的迁移由运动因子启动"运动因子与受体结合后通过信息传导而引发癌细胞的运动.!0"影响细胞运动及生长的因子有#!肝细胞生长因子1分散因子$234154%#目前的实验研究发现’234154在许多肿瘤尤其在侵袭和转移表型中均有较高水平的表达&例如’在多形性神经胶质母细胞瘤细胞中234154及编码其受体的基因+67表达水平高’尤以其侵袭边缘为明显’而在恶性程度较低的星形胶质瘤中234154表达则较低.&0&"自分泌运动因子$8+4%#8+4与细胞膜上的8+49结合可促使8+49磷酸化’从而激活一种百日咳毒素敏感的!蛋白’刺激肌醇代谢’促进癌细胞的运动&肿瘤细胞转移除了需要具备细胞运动能力外’还需要对基底膜进行降解&组织蛋白酶"是一种半胱氨酸蛋白酶’与基底膜的降解密切相关.#0& !细胞黏附机制与转移 !"#同质型黏附 同质型黏附:)#;<=>6?@A$;<76A@A复合体结构的完整性对黏附功能的发挥有重要的意义&)34和B34##通过)34受体可使)#;<=>6?@A和$#;<76A@A磷酸化导致复合体解体!影响 肿瘤转移的分子机制研究进展 佟玲’王文萍’邢玉庆(辽宁中医学院’辽宁沈阳$$%%&!, 摘要!肿瘤转移是临床肿瘤病人死亡的最主要原因之一&目前对其研究较多的是有关其分子机制方面’肿瘤转移是一个多阶段复杂的过程’其中包括肿瘤细胞的脱落’迁移’黏附’生长等’每一阶段都受着不同因素的影响和调控"全文介绍近年来此领域的研究进展" 关键词!肿瘤转移(运动(黏附(降解 中图分类号!9C&D&C文献标识码!8文章编号!/EC/D/C%F(!%%#,%&D%$GHD%& 96I6J?KL?6II KM+KN6;ON6P
肿瘤干细胞的研究进展 Researchprogressintumorstemcells 摘要： 肿瘤干细胞具有高度增殖和分化能力，但又不同于普通干细胞，此类干细胞还具有发展成为肿瘤的特性，已经成为抗肿瘤研究的靶细胞,肿瘤干细胞研究进展迅速,深入研究肿瘤干细胞的特性,对恶性肿瘤的诊断,治疗和预后评估具有重要意义。本文对肿瘤干细胞的起源、表面标志、肿瘤干细胞生长的微环境及其临床意义进行了阐述。 关键词：肿瘤干细胞干细胞肿瘤综述文献 Abstract: Cancer stem cells have the ability to proliferate and differentiate, but they are also different from common stem cells. This kind of stem cells also have the characteristics of tumor development. In this paper, we describe the origin of tumor stem cells, the surface markers, the micro environment of tumor stem cells and their clinical significance . Keywords:Tumor stem cellsStem cellsTumorOverview 一、前言 肿瘤干细胞是肿瘤中具有干细胞特性的一类细胞，既具备高度增殖能力与自我更新能力，也具备多向分化潜能的细胞，这部分细胞虽只占少部分，但却是肿瘤发生、发展的关键。肿瘤干细胞增殖过程中，通过不均一分裂，一个肿瘤干细胞分裂形成一个新的肿瘤干细胞和另一个可最终分化为包括肿瘤细胞在内的各种细胞的子细胞，其结果是维持肿瘤干细胞数目稳定并产生肿瘤。近几年来，肿瘤干细胞的研究已经成为热点，在多种肿瘤组织中发现并鉴定了肿瘤干细胞。目前国内肿瘤干细胞还处于基础研究阶段，国外肿瘤干细胞在实验研究方面已经取得了一定的进展，而且也在临床应用研究方面有一定的突破[1]。文章对肿瘤干细胞的起源、表面标志、与干细胞及肿瘤的关系及其临床意义进行了阐述。 二、肿瘤干细胞的起源
一肿瘤的转移途径： 1 淋巴道转移：（癌多见）。原发癌的细胞随淋巴引流，由近及远转移到各级淋巴结，也可能超级转移；或因癌阻碍顺行的淋巴引流而发生逆向转移。转移癌在淋巴结发展时，淋巴结肿大且变硬，起初尚可活动，癌侵越包膜后趋向固定，转移癌阻碍局部组 织淋巴引流，可能引起皮肤、皮下或肢体的淋巴水肿；如：乳腺癌同侧腋窝淋巴结；肺癌肺门、支气管旁淋巴结；鼻咽癌同侧颈淋巴结。 2 血道转移：癌细胞进入血管随血流转移至远隔部位如肺、肝、骨、脑等处，形成继 发性肿瘤；如：瘤细胞静脉肺和肝等（最多见），形成边缘整齐、散在、多发的球形结节，中央常发生坏死，近脏器表面形成“癌脐”。 3种植性转移：内脏器官的肿瘤，侵犯浆膜后，瘤细胞脱落入体腔，种植在浆膜面 上。如：肺癌胸膜腔；消化道癌或卵巢癌腹膜腔。 形态：浆膜增厚，表面癌结，血性积液，脱落细胞学检查可见癌细胞。 4.直接转移：随着肿瘤体积不断增大，肿瘤细胞可沿周围正常组织的薄弱处，直接延伸，侵入并破坏邻近组织或器官。如：直肠癌前列腺、膀胱、子宫及阴道壁等。 二此例的转移方式： 1.胃卵巢：种植性转移，胃癌浸透到脏器外表面时，随着呼吸或肠蠕动等相应的摩擦，可脱落到体腔继续生长 2.胃、肝、肺淋巴结：淋巴道转移，肿瘤细胞侵入淋巴管后，随淋巴液转移到淋巴结，在淋巴结内生长形成转移瘤，淋巴结肿大且变硬 3.胃肺、肝脏：血道转移，肿瘤细胞侵入血管后，随血流转移到全身各处称血道转移。侵入人体静脉系统的肿瘤细胞，先转移到肺，再经心脏扩散到全身各脏器。消化 道的恶性肿瘤常入侵门静脉系统转移到肝脏。 三 (1)阻塞和压迫：肿瘤的阻塞压迫发展迅速，程度也高，如肝肿大可以压迫神经；淋巴结肿大变硬，淋巴回流受阻。 (2)破坏所在器官的结构和功能：如肝癌由于肝细胞破坏和肝内胆管阻塞，可引起全身性黄疸。 (3)侵袭破坏邻近器官：如胃癌可穿胃壁，侵犯胃周围的器官。
抗肿瘤转移药物研究进展 李劲（中国药房杂志社，重庆市 400042） 癌症是严重威胁人类生命健康的疾病之一,肿瘤转移则是癌症患者死亡的最主要原因〔1〕。某种程度上说，防止肿瘤转移即能控制肿瘤所致的死亡。虽然国内外抗肿瘤转移药物研究的时间、人力、物力投入较多，但还没有一个真正的抗肿瘤转移药物上市。相关研究领域尚缺乏系统、科学的评价手段和方法。鉴于近期在国内有抗肿瘤转移的中药申报临床研究，本文拟结合近年来肿瘤转移研究的进展，对国内抗肿瘤转移的研究情况作一简介，供同行参考。 1 抗肿瘤转移药物研究现状 肿瘤侵袭与转移是肿瘤细胞的恶性生物学行为,见于肿瘤发展的中后阶段。肿瘤侵袭也称为肿瘤直接扩散(direct spread)[1,2]。瘤细胞不连续性播散,并在远隔部位生长的过程为转移(metastasis)[3，4]。上述过程是一个复杂的、多步骤的过程，大致包括肿瘤细胞从原发肿瘤灶脱离；降解基底膜,向外浸润、迁移并粘附于血管内皮细胞；进入循环系统随着血流到达并停留于远处的血管壁；穿过血管侵入细胞外基质,最后在特定的组织或器官形成转移灶[7]这样一个过程〔2〕。 关于肿瘤转移机制，分别有“种子和土壤”学说、“机械和解剖”学说、“过滤”学说等〔3〕,但均没有很强的说服力。近年来随着分子生物学的发展，发现此过程分别受“转移相关基因”和“转移抑制相关基因”的调控，并且转移过程与各种细胞因子的功能失调密切相关〔4〕。由于转移过程的复杂性，肿瘤转移的分子和细胞机制尚未真正阐述清楚。 肿瘤转移过程牵涉到细胞脱落、浸润、迁移运行、着床、新生血管生成等〔5〕，理论上讲，只要能够阻止上述一个或多个过程，就能抑制肿瘤转移。目前抗肿瘤转移药物的研究也是针对肿瘤转移的各个环节，寻找具有不同药理作用的受试物。研究较多的有抑制癌细胞粘附、抑制蛋白水解酶对基底膜降解、抑制癌细胞运动、抑制肿瘤新生血管形成、抗血管内凝聚以及抗信息传递的制剂等〔6〕。其中细胞粘附分子、基质金属蛋白酶、新生血管生成因子等是抗肿瘤转移药物研究的热点。90年代国际上有多个基质金属蛋白酶抑制剂、整合蛋白抑制剂、及抗肿瘤新生血管生成抑制剂（TNP 470、酞咪哌啶酮等）进入临床试验〔7〕。但除抗肿瘤新生血管生成抑制剂研究进展较快外，其他方面研究由于没有取得预期的效果，多个临床试验并没有达到预期目的。 天然来源的抗肿瘤侵袭和转移[5]物的研究也方兴未艾,多酚类化合物如茶多酚[6]、姜黄素可抑制血管生成和肿瘤转移。单味中药材提取物，如刺五加皂苷、猪苓多糖、云芝多糖、金荞麦提取物、紫杉醇等表现出一定的诱导癌细胞凋亡、减少转移癌结节数目、抑制肿瘤细胞的侵袭和运动等作用〔8〕。补益、活血化瘀、清热解毒、化湿利水、软坚散结类的中药复方制剂也表现出减少肿瘤细胞转移的作用，初步研究结果提示，其作用机制与抗迁移机制、抑制细胞外基质的降解、抗粘附、阻断信息传递、抑制血管生成等有关〔9〕。中药为抗肿瘤侵袭和转移药物的研究提供了广阔的药物资源。目前中药抗肿瘤转移的研究仅仅是局限于实验性阶段，整体的研究水平也有待进一步提高和深入。鉴于中药物质基础的复杂性，在真正发现疗效确切的抗肿瘤转移中药制剂之前，还需要进行许多探索性的研究。 2 抗肿瘤转移药物的药效学评价[7~10] 2.1 非临床药效学评价 建立体内肿瘤转移模型是药效学研究的基础和前提。肿瘤转移模型大致多分为两大类,即自发性转移模型和实验性转移模型。自发性转移模型是一种移植瘤转移模型，其标准部位是腋部背侧皮下移植。凡是从血管或淋巴管直接接种瘤细胞后引起的转移,为实验性转移模型。 在模型建立方面开展的研究工作较多〔10〕，如1840年,Langenbeck将新鲜肿瘤材料接种到狗静脉内,引起了肺内肿瘤生长，是建立实验性转移模型的开端,此后又用啮齿类动物建立了该类模型，以及皮下移植的自发性转移模型。20世纪80年代初，Bogden将瘤组织移植于小鼠肾包膜下,建立了肾包膜下侵袭模型。人类恶性肿瘤裸鼠移植瘤是近十几年来发展比较迅速的研究领域,特别是原位移植技术的引进,开拓了在人体外整体实验研究人类恶性肿瘤的重要途径,使之更接近机体环境的特点。 淋巴道转移的实验研究起步较晚。20世纪50年代,有人用肿瘤细胞进行淋巴管内移植,以后又发展到用鼠类爪垫内侧皮下移植、骨髓腔内移植及阴茎部位皮下移植等建立淋巴道转移模型。为肿瘤转移的实验研究创立了有利条件〔11〕。 国内在20世纪80年代前后对建立肿瘤侵袭与转移模型进行了广泛的研究，建立的动物肿瘤转移模型有小鼠宫颈癌、小鼠胃癌、小鼠肺癌、小鼠肝癌等高转移模型。自1978年由国外引进裸小鼠后,建立了大量人类肿瘤在免疫缺陷动物体内的转移模型,如人肠黏液腺癌、
循环肿瘤细胞研究进展 任文君，孙国平 (安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科，安徽合肥230022) 摘要：循环肿瘤细胞（CTCs）存在于患者外周血中，是造成肿瘤转移和复发的主要原因。外周血中的CTC是非常罕见的，要求检测方法具有高敏感性及高特异性，成为临床常规检测的巨大挑战，但是检测CTC在协助诊断、早期发现肿瘤的微转移、指导个体化治疗、评价治疗效果及预后方面上具有重要的临床意义。该文将对其检测方法及临床应用进行探讨。 关键词：循环肿瘤细胞；检测；治疗 Ashworth曾在1986年首次发现并提出循环肿瘤细胞（CTCs）的概念［1］。CTC定义为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞［2］。肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程，肿瘤细胞由原发灶脱落，侵入循环系统，大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数存活下来，在远隔脏器或原发脏器中定居，发展为转移灶［3-4］。有些播散的肿瘤细胞和微小转移灶在切除原发灶后可以保持休眠状态并在若干年后形成转移灶［5］。因此，在外周血中检测到CTC提示可能有早期转移存在，尤其是临床尚未发现的微转移病灶。 CTC的检测包括以下2个步骤：（1）富集，方法包括形态学或免疫学为基础的技术。（2）检测，方法包括细胞计数和核酸检测技术。因为CTC在外周血中是非常罕见的（1个CTC/106 107个单核细胞），富集细胞可提高检测的敏感性，富集之后则通过细胞计数或核酸检测技术利用肿瘤特异性标志物对CTC进行检测及分析。 1富集 1．1以形态学为基础的富集膜滤过分离肿瘤细胞技术（ISET）通过肿瘤细胞体积大小进行富集［6］，就像一个微孔过滤器根据CTC的大小差异使其分离，其隔离灵敏度阈值接近每毫升全血一个癌细胞［7］，其优势在于不破坏CTC的形态，利于后续对单个CTC进行形态学、免疫细胞学及遗传学特征的研究，但只适合部分肿瘤，不适合那些体积小于2倍粒细胞大小的肿瘤细胞。 基于密度梯度分离，单核细胞较其他血液成分密度低，因此可依据密度梯度差异将肿瘤细胞和单核细胞从其他血液细胞中分离出来，如Ficoll-Hypaque和Oncoquick。与传统的Ficoll 通信作者：孙国平，男，主任医师，博士生导师，研究方向：消化系统肿瘤，E-mail：sunguoping@anhmu．edu．cn 程序相比较，Oncoquick增加了多孔屏障，使得分离出的细胞更加纯化，检出率更高［8］。 由于这两种富集方法是借助细胞的物理特性，因此缺乏特异性，易导致缺乏相应体积大小及密度梯度的肿瘤细胞的丢失，同时所富集的细胞不仅含有肿瘤细胞，还存在不同种类的其他细胞（特别是单核细胞），在后续检测过程中可能会因为肿瘤细胞的异质性和基因标志物的非特异性，造成假阳性结果。 1．2以免疫学为基础的富集免疫磁性分离技术（IMS），基于特异性免疫识别原理的富集技术，是目前应用最广泛的方法，通过特异性抗体包被的磁珠与细胞表面抗原特异性结合，形成细胞抗原-抗体-磁珠免疫复合物，在外加磁场作用下，将CTC从血细胞中分离出来。免疫磁性分离方式有2种：阳性分选和阴性分选。阳性筛选获得目的细胞，阴性筛选去除无关细胞使目的细胞得以纯化，也可将两种模式结合，提高富集效率。这项技术最大的优势在于可保证分离靶细胞的形态和功能的完整，有利于下一步CTC的计数、免疫细胞化学、PCR 等检测。目前，免疫磁珠可达纳米级，结合时间短，灵敏度高10－7 10－6。 CellSearch系统是目前FDA唯一批准用于临床富集及检测分析的技术，是一种半自动技术，集合了免疫磁分选技术和免疫细胞化学法的分离检测技术。涂有抗EpCAM抗体的磁珠与靶细胞结合，在外加磁场作用下被保留下来，接着采用荧光标记（CK8/18/19，DAPI，CD45）来区别CTC与血细胞，CTC 标记为CK8/18/19、DAPI（+），CD45（－），随后采用半自动荧光显微镜Cell-Spotter Analyzer检测分析细胞大小和形态，最终确定CTC，只需要7．5mL血液样本，即可从400多亿血细胞中检测到一个CTC。这种半自动系统能快速分析样本，并有良好的重复性。一个多中心研究，有学者提出Cell Search系统有82%的高富集率，且在乳腺癌CTC检测上有极 ［34］Ikeda T．Stem cells and neonatal brain injury［J］．Cell Tissue Res，2008，331（1）：263－269． ［35］尹国才，张长征，张淼涛，等．人胎脑神经干细胞在年幼大鼠脑内的成神经元分化［J］．中国组织工程研究与临床康复，2008，12（12）：2281－2284． ［36］Toda H，Takahashi J，Iwakami N，et al．Grafting neural stem cells improved the impaired spatial recognition in ischemic rats［J］．Neu- rosci Lett，2001，316（1）：9－12． ［37］吴芳，杨佳勇，张敏，等．脐血间充质干细胞移植对脑性瘫 痪儿童神经系统功能的影响：20例分析［J］．中国组织工程研究 与临床康复，2008，12（16）：3198－3200． ［38］张敏，杨万章，吴芳，等．神经生长因子配合脐血源神经干细胞移植对脑瘫患儿运动功能的影响［J］．中国误诊学杂志，2008，8（23）：5596－5597． ［39］杨万章，吴芳，张敏，等．脐血源神经干细胞移植治疗神经系统疾病临床总结和分析［J］．中西医结合心脑血管病杂志，2009，7（3）：287－290． （收稿日期：2012－05－25，修回日期：2012－10－26） · 9 · 安徽医药Anhui Medical and Pharmaceutical Journal2013Jan;17(1)
第6章肿瘤细胞的培养 肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。癌细胞是比较容易培养的细胞，当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点： (1)可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物 因素对肿瘤细胞生命活动的影响。 (2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究 癌变的发生机理； (3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。 (4)可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。 (5)研究周期短，比较经济。 但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。 一、肿瘤细胞培养的生物学特性 1、形态和性状 形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。 2、生物特性 癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高，细胞倍增周期短。 3、永生性 永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。但两者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。 4、侵润性 侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。 5、异质性 所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性，其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分，肿瘤干细胞易于生长增殖，分离培养干细胞的方法称干细胞培养(有干细胞系和数个亚系组成)。
肿瘤转移的分子机制 陈露12级七临9班12170918 指导老师：马长艳 【摘要】恶性肿瘤是危害人类健康的全球公共卫生问题之一，为新世纪人类的第一杀手。转移是恶性肿瘤发生和演变过程中最危险的阶段，了解恶性肿瘤侵袭、转移发生机制，寻找相应阻断途径对遏制恶性肿瘤发展有重要作用。本文就恶性肿瘤细胞侵袭与转移机制的研究进展作一综述。 【关键词】恶性肿瘤、侵袭、转移机制 众所周知，转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因，大约90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移[1]。肿瘤的转移过程包括从肿瘤的原发部位脱离，进入周围的基质，进入循环或淋巴系统，粘附在内皮细胞壁并向血管外迁移及在远处侵润，血管增生，形成新的转移灶等。从上个世纪StephenPaget提出肿瘤转移的种子-土壤学说到现在，人类对于肿瘤转移机制的研究已有一百多年历史。随着各种理论的不断完善，人们对于肿瘤转移这一极为复杂的病理过程有了更进一步的认识。肿瘤的转移主要与以下几个因素有关。 1.遗传异质性 实验证实，肿瘤细胞的同一转移性克隆中可以分离出不同恶性潜能的亚克隆，而高转移性克隆出现遗传学突变的频率要远远高于非转移性克隆，提示肿瘤转移是一个主动的过程，与基因组的不稳定性具有早期联系[2]。临床上与肿瘤转移相关的基因分为肿瘤转移促进基因及肿瘤转移抑制基因，如matal、H-ras、nm23、mts-1、WDNM、PGM21等，它们通过参与信号传导，诱导转移表型，调节细胞因子表达来诱导、促进、抑制肿瘤转移，如VaramballR等[3]研究发现EZH2在前列腺癌转移演进的过程中通过异位过表达和重建染色体等组成性抑制多种抑癌基因，并与肿瘤的转移和不良预后密切相关。肿瘤的遗传异质性是肿瘤细胞逃避免疫监视、产生化疗抗性、形成转移复发的根源，是抗转移治疗中不可忽视的重要环节。 2.上皮间充质转化EMT 2.1EMT概念 上皮间质转化(EMT)是指具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程，它以上皮细胞极性的丧失及间质特性的
肿瘤干细胞培养技术 随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。 肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。 无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分[1]。基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。 一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子 (一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促进干细胞增殖。胚胎干细胞的体外培养需要添加LIF以抑制其分化，维持其多能性。LIF可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、β转移生长因子(β-transforming Growth
抗肿瘤转移机制的实验方法学研究进展 肿瘤转移是是恶性肿瘤的一个重要表现，是指肿瘤细胞从原发部位侵入血管、淋巴管或体腔，在新的部位由于血管生成而继续生长，从而形成与原发瘤相同类型肿瘤的过程。主要经淋巴管、血道转移，它的出现往往标志着预后不良，大多数的癌症患者死亡与肿瘤转移密切相关[1]。肿瘤转移是一个多阶段的复杂过程，大体归纳如下：即机体内原发部位的肿瘤细胞在生长过程中细胞内部的骨架发生重排、变形，从而脱落侵入细胞外基质（ECM），酶解ECM进入循环系统，在循环系统释放的血管生成因子与内皮细胞特异性受体结合后，生成新的血管，瘤细胞在血管构建的“骨架”上增殖，形成一个新的癌巢，再脱离出循环系统，在机体某个点定居下来，并逐渐增殖成长为一个新的肿瘤瘤块的一系列过程。如果肿瘤细胞反复转移，后果则相当的严重。这是目前肿瘤难治的一个主要原因，所以研究抗肿瘤药物抗肿瘤转移的机制，从而筛选、开发出新的能促进机体抗肿瘤转移的药物是非常重要的。 抗肿瘤转移机制的药理实验方法主要涉及到以下几个方面： 1. 建立肿瘤转移的动物模型 一般以大鼠、裸鼠为常用动物模型。将目标瘤细胞如SGC-7901胃癌细胞株、S180肝癌细胞株等置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，培养箱条件为37℃，5%CO2进行细胞培养，0.1%胰酶消化传代后制备细胞悬液，之后将细胞悬液以皮下注射或腹腔注射的方式，将肿瘤移植入动物体内。黄挺[2]等人采用皮下接种W256癌肉瘤的方法建立了Wistar大鼠的肝癌转移模型；魏锦来[3]通过腋下接种SGC-7901细胞悬液的方式建立了裸鼠的胃癌原位移植瘤动物模型。此外还有尾静脉注射、裸鼠脑部右尾状核注射人肿瘤组织制备的细胞悬液等方式接种。现阶段裸鼠的应用对于肿瘤方面的研究更有意义，因为裸鼠体表无毛，其先天性缺乏T淋巴细胞，免疫功能低于别的实验动物，更容易进行异种肿瘤的移植。而大鼠由于价格相对便宜而应用较为广泛。此外也可用C57BL/6小鼠等动物建立动物模型。均应在无菌条件下进行造模，以免细菌等微生物产生污染。 2. 观察转移情况 肿瘤转移的动物模型建立以后，需对动物进行分组实验研究。一般分为空白对照组、药物组、阳性药对照组等。薛晓红等人在进行乳宁冲剂及其拆方对裸鼠