分子生物学实验步骤总结超全
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一目的基因的获得
细菌基因组DNA的提取
（一）仪器
1）台式高速离心机
2）恒温水浴箱
3）枪式移液器
4）灭菌的EP管和Tip头
（二）试剂
1）溶液1: 25% 蔗糖
50ｍmoｌ／L Trｉs-Hcl,ｐH8.０
50mmol/ＬEＤTA,ｐH8．０
5０0ug／ml 溶菌酶(现用现配）
1０0ug/ml RNaｓe
２）溶液Ⅱ:１00mｍｏl/L Trｉs-Hcl,pＨ8.０
1% SDS
４00ug／ml 蛋白酶K
3）酚:氯仿:异戊醇（25:2４:1)
4）氯仿:异戊醇（24：１）
5）3moｌ/L NaＡｃ(pH5.2)
6）异丙醇或无水乙醇
7）70％乙醇
８)TＥ缓冲液：10mmol/ＬＴris-Hｃl，pH８.０
1mmol/L EDTＡ，pH８．0
(三)实验步骤
1） 5ｍL细菌过夜培养,5000ｒｐm离心10分钟，去上清液。
2）将菌体细胞悬于250uL溶液１中，3７°C水浴保温过夜。
3）加250ｕＬ溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。
4）加0.9倍体积的酚／氯仿／异戊醇(25:24：1)，轻轻混匀，于1４０00rpm离心１0分钟，转移水相至新的Ｅp管，重复步骤4一次。
5）向转移的水相中加入0,９倍体积的氯仿/异戊醇（2４:1)，轻轻混匀,于１４00０rpm离
心1０分钟,转移水相至新的Ep管,重复步骤5一次。
6）向转移的水相中加入０．1倍体积的3ｍol/ＬNaAｃ和0.7倍体积的异丙醇（或2．5倍体积的无水乙醇）,冰上放置３0分钟。
7）１4000rpm离心20分钟,弃上清，用0.5ｍL70％乙醇洗涤沉淀一次,弃上清，沉淀于室温干燥。
8）将DＮＡ沉淀溶解于１5uｌTＥ缓冲液中,－20°C保存。
9）进行ＤNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
植物DNA的SDS提取法:
(一)试验试剂：
1）研磨缓冲液：称取５９.6３gNaCｌ，13.２5g柠檬酸三钠，37．２gEDTA-Na分别溶解后合并为一,用０.2mｏl/Ｌ的NａＯＨ调至ｐＨ7．0,并定容至1000mｌ。
２）１0 ＳＳＣ溶液：称取８7．66gＮaＣl和4４．1２ｇ柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。
3）１SSC溶液:用10 SSC溶液稀释10倍。
4）0．1 ＳSC溶液：用1ＳSC溶液稀释1０倍。
5）Rnase溶液:用0.1４mol／ＬＮaCl溶液配制成25mg/mｌ的酶液，用1mol/LHCl，ｐＨ至5.０,使用前经80℃水浴处理5ｍｉn（以破坏可能存在的Dｎasｅ）。
6)氯仿－异戊醇：按24ｍl氯仿和1ml异戊醇混合。
7)5mｏl／L高氯酸钠溶液：称取ＮaClO4．H2O ７0.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至10０ｍl。
8) ＳDS(十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止,然后在70～80℃的水浴中溶解,趁热过滤,冷却之后即将滤液放入冰箱,待结晶出现再置室温下凉干待用。
9) 1mol/LHCl。
10) ０.２mol/LNａOH。
1１）二苯胺乙醛试剂：1.5ｇ二苯胺溶于10０ml冰醋酸中，添加1.5ml 浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处,使用时加0.１mｌ乙醛液[浓乙醛：H2Ｏ=１：５0(V／V）］。
１２) 1.０ｍol／L高酸溶液(HClO4)。
１3) 0.05mｏｌ／ＬＮaOH。
１4) DＮA标准液:取标准DＮA25mｇ溶于少量0.05mｏl/ＬNaOH中，再用0．05mol/L ＮaOH定容至２5ｍｌ,后用移溶管吸取此液5ｍl至50ｍｌ容量瓶中,加5．0ml１mol／L
ＨＣlO4，混合冷却后用0.5ｍol／ＬHClＯ4定容至刻度，则得100μｇ/ｍl的标准溶液。（二)实验步骤:
1) 称取植物幼嫩组织10ｇ剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。
2) 将匀浆无损转入25mｌ刻度试管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，加上塞子,剧烈振荡3０ｓ,转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000ｒpm离心５min。
3) 离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中,弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。
4) 将试管置72℃水浴中保温3min(不超过４mｉn)，以灭活组织的ＤNA酶,然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温,加５mｏl/L高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1(V ／V)］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为１mol/Ｌ。
5) 再次加入等体积氯仿-异戊醇混合液至大试管中，振荡1miｎ,静置后在室温下离心(400０rpm）5ｍｉn，取上清液置小烧杯中。
６) 用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。
7) 然后加入0.5ｍl左右的1０ＳSC，使最终浓度为1 SSC。
8）重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。
9) 加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为5０~70μg/ml，并在３7℃水浴中保温３0min,以除去RNA。
１0) 加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡１min，再除去残留蛋白质及所加Rnａｓe蛋白,室温下以４00０rpm离心5min,收集上层水溶液。
11) 再按６、7步骤处理即可得到纯化的ＤＮA液。
二、PCR扩增目的基因
(一)器材
1) 微量移液器
2) 灭菌的Tip头、ＰCR管
3) PCR扩增仪
4) 目的DNＡ（ＤNA模板)
5) dNＴP混合物
6) 引物对
7) Taｐ酶
8)PCR扩增试剂盒
（二)试剂
1)10×PCR缓冲液(含Trｉs-ＨCl 100mmｏl/Ｌ; ＭgCｌ
2
15mmol/Ｌ、KCl500mmol/L, pH8．3,0．１%明胶)
2) 脱氧核苷三磷酸dNＴPs：配成 10mＭ——dAＴP,ｄＴTP，dGＴP，dCTＰ各10mM,用NａOH溶液调节至ｐＨ８.3。）
3)氯仿-异戊醇:配成24:１的比例，室温避光保存。
4) 酚：氯仿：异戊醇=25：2４:1
５) ３M NaAｃ、ddH2O
6) 无水乙醇:7０%乙醇
７) TE缓冲液
（三）实验步骤
１)在0.2mｌ薄壁反应管中加入下列成份:（混匀)
ddH
2
O:补至终体积(2５μl）
1０×PCR缓冲液 1/１0总体积
２.0mＭdNTPs1μl
２Ｕ/μl TaｑDNA聚合酶 0.５μl
引物混合液(１0 pｍoｌ/μl /引物) １μl
DNA模板０.6μl
混匀后,在台式离心机上瞬时离心１0秒。 2)在设定好的PC Ｒ仪上反应
９5°C,5min ;95°C ，1mi ｎ;56°C,１min ；72°C,2m ｉn 。反应３０轮。
3）反应结束后，将反应管在72°C 充分延伸10分钟，再将反应管冷却至４°C 。 取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳(实验三）,确认是否有目的的P ＣR 产物。如果P ＣR 产物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物,可以通过纯化得到改善。纯化继续４）—6)。 ４）转至1．5ml 离心管，向管中加２5μl 酚，2５μｌ氯仿－异戊醇混匀，离心10000rpm ，30秒。
5）吸取上层液,转至另一已加5μl 3M ＮaAc 的1.5m ｌ的离心管，加150μl 无水乙醇,-２0°
C 过夜。
6）离心10000rpm ,1０分钟，弃上清,加0.5ml 70％乙醇，１00００rp ｍ离心,5分钟。弃上清，烤箱中干（60°C)，溶于20μl TE 。 (四）技术要点
1)P ＣR 各组份的配制与加样量要特别注意。
(１) 引物浓度：１0 ｐmol 足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强,扩增非 特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。
（2) 引物的配制：厂家提供的引物一般是干粉状态并标明O Ｄ值,1 OD 约含33μg 。开盖前先将干粉离心至管底,加双蒸水至浓度２μg/μl ，再取部分稀释至10 pmo ｌ ／μl 。 引物浓度计算公式:1ｐｍol =(3．３×10-4
μg ) ×ｎ ，n 是引物的碱基数
（3) Mg 2＋
：使用浓度一般在１.５mM ,要求模板不含高浓度ED ＴA 和诸如硫酸基团类的负电荷基团， Mg ２+
浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。
(4) 模板ＤNA ：浓度不可过高，质粒DNA 2０ｎg 即可，若需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释1000－10000倍作为模板使用。
（5) T ａq DNA 聚合酶:一般用量5U /100μl 。酶量过大易导致扩增非特异序列，Ta ｑ酶具有末端转移酶活性,常在3’端加A 。 2)扩增轮数与退火温度
扩增轮数：一般３0轮以内就可使模板扩增1０６
倍，超过30轮，错配率升高。 退火温度计算公式：Ｔm 值=（GC ×4+AT ×2）–4
三、琼脂糖凝胶电泳的检测
(一)仪器
1）琼脂糖凝胶电泳系统(天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tｉp头、水平电泳槽、电泳仪）
2）凝胶成像仪
(二)试剂及材料
目的DＮA、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDＴA、EＢ、DNA纯化试剂
盒
1)TＡE电泳缓冲液
浓储存液 50×:242g Ｔriｓ;57.１ml冰乙酸;10０ｍl 0.5ｍol/ＬEDTA（PH8.０) 定容至一升。
使用液 1×:4.８4g Trｉs；1.15ｍl冰乙酸；2ｍl 0.5 mｏｌ/L EDTA(PH8.0)
定容至一升。
2）样本液
１０×缓冲液: 60%蔗糖;0．４%溴酚蓝
(三)实验步骤
１）将有机玻璃内槽洗净、晾干,放置于水平制胶器中,插好梳子,在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。
2）0.8%琼脂凝胶板的配制：取０.6g琼脂糖加8０ml TAE(1×)，20ml水,微波炉加热融化３分钟,将其冷却至５5°C-６5°C,加入ＥＢ储存液1ul,小心混匀,缓慢倒入制胶槽中。(根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度)。
3）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板,放入电泳槽，加入TＡE（1×），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。
４)ＤＮＡ样品按照１0:1的比例加入样本液,在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进行电泳。5）接通电泳槽与电泳仪的电源,维持稳压1-5V/ｃm（按照两极之间距离计算)，电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断,当移动到距凝胶前沿1-2ｃm出停止电泳。
６）剥胶并在凝胶成像仪观察结果。
（四）技术要点
1)选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定ＤNA的大小,小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在１%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与５00bp的双链线状ＤNA一致。
不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性ＤＮA大小范围见下表1。
表１不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效
范围凝胶浓度(%) 分离DＮA的有效范围
（kb)
0.3 60~5
0．6 20~1
０.8 10～０.8
１.0 7~0.5
1．2 6~0.4
1.5 ３～0.2
２.0 ２～０.1
2)电泳中注意防止凝胶发热。
3）将电泳仪置稳压档，电压设置小于5Ｖ/cm(电极间的最小路径)。随着电压的增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。
４)溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。
四、目的DNA的回收纯化
(一）仪器
1)琼脂糖凝胶电泳系统
２)凝胶成像仪
3）离心机
4)单面刀片
5)恒温水浴锅
(二)试剂
１) DＮＡ回收试剂盒
2）5０×TAE
3）ddＨ２O
(三)实验步骤
１）在紫外灯下切分含ＤNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖.放入1.５ml离心管中。
2) 按每1０0mｇ琼脂糖加入300—６00μl溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500ul),置5５℃水浴10分钟,使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。
3)将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，1２000rｐｍ室温离心1分钟,倒掉收集管中的液体.再将吸附柱放入同一个收集管中。
4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后，１20０0rpｍ室温离心3０秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。
５)再在吸附柱中加入５０0uI漂洗液， 1200０ｒpm室温离心15秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。
6) 1２00０ｒｐm室温空离心1分钟。
７)将吸附柱放入一个干净的1．5ml的离心管中，在吸附膜中央加入３0ul洗脱缓冲液，室温静置２分钟后, 12000rｐm室温离心1分钟(为提高回收效率可再洗脱一次)，将1.5ｍl离心管（DNＡ)贮存于－20℃。
五、限制性内切酶消化、产物回收及连接重组
(一）仪器及材料
1）回收得到的目的DNA
2）BamHI、HiｎdIII、T4 DNA连接酶、DNA回收试剂盒
3)ｐUＣ1８‐ＣA T 质粒、双蒸水、１0×酶切通用缓冲液K
4)EP管、恒温水浴锅、微量移液器、台式离心机
表1 常用酶切缓冲液配方
缓冲液名称配方贮存温度（℃）
10×Ｌ1０0ｍM
Triｓ-ＨＣl,ｐＨ7.
５
１00ｍM MgCl
２
10 mＭ DTT
-20
１0×M 100ｍM
Tris-HＣｌ,pH７．5
100mM MgCｌ
２
10 mM DＴT
500ｍM NaCｌ
-20
１0×Ｈ50０ｍM
Ｔris-HCl,pH７.5
1０0mＭMgCl
2
10 ｍM DTT
1０0０mM NaCl
-２0
10×K 200 ｍM
Ｔris-HCｌ,ｐＨ8.5
1００ｍM MgCl
2
10 mM DＴT
1０00mM KＣl
-20
１0×T(BSＡ-Free) ３30ｍM
Trｉｓ-Ａc,pH７.9
10０mＭＭgAｃ－20
(二)实验步骤
１）在灭菌的EP 管中按如下方式准备双酶切反应体系: 酶切反应体系(20u ｌ体系）
管号 核酸 １0×酶切通用缓冲液K ddH2Ｏ B ａmHI Ｈｉnd ＩII
1 1５ul 目的ＤＮA 2ｕl 0u ｌ 2ｕl 1ul
2 １0u ｌpU Ｃ18‐ＣA Ｔ质粒 2ul 5ul 2ul 1ul
2)37℃保温三小时。
3)酶切产物的纯化回收，每１00ul 溶液加入700u ｌ溶胶液,其余的操作步骤详见实验四 4)载体与目的DNA 的连接。在灭菌的EP 管中按如下方式准备双酶切反应体系（20ul ）: 目的DNA pU Ｃ18‐CAT 质粒 10×连接缓冲液 Ｔ4 D ＮA 连接酶 ddH2Ｏ
X u ｌ Ｙ ul ２ul 1ul Ｚul
目的ＤNA 和pU Ｃ18‐CAT 质粒的相对浓度约为1：3—1:１0 5)１4℃水浴保温过夜。
5 ｍM DTT 660m Ｍ KAc
0.1% ＢSA
－20 0.1％ Tri ｔion Ｘ-１００
-20
六、大肠杆菌感受态细胞的制备及目的DNA的转化
(一)仪器
1．小型高速离心机
2．恒温摇床
3．恒温培养箱
4．‐20℃冰箱
5．恒温水浴器
6．超净工作台
7．高压灭菌锅
(二)材料
1．氨苄青霉素
2.大肠杆菌DＨ5a
３.连接产物
4．离心管
5．枪头、微量移液器
６．试管、培养皿、三角瓶
(三）试剂
LB培养基（根据需要确定配制的量):
1０g/L胰蛋白胨，5ｇ/L酵母提取物，１0g/L NaCｌ,加水至1000ｍl，高压灭菌,保存在室温。
氨苄青霉素：
用去离子水配成10０mｇ/ml的储存液,过滤除菌,－20℃分装保存。
卡那霉素:
用去离子水配成10０ｍｇ/ml的储存液,过滤除菌，-2０℃分装保存
无抗生素LＢ琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）:
1０g/ｌ胰蛋白胨，５g／l酵母提取物，１0g/ｌNaCl,15ｇ／l 琼脂粉，加水至100０mｌ，高压灭菌;铺平板,冷却后在37℃培养2４小时,保存在室温。
含有抗生素ＬＢ琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）:
10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物,1０g/l NａCl,15ｇ/l琼脂粉,加水至１0００ｍl，高压灭菌;当培养基降温至５０℃左右，加入终浓度为１00μg/ml的氨苄青霉素或5０μｇ／ｍl卡那霉素，并铺平板,冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。
0.１ＭCaCl
2
(根据需要确定配制的量):
1１.099克溶解在１00０ml灭菌水中,0．２2μm滤器过滤除菌。氯化钙分子量为：1１0.99。50%甘油:
５０ｍl甘油加入５0mｌ水,混匀，高压灭菌。
其他:
DH５α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干,接菌环,加250ｍl ＬB液体培养基的１00０ml灭菌锥形瓶一个，灭菌5０ｍｌ和500 ｍL离心管若干,灭菌刻度吸管若干,冰盒，移液器,灭菌移液器吸头，灭菌Eｐpendorf管等。
(四)实验步骤
１)以接菌环从-70℃保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12小时；
2)挑取单菌落接种于5 mL无抗生素ＬB培养基中,37℃振荡培养过夜；
３）按照1:100接种菌液至2５0ｍＬLB培养基中，３７℃剧烈振荡培养1.5-2 小时左右，
至ＯD
600
达0.4-０．6;
4)将菌液冰浴１0 分钟，转移至预冷的500 mL离心管中，4℃,４000 rｐm离心10 分钟；
5）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于５0ｍL预冷的０．1 ＭCaCl
2
中，冰浴２0 分钟，４℃，４０００rpm离心10 分钟;
6）弃尽上清。以１２．5 mＬ（菌液体积的5%）预冷的０．１M CａCl
2
溶液重悬细菌沉淀，同时加入等体积预冷的５0%甘油水溶液,混匀后按每支5０μL在冰上分装，-80℃保存；注:以上操作全部在无菌条件下进行。
7)取连接产物2μl（在实际操作中，经常需要取全部连接产物)置于冰上;
8)从－80℃冰箱取３管感受态细菌（每管5０μl),在冰上融化;
9)将连接产物加入感受态细菌中，混匀,放置冰上2０－3０分钟；同时做两个对照管
?受体菌对照:50μl感受态细胞＋2μl无菌水
?质粒对照：50μｌ０．1 M CaＣl
2
溶液＋2μl连接产物
１0）42℃加热９0秒,迅速置于冰上1-2分钟；
11）每管加入400－1０0０μl的无抗生素液体ＬB培养基,在3７℃摇床缓慢摇荡20－6０分钟;
12)用<10０00rpｍ离心10秒，弃去大部分上清，留下约50μｌ并用移液器吹吸重悬细菌;
13)取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性(根据质粒所携带抗生素抗性基因而定)的ＬB琼脂糖平板上,倒置于37℃培养箱培养12小时以上，出现菌落。
(五）技术要点
１.加入的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5％；
2．42℃热激时,必须要保证温度的准确性;
3.涂布LＢ平板的菌液量应该根据经验确定。如果连接效率很高,而且所用感受态细菌的效率也很高，则吸取较少量的菌液；反之，可以增加,甚至全部菌液涂布平板。判断的标准：在LＢ平板上生长密度合适的单菌落;
4．涂布平板之后，在３7℃培养的时间不超过12-１６小时，否则可能产生卫星菌落；
5.防止其它质粒污染;
６.防止其它细菌污染。
七、质粒DＮA的提取及重组子的鉴定
(一)仪器
1．恒温培养箱
2．恒温摇床
3．小型高速离心机
4．高压灭菌锅
5．分光光度计
（二）试剂及材料
1.转化重组子
２.缓冲液A:５0mM葡萄糖;10mＭEDＴA;25mM Tｒis-ＨCl，pH8．０。
3.碱溶液：0.2M NaＯH；１%SDＳ, PH12.5。
4.乙酸缓冲液：3ＭNａAC;2M乙酸,ｐH4.8(盐酸调ｐH）。
5．TE缓冲液:10mＭTris-HCl，pＨ8．0；1mM ＥDTA．。
６.ＲＮA酶Ａ溶液:１０mg/mｌRNＡ酶Ａ,用TE配制,100°C煮１0分钟,灭活ＤNA酶。缓慢冷却至室温,1０0００r/ｍin离心5ｍｉn,上清于－2０°C保存。
7.LB培养基: 10g胰蛋白胨,5g酵母粉,5g NaCｌ加水至1０00ml，用1M NaOＨ调pH至7.5，高压灭菌。
８．氨苄青霉素：用去离子水配成1０0mg/ml的储存液，过滤除菌，-2０℃分装保存。9.ＬA培养基：在ＬB培养基中加入终浓度10０μｇ/ml的氨苄青霉素。
1０．异丙醇
11.酚－氯仿－异戊醇:25:２4：1
１2．70%乙醇
1３.3M NaＡc
（三）实验步骤
１) 从转化平皿上挑一克隆接种到ＬＡ液体培养基中,３７℃震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1—1．２时,收获细菌。菌液转到1.5ｍlＥpｐeｎdｏrｆ管中,离心8000rpm，2分钟，弃上清。
2）加100μl缓冲液A，充分混悬细菌。
3）加200μl碱溶液,裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮,开盖后能拉出丝状粘稠液体。4）加150μl乙酸缓冲液，反复倒转管5次,混匀,冰浴1０分钟。
5)离心10000rpm,5分钟，将上清转移至另一Eppendorf管中。
6)加等体积的酚－ｌ氯仿-异戊醇(2５:2４：1)混匀，离心10０00rpm，1分钟。
７)吸上层水相至另一Eppendoｒf管中,加等体积的氯仿混匀，离心10000ｒpm,1分钟。8)吸上层水相至另一Eppendｏｒf管中，加０．6倍体积的异丙醇,混匀，室温或-2０°C,10分钟。
９）离心100０0rｐm,１0分钟，弃上清,加入１ml 70％乙醇。勿混匀,离心１00００rpm,5分钟,重复加入1mｌ 70%乙醇一次,弃上清,干燥箱中干燥。
１0)干燥后,加入30μｌTE(含ＲNA酶A 10ul,２0μg/ｍl)，使质粒溶解，-20°C保存备用。1１) 取一个灭菌的ＥＰ管,依次加入下列试剂
10×限制酶缓冲液2.0uｌ、重组质粒5.0ul、ddH2O11.0ul、限制性内切酶2.0ul总体积为2０.０ｕl。
12）将上述试剂轻轻混匀,稍加离心，集中溶液，37°C水浴保温３—4小时。酶切结束时,加入０.5mmｏl／L EDTA(PＨ8.0）使终浓度达10mｍol/L，以终止反应。
13）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析详见实验三。
(四）技术要点
1)每一步都要充分混匀，为获得高产量DNA,第一步需使菌体完全重悬。
2)加入碱溶液后,反复混匀使细菌充分裂解,但需要轻柔，一旦裂解（液体变清亮)必须马上加乙酸缓冲液中和。
3)70%乙醇洗涤时，离心后应小心地将上清倒掉,注意这时DNA沉淀较疏松，易从管壁上脱落。
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
实验实习总结 实验室教学是培养应用人才的关键环节，关于实验室实习的总结该怎么写。下面是我为大家整理的实验实习总结，希望对大家有帮助。 实验实习总结篇一 时间过的真快，转眼间，在实验室为期两个月的毕业实习结束了，留下的是满满的收获和不舍。 在这两个月的时间，我学到了很多东西，不仅有学习方面的，更学到了很多做人的道理，对我来说受益非浅。在老师和师兄师姐的帮助下，我很快融入了这个新的环境，这对我今后进入研究生阶段是非常有益的。除此以外，我还学会了如何更好地与别人沟通，如何更好地去陈述自己的观点，如何从更多的人那里获取对自己有用的信息。相信这些宝贵的经验会成为我今后实验的最重要的基石。实习是每一个打算进入研究生阶段的学生必须拥有的一段经历，它使我们在实践中了解专业，让我们学到了很多在课堂上根本就学不到的知识，也打开了视野，增长了见识，为我们以后更好地从事科研工作、探索大自然的奥秘打下了坚实的基础。 现实的脚步声却是那么地清晰、有力。在一次次理论与实践相结合的过程中，在老师们悉心指导下，我不但生物实验有了系统的理解，从无数次的失败中吸取了宝贵的经验教训，而且随着时间的推移，自己的意志也得到了磨练，恐惧心理也逐渐地消失了。我时刻提醒自己，唯有不断努力，才能与时俱进。总之，这次实习的意义，对我来说已不再是完成学分、完成毕业实习的任务，而是在开启"生命之旅"大门的过程中迈出了第一
步。我一定会好好地珍惜这个机会，并为自己所喜爱的方向努力贡献自己的聪明才智。 在为期两个月的以实验为主的的实习中，我受益匪浅，我不仅学习到了专业知识，更重要的是收获了经验与体会，这些使我一生受用不尽，记下来以时刻自勉： 1.手脚勤快，热心帮助他人。初来匝道，不管是不是自己的份内之事，都应该用心去完成，也许自己累点，但你会收获很多，无论是知识与经验还是别人的称赞与认可。毕竟师兄师姐们也都是从我们这个时候过来的，对于他们而言，哪些学生是认真的，哪些学生只是混时间，他们一眼就能看出。因为态度决定一些，一些小事，如刷培养皿、刷试管，大家都是从这里开始的，不能因为好高骛远就偷懒。只有用心地，以良好的态度做好这一件件小事，才能获得大家的认可，也只有这样，才有师兄师姐愿意更深入的教给我们一些技术和方法。 2.多学多问，学会他人技能。学问学问，无问不成学。知识和经验的收获可 以说与勤学好问是成正比的，知识总是垂青那些善于提问的人。由于之前没有学过分子生物学，必然没有这方面的知识基础，很多东西不懂也是很正常的。所有的知识也都有一个从不懂到懂的过程，所以没有什么好丢脸的，不懂装懂才是真正的傻。此外，有一些经验上的东西，可能是关于细节的，在已知的基础上根据每个实验室的实验环境等因素进行了一些优化，这就需要我们及时的询问，才能少走弯路。 3.善于思考，真正消化知识。有知到识，永远不是那么简单的事，
结合着下载的资料复习吧~~~~ 绪论 分子生物学的发展简史 Schleiden和Schwann提出“细胞学说” 孟德尔提出了“遗传因子”的概念、分离定律、独立分配规律 Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离出DNA Morgan基因存在于染色体上、连锁遗传规律 Avery证明基因就是DNA分子，提出DNA是遗传信息的载体 McClintock首次提出转座子或跳跃基因概念 Watson和Crick提出DNA双螺旋模型 Crick提出了“中心法则” Meselson与Stah用N重同位素证明了DNA复制是一种半保留复制 Jacob和Monod提出了著名的乳糖操纵子模型 Arber首次发现DNA限制性内切酶的存在 Temin和Baltimore发现在病毒中存在以RNA为模板，逆转录成DNA的逆转录酶 哪几种经典实验证明了DNA是遗传物质? (Avery等进行的肺炎双球菌转化实验、Hershey 利用放射性同位素35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质外壳和DNA) 第二章染色体与DNA 第一节染色体 一、真核细胞染色体的组成 DNA：组蛋白：非组蛋白：RNA = 1：1：(1-1.5)：0.05 （一）蛋白质（组蛋白、非组蛋白） （1）组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4 功能：①核小体组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）作用是将DNA分子盘绕成核小体
②不参加核小体组建的组蛋白H1，在构成核小体时起连接作用 （2）非组蛋白：包括以DNA为底物的酶、作用于组蛋白的酶、RNA聚合酶等。常见的有（HMG蛋白、DNA结合蛋白） 二、染色质 染色体：分裂期由染色质聚缩形成。 染色质：线性复合结构，间期遗传物质存在形式。 常染色质（着色浅） 具间期染色质形态特征和着色特征染色质 异染色质（着色深） 结构性异染色质兼性异染色质 （在整个细胞周期内都处于凝集状态）（特定时期处于凝集状态）三、核小体 由H2A、H2B、H3、H4各2 分子组成的八聚体和绕在八聚体外的DNA、一分 子H1组成。八聚体在中央，DNA分子盘绕在外，由此形成核心颗粒。,H1结合在核心颗粒外侧DNA双链的进出口端，如搭扣将绕在八聚体外DNA链固定，核心颗粒之间的连接部分为连接DNA。 核小体的定位对转录有促进作用
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
分子生物学综合试验报告
综合实验Ⅰ.Southern杂交 （质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、 地高辛标记的Southern杂交） 一.实验目的 1.学习Southern杂交的原理及操作方法。 2.学习碱裂解法提取质粒的原理。 3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。 4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 二.实验原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。 PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。 地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 三．实验准备 1.实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基 2.实验试剂： Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M
分子生物学复习题 实验一DNA的制备 （1）为什么分子生物学实施时要担心EB？ 溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？ 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？ 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。 （6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁 实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？ 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？ 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？
常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。
Section A 细胞与大分子 简述复杂大分子的生物学功能及与人类健康的关系。 Section C 核酸的性质 1.DNA的超螺旋结构的特点有哪些？ A 发生在闭环双链DNA分子上 B DNA双链轴线高卷曲，与简单的环状相比，连接数发生变化 C 当DNA扭曲方向与双螺旋方向相同时，DNA变得紧绷，为正超螺旋，反之变得松弛为负超螺旋。自然界几乎所有DNA分子超螺旋都为负的，因为能量最低。 2.简述核酸的性质。 A 核酸的稳定性：由于核酸中碱基对的疏水效应以及电荷偶极作用而趋于稳定 B 酸效应：在强酸和高温条件下，核酸完全水解，而在稀酸条件下，DNA的核苷键被选择性地断裂生成脱嘌呤核酸 C 碱效应：当PH超出生理范围时（7-8），碱基的互变异构态发生变化 D 化学变性：一些化学物质如尿素，甲酰胺能破坏DNA和RNA二级结构中的 而使核酸变性。 E 粘性：DNA的粘性是由其形态决定的，DNA分子细长，称为高轴比，可被机械力和超声波剪切而粘性下降。 F 浮力密度：1.7g/cm^3,因此可利用高浓度分子质量的盐溶液进行纯化和分析 G 紫外线吸收：核酸中的芳香族碱基在269nm 处有最大光吸收 H 减色性，热变性，复性。 思考题：提取细菌的质粒依据是核酸的哪些性质？ 质粒是抗性基因，，在基因组或者质粒DNA中用碱提取法。 Sectio C 课前提问 1.在1.5mL的离心管中有500μL，取出10 μL稀释至1000 μL后进行检测，测得A260=0.15。 问（1）：试管中的DNA浓度是多少？ 问（2）：如果测得A280=0.078, .A260/A280=？说明什么问题？ (1)稀释前的浓度：0.15/20=0.0075 稀释后的浓度：0.0075/100=0.75ug/ml （2）0.15/0.078=1.92〉1.8，说明DNA中混有RNA样品。 2.解释以下两幅图
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp- 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配方： 蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0 固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！ (1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容 至100ml。 (3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。 (5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培 养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加
热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。 (9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。 每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。 (10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 (11)接种环蘸取菌液，密密划线。 (12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 (13)一天后观察菌落。 四、思考题 (1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌 种的什么信息？ (2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完 毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？ (3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什 么不是正放呢？ (4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？ 实验二碱裂解法小量提取质粒DNA 一实验目的 了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。 二实验原理 本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA
分子生物学实习总结 三天的分子生物学实习，我能认真听老师的讲解和很好的按照老师的安排完成实验。期间，接触和学习到了很多有关分子生物学实验的方法、仪器的使用、技术，而且对分子生物学实验有一个大致的了解，学习到很多以前没有接触过的知识。 这几天来做的不足的地方有： 1.预习不够充分。只是浏览了实验报告上的原理、操作等内容，并没有深入了解每一个步骤的操作会对实验有什么的作用和影响。实验失败了，不能自主找到原因。 2.实验操作过程不够细心。实验要求十分细心，严谨和专注。实验中很多细小的地方还是没有很好的注意到。 3.遇到不懂的没有及时发问。实验就是一个让我们实操的过程，一边操作一边巩固书本上的知识。过程中，遇到不明白的地方应该及时问别人活着自己翻阅资料，力求把实验弄透彻。 但是我还是有很多收获的： 1.对分子生物学实验有了了解。例如实验的基本的流程和操作，常用的方法等基础知识已经有了一定了解，对以后的实验会有一定的帮助。 2.最基本的移液枪、离心机、涡旋器等的使用还有实验中的PCR仪、电泳等有一定的认。 3.学会了严谨和细心。实验所用的材料都是比较昂贵的，而且实验只要一步错了，就得重做。所以需要非常严谨。不仅仅是分子生物学实验，其他实验也要求，所以培养这个有点对以后的实验非常有好处。 4.学会了坚持。很多次因为实验做的时间很长，大家都会很累，但是，还是要坚持，一点点累都受不了是不能把实验做好的。开始慢慢了解到做科研的人员的辛酸，长时间整天呆在实验室做实验，这需要很大的毅力。 5.把握实验机会，让自己学得更多。实验过程中，只要有实操的机会，我都会去操作。因为说和做是不一样的。而且在操作中能加深巩固知识和学得更加深入。 三天的分子生物学实习虽然很累，因为要天天去院楼，而却实验时间都比较长。但是 还是很有意义的，因为学习到很到东西，收获了很多。 老师也为我们准备了很多的材料和准备，实验才做得那么快和顺利，其实，实验室简 化了很多了，而且我们所做的实验都是已经设计好的，按照操作做就行了。如果时间和资 金允许，应该设立一些自主完成的实验，这样可以培养我们更加多的能力，开阔知识面和 拓宽思维。
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
一目的基因的获得 细菌基因组DNA的提取 （一）仪器 1）台式高速离心机 2）恒温水浴箱 3）枪式移液器 4）灭菌的EP管和Tip头 （二）试剂 1）溶液1: 25% 蔗糖 50mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 50mmol/L EDTA，pH8.0 500ug/ml 溶菌酶（现用现配） 100ug/ml RNase 2)溶液Ⅱ：100mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1% SDS 400ug/ml 蛋白酶K 3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 4）氯仿：异戊醇（24：1） 5）3mol/L NaAc(pH5.2) 6）异丙醇或无水乙醇 7）70%乙醇 8) TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1mmol/L EDTA，pH8.0 (三)实验步骤 1) 5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。 2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。 3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。 4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。 5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10
分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。 6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。 7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。 8）将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中，-20°C保存。 9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。 植物DNA的SDS提取法： （一）试验试剂： 1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。 2）10 SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3）1 SSC溶液：用10 SSC溶液稀释10倍。 4）0.1 SSC溶液：用1 SSC溶液稀释10倍。 5）Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。 6）氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7）5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O 70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8) SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9) 1mol／LHCl。 10) 0.2mol/LNaOH。 11) 二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml 浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。 12) 1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。 13) 0.05mol/LNaOH。 14) DNA标准液：取标准DNA25mg 溶于少量0.05mol/L NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。 （二）实验步骤：
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。 4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。 5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。 7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。 8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。 9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 （一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
分子生物学实验 ： 专业： 学号：
目录 实验一细菌培养 实验二质粒DNA提取 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验五聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验六地高辛标记的Southern杂交
实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1. 胰蛋白胨 2. 酵母提取物 3. 氯化钠 4. 1mol/L NaOH 5. 琼脂粉 6. 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等） （三）仪器 1. 培养皿 2. 带帽试管 3. 涂布器 4. 灭菌锅 5. 无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等） 6. 恒温摇床 四、操作步骤 （一）LB培养基的配制 配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入： 细菌培养用胰蛋白胨10g 细菌培养用酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。加入去离子水至总体积为lL，在15 lbf／in2 (1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20分钟。 这样得到是LB液体培养基。LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。 （二）细菌的培养 （１）在液体培养基中培养