附录1文件检查
目的：确认文件资料已经完备，并且是当前最新版本。
测试方法：检查开箱单、使用说明书、标准操作规程及其他相关资料。
可接受标准：文件资料已经完备，并且是最终批准版本。将检查结果记录在《文件检查表》内。
文件检查表
资料名称提供单位文件编号存放地点
开箱单——质量管理部档案室
《Agilent 11000型液相色谱仪使用、清洁与维护保养标准操作规程》本公司S0P-SB-057
质量管理部
档案室
Agilent 11000型液相色谱仪使用说明书——
质量管理部
档案室
备注：
验收标准：文件资料已经完备，并且是最终批准版本。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_____________
检查人：日期：
复核人：日期：
附录2培训检查和签字确认
目的：确认参与验证的人员都经过此方案的培训，和识别所有签字和草签本方案任何数据表的人员。
测试方法：检查培训记录。
可接受标准：参与验证的人员进行此方案前已经完成此方案的培训。将检查结果记录在《培训检查和签字确认表》内。
培训检查和签字确认表
培训/草签确认
姓名职务/公司签名/日期是否接受方案的培训
（是/否）
□是□否
□是□否
□是□否
□是□否
□是□否
□是□否
□是□否
□是□否
备注：
验收标准：所有参与验证人员已接受方案培训，并完成签字确认。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_____________
检查人：日期：
复核人：日期：
附录3确认用仪器仪表校验检查
目的：确认测试用仪器、仪表是否已经校准并且在有效期内。
测试方法：检查仪表参数和校准报告。
可接受标准：测试用仪器、仪表已经校准并且在校准有效期内。将检查结果记录在《确认用仪器仪表校验检查表》内。
确认用仪器仪表校验检查表
仪器仪表名称型号及编号校准日期校准编码有效期至
备注：
验收标准：测试用仪器、仪表已经校准并且在校准有效期内。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_____________
检查人：日期：
复核人：日期：
附录4设备基本信息确认
目的：确认铭牌信息与说明书一致。
测试方法：根据说明书和合同的信息，现场核对设备铭牌信息。
接受标准：设备铭牌的基本信息与说明书一致。将检查结果记录在《设备基本信息确认表》内。
设备基本信息确认表
确认项目接受标准确认结果是否可接受
设备名称型液相色谱仪
型号Agilent 11000□是□否
出厂编号□是□否
安装位置QC组天平室□是□否
生产厂家美国□是□否
生产日期□是□否
备注：
验收标准：检查结果符合预期可接受标准。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人：日期：
复核人：日期：
目的：确认设备的安装是否符合原设计的条件。
测试方法：室内使用温湿度计测量，目测地面，检查室内空气。
接受标准：室内温度应在5～40℃；相对湿度≦85%；地面平滑，不易起尘；室内无腐蚀性气体存在或产生。将检查结果记录在附录5《外部环境确认》内
外部环境确认表
项目接受标准检查结果是否可接受温度5~40℃□是□否
相对湿度≤85%□是□否地面平滑、不易起尘□是□否
环境无腐蚀性气体及有毒有害气体，无
强电干扰
□是□否
备注：
验收标准：室内温度应在5～40℃；相对湿度≦85%；地面平滑，不易起尘；室内无腐蚀性气体存在或产生。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人：日期：
复核人：日期：
目的：确认设备各部件的型号，保证与其订单和装箱单所描述的一致。
测试方法：检查设备的输液泵、脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器是否与设备订单或装箱单一致。
接受标准：设备的输液泵、脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器应与设备订单或装箱单一致。将检查结果记录在附录6《安装环境确认》内。
设备型号确认表
项目型号/序列号检查结果是否可接受输液泵电子流控阀(EFC)控制的毛细液相泵系统□是□否脱气机真空在线脱气机□是□否
自动进样器Aglient 1100系列微盘自动进样器自
动进样器
□是□否
柱温箱Agilent 1100系列柱温箱□是□否
DAD检测器紫外检测器□是□否
备注：
验收标准：设备的输液泵、脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器应与设备订单或装箱单一致。是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人：日期：
复核人：日期：
附录7公用系统安装确认
目的：确认公用系统安装正确，符合设备使用要求。
测试方法：用万用表测量电源、接地电阻是否符合设备使用要求。
可接受标准：电源220V，50Hz，接地电阻小于4Ω。将检查结果记录在《公用系统安装确认表》内。
公用系统安装确认表
公用系统名称接受标准检查结果是否可接受电源220V,50Hz □是□否
接地电阻小于4Ω□是□否
备注：
验收标准：电源220V，50Hz，接地电阻小于4Ω。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人：日期：
复核人：日期：
目的：根据生产商硬件和系统设计规格标准，确认仪器安装符合要求。
测试方法：按安装要求，检查设备连接安装是否正确。
可接受标准：打开计算机电源开关，指示灯亮，机器运行；打开打印机，指示灯亮；打开仪器及工作站，有信号出现。将检查结果记录在附录8《设备安装确认》内。
设备安装确认表
项目接受标准检查结果是否可接受
位置仪器放在水平的工作台上，计算
机在仪器的旁边
□是□否
设备仪器连接输液泵、脱气机、自动进样器、
柱温箱、检测器、计算机、打印
机和电源之间正确连接
□是□否
仪器工作打开仪器及工作站，有信号出现□是□否
备注：
验收标准：打开计算机电源开关，指示灯亮，机器运行；打开打印机，指示灯亮；打开仪器及工作站，有信号出现。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人：日期：
复核人：日期：
目的：确认安装的应用软件符合计算机系统和外围设备的要求。
测试方法：打开电源开关，打开计算机，确认计算机运行系统；打开仪器各部件电源，确认仪器运行系统及软件。
可接受标准：计算机使用Windows XP系统；计算机桌面上有仪器联机图标；确认仪器跟Agilent ChemStation软件连接；进入Agilent ChemStation 主画面。将检查结果记录在附录9《软件配置确认》内。
软件配置确认表
项目接受标准检查结果是否可接受计算机系统打开计算机，进入Windows XP系统□是□否
软件安装在计算机桌面上双击“仪器1 联机”图标，
进入Agilent ChemStation 主画面
□是□否
备注：
验收标准：计算机使用Windows XP系统；计算机桌面上有仪器联机图标；确认仪器跟Agilent ChemStation软件连接；进入Agilent ChemStation 主画面。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人：日期：
复核人：日期：
附录10噪音和漂移的确认
目的：保证设备稳定。
测试方法：检查条件：选用C18柱，以100%甲醇为流动相，流速1.0ml/min，DAD检测器的波长选在254nm。开机预热，按色谱条件编好方法并保存后待仪器稳定后记运行，测定30min内基线波动振幅作为基线噪音，用检测器自身的物理量（Au）作单位表示，基线漂移用60min内基线偏离原点的值（Au/60min）作单位表示，运行方法，根据色谱图计算结果。
可接受标准：基线漂移：＜±5.0×10-4Au/60min；基线噪音：＜±1.0×10-4Au(250nm)。将检查结果记录在附录10《噪音和漂移确认表》内。
噪音和漂移确认表
实验次数
测试结果
可接受标准是否可接受基线漂移基线噪音
1
基线漂移：＜±5.0×10-4Au/60min 基线噪音：＜±1.0×10-4Au(250nm)□是□否
2
3
备注：
验收标准：基线漂移：＜±5.0×10-4Au/60min；基线噪音：＜±1.0×10-4Au(250nm)。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人：日期：
复核人：日期：
附录11 流速确认
目的：证明液相色谱仪的软硬件功能运行正常，并且达到设计要求及检测要求。 测试方法：以水为流动相，将流速分别设定在0.5ml/min 、1.0ml/min 和2.0ml/min ，待流速稳定后，用一校正过的10ml 量瓶接收流动相并开始记时，当流动相接收至量瓶刻度时立即停止计时并计算流速。每种流速做三次，按以下公式计算流速的设定值误差，流速的稳定性误差。
%
100%
100?-=?-=
平均流速
最小流速
最大流速稳定性误差设定流速
设定流速
平均流速设定值误差
可接受标准：设定值误差：±2%；稳定性误差：≤2%。将检查结果记录在附录11《流速确认表》内。
流速确认表
设定流速（ml/min ）
收集
次数 收集时
间（min ） 实测流速
（ml/min ） 平均流速
（ml/min ） 设定值
误差（%） 稳定性
误差（%） 可接受标准
是否可接受
0.5
第1次
设定值误差： ±2%； 稳定性误差：
≤2%
□是 □否
第2次 第3次 1.0
第1次
第2次 第3次 2.0 第1次
第2次 第3次
备注：
验收标准：设定值误差：±2%；稳定性误差：≤2%。 是否符合验收标准？
是:
否:
如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人： 日期： 复核人： 日期：
附录12 梯度比例确认
目的：证明液相色谱仪的软硬件功能运行正常，并且达到设计要求及检测要求。 测试方法：使用一根阻尼管（2000×0.12mm ）代替柱子，检测波长调至265nm ，流速1.0ml/min ，流动相A ：水，流动相B ：0.5%丙酮，按色谱条件编好方法并保存后，待仪器预热稳定后运行梯度程序，程序完成后，按下式计算： 100
H H V X
X
，式中， Vx 为单元B 的梯度；Hx 为每梯度的响应值。 D=Vx-G ，式中，D 为梯度准确性的偏差；G 为设置的流动相B 的比例。 可接受标准：≤±1%。 将检查结果记录在附录11《梯度比例确认表》内。
梯度比例确认表
H x H 100
V x G D 可接受标准
是否可接受
10% ≤±1%
□是 □否
50%
90%
图谱编号
备注：
验收标准：≤±1%。 是否符合验收标准？
是:
否:
如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人： 日期： 复核人：
日期：
附录13 前后进样带入量的确认
目的：证明液相色谱仪的软硬件功能运行正常，并且达到设计要求及检测要求。
测试方法：选用4.6mm×250mm的C18柱，用甲醇为流动相，检测器波长为254nm，流速为1.0ml/min,进样量20ul，按色谱条件编好方法并保存后，待仪器预热稳定后使用下列样品溶液进样。
样品溶液(a):萘的甲醇溶液200ug/ml；
样品溶液(b):萘的甲醇溶液2ug/ml；
空白溶液:甲醇。
按以下顺序进样：样品溶液(a)，1针、空白溶液，1针、—溶液溶液(b)，1针；
记录色谱图并对萘峰进行积分。
可接受标准：空白溶液中相应的峰面积百分比不超过样品溶液(a)中萘峰峰面积的0.1%；样品溶液(b)中萘峰峰面积是样品溶液(a)中萘峰峰面积的0.9%~1.1%。将测试结果记录在附录13《前后进样带入量确认表》内。
前后进样带入量确认表
名称萘峰峰面积峰面积百分比可接受标准是否可接受图谱编号样品溶液(a) ————
空白溶液≤0.1%
□是□否
样品溶液(b) 0.9%~1.1%
备注：
验收标准：空白溶液中相应的峰面积百分比不超过样品溶液(a)中萘峰峰面积的0.1%；样品溶液(b)中萘峰峰面积是样品溶液(a)中萘峰峰面积的0.9%~1.1%。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_______________ 检查人：日期：
复核人：日期：
附录14 定量环准确度确认
目的：证明液相色谱仪的软硬件功能运行正常，并且达到设计要求及检测要求。
测试方法：样品准备：用脱气纯化水冲洗自动进样器，在一个2mL样品瓶中装入1.0mL纯
化水，盖上盖子，用万分之一天平称量重量（W
1
），放入样品盘中。
样品运行：设置流速为1.0mL/min，进样体积为50μL，运行时间为0.1分钟，连续
进样6次。运行自动进样器，结束后，称量样品瓶重量（W
2
），用公式计算进样体积（μL）：
（W
1-W
2
）/6×1000。（注：水的密度:25℃时0.99707g/mL，20℃时0.99823g/mL。）
可接受标准：实际进样体积50±0.1%μL。（根据实际情况待定）将测试结果记录在附录14《定量环准确度确认表》内。
定量环准确度确认表
W1（g）W2（g）实际进样体积（g）可接受标准是否可接受
50±0.1%μL □是□否备注：
验收标准：实际进样体积50±0.1%μL。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人：日期：
复核人：日期：
附录15 样品盘定位确认
目的：证明液相色谱仪的软硬件功能运行正常，并且达到设计要求及检测要求。
测试方法：随机放置6个样品瓶在不同的位置，用完好的瓶垫封装，设置好进样程序，运行自动进样器。
可接受标准：每个瓶垫都必须有小孔。将测试结果记录在附录15《样品盘定位确认表》内。
样品盘定位确认表
瓶号 1 2 3 4 5 6 可接受标准是否可接受
是否有小
孔□是
□否
□是
□否
□是
□否
□是
□否
□是
□否
□是
□否
每个瓶垫都
必须有小孔
□是□否
备注：
验收标准：每个瓶垫都必须有小孔。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人：日期：
复核人：日期：
目的：仪器的运行确认完成以后，在其功能试验符合要求的情况下，应用标准品或对照品、或检测的样品进行性能确认，以确认仪器符合使用要求。
测试方法：选用4.6mm×250mm的C18柱，用甲醇为流动相，检测器波长为254nm，流速为1.0ml/min,进样量20ul，按色谱条件编好方法并保存后，待仪器预热稳定后,进萘溶液200ug/ml，连续进样五次。
可接受标准：定性测量重现性（RSD）：≤1.0%；定量测量重现性（RSD）：≤1.0%。将测量结果记录在附录16《重现性确认表》内。
重现性确认表
进样次数第1次第2次第3次第4次第5次平均值RSD 可接受
标准
是否可
接受
主峰保留时间≤1.0% □是□否主峰峰面积≤1.0% □是□否备注
验收标准：定性测量重现性（RSD）：≤1.0%；定量测量重现性（RSD）：≤1.0%。
是否符合验收标准？是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人：日期：
复核人：日期：
目的：仪器的运行确认完成以后，在其功能试验符合要求的情况下，应用标准品或对照品、或检测的样品进行性能确认，以确认仪器符合使用要求。
测试方法：选用4.6mm ×250mm 的C18柱，用甲醇为流动相，检测器波长为254nm ，流速为1.0ml/min,进样量20ul ，按色谱条件编好方法并保存后，待仪器预热稳定后,进萘溶液200ug/ml ，100ug/ml ，25ug/ml ，5ug/ml ，1ug/ml 每个样进样1次。
可接受标准：相关系数R 2＞0.999。将测量结果记录在附录17《线性确认表》内。
线性确认表
验收标准：相关系数R 2
＞0.999。
是否符合验收标准？ 是: 否: 如果为否，输入异常情况编号_______________
检查人： 日期： 复核人：
日期：
浓度 (ug/ml)
主峰峰面积
图谱编号
可接受标准 是否可接受
1 R 2＞0.999
□是□否
5 25 100 200
标准曲线方程 相关系数R 2
图谱编号
备注：
11.1 偏差处理
将Agilent 11000型液相色谱仪安装/运行/性能确认方案确认中发现的所有的偏差记录在下表中，经公司审核、批准偏差解决方案后实施。
A部分：偏差情况确认
偏差号：偏差发生的日期：
偏差的描述:
签名/日期：
B部分：解决方案（根本原因和纠正措施）
签名/日期：
批准
使用部门
生产部
质量管理部
其他
对验证影响审核：? GMP影响?无GMP影响
偏差执行及结果：
?符合并接受
?不符合但接受，见备注
?不符合且不接受，见备注
填写人/日期：审核人/日期：
备注：
11.2 变更处理
将Agilent 11000型液相色谱仪安装/运行/性能确认方案确认中发现的所有的变更记录在下表中，变更实施前需经过审核、批准。
方案变更申请
该方案变更需求是由偏差引发的吗？否?是?偏差编号_______
方案变更类型：修正删除添加
变更的描述:
签名/日期：
变更原因和影响
签名/日期：
变更后测试页：
申请人/日期
批准
部门签名日期
使用者
设备能源部
质量管理部
其他
其他
液相色谱仪结构及原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 一、特点： 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 二、性质及原理：高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 1 ．液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 c. 液—液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。 2 ．液—固色谱法 流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子(X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：
安捷伦高效液相色谱仪的规范操作 1. 目的：明确安捷伦高效液相色谱仪的规范操作，确保数据的准确性。 2. 范围：适用于安捷伦高效液相色谱仪。 3. 职责：检验人员对此负责。 4.操作规程： 系统组成 本系统由1个溶剂二元输送泵（分主/A泵和副/B泵）、手动进样阀、柱温箱、检测器、化学工作站和电脑等组成。 准备 4.2.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相，用合适的μm滤膜过滤，超声脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的μm滤膜过滤。 4.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常 将待测样品按要求前处理，准备HPLC 所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。 开机： 4.3.1 打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。4.3.2 打开1200 LC 各模块电源。 4.3.3 待各模块自检完成后，双击[Instrument 1 Online]图标，化学工作站自动与1200LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。 4.3.4 从[视图]菜单中选择[方法和运行控制]画面, 点击[视图]菜单中的[显示顶部工具栏]，[ 显示状态工具栏]，[系统视图],[样品视图]，使其命令前有[√]标志，来调用所需的界面。 4.3.5 把流动相放入溶剂瓶中。
4.3.6 打开冲洗阀。 4.3.7 点击[泵]图标，点击[设置泵…]选项，进入泵编辑画面。 4.3.8 设流速：5ml/min，点击[确定]。 4.3.9 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[启动]，点击[确定] ，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 4.3.10 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[关闭]，点击[确定]关泵，关闭冲洗阀。 4.3.11 点击[泵]图标，点击[设置泵…选项]，设流速：min。 4.3.12 点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击[确定]。 数据采集方法编辑 4.4.1开始编辑完整方法：从[方法]菜单中选择[编辑完整方法…] 项，如下图所示选中除[数据分析]外的三项，点击[确定]，进入下一画面。 4.4.2方法信息 4.4.2.1在[方法注释]中加入方法的信息（如：测试方法）。 4.4.2.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.3 泵参数设定 4.4.3.1 在[流速]处输入流量,如1ml/min，在[溶剂B]处输入,(A=100-B) ,也可[插入]一行[时间表] ,编辑梯度。在[压力限]处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 4.4.3.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.4 柱温箱参数设定 4.4.4.1 在[温度]下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。并选中它,点击[更多>>] 键,如图所示,选中[与左侧相同]，使柱温箱的温度左右一致。 4.4.4.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.5 检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区 域。参比带宽：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省
高效液相色谱仪的使用及运行性能测试 实验目的 1.了解高效液相色谱仪的基本原理和结构。 2.掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。 3.掌握测试高效液相色谱仪运行性能的指标和方法，验证各部件及整机的性能。 实验器材 高效液相色谱仪，LC-ATvp高压泵、SCL-10Avp程序控制器、SPD-M10Avp二极管阵列检测器、CTO-10Asvp温度控制器。Shim-packVP-ODS C18 150×4.6mm分析柱、20μl进样器、AS3210型超声波发生器。无水甲醇和双蒸水各500ml（脱气处理）、萘、咖啡因（均为色谱纯或分析纯）。 实验原理 高效液相色谱法是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 仪器描述 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。LC-2010和Agilent1100型为单泵型，适于单一流动相的洗脱；LC-10Avp型为双泵型高效液相色谱仪，适于程序洗脱。单泵型高效液相色谱仪的结构示意见图9-1。 实验步骤 （一）高效液相色谱仪的基本操作步骤（以岛津LC-10A为例） 1.依照顺序开机，自检完毕后进入操作模板； 2.设定洗脱程序、检测器的条件及测定报告； 3.完成实验过程，打印试验结果，依照顺序关机。 （二）性能测试
高效液相色谱仪的性能检查分为单个部件的验证和整机验证。验证时一般先验证泵、柱温箱、自动进样器的性能，接着是检测器的性能，最后是整机的性能验证。验证目的是检查并确认高效液相色谱仪运行性能是否符合要求。 1.验证标准 按照中华人民共和国国家计量检定规程，高效液相色谱仪各验证部件的验证项目的合格标准见表9-1。 表9-1 高效液相色谱仪各验证部件的验证项目的合格标准 验证部件验证项目合格标准 输液泵流量设定值误差Ss 0.5ml.min-1: < 5%； 1.0ml.min-1: < 3% 2.0 ml.min-1: < 2% 流量稳定性误差SR 0.5ml.min-1: < 3%； 1.0ml.min-1: < 2% 2.0 ml.min-1: < 2% 柱温箱柱温箱设定值误差ΔTs< ±2℃柱温箱控温稳定性Tc ≤1℃ 自动进样器进样量准确度误差≤±2% 检测器基线噪声≤2×10+5AU 最小检测浓度≤1×10-7g.ml-1(萘的甲醇溶液) 基线漂移≤5×10-4AU.h-1 整机性能定性测量重复性误差RSD≤0.5% 2.验证步骤 （1）输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定 将仪器的各部分联接好，以甲醇为流动相，流量设为1.0mL.min-1，按说明书启动仪器，待压力平稳后保持10分钟，按表16-2设定相应数值，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集，称重。按式(1)、式(2)计算SS和SR，结果填入数据记录与处理的表9-3中。 表9-2 流量、次数、收集时间表 流量设定值（mL/min）0.5 1.0 2.0 测量次数 3 3 3 流动相收集时间（min）10 5 5
高效液相色谱法简介 “色谱”一词是由俄国科学家斯威特提出的。色谱法是基于补充物质在相对运动物的两相之间分布时，物理或物理化学性质的微小的差异而使混合物相互分离的一类分离或分析方法。发展与上世纪初，飞速发展于五十年代，有超过30位科学家家因为它而获得诺贝尔奖，其有自己的理论和研究方法，同时也有众多的应用领域。 色谱法常见的方法有：柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。 柱色谱：柱色谱法是最原始的色谱方法，这种方法将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中，将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端，以流动相洗脱。常见的洗脱方式有两种，一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱，一种是自下而上依靠毛细作用洗脱。收集分离后的纯净组分也有两种不同的方法，一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一种方法是烘干固定相后用机械方法分开各个色带，以合适的溶剂浸泡固定相提取组分分子。柱色谱法被广泛应用于混合物的分离，包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。 薄层色谱：薄层色谱法是应用非常广泛的色谱方法，这种色谱方法将固定相图布在金属或玻璃薄板上形成薄层，用毛细管、钢笔或者其他工具将样品点染于薄板一端，之后将点样端浸入流动相中，依靠毛细作用令流动相溶剂沿薄板上行展开样品。薄层色谱法成本低廉操作简单，被用于对样品的粗测、对有机合成反应进程的检测等用途。
气相色谱：GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体流动相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立起来。也正是由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/解吸附，结果是在载气中浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后，立即进入检测器。检测器能够将样品组分的与否转变为电信号，而电信号的大小与被测组分的量或浓度成正比。当将这些信号放大并记录下来时，就是气相色谱图了。气相色谱被广泛应用于小分子量复杂组分物质的定量分析。 高效液相色谱：高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9-107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。高效液相色谱（HPLC）是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效
实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯 一.实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二.实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t (R2)-t (R1) ] /1.7*(W 1 ＋W 2 ) 式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t (R1) 为相邻两峰中前一峰的保留 时间； W 1及W 2 为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四.实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：100μl定量环，实际注射每次可控制在200μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果
高效液相色谱分析原理及流程 高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。 高效液相色谱分析原理 (一)高效液相色谱分析的流程 由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 (二)高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等
Agilent 1290 超高效液相色谱仪标准操作规程 一、目的 制定Agilent 1290超高效液相色谱仪使用操作规程，确保操作人员能正确规范地操作液相色谱仪。 二、范围 适用于Agilent1290超高效液相色谱仪的使用。 三、操作规程 1 开机 1.1 打开计算机，进入 Windows画面。 1.2 打开 1290INFINITY HPLC 各模块电源。 1.3 待各模块自检完成后，双击“Instrument 1 Online”图标，化学工作站自动与 12001290INFINITY HPLC 通讯。 1.4 从“View”菜单中选择“方法和运行控制”画面，点击”视图”菜单中的“样品视图 “系统视图”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。 1.5 点击泵下面的瓶图标，选择‘瓶填充‘如下图所示，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也 可输入停泵的体积。点击“Ok”。 1.6 从菜单“视图”中，选中“在线信号”，选中“信号窗口 1”，然后点击“改变…”钮， 将所要绘图的信号移到右边的框中，点击“确定”。(如同时检测二个信号，则重复选中“信号窗口 2”) 2 排气 2.1 首先在方法编辑中，泵的参数设置部分，选好需要排空的通道（保证是开的） 2.2 点击仪器状态视图中泵的图标，选择控制，出现如下图 2.3 勾上吹扫，并且输入流速，时间，比例就可以 purge 泵头。排空的时候阀会自动切换， 无需人为介入。 2.4 当我们发现泵头里面有气泡出不来的时候，选择预备---开。然后点击确定。此时泵会 用很强烈的方式朝外泵液体，并持续 20 次自动停止。 3 编辑数据采集方法 3.1 开始编辑完整方法： 从“方法”菜单中选择“编辑完整方法…”项，如下图所示选中除“数据分析”外
高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。 注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。
液相色谱仪的工作原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。特点 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～ 350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 1 ．液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)
. ... .. 标准文件 1、目的Objective：建立高效液相色谱仪部校验规程，确保校验工作规、顺利进行。 2、围Scope ：本规程适用于本公司使用的高效液相色谱仪（紫外-可见光检测器/二极管阵列检测器）的校验。 3、职责Responsibilities： 3.1 培训职责：本文件起草人或审核人或批准人负责对质量管理部全体人员培训。 3.2 QC：负责制定本规程，并对本规程的实施负责。 3.3 QA：负责监督和检查本规程的实施。 4、定义Definition：无。 5、程序Procedures： 5.1 依据 国家计量校验规程JJG 705-2002液相色谱仪，安捷伦液相说明书，岛津液相说明书。 5.2 备件及材料 5.2.1水：HPLC级水。 5.2.2化学试剂：乙腈（HPLC）、丙酮（分析纯）。 5.2.3咖啡因标准品。 5.2.4咖啡因标样。 0.005 mg/ml, 0.010 mg/ml, 0.025 mg/ml,0.050 mg/ml,0.125 mg/ml和0.250 mg/ml咖啡因水溶液。 5.2.5色谱柱：4.6mm×250mm，C18，5μm。 5.2.6 容量瓶：10ml。 5.2.7玻璃注射器。 5.2.8 限流阻尼管。
5.2.9 分析天平。 5.2.10 秒表。 5.2.11 热电偶 5.3 校验项目及技术指标 5.3.1泵性能的测试 表1 5.3.2柱温箱温度稳定性测试* 表2 备注：如药典专论规定的特定柱温，不在以上温度围之，则对分析该品种的仪器增加该温度点校验，校验项目和可接受指标相同。 5.3.3 检测器性能测试 表3 5.3.4进样器性能测试 表4
安捷伦1260高效液相色谱仪操作规程
安捷伦1260高效液相色谱仪操作规程一、开机 （1）打开计算机，登陆windows操作系统。 （2）打开主机各模块电源（从上至下），待各模块完成自检后，再双击桌面“仪器1联机”图标，进入化学工作站，从视图菜单中选择“方法和运行控制”画面。 （3）进行仪器配置，点仪器-仪器配置-选择所需模块-自动配置-输入IP地址：192.168.254.11。把各流动相放入相应的溶剂瓶中。 （4）编辑方法。方法-新建方法-方法-编辑完整方法-编辑各项（四元泵、TCC、VWD、仪器曲线参数设定，仪器参数默认），完成后，文件→方法另存为→编辑名称，保存方法。 （5）排气。旋开排气阀（逆时针），右单击“四元泵”图标出现快捷键，点击“方法”设置泵流速，排气可设置1.2ml/min，l流量梯度100，也可 5ml/min，流量梯度10。一般冲洗3-5min，注意倾斜储液瓶使过滤头处 的气体进入管道才可使气体排出，观察管路中气体位置，以其排净为目的。关泵，关闭排气阀（顺时针）。（注意：先开排气阀，再开泵，先关泵，后关排气阀）。 （6）在让液体进入柱子之前应将甁填充设置为实际值，谨防空进。将泵流速设置1ml/min,用过渡液即缓冲液冲洗色谱柱20—30分钟。 （7）换流动相，待柱前压力基本稳定后，打开检测器，视图，在线信号，选择信号，观察基线情况。 二、数据采集信息编辑及进样
（1）编辑样品信息：点“单次样品”小瓶，或点击运行信息-单次进样，设定操作者姓名，样品数据文件名，进样量等。 （2）编辑好样品信息后方可进样。 三、数据处理 （1）打开桌面“仪器1脱机”，单击“数据分析”进入数据分析画面。 （2）从“文件”菜单中选择调用信号，选择您的数据文件名，单击确定。（3）谱图优化。从“图形”菜单中选择“信号选项”从范围中选择“自动量程”及合适的显示时间，或选择“自定义量程”调整，反复进行，直到图比例合适 为止。 （4）积分。从“积分”中选择“自动积分”，若积分结果不理想，从菜单中选“积分事件”，更改数据为合适的“斜率灵敏度、峰宽、最小峰面积、最小峰 高”，从“积分”中选择积分选项，则数据被积分，如积分结果不理想则修改相应的积分参数直到满意为止。单击左边图标将积分参数存入方法。（5）校正表设计。点击“校正”菜单中的“校正设置”给出各个参数，点击确定，调出建立校正表所需的谱图并对谱图进行图形优化和积分优化。点击校正→新建校正表，选择自动设定→确定，在校正表中给出正确的“化合物名”和“含量”如需增加校正点数，校正→添加级别，给出第二校正点的含量，以此类推。校正表建立完成后点击“确定”点击“保存图标”将校正表存入方法中，或点击文件-方法另存为-找到对应文件夹，编辑日期及前缀 存入。
液相色谱仪工作原理公司内部档案编码：[OPPTR-OPPT28-OPPTL98-OPPNN08]
一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性
准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值
精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查
Agilent1100高效液相色谱仪操作规程 操作说明： 1.开机前准备： 1.1仪器设备：Agilent 1200LC ● G1322A (在线脱气机)。 ● G1311A (四元泵)。 ● G1329A（标准型自动进样器）。 ● G1316A（柱温箱）。 ● G1315A（DAD检测器）。 ●色谱柱 1.2溶剂准备： ●有机相必须是色谱级纯。 ●水相必须是二次蒸馏水或用二级蒸馏水配置的缓冲盐溶液、 酸碱溶液。 ●流动相使用前必须过0.45μm的微孔滤膜。有机相和水相微孔滤膜的选择参考下表。
2.基本操作步骤: (一)、开机： 1、打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序（部分安装程序不需要运行Bootp）。 2、打开 1200 LC 各模块电源。 3、待各模块自检完成后，双击“仪器1 联机”图标，化学工作站自动与1200LC通讯，进入的工作站画面如下所示。 4、从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面, 点击“视图”
菜单中的“仪器实际值”，“在线光谱”，“化学工作站状态”，“系统视图”,“样品视图”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。 5、把流动相放入溶剂瓶中。 6、打开冲洗阀。 7、点击“泵”图标，点击“设置泵…”选项，进入泵编辑画面。 8 、设流速：5ml/min，点击“确定”。 9、点击“泵”图标，点击“控制…”选项，选中“启动”，点击“确定”，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 10、点击“泵”图标，点击“控制…”选项，选中“关闭”，点击“确定”关泵，关闭冲洗阀。 11、点击“泵”图标，点击“设置泵…选项”，设流速：例如1.0ml/min。 12、点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击“确定”。
高效液相色谱法（HPLC） 一、方法原理 1、液相色谱法概述 高效液相色谱分析法
其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构 2、高效液相色谱法的特点（HPLC） 与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分
配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。 由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。 特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。 高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。 高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。 如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。 3、高效液相色谱法的固定相和流动相 （1）固定相 表面多孔型和全多孔型两大类。 （2）流动相（淋洗液） 流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。 从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求： ①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。 ②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱 性能的改变。 ③与所用的检测器相匹配。 ④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏 度。 ⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱 效）和适当低的沸点。
编号：EV- 高效液相色谱仪 验证报告 XXXX药业有限公司
目录 1.引言 2.安装验证 3.操作验证 3.1 试验项目及限度 3.2 实验方法 3.2.1流量控制阀 3.2.2GM-150混合器 3.2.3柱温箱 3.2.4 UV检测器准确度 3.2.5 UV检测器基线噪音 4.性能验证 5.验证报告结果分析、评价及结论 6.验证结论批准
仪器名称：实验室用高效液相色谱仪 生产厂家及型号：Waters in USA，1525泵、1500series柱温箱、2487检测器 设备登记号：HY-017 1.引言 为确保仪器在使用中符合原设计的要求，并达到原拟订的目的，产生可信赖的量测结果，对仪器进行安装验证（IQ）、操作验证（OQ）、及性能验证（PQ）。 当仪器首次安装调试、经过一定周期（一年）或者变更位置时进行该验证。 2.安装验证 2.1参加人员： 2.2检查清单： 联系人： 单位： 地址： 电话： 传真： 2.4结论：所有物品应与检查清单相符，实验室水、电、气设计安装合理，实验室通风系统运行良好则符合仪器安装要求。 3 操作验证 确认仪器在操作极限内能正常运转，由装机工程师及操作者共同完成。每过一个周期要对该项进行例行验证。若仪器有移动、维修、更换主组件或增加新配件时必须对仪器部分OQ非例行性验证。 3.1试验项目与限度（表2） 3.2试验方法
3.2.1流量控制阀 ①方法：泵流量设为1ml/min,将5ml 的容量瓶接在泵出口处，在溶剂流入容量瓶的同时计时， 至5ml 标线时停止计时，计下测量时间。间隔约10min 再测量一次。重复测三次以 上， 求平均值 (n t t n i i ∑== 1 ) 计算出时间测量最小值及最d 大值与平均值的相对偏差S RMAX 、S RMIN 。 %100?-= t t t S R 3.2.2 GM-150混合器： 方法：设定流动相A 和B 比例为1：1，流速为1.0ml/ min 。取两个10ml 量筒，分别装入流 动相A 、B ，开始运行，同时计时。5ml 时记录消耗流动相A 、B 体积，重复三次。 ②结论：实际偏差在限度以内则符合要求。 3.2.3柱温箱 方法：温度计为37℃，将一经校正的温度计放入柱温箱，每30min 读取温度计及标准面板显示温度一次，共读5次。 结论：温度计示数偏差应小于1℃，符合规定。工作面板示数波动应小于0.5℃。精密 度符合要求。 3.2 .4 UV 检测器波长准确性 ①方法：已知苯在233.9nm 、238.9nm 、243.3nm 、248.5nm 、254.5nm 、260.6nm 有特征吸收，故配置100mg/ml 苯的乙醇溶液运行“Sample scan ”程序。 ②结论：波长误差均应小于3nm ，符合规定。 3.2.5 UV 检测器基线噪音： ① 方法：双波长基线噪音测定：以水和甲醇先后冲洗系统0.5h ，然后由流动相的检
高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
高效液相色谱仪验证方案 LC-10A型高效液相色谱仪为苏州岛津分析仪器有限公司生产的产品，我司在购买前对该产品的性能、价格、外观和售后服务进行了广泛地调查研究，在同类产品中价格便宜、性能稳定、美观且售后服务好。购买该产品的目的是为今后新产品研制、开发、生产。为了确保使用该仪器检测数据真实可靠，也为了确认该仪器的各项指标能达到该仪器所设计的性能指标，计划对该仪器进行必要的验证。仪器名称：高效液相色谱仪仪器负责人： 仪器型号：LC-10A 仪器系列号： 生产厂家：苏州岛津分析仪器有限公司 仪器所在部门和房间：质量检验室的精密仪器室 1、预确认 1.1、概述 用于样品的鉴别、含量测定。 1.2、资料档案 设备预确认资料及归档情况?。 2、安装确认 2.1、仪器随机资料归档或准备情况是否符合要求? 备件清单如下
2.2、安装确认 设备开箱验收是否符合要求? 确认人：复核人：时间： 仪器的安装是否符合要求：环境温度10-30℃，且要稳定；相对湿度≤80%，无腐蚀性气体；远离振源。电源功率：220±10V，50HZ ，供电电源：应有良好的接地，线路连接：各接口连接正确，管线连接：各接口连接正确。 3、运行确认 目的：确认该仪器达到技术要求。 3.1、校正 3.1.1、计量部门的校正(见有关检定证书) 检定单位： 检定证书编号： 检定日期：年月日 复核者：日期：年月日 3.2、LC-10A型溶剂输液泵流量精度
可执行标准：＜±5% 测试方法：将输液系统、进样器、色谱柱和检测器连接好，以重蒸馏水为流动相，将流速稳定后，分别设定0.5、1.0、1.5ml/min三段，每个流速测定三次,在流动相排出口用已恒重的比重瓶收集流动相，同时计时收集10分钟，称重，查表，即得。 结论： 试验者：日期：年月日 复核者：日期：年月日 3.3、LC-10A型溶剂输液泵流量稳定度 可执行标准：＜±5%（0.95ml/min～1.05ml/min） 测试方法：将输液系统、进样器、色谱柱和检测器连接好，以重蒸馏水为流动相，将流速稳定后，设定流量为1.0ml/min，在流动相排出口用已恒重的比重瓶收集流动相，同时计时收集10分钟，称重，查表，即得，共收集5次。 结论： 试验者：日期：年月日