一，名词解释
In vitro culture体外培养:指从活体内取出组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适当的温度和一定营养条件下存活和生长的方法。包括细胞培养、组织培养、器官培养。
Cell culture细胞培养：指从体内取出单细胞或细胞群，在无菌适当温度和一定营养条件下生存和生长并维持其结构和功能的方法
Life span of culture cells培养细胞生命期：指细胞在培养中持续增殖和生长的时间，与细胞种类，生物学性状和供体的年龄等因素有关
Cell fusion细胞融合：两个细胞或两个以上细胞合并形成一个细胞的过程。常用诱导物为：①仙台病毒（RNA病毒）②聚乙二醇（PEG）
“返祖”现象细胞分化特征减弱或不明显，形态和功能趋于单一化，发生转化，获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群
Immatality永生性或恶性性，是细胞转化的标志之一，即细胞获得持久增殖能力。永生性的细胞能够长期传代不死，并多伴有核型的改变，不一定具有恶性，但都会进一步演变成恶性细胞。
Deadaption不适应：表现为细胞在原体内时所拥有的分化特性在体外培养时减弱或不明显
Dedifferentiation去分化或脱分化:即细胞失掉发生分化的能力。可能是基因变异所致。，导致细胞分化表达受阻，分化基因表达不充分，但并不意味着细胞分化能力完全丧失
Anchorage-dependent cells贴壁性细胞或锚着依存性细胞：这类细胞在培养时能黏附在支持物表面生长，大多数培养细胞呈贴壁性生长，有赖于贴壁才能生长的细胞。
“铺路石样”：细胞紧密排列时，细胞呈多角形或六角形
Netting拉网现象：在构成上皮细胞膜状生长的细胞群中一些细胞常相互分离卷曲，致使上皮细胞膜中形成网眼状空洞，可能与细胞分泌透明质酸酶有关
NIH3T3细胞：美国国立卫生研究院首先建系的小鼠成纤维细胞的无限细胞系，具有永生性，接触抑制，无异体接种致癌性，每三天传代一次，每次接种3×105细胞/ml
Nude mouse，裸鼠：是20世纪60年代作为无毛变种被发现，后来查明该类小鼠先天性胸腺缺陷，此性状由隐性遗传基因“nu”传递。裸鼠缺乏T细胞免疫反应，而移植瘤的免疫排斥反应主要有T淋巴细胞完成，因此将肿瘤细胞移植在裸鼠体内，能成功建立移植瘤。
Fedder cell饲细胞：也成滋养细胞，系成纤维细胞或其他细胞生长形成单层细胞后，再用大剂量的射线照射，使细胞失去增殖能力，但应具有活力和代谢能力，令其作为底物将其他细胞接种于其上，饲细胞的代谢产物有利于其他细胞的生长，通常用饲细胞培养特殊难培养细胞。
Saturation density饱和密度：在特殊情况下，培养容器所达到的最大细胞数，此后，细胞停止增殖，在贴壁生长的细胞以每平方厘米细胞数表示，在悬浮培养的细胞，以每立方厘米的细胞数表示
Contact inhibition接触抑制：当一个贴壁生长的正常细胞也另一个细胞相互接触式，便停止分裂增殖，相互之间紧密接触，但不存在交叉重叠的现象，称为接触抑制。作为区分正常细胞和癌细胞的标志之一
Density inhibition密度抑制：细胞接触回合成片后，虽然发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能进行增值分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多是，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。
Apoptic body凋亡小体：细胞凋亡后，降解的胞浆及胞核成分被包裹在膜性成分中而形成凋亡小体，嗜伊红染色阳性。PCD细胞程序性死亡：正常机体细胞在受到生理和病理刺激因细胞凋亡基因表达而出现的一种主动的死亡过程。特点是凋亡小体形成，不引发炎症反应。
BBS平衡盐溶液：主要是由无机盐，葡萄糖组成，作用是维持细胞渗透压的平衡，保持pH稳定，并提供简单营养Hamf12：使用微量元素，适应在血清含量低的情况下的细胞培养，有利于培养细胞的分化，也适合于克隆化培养，无血清培养基中常用的基础培养基
MC-COY5：是一种为肉瘤细胞设计的培养液，发现它除适用于原代细胞培养，，组织活检体液细胞及淋巴细胞生长外，还特别适用于较难培养的细胞的生长
Serum freemedium无血清培养基：利用促细胞生长物质的组合与合成附加物，再与基本培养及混合，使构成无血清培养基，对细胞有良好的促生长效应
Scid mouse严重联合免疫缺陷小鼠：一种淋巴细胞分化过程受损的小鼠，因抗原R基因重组异常，使B淋巴细胞不能发育成熟，机体的体液细胞免疫功能均缺陷，难检测到免疫球蛋白的分泌，这样Scid小鼠就成为异种移植的良好活体承载系统
Suspension culture悬浮培养：细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中的一种培养方法
Primary culture原代培养：也成为初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。此期
细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。
subculture传代培养：当细胞增殖到一定密度后，需要分离出部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。或将细胞从一个培养瓶转移到多个培养瓶的过程
传代（passage）：细胞增殖达到一定密度时，需要分离出部分细胞并更换新营养液，适应细胞的继续生长和增殖，这一过程称为传代。
Mitotic index（MI）细胞分裂指数：细胞群中每1000个细胞中的分裂数，用来描述指数增生期细胞的分裂数量，是判定细胞生长旺盛与否的一个重要指标。
细胞群体倍增时间是指培养物中细胞数量翻倍的平均时间。
Diploid Cells二倍体细胞：在细胞培养中呈二倍体核型的细胞群体称二倍体细胞
Diploid cell line二倍体细胞系：正常细胞在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，这种细胞称二倍体细胞系
Stem line干系：当某一核型的细胞，在该细胞群中居多数时，具有该数值染色体数的细胞群即称为干系，也叫主流系。二倍体细胞培养法：能维持细胞保持二倍体状态的培养方法。
Cell line细胞系：初代培养物开始第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。
Clone: 是指由一个祖细胞分裂形成的细胞群体，其遗传学特征、生物学特征都应完全相同。
Colony（集落）：是指一个以上的祖细胞分裂增殖而聚集在一起的细胞团。由于是来自不同的祖细胞，故其遗传学特征、生物学特征不同，甚至差异很大
Cell cloning细胞克隆：又称为单细胞分离培养，即把单个细胞从群体中分离出来单独培养，是指重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。
Cell strain细胞株：细胞经过克隆后，后裔细胞群来源于一个共同的祖细胞，即形成所谓的纯系，即细胞株。Certified Cells已鉴定的细胞：各种已被命名Cell line和经过细胞生物学鉴定Cell Strain具有以下特征：形态均一、生长增殖稳定、生物学性状清楚。符合上述情况的细胞群即文献中常称之为已鉴定细胞
RPMI1640：是一种常用的细胞培养液，最初是针对淋巴细胞培养而设计的，后来发现它能广泛用于许多种类细胞的培养，包括正常细胞和肿瘤细胞的培养，最适合于悬浮细胞生长。
Coloning efficiency克隆形成率：克隆细胞时，要把细胞先制成单细胞悬液，再接种培养在底物上，让细胞单独生长，适应性较强和活力较好的细胞能增殖形成细胞小群（colony）克隆。细胞群单个细胞形成克隆的百分数称为克隆形成率，用于表示细胞生活力和独立生长能力
Plating efficiency接种存活率：细胞被制成散在的悬液后，以低密度2-5个/cm2接种到底物上贴壁并能存活生长形成细胞小群的细胞的分数值，成为接种存活率
HAT medium：是有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸及双蒸水配制而成的完全培养基。可以选择性的杀死骨髓瘤细胞及自身融合细胞，可用于杂交瘤技术中单克隆抗体的制备
MTT test（四甲基偶氮唑盐检测法）用于多药耐药性的检测。检测原理：活细胞线粒体脱氢酶可以还原MTT为蓝色产物，药物作用后，用96孔板在酶标仪上测570nm的吸收值，能表示存活细胞的量。
Precancerous Cell癌前细胞：受一定剂量致癌物处理的细胞群中，并非所有的细胞都必定受到损害，受到打击发生启动并进入转化发展阶段的细胞仅是一小部分，散在于那些未受损的正常细胞中，这些细胞称为癌前细胞。随着转化的不断进展，细胞接触后却不发生接触抑制，最后形成可见的转化灶。
Population Dependence群体依赖性：单个细胞不是细胞永久存在的形式，不能长期生存。一个有活力的细胞终需经过繁殖形成群体，只有群体细胞才是培养细胞的基本存在形式。单个细胞虽能生长繁殖，但不如群体细胞生存能力强，细胞量多时比少时易于培养，说明细胞之间能相互沟通信息，呈现着相互依存性或群体依赖性。
Gene Transfection基因转染：将基因导入体外培养细胞中，观察目的基因在体外细胞中的表达。可用于基因治疗即取出体内细胞导入基因后，再输回体内。
Gene transfer基因转导：即把基因导入细胞的技术，或成导入，培养细胞是基因转导最适宜的对象。外源性基因能整合入受体细胞基因组中
Transgenic Technique转基因技术：是基因转导技术的一种，受体细胞是受精卵，向受精卵导入目的基因后，再置入宿主动物子宫，发育成个体；可在胚胎期检测基因表达，也可于生后再进一步观察目的基因在整体水平内的表达。
cell therapy细胞治疗指将正常或遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者体内，以达到替代受损细胞、治疗疾病的目的。
MDR多药耐药基因：其产物是一种糖蛋白p-170，它能将进入癌细胞中的抗癌药物泵出细胞外
Stem cells, SC干细胞：是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。按分化潜能大小来分类全能干细胞，多能干细胞，专能干细胞。
PDFG血小板生长因子：来源与血小板和血清中的一种多肽，具有强烈刺激细胞分裂活动性，可以表示细胞增殖旺盛程
度。
染色是利用化学染料与细胞及各种细胞器发生化学作用或吸附作用，使各种细胞结构能够通过染色改变其折射率，从而清晰地显现出来。染色有单染和复染两种
TUNEL法细胞凋亡时，DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’－末端，从而可进行凋亡细胞的检测。
诱发细胞转化基因：能诱发细胞发生无限增殖和包括恶变在内的转化作用，癌基因便是该类基因中最主要的基因。
功能性基因：该类基因表达时，能产生特定功能的产物，如β球蛋白基因便是典型的功能性基因。
二．填空
现代组织培养的进步主要体现在消化酶的应用和液体培养基的应用
体外浸润性生长实验通常不选用鸡胚的软骨组织作为实验对象，是由于组织中含有胶原酶抑制物
细胞培养液的除菌需用滤过消毒法
单细胞培养的主要方法学基础是胰蛋白酶的应用和液体培养基的应用
诱发细胞融合的物质是聚乙二醇，分子量是1000，最适pH值是6.0，最适用浓度是50：1
鉴定CSC细胞的金标准是看分选得到的CSC能否在移植动物体内形成新肿瘤
传代的频率或间隔与下列因素有关：细胞性质、培养液性质（Serum多少）、接种的细胞数量和细胞增殖速度等。
细胞传一代后，通常经历三个阶段1．潜伏期2. 指数增生期3. 停滞期
体外培养细胞形态大致分类：1．成纤维细胞型2．上皮型细胞3．游走型细胞4．多形型细胞
指数增生期是细胞一代中活力最好和最主要的时期，各种试验多在此期进行。
消化液常用胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠（EDTA），可单独使用，也可按一定比例混合一起使用
提高细胞在体外培养的成功率，是细胞培养实验工作的首要问题。关键在于初代培养。
体外培养细胞的两大生命特征是分化增殖和生长发育。
体外培养永生性细胞和体内细胞相比有较大差异，主要表现为单一化和不死性
体外培养永生性细胞和二倍体细胞的主要区别是无限增殖性和非二倍体核型
诱发体外培养细胞转化的主要因素是物理因素、化学因素、病毒和癌基因
悬浮型细胞培养成功的标志：细胞增殖
细胞冻存保护剂甘油或DMSO，主要原则是慢冻速融、保持最大存活率
污染种类1微生物：细菌、真菌、支原体和病毒2化学物质：影响细胞生存、非细胞生存所需的化学成分3细胞：非同种的其他细胞
上皮组织特征性生长状态：膜状生长（细胞紧密相连），细胞数量多时最为明显；不规则多角形，呈铺路石样；“拉网”现象
上皮细胞培养的3个要点：①需特殊底物②需特殊培养基③如何纯化和延长上皮细胞生存期。
检测体外培养细胞是否具有恶性的实验有异体接种致瘤实验，浸润生长性检测，软琼脂培养，凝集实验
抗癌药物检测时实验组是加药的癌细胞，对照组是不加药的癌细胞和加药的正常的细胞
胰蛋白酶消化反复贴壁法依据：1肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁慢2 结合使用无血清或低血清含量培养基
提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施1适宜底物2生长因子3动物体媒介培养（裸鼠为佳）
细胞从正常到发生恶性转化大致经过以下几个阶段：1．诱发2.DNA的损伤与修复3发展或表现
从基因表达的持续性上可分为（1）稳定表达（2）瞬时表达
三．简答与问答
如何理解体外培养细胞的单一化现象？
体内生长的细胞在一个动态的平衡的环境中，受周围环境细胞的相互作用，接受内环境调控，相互影响，发生分化，表达生物学特性。而在体外培养的细胞，失去神经体液的调节和细胞间的相互影响，缺少动态平衡的环境，因而发生去分化和脱分化现象，表现为①失去原有的组织结构和细胞形态②分化特征减弱或不明显，形态和功能趋于单一化，出现类似“返祖”现象。③发生转化，获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。
一定浓度的CO2对细胞培养的影响作用，应用CO2培养箱的注意事项？
一定浓度的CO2，通常用5%可以使培养液保持稳定的pH值
注意事项：1维持一定的浓度2保持开放氏培养3定期消毒内置紫外灯、酒精4一定的湿度，避免培养液蒸发简述HAT系统选择杂交瘤细胞的原理？
杂交瘤技术主要有细胞融合，抗体筛选和克隆化培养三部分组成，这三部分紧密连接，组成一套完整的技术体系。HAT 系统为次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷的缩号，是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂交瘤细胞的特殊培
养基。氨基喋呤能阻断核苷酸的主要IMP合成途径，诱变的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺陷骨髓瘤细胞或骨髓瘤之间的融合细胞也失去了利用外源性次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷的能力，无法合成核苷酸，因此在HAT培养基上不能生存。而杂交瘤细胞含有从亲代脾细胞来的正常基因而得以生存
简述浸润性生长检测试验及注意事项？
浸润性生长时细胞浸入或穿透其他组织增值生长的能力，是检测恶性细胞的一项有意义的指标，检测方法乣其他正常组织和癌细胞共同培养，观察癌细胞像正常组织浸润生长的情况，体外浸润实验最常用的宿主细胞是鸡胚组织，包括皮肤，肾，肝，肺和心脏组织，也可用羊膜组织，甚至骨组织。
注意事项1宿主组织培养1-3天后，镜下观察到有细胞游离生长时加肿瘤细胞悬液2应用肿瘤细胞团比单细胞悬液好，更接近体内肿瘤状态，容易观察3通常培养5天后观察到肿瘤细胞侵入宿主组织块中，甚至全部取代组织块4肿瘤浸润的形态学观察：将浸润模型组织进行石蜡包埋，切片染色观察。
提高克隆形成率的方法？
1、培养基;自制适应性培养基和条件培养基，即不含有细胞而已被细胞生活过或同化过的培养基
2、血清:选胎牛血清，用时应先做克隆形成率实验，选最佳者使用。灭活处理：56o C，0.5h
3、激素：含1-100/ml的胰岛素培养液能促进更多细胞克隆的形成
4、CO2：CO2对对绝大多数细胞克隆形成率都有提高，多用5%浓度，成纤维细胞和胶质细胞2%
5、适应性底物：无限细胞系用塑料底物，原代培养细胞用胶原层或血浆纤维蛋白质作为底物
6、饲细胞：用于克隆细胞附着底物的细胞层，利于克隆的形成
7、底物特殊处理：多用聚右旋赖氨酸处理培养瓶和培养皿底物，能提高血清培养人成纤维细胞的克隆形成率
二倍体细胞培养方法？
指使培养的细胞始终维持二倍体生物性状的培养方法，它与一般培养相同关键在传代，培养中用采取以下措施：①严格控制pH最好在CO2培养箱中培养②换液时间不要间隔太长，切不要全部更新，尽量保留一部分旧培养液以弃掉1/2或1/3为宜③每次传代均一分为二④掌握好传代时机，细胞不能过于密集，应及时传代⑤传代后细胞如不用于实验，立即低温冻存
传代期细胞的特点？
传代是原代培养物贴壁生长长满培养器皿的生长面或悬浮培养状态下细胞密度足够大时进行，原代细胞一经传代即改称为细胞系，细胞系可以继续传代。细胞传代期是个整个培养过程的主要时期，持续时间最长。特点：①细胞分裂增殖活动旺盛，细胞生长活跃。②在传代期内，细胞逐渐进入去分化状态。③原本混杂的细胞，会以一种能力强的细胞逐渐处于优势，比例越来越大。④在传代培养期的早期，细胞尚能保持二倍体核型，随着传代次数的增多，细胞发生转化的概率增大。
求证某化学药物是否有抗癌作用，如何进行试验？
1细胞：根据已知药物的作用特点，选用相应细胞。本题药效不明，选Hela细胞，取适量细胞用胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液。分成等量若干份接种入多空塑料板中，用CO2培养箱培养2、加药①对照细胞根据药物的性质和要求选用与相应的二倍体细胞作对照，一切营养条件同试验细胞②加药时间生长中加药常用，加药时间宜在接种细胞后约48小时③药物作用时间应用持续作用法，一般为7天，必要时中间换一次培养液，对照组做相同处理，加等量BBS 3、观察：实验开始后，每天按一定时间取一组培养细胞进行观察①形态结构观察药物对细胞膜、微绒毛、内质网、线粒体、染色质有无影响②生长增殖了解生长增殖状况，计算细胞分裂指数③细胞死亡观察细胞死亡数以判断药效4、结果分析：引起细胞死亡，说明有抗癌作用
简述细胞转化实验何总细胞选择的原则，常用细胞，转化因素？
1、选择的原则：要求所有细胞共有适当的转化率，如过于稳定则转化成功率低，实验难以成功。如细胞对外界环境过于敏感，易发生自身转化，则影响实验的可信性。
2、常用的细胞：（1）原代培养细胞①地鼠：胚胎成纤维细胞较好②人细胞：人成纤维细胞较好（2）传代细胞系，常见的有C3H/10T1/2
3、转化因素：⑴化学因素：MNNG⑵物理因素：射线⑶病毒：SV40⑷癌基因：大约需要两个以上
镜下观察组织培养细胞时应注意什么？对经常出现的问题应如何处理？
1、一般形态：正常细胞透明度大，轮廓不清。不良时，轮廓增厚，胞质中出现空泡脂滴和其他颗粒状物，空隙变大，不规则，出现这种情况需要全面分析
2、细胞增殖生长状态：初代培养或原代培养时，有一长短不同的潜伏期，当细胞分裂时数量增多，形成生长晕或连接成片则进入增值状态。成纤维细胞易生长，上皮细胞呈；拉网状，要及时传代。
3、培养液：成红黄色，可能是CO2积累增多，更换营养液，细胞生长旺盛时2-3天换一次，生长慢是3-4天换一次
4、微生物污染：一旦污染及时处理
基因转导的实验流程？
比较胰蛋白酶vs胶原酶生物活性的异同？
胰蛋白酶胶原酶
消化特性适应于消化软组织消化纤维多的组织
使用浓度 0.01～0.5% 0.1～0.3μg/ml
消化时间 0.5～2h 1～12h
pH 8～9 6.5～7.0
作用强度强烈缓和
细胞影响时间过长有影响无大影响
血清抑活有无
Ca2+和Mg2+ 有影响无影响
多空塑料培养板克隆细胞的主要过程及注意事项?
先制备出1-2细胞/ml低密度的细胞悬液。然后向多空塑料培养板各孔中分别接种细胞悬液0.5-1ml，则每个孔平均含1个细胞，镜下检测每孔所含细胞数，标记下含单细胞的孔，置温箱中培养，数日后凡在已标记的孔中有生长增殖的细胞群即为克隆细胞，具体步骤：1消化：取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液2、低密度细胞悬液的制备：用消化法制备出分散成单个的细胞悬液，然后将其稀释至细胞密度为1-2细胞/ml 3、接种：用加样器向塑料培养板每孔中加0.1-0.3ml，置于CO2温箱中培养4、标记：培养6-12小时后用倒置显微镜观察和标记含单个细胞的孔，置于CO2温箱中继续培养，待孔内细胞增至500-600个时，进行分离培养5、分离扩大培养：选取生长良好的单细胞克隆孔，用胰蛋白酶将其消化成单个细胞后，加入培养基后移入令瓶或皿中，置于CO2温箱中继续培养。用于常规培养法培养
注意1,、观察并确定孔内仅含有一个细胞后，方可进行标记，凡不确认含一个细胞的孔者，不进行标记2、标记时要挑选含有健康细胞的孔3、也可接种到其他底物中进行细胞克隆
试述现代组织细胞培养的主要标志性进展？
1、培养液的改变：培养基由原来的天然动物血浆改进为应用人工合成培养基
2、培养容器的改变：由试管培养改进为多种类型的培养瓶
3、培养方法的改变a1948年，Sanford创立了单细胞分离培养法b、蛋白酶消化分离组织，分离细胞c、液体培养基的应用d、细胞培养用的多种材料都已经系统化和商品化e、低温冷冻技术的应用，将以建立的多种细胞系和细胞株长期冻存
4、细胞培养技术广泛应用于生物学和医学研究a应用理化因素揉法出遗传缺陷的细胞株b、杂交瘤细胞制备单克隆抗体c、检测环境中可疑致癌物，癌基因转染和细胞转化等d、基因工程的生产手段，用于生产多种生物制品
试述鉴定细胞是否具恶性性质的常用技术和注意事项？方法学如何？
1、软琼脂培养：正常细胞不能形成克隆而恶性细胞能形成。方法①琼脂制备②无菌制备DMEM③底层琼脂制备④消化细胞⑤上层琼脂制备。注意①琼脂与细胞相混合时，温度不超过40o C②细胞密度小于等于35个/cm2③计数细胞数大于20个细胞克隆。制备单细胞悬液④选择对数生长期细胞
2、浸润性生长检测
3、异种动物接种致瘤性：向异种动物体内接种备测细胞悬液，观察其是否能生长成瘤，以说明其致瘤性受体动物以裸鼠最好。方法①实验前一天细胞免疫，制备细胞悬液，生理盐水洗1-2次②细胞计数③裸鼠一侧或双侧腋下、皮下接种0.2ml④待肿瘤体积达10cm后观察1-2个月解剖，固定，包埋，切片染色。注意①选择对数生长期的细胞②接种细胞数量不足，瘤细胞和恶性转化细胞不能形成移植瘤，形成假阴性③区别非特异性的局部反应
4、ConA凝集实验：癌细胞结合性较正常细胞强，比较集中
5、核型分析：核型大多为异倍体，染色体形态异常
6、细胞骨架和电镜分析
7、癌基因和抗癌基因的分析正常干细胞和肿瘤干细胞的不同点？
1肿瘤干细胞没有分化为完全成熟细胞的能力, 其分化程序异常。肿瘤细胞倾向于积累复制错误, 而正常干细胞的发育机制要防止这种现象的出现。2干细胞可以在某一时间内连续分裂, 也可在较长时间内处于相对静止状态, 干细胞的自我更新具有反馈机制调节, 增殖和分化处于平衡状态, 有序的; 而在肿瘤干细胞中, 这一调节机制并不存在, 它的增殖分化是无序的, 失控的。3干细胞的增殖具有自稳定性, 当组织处于稳定状态时, 平均一个干细胞产生一个子代干细胞和一个特定分化细胞, 其干细胞总数保持恒定。而肿瘤细胞无自稳定性的特点
如何评价细胞培养技术在检测药物效应中的应用？
优点1直接应用人体细胞作为实验对象（用动物进行检测存在着物种上的差别，不同种动物对同一种药的耐药性有很大差别）2如检测的药物具有组织特异性时，可选用相应的细胞3细胞生长在瓶皿中，加药后药物与细胞直接接触或直接注入细胞内，获得的实验结果比较迅速，比动物经济4结合使用多种方法技术检测药物效应多方面揭示药物特性5 与动物试验相比较为经济
描述两幅图内容，并进行比较？
一、培养细胞的生命期（Life Span of Culture Cells）
指细胞在体外培养中持续增殖和生长的时间，与细胞的种类、生物学性状和供体的年龄等因素有关。(一) 原代培养期（primary culture）初代培养是指从活体内取出组织细胞开始体外培养到第1次进行传代之前的时期，一般持续1～4周。特点：1．细胞群是异质性的（heterogeneous），即各细胞的遗传性状互不相同，相互依存性强。2．细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛，细胞的结构和功能与体内仍很相似。3．克隆形成率低4. 多呈二倍体核型。5. 是检
测药物很好的实验对象。(二) 传代期：传代是原代培养物贴壁生长长满培养器皿的生长面或悬浮培养状态下细胞密度足够大时进行，原代细胞一经传代即改称为细胞系，细胞系可以继续传代。细胞传代期是个整个培养过程的主要时期，持续时间最长。特点：①细胞分裂增殖活动旺盛，细胞生长活跃。②在传代期内，细胞逐渐进入去分化状态。③原本混杂的细胞，会以一种能力强的细胞逐渐处于优势，比例越来越大。④在传代培养期的早期，细胞尚能保持二倍体核型，随着传代次数的增多，细胞发生转化的概率增大。(三) 衰退期：正常二倍体细胞传代到一定的代数时，细胞的生命活动明显减弱，细胞虽然生存，但增殖缓慢或不再增殖，培养物很难长满培养空间，即便是及时更换新营养液也无济于事。此期细胞轮廓增强，胞质出现颗粒、空泡和脂滴等，最终细胞发生程序化死亡（PCD或Apoptosis）。
细胞转化：可发生三期中任何一点，多发生在传代期或衰退期，细胞发生转化的标志：①获得永生性（也称不死性）或恶性性，即细胞获得持久增殖能力，称无限细胞系（Infinite cell line）或连续细胞系（Continuous cell line）。②细胞核型改变，由二倍体变成异倍体
二、组织细胞培养一代的生长过程
细胞传一代后，通常经历三个阶段：1．潜伏期(latent phage)：是细胞对传代操作所致损伤的恢复期以及对新的生长环境的适应期。不论从活体组织制备细胞悬液进行原代培养，还是在进行传代操作时，都要使用蛋白酶等消化酶处理，细胞之间以及细胞及支持物黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤。接种到培养器皿后，先经过一个短暂的悬浮期，接着细胞贴附在支持物上，称贴壁，悬浮期结束。该期细胞修复损伤，“熟悉”环境，恢复生长，但很少分裂2. 指数增生期：是细胞增殖最活跃，细胞活力最旺盛的阶段，分裂相增多，培养物中的细胞数量呈指数增长。指数生长期内细胞分裂相数量（即细胞增殖活性）可以作为判断细胞生长是否旺盛的重要标志。一般以细胞分裂指数（Mitotic Index，MI）和细胞群体倍增时间表示。3.停滞期：又称平顶期，细胞数量达到饱和密度后，不再分裂增殖，进入停滞期。细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞，但仍有代谢活动，该期培养液中营养物质渐趋枯竭，代谢产物积累，pH↓。应及时传代，否则细胞发生中毒，形态老化，重者脱落死亡。传代应越早越好。
动物细胞培养的基本步骤？
1、准备，无菌条件。切取拟培养的动物器官或大组织块
2、用Hanks液漂洗，洗去血污
3、剔除多余成分
4、将所有组织用盐科剪剪碎切成约1mm3大小的组织块
5、蛋白酶溶液消化用于组织培养
6、机械方法吹打组织块
7、离心、制成细胞悬液
8、计数、调节细胞密度
9、用于分离细胞培养
基因转导的试验流程？
1目的基因筛选和克隆2重组表达载体3转染靶细胞，进而进行阳性细胞筛选，阳性细胞克隆培养4若转染成功则出现绿色荧光，若培养后成活则转染成功存活
下图描述的是什么实验，应用如何，注意什么，各步骤的相关内容？
该实验室用于肿瘤细胞培养中除去成纤维细胞时用的胰蛋白酶消化反复贴壁法，利用肿瘤细胞较成纤维细胞贴壁慢且能在低血清培养基上能生长。
该实验适用于肿瘤细胞的培养。
实验中应注意1无菌操作2控制温度在适宜范围内3细胞消化分离时所用时间应适当，定时分离培养4低速离心，避免损伤细胞。
步骤1代表培养肿瘤细胞2代表加入培养基和酶后，进行培养3代表将2培养的细胞进一步加培养基进行培养4代表EDTA5离心管离心6克隆培养
单层细胞→Hanks液冲洗→加无血清培养基吹打细胞制成单细胞悬液→A培养瓶→37℃静置5～20min→全部培养液移入B培养瓶→37℃静置5～20min→全部培养液移入C培养瓶，A、B培养瓶补充完全培养液继续培养，次日观察。A瓶主要为成纤维细胞，B瓶为两类细胞混杂，C瓶则主要为肿瘤细胞。
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
2．1小胶质细胞的原代细胞培养 2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。 第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定 2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。分离后的底层混
合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。 2．1．3免疫荧光鉴定步骤 1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。 2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟 3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右 4)PBS洗3次，每次5分钟 5) 5％BSA室温封闭30分钟 6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜 7)PBS洗3次，每次5分钟 8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时 9)PBS洗3次，每次5分钟 10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟 11)1xPBS洗3次，每次5分钟 12)95％甘油封片
细胞传代培养（胰蛋白酶消化法） 具体操作： 一. 传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 二.胰蛋白酶消化； 1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 三.吹打分散细胞： 1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 四.分装稀释细胞： 1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 五.继续培养： 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。 传代细胞培养注意事项： 1.严格的无菌操作 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
树突状细胞的培养与鉴定 【摘要】目的研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子gm-csf和il-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, dcs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的dcs的培养方法。方法通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。在细胞因子gm-csf和il-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。结果在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。流式分析发现细胞高表达dc表面特异性抗原 cd80，cd86，hla-dr，并且不再表达单核细胞表面抗原cd14，细胞纯度约为93.12%。淋巴细胞增殖实验显示dcs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。结论通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用 gm-csf和il-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。【关键词】树突状细胞；磁珠；流式 molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes. 【abstract】 objectives：to develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (dcs) from highly purified cd14 + monocytes from human peripheral blood. methods：monocytes were purified by negatively sorting
实验5 细胞的传代培养 一、实验目的 熟练掌握动物细胞的传代培养法。 二、实验原理 哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。 三、仪器、材料与试剂 1仪器 CO2培养箱，倒置显微镜，超净台 2材料 培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。 3试剂 完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。 四、实验步骤 1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。 2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。 3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。 4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。 5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。 6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。 8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。
9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。 10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。 五、注意事项 1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。 2.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。 六、实验报告 1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤？ 2.细胞传代培养的目的是什么？
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
姓名程开源系年级2010级临床医学八年制组别同组者孙琳 科目分子细胞生物学目细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号201000232012 【实验目的】 1.学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2.了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。 3.熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。 4.学习细胞生死状态鉴别的方法。 5.了解细胞生死状态鉴别的原理。 6.熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 7.掌握细胞技术方法，计算细胞存货率。 【实验原理】 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。 【实验材料】 1.超净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样器、吸管、酒精灯；小鼠、培养基 2.血球计数板、盖玻片、滴管、显微镜；培养的小鼠脾脏细胞、台盼蓝、伊红 【实验步骤】
《组织细胞培养技术》课程教学大纲 课程编码：26990214 课程名称：组织细胞培养技术 英文名称：Cell and tissue culture technology 开课学期：第二学期 授课对象：统招硕士 开课院系：基础医学院 开课教研室：病理学与法医学教研室 学时：40 （其中理论学时：20 实验学时：20 ） 学分：0.5 课程类型：公共选修课（公共必修课/选修课/专业课） 选用教材：自编教材《组织细胞培养技术》 主要参考书：⑴鄂征主编. 组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1994。⑵施新猷主编.实验动物学. 北京：人民军医出版社，2000。 大纲编写人员：张宏颖副教授 一、课程目的与任务 组织细胞培养技术是研究组织和细胞的技术方法，被培养的组织和细胞也是实验研究的对象。本课程是医学临床与基础专业硕士研究生的公共选修课程之一，在医学各专业高级人才培养中具有重要地位。本课程系统介绍了组织和细胞培养技术有关的概念、基本原理、操作程序和关键技术，及其在医学研究和临床实践中的应用，该领域的研究历史和最新发展动态；转基因动物技术的概念、研究进展、技术方法、建立方法、应用及前景展望。旨在提升医学专业硕士研究生的知识结构，掌握现代生物技术中的基本实验技能，培养学生开拓创新的能力，适应未来学科发展对人才的需求。 二、教学基本要求 本课程系统地论述了组织细胞培养技术的理论和方法，简要介绍了转基因动物技术及应用。要求学生全面系统地掌握组织细胞培养的操作过程，了解各种操作的基本原理；有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力；熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和与此有关的基本理论知识，了解国内外细胞培养的最新动态和研究进展，了解转基因动物技术的概念、研究进展、技术方法、建立方法、应用，并能自行根据需要设计实验，运用所学技术解决科研中的实际问题，提高学生综合分析问题，系统利用专业知识的综合素质。 三、各章节内容及学时分配 第一章组织培养技术的基本理论知识（4.5学时） 目的与要求 1、掌握组织培养基本概念；了解对组织培养的评价；熟悉对组织培养工作者的要求和工作方法。 2、了解体内外细胞的差异与分化；掌握培养细胞形态分类及培养细胞的大体形态；熟悉组织培养 细胞的生长和增殖过程。 3、熟悉培养细胞生存环境和条件。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
细胞传代培养 一.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的 应用打下基础。 二、原理 从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生 长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接 观察 活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可 以与 体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较 经济， 因此成为生物学研究的重要手段。 细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养 为 原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞 分散 后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养， 传 代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受 温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌 操 作是细胞培养成败的关键。 三、材料和试剂 1、细胞：293细胞株 2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清） 3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精 灯等 四、操作步骤 1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。 2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。 3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入 培养箱中消化几分钟 4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代 5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液 6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱 7.收拾整理超净台 附：消化液配制方法： 称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存， 用前可在37℃下回温。 10x pbs配方：na2hpo4(14.2g) kh2po4(2.32g) nacl(80g) kcl(2.02g) (调至ph=7.4） 五、实验结果
HSC-T6大鼠肝星状细胞培养及鉴定实验报告 前言 肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的名称有多种多样，如肝贮脂细胞（fat-storing cell，FSC）、脂细胞（1ipocyte）、维生素A贮存细胞（vitamin A-storing cell）、窦周细胞（perisinusoidal cell）、Ito细胞等。HSC位于Disse间隙内，紧贴着肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells, SEC）和肝细胞。其形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。此外，HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。HSC胞质内有1～14个直径约1.0～2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴，胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。胞核形态不规则，由于脂滴的挤压，常致细胞核有一个或多个凹陷，核内可见1～2个核仁。正常肝脏中HSC的数目很少，只占肝细胞总体数目的5%～8%及总体体积的1.4%，但HSC的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。 正常情况下HSC表现为富含Vitamin A脂滴的静止型，其功能主要有： （1）代谢和贮存Vitamin A：肝脏储存有体内80%左右的维生素A，对体内维生素A的代谢起着重要作用。视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合，然后转运到邻近的HSC储存。 （2）储存脂肪：正常HSC胞质内的脂滴含有大量的甘油三酯，为肝细胞提供能源。 （3）合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分。目前的研究认为，HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）的主要合成细胞。正常肝脏中HSC合成的胶原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型为主，其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。HSC 还能合成纤维连接蛋白、层连蛋白和粗纤维调理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖。 （4）合成基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase, MMP）及其组织抑制剂（tissue inhibitor of metallo proteinase，TIMP）:正常情况下，HSC能分泌多种胶原酶和基质降解蛋白酶如基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2等以降解各种细胞外基质，同时分泌组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1防止胶原过度降解，使肝脏ECM的合成和分解处在一个动态平衡中。 （5）表达细胞因子及受体：正常情况下，HSC可以分泌肝细胞生长因子（HGF），参与肝细胞再生的调控。此外，HSC还能表达少量的转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生的生长因子（Platelet derived growth factor，PDGF）和胰岛素样生长因子（IGF）等，同时HSC能表达TGF-β1的II、III型受体和PDGF受体的α亚单位等。
组织细胞培养概述 组织细胞培养一般泛指所有的体外培养，包括组织培养、细胞培养和器官培养。其中，组织培养（Tissue Culture）指从活体内取出组织，模拟体内生理环境，在体外无菌、适当温度和一定培养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。细胞培养（Cell Culture）则是指离散细胞的培养，这些细胞通过酶学的、机械的或化学方法从来源组织中获得，培养物是单个细胞或细胞群。器官培养（Organ Culture）是指以器官的原基、器官的一部分或整个器官为培养物，应用与组织培养相似的条件，使培养物保持着体内组织部分或全部组织学特征，在体外生存、生长并保持一定的功能。组织培养与细胞培养并无严格区别，组织培养可出现细胞单一化现象，即趋向变成单一类型细胞，最终也变成了细胞培养。细胞在培养过程中的生命活动是互相依存的，呈现着一定的“组织”特性。 （一）体外培养方式的分类 体外培养可分为原代培养和传代培养。原代培养，又称初代培养（Primary Culture），即对从生物体内取出的细胞、组织和器官进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，通常只能培养10-50代左右即退化死亡。传代培养（Passage Culture），是指无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。原代培养物经首次传代成功后即为细胞系（Cell Line）。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line），而已获无限繁殖能力能够持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞的亚系（Subline）。 （二）体外培养细胞的分型 根据离体细胞在培养皿中生长时是否贴壁，可将体外培养细胞分为贴壁型和悬浮型两类。 1.贴壁型细胞：培养细胞需贴附在支持物上生长，大多数细胞属于此型，也称锚着依赖性细胞（anchorage-dependent cells）。细胞贴壁后，分化现象常变的不显著，易失去原有组织特征，形态上表现单一化。主要包括①上皮细胞
原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去
Case：新生SD大鼠原代心房肌细胞分离与药物刺激培养冰检测相关蛋 白与基因 实验设计 一、细胞：分离大鼠原代心房肌细胞 二、细胞培养分组： a)对照组：正常大鼠原代心房肌细胞72h培养 b)高糖72h培养 c)高糖+氧化应激抑制因子72h培养 d)正常培养48h+氧化应激刺激因子再培养24h e)高糖培养48h+氧化应激抑制因子再培养24h f)正常培养48h+（氧化应激刺激因子+氧化应激抑制因子）共同培养24h 三、蛋白检测：WB检测各组培养细胞中A蛋白与B蛋白的表达。 四、荧光定量检测：荧光定量PCR方法检测各组培养细胞中A基因与B基因的表达。 实验报告 一、新生SD大鼠心房肌细胞的分离与培养： 1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小； 2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置； 3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化； 4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃，5％CO2 培养箱中培养； 5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养； 二、新生SD大鼠心房肌细胞的α-actin免疫荧光鉴定： 1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min； 2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min； 3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min； 4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜； 5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗（嘉美生物公司）， 37℃条件下放置1h； 6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。
3.1海马原代培养操作 准备： 1、取海马：培养皿6个（3对），D-hanks（100ml，提前预冷），75%酒精，眼科镊2把， 小剪刀3把，小镊子4把（三个弯头，一个直头），冰袋3个，中号镊一把。 2、细胞室：小dish，多聚赖氨酸（1个EP），纸抽，细胞剪，胰酶（2个EP），DMEM（10% 胎牛血清+青霉素+链霉素，提前拿出），离心管2个，24孔板1个，细胞筛2个，废液缸1个, D-hanks 3、分装：胰酶：1ml、D-hanks:100ml、青霉素：500ul、链霉素：500ul、胎牛血清：10ml、 DMEM：90ml、B27：40ul、Neurobasal：1.6ml 4、玻璃器皿：移液管，培养皿，24孔板内的玻璃片，泡酸过夜，自来水清洗10遍，一蒸 10遍，三蒸3遍，烤干，高压，再烤干 步骤： 1、培养前30min包被多聚赖氨酸置于培养箱中备用； ↓ 2、75%酒精浸泡鼠，断头取脑（1把中镊，1把中剪） ↓ 3、剥离海马（D-hanks液，冰盒，4把小镊） ↓ 4、去血管、被膜（显微镊2把） ↓（进细胞间） 5、吸去多余D-hanks，剪碎，吸入15ml离心管 ↓ 6、D-hanks：胰酶=1:1，吹打20次 ↓ 7、15-20 min，37℃，期间5min震荡一次 ↓ 8、1:1比例加（DMEM+青链+胎牛血清）终止消化，吹打20次 ↓ 9、配平，1000rpm，5min ↓ 10、弃上清，得沉淀 ↓ 11、加（DMEM+青链+胎牛血清），吹打20次 ↓ 12、100目过筛， ↓ 13、放入15ml离心管，吹打
↓ 14、配平，1000rpm，5min ↓ 15、弃上清，得沉淀，加DMEM，吹打 ↓ 16、200目过筛 ↓ 17、计数（1×106） ↓ 18、500微升/孔（24孔板） ↓ 19、24孔板放入恒温培养箱中，37℃，5%CO2 ↓ 20、第二天换Neurobasal+B27（N:1.6ml，B27:40ul） ↓ 21、隔三天换液 注意事项：1、取海马的操作过程要迅速，提高神经细胞的存活率。 2、从断头处死鼠到胰酶消化前整个过程都要在冰上进行。 3、如果是胎鼠，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出 放到预冷的液体中。 4、一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。 5、吹打动作要轻柔，以免损伤细胞。 6、种板时密度很重要，过密和过稀都会影响细胞生长。 7、种板后需轻摇晃板，切记！不能圈圈摇晃。应左右平行，上下平行摇晃。 3.2 海马细胞的鉴定： 取培养7-9天的细胞 海马神经细胞特异性抗体：神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白质2（MAP2）、生长相关换蛋白43（GAP-43） NSE：神经元特异性烯醇化酶，血清NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶 GAP-43：GAP-43是一种膜相关的鳞蛋白，与神经纤维生长的调节有关，主要分布于海马神经元的轴突 MAP2：MAP2是一种细胞骨架蛋白，定位于海马神经元的胞体和树突。
原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 原代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 原代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。