水质粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书
1含义及执行标准
1.1含义
粪大肠菌群基本性状与总大肠菌群相似，属于总大肠菌群的一部分。在培养温度为37℃时可检出总大肠菌群的存在，为区别存在于自然环境和温血动物肠道内的粪源性大肠菌群细菌，将培养温度提高倒44.5℃，仍能使乳糖发酵产酸产气的总大肠菌群为粪大肠菌群。一般水样特指除医院污水外的各种水样。本实验通过定性区别实验产酸产气，检索MPN表，导出定量的粪大肠菌群结果。
1.2方法原理
多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。
1.3水环境质量标准
表1-1 粪大肠菌群地表水环境质量标准（GB 3838-2002）
表1-2 粪大肠菌群农田灌溉水质标准（GB 5084-2005）
a 加工、烹调及去皮蔬菜
b 生食类蔬菜、瓜类及草本水果
表1-3 粪大肠菌群畜禽养殖污染物排放标准（GB 18596-2001）
2分析方法
2.1方法名称、方法来源及适用范围
方法名称：多管发酵法
方法来源：水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）(HJ/T 347─ 2007) 方法适用范围：此法适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。
2.2仪器
高压蒸汽灭菌器
电热干燥箱
恒温培养箱
冰箱
采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。
2.3 标准菌株制备
将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。必须包括大肠埃希氏菌、产气场杆菌和山夫登堡沙门氏菌三种对照。接种完后需记录：母种的来源，母种和工作种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。
2.4培养基
2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌比例，三倍配制（蒸馏水除外），用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
2.4.3 EC培养液：市售EC培养基，按铭牌配制，在115℃灭菌20min，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，贮存于暗处备用。
2.4.4 培养基存放于带紫外灯的灭菌物品专用贮藏柜中，当培养基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。
2.5分析步骤
2.5.1 水样接种量
将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表2。
如接种体积为10mL ，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL ；如接种量为1mL 或少于1mL ，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。 2.5.2 初发酵试验
吸取适量水样，按相应的比例将其制成1：10和1：100或其他稀释比的稀释样。将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃下培养24h ±2h 。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。
1:10稀释样品的制作方法为：吸取1mL 水样，注入到盛有9mL 灭菌水的试管中，混匀，制成1:10稀释样品。因此，取1mL1:10稀释样品，等于取0.1mL 水样。其它稀释比的稀释样品同法制作。
样品为地表水、废水时，取三个接种量，每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需15个试管。样品为地下水时，取三个接种量，首个接种量为100mL,其他每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需12个试管。
试管内乳糖蛋白胨培养液的浓度与体积应根据接种量确定。若接种量为100mL ，倒取100mL 样品接种于装有50mL 三倍浓度乳糖蛋白胨培养液的大试管内；若接种量为10mL ，吸取10mL 样品接种于装有5mL 三倍浓度乳糖蛋白胨培养液的试管内；若接种量为1mL 时，吸取1mL 样品接种于装有10mL 普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内；若接种量少于1mL 时，吸取1mL 稀释样品接种于装有10mL 普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内。 2.5.3 复发酵试验
轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。在44.5℃±0.5℃温度下培养24h ±2h （水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在30min 内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。 3 结果的计算
根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表3 或表4中查得每升水样中的粪大肠菌群。接种水样为100mL2 份、10mL10 份、总量300mL 时，查表3 可得每升水样中的粪大肠菌群；接种5份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，查表4求得MPN 指数，MPN 值再乘10，即为1L 水样中的粪大肠菌群。
10(mL)
MPN MPN mL =?
值指数接种量最大的一管（）
表3、表4 见附件 4质量控制要求 4.1对照控制
采用无菌水作全过程对照控制，当有明显杂菌污染时，表明测定过程某环节无菌性失控，应重新检验；采用阳性、阴性菌株作实验室过程对照控制，当阳性菌株不能生长或阴性
菌株生长时，表明测定过程某环节失控，应重新检验。 4.2精确度
同一实验人员所作前15个阳性水样平行双样结果为X 1i 、X 2i （X 1i 、X 2i ＞0，i ＝1，2，…，15），则精确度判断值＝R ?27.3。
（ ，i
i i X X R 21log log -= ）
当分析所得2
1log log X X R -=＞R ?27.3表示精密度已失控；否则平行双样
的差距可以接受。 5 数据处理 5.1数据审核
分析结果填写原始记录表与样品送检单，应经科室内部校对、审核后，方可上交。 5.2数据填报
粪大肠菌群报告以个/L 单位填报，当数量在100以内按实有数据报告；大于100采用二位有效数字报告，有效数字后面的数值以四舍五入方法计算，为缩短数字后面的零数可用10的指数形式表示（如报告16，000或1.6×104）。 6 样品采集
6.1采样瓶应经高压或干热灭菌处理后方可使用；
6.2样品含有余氯时采样瓶灭菌前应加脱氯剂，即于500mL 采样瓶中加入0.3mL10%硫代硫酸钠溶液；
6.3样品含铜锌等重金属较高时采样瓶灭菌前应加螯合剂，即于500mL 采样瓶中加入1.0mL15%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na 2）溶液；
6.4 同一地点同时采多瓶水样时，细菌学检验水样先采； 6.5采样时，采样瓶不得用水样荡洗；
6.6采样后，样品应2小时内检验，否则，应10℃以下保存且不超过6小时。 7 期间核查
7.1 人员素质
首先要参加省上岗证理论考试，理论考试合格后方能上岗。同时站内进行操作技能考核、培训，考核合格后方能持证上岗，承但本项分析。按国家和省环境监测中心的要求，须要进行五年换证的理论考试、操作技能考核。 7.2 仪器设备
臭氧杀菌效果、高压锅压力表指示、恒温培养箱温控情况每年由站质管中心组织持证人员检验、校正，玻璃量具每三年由站质管中心组织持证人员校正。 8分析环境条件控制 8.2仪器设备
∑
==15
1
15
/)(i i
R R
保持实验室环境整洁，定期检查，避免恒温培养箱温控失控，做好仪器设备使用和保养记录。
8.3无菌室
定期采用消毒剂清洁无菌室，定期检查臭氧杀菌效果，保证无菌室微生物实验条件的满足。
8.4分析环境条件检查和记录
每次分析样品时，作无菌室空气细菌培养对照，保证无菌室空气微生物学质量，并做好记录。
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