离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 1.离子交换层析的基本原理： 离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。 离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。 由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。 2.离子交换层析介质： 离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。 阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可
蛋白纯化离子交换层析 离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过共价键结合某种电荷基团，形成带电基质，带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上，而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上，不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。 常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，在阳离子交换剂中，带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。例如DEAE纤维素阳离子交换剂，当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基（DEAE）时，形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，可与带负电荷的蛋白质进行结合，交换阴离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离，如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。 强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有：磺酸甲基、磺酸乙基；中等酸型阳离子交换剂有：磷酸基团和亚磷酸基团；弱酸型离子交换剂有：酚羟基和羧基类； 在阴离子交换剂中，带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换，例如阴离子交换剂CM纤维素，当纤维素交换剂分子上结合羧甲基（CM）时，形成带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），可与带正电荷蛋白质结合，交换阳离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。 蛋白质是两性电解质，当溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，蛋白质的静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，羧基电离，蛋白质带负电荷，蛋白质能够被阴离子交换剂所吸附，相反，当溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷，被阳离子交换剂所吸附，溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质带电荷越多，与交换剂的结合程度也越强，反之则越弱。 当溶液的pH值发生改变时，蛋白质与交换剂的吸附作用也发生变化，因此可以通过改变洗脱液的pH值来改变蛋白对交换剂的吸附能力，从而把不同的蛋白质逐个分离，当pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱，当pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低蛋白质对阴离子交换剂的吸附。 另外，无机盐离子（如NaCl）对交换剂也具有交换吸附的能力，当洗脱液中的离子强度增加时，无机盐离子和蛋白质竞争吸附交换剂。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。 因此，洗脱阴离子交换剂结合的蛋白时，则降低pH值，增加盐离子浓度；洗脱阳离子交换剂结合蛋白时，则升高溶液pH值，增加盐离子浓度，能够洗脱交换剂上的结合蛋白。
离子交换层析柱的装填及处理 一、原理： 有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如：R-SO3H＋M+ R-S3M＋H+ 或R-NH3OH＋CL－— R-NH3CL＋OH －这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。 二、目的与要求： 本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。 三、仪器与装置： 玻璃层析柱：长19cm，内径1、2cm，3# 砂芯。H L-2型恒流泵。H D-4型电脑核酸蛋白检测仪。B S-100A自动部份收集器。 250ml烧杯。 1ml吸管。 水浴锅。 72型（或721型）分光光度计。
四、试剂与药品： 树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。 洗脱液：0、45N，PH5、3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸 （C6O7H8?H2O）；186g97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。 样品液：0、005M ASP和LYs的0、02N HCL混合溶液。 显色剂：显色剂列出两种可任选一种。 显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。 10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0、85 ml TiCL3（15%）显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。 0、1M KCN:0、1628g KCN溶于水中稀释至250ml A、将1、25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。B 、将2、5ml 0、01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时， A、B两溶液在前一天合并，配好的溶液仅能在1-2天内使用，过时失效须重配。 五、方法与步骤： 1、树脂的处理： 关于市售新树脂的处理见 7、，本实验采用处理好的树脂。 2、装柱：将层析柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。
蛋白纯化离子交换层析 研究生的生活，单调的科研，重复的脚印，匆匆的轨迹，踩着早上的时光一如往常的走进实验室，摊开实验记录本，写上日期，就像每天写日记一样开始计划今天的实验日记，用笔似乎要绘制一副有关实验的画面。 如果你处在这样的科研氛围里，慢慢的就会体味到科学本身就像窗外的大自然一样的美，绿色撩人，诗意陶醉…… 今天，我们写下的实验日记——蛋白纯化离子交换层析法，文章详细的总结了离子交换层析的定义、离子交换层析的原理、离子交换剂的种类，似乎要提醒一下脑子要保持清醒了，不然，看完之后，你能分清楚阴阳离子交换剂的概念，熟知它们的区别么？ ————你会创造规律科研生活的美 我，生在春天里，刚发芽的地方是实验室 知了也睡了，而我刷夜实验室 因为我在等待秋天收获的季节 虽然有可能错过成功的喜悦，却收获心灵上的成长
离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过共价键结合某种电荷基团，形成带电基质，带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上，而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上，不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。 常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，在阳离子交换剂中，带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。例如DEAE纤维素阳离子交换剂，当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基（DEAE）时，形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，可与带负电荷的蛋白质进行结合，交换阴离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离，如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。 强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有：磺酸甲基、磺酸乙基；中等酸型阳离子交换剂有：磷酸基团和亚磷酸基团；弱酸型离子交换剂有：酚羟基和羧基类； 在阴离子交换剂中，带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换，例如阴离子交换剂CM纤维素，当纤维素交换剂分子上结合羧甲基（CM）时，形成带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），可与带正电荷蛋白质结合，交换阳离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。 蛋白质是两性电解质，当溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，蛋白质的静
离子交换层析技术 层析( chromatography) 也称为色谱, 就是将混合物中各种组分分离的方法, 是分离、纯化及鉴定生物大分子时最常使用的技术之一。一个层析系统都包括两相, 即固定相和移动相。当移动相流过加有样品的定相时, 由于各组分在两相之间的分配比例不同, 它们( 各组分) 就会以不同的速度移动而相互分离开来。定相能够是固体, 也能够是被固体或凝胶所支持的液体。定相能够被装入柱中或涂成薄层、薄膜, 成为层析”床”。动相能够是气体, 也能够是液体, 前者称为气相层析, 或者成为液相层析。 离子交换层析技术是以离子交换纤维素、离子交换树脂或离子交换葡聚糖凝胶为固定相, 以待分离的样品为移动相, 分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 ( 一) 原理 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团, 当结合阳离子基团时, 可换出阴离子, 则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基( Dicthylaminoethyl, DEAE) 纤维素。在纤维素上结合了DEAE, 含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H, 它的反离子为阴离子( 如Cl-等) , 可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时, 可置换阳离子, 称为阳离子交换剂, 如羧甲基( Carboxymethy, CM) 纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子( 纤维素－O－CH2－COO一) , 其反离子为阳离子( 如Na+等) ,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 溶液的pH值与蛋白质等电点相同时, 静电荷为0, 当溶液pH值大于蛋白质等电点时, 则羧基游离, 蛋白质带负电荷。反之, 溶液的pH值小于蛋白质等电点时, 则氨基电离, 蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远,
酶工程复习材料 1.简述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析的原理和操作要点？ 离子交换层析原理：根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。 操作:a上样：上样体积不十分严格。b洗脱:增加溶液的离子强度c梯度洗脱法:改变溶液的pH d再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl 处理。 凝胶层析原理：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。大分子 物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最 先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出 层析柱。 操作：a凝胶的选择和处理,根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。 将干胶悬浮于5-10倍的蒸馏水中，充分溶胀，抽气，装柱。b柱的 选择:采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。c加样: 体积不能过多，不超过凝胶床体积的5％，脱盐时可在10％左右。d 洗脱:洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。e 胶的保存:洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。亲和层析原理:利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子.体通过适当的化学反 应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。 2.酶的分类： 根据酶的化学组成可将酶分为：1.单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分；2.结合蛋白酶类（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子） 全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子 根据酶蛋白结构特点可将酶分为 单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。 寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。 多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。 3.酶合成调节的类型 诱导: 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。 阻遏:分解代谢物阻遏和反馈阻遏
实验二离子交换层析纯化兔血清IgG 【原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85 ～7.5 ），其余均属酸性蛋白。pH7.2 ～7.4 的环境中。酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG 。 【试剂与器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5mol/L HCl 和NaOH 3.0.1mol/L pH7.4 PBS 4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)
5.0.02 ％NaN 3 6.PEG 7. 无水乙醇 8. 紫外分光光度计 9.1cm×20cm 玻璃层析柱 10. 自动部分收集器 【操作步骤】 1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 （下称A-50 ）5g ，悬于500ml 蒸馏水内，1h 后倾去上层细粒。按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置30min ，装入布氏漏斗（垫有 2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。
2 ．装柱 （ 1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 （2 ）将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。待A-50 凝胶沉降2 ～3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min ，同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。 （ 3 ）关闭出水口，待A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 3 ．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速 4 滴/min ，使约2 倍床体积的洗脱液流出。并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。 4 ．加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（0.5ml 血清，体积应小于床体积的2% ，蛋白浓度以＜100mg 为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面
离子交换层析 1、定义 2、发展 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。 3、基本信息 离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阳离子交换树脂；而带有负电荷的称之阴离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 4、具体操作 预处理和装柱 对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。 洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
离子交换分离纯化蛋白 原理总结 Document number：WTWYT-WYWY-BTGTT-YTTYU-2018GT
离子交换分离纯化蛋白原理及应用 离子交换剂 基质主要有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和硅胶（HPLC）等 离子交换树脂一般只适合分离小分子物质如氨基酸等，不适合分离蛋白质等大分子物质，一方面是因为大分子不易进入树脂紧密交联结构的内部，另一方面因为交联聚苯乙烯骨架疏水性很强，用于蛋白质分离时，会出现疏水性的不可逆吸附。此外，离子交换树脂的机械强度较差，而且树脂的体积常随着溶剂离子强度的变化发生溶胀和收缩。 根据交换基团的电荷性质进行分类： 阳离子交换树脂：强酸型含磺酸基团(R-SO3H) 中等酸型含磷酸基团(-O-PO2H4) 弱酸型含酚基、羧基 阴离子交换树脂：强碱含季胺基团[-N+(CH3)3] 弱碱含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。 弱酸型—只能在碱性pH范围内使用弱碱型—只能在酸性pH范围内使用 离子交换纤维素的种类很多，可分为阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素两大类。由于这些材料是纤维状的，大部分活性基团分布在表面，所以，适合于分离蛋白质等生物大分子。阴离子交换纤维素—DEAE-纤维素,具二乙胺乙基，阳离子交换纤维素—CM-纤维素,具有羧甲基，分别是应用得最广泛的阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维
素。另外，根据纤维素颗粒的物理结构不同，可分为“纤维型”和“微晶型”两大类。“微晶型”因颗粒细、比重大，能制成紧密的柱，交换容量大，分辨率高。 离子交换凝胶：离子交换葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶具有许多优点，分离大分子物质，不会引起被分离物质的变性戒失活，非特异性吸附很低；交换容量大(为离子交换纤维素的3-4倍)；容易制成微球型，因此装柱和层析时的流速都较易控制。它的缺点是随着洗脱液的离子强度和pH的变化，床体积变化大，明显影响流速;另外,由于它的凝胶性质,有时会把大分子物质排阻在网络结构之外。 如：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose） 平衡缓冲液：它的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合。 增强洗脱液与离子交换剂的结合力，降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱缓冲液：在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH 两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pH从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。 强酸性阳离子换剂H+的结合力比对Na+的小；H型SPSepharoseFF Nacl、NaOH、NH4OH、NH4Cl洗脱磷酸缓冲液平衡 弱酸性阳离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大；Na型CM-纤维素 NAOH或HCLH+或Na+洗脱 强碱性阴离子交换剂对OH-的结合力比对C1-的小得多；OH型 弱碱性阴离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的大。Cl型DEAE-纤维素
实验报告 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法 二、实验内容和原理 1、离子交换层析 由于蔗糖酶的偏酸性,所以在7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测 蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。（100℃显色） 三、实验材料和主要仪器 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂 ⑴ ⑵ 20 7.3 缓冲液 ⑶ 20 （1 ）7.3缓冲液 ⑷ 0.2乙酸缓冲液，4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液 ⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器 （1）高速冷冻离心机 （2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）
（3）? （1套/组） （4）部分收集器及收集试管（4管）（1台/组） （5）－20℃冰箱（保存样品用） （6）微量移液枪 200、1000 （7）1.5离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用） （8）7离心管（留样品Ⅳ用） （9）恒温水浴（50℃、100℃） （10）试管、移液管、试管架等 四、实验方法和步骤 1、仪器连接 （1）接通各仪器电源，将泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。注意B为含溶液。 （2）点击电脑桌面上软件图标，打开软件。选择，点击，进入操作界面。点击 （3）在操作界面的工具栏，点击。出现窗口，调节为 1，确定。 2、装柱与平衡 （1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。 （2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（)相连，下端接头与样品阀（ )相连。 （3）平衡一个柱体积（约2020） 3、加样 停止加入20 7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，程序暂停。旋开柱上方接头，用胶头滴管缓慢将5蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。程序继续，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，程序暂停，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加缓冲液至一定高度。 4、洗脱（梯度洗脱法） （1）加样后，先用进行洗脱，洗去未被凝胶吸附的杂蛋白（20左右）； （2）待层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定，在程序主界面的工具栏→ → → ，在两个框内均填入100，点击，最后点击一次，开始梯度洗脱。每2接一管，当上升至8 时，开始测定各管的蔗糖酶活力； （3）将蔗糖酶活力高的若干管酶液（2-3管）合并，测量总体积V4（样品Ⅳ），样品用7离心管－20℃保存。 5、蔗糖酶活力检测
离子交换层析实验原理及步骤 离子交换层析实验方法 阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。 1. 剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。 下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法 2. 膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。 表1－4 分离的血清与所需DEAE—纤维素量及其他条件的大致关系 血清样品量（ml） DEAE需用量（g） 选层析柱规格（cm） 选脱液量（ml） 1~2 2 1×25 100~150 5 5 2×12 200~300 10 10 2×20 300~400 20 20 2×37
400~800 称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。 3. 平衡 将DEAE—纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。 4. 装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为10∶1～20∶1，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。 装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE－纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。 5. 上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。 样品的加量与DEAE—纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的—球蛋白50mg～100mg，用干重约4g DEAE－纤维素装柱分离，可获得理想结果。
DEAE离子交换层析分离血清蛋白质 【教学对象与学时】 教学对象：临床医学五年制、七年制学生 学时：8学时 【预习要求】 蛋白质的基本理化性质 血清蛋白的组成及其理化性质 【目的要求】 教学目的：熟悉层析的基本原理与分类、掌握离子交换层析的原理及操作教学要求：利用离子交换层析对血清蛋白进行分离并对分离所得各组分性质进行比较、实验前预习，实验后写出实验报告。 【重点和难点】 重点：离子交换层析分离蛋白质的实验原理。 难点：DEAE纤维素处理的原理与操作。 【教学过程设计】 一、布置预习内容。 1、复习蛋白质的基本理化性质，重点是蛋白质的两性电解性质及由此引申出来的蛋白质表面电量与溶液PH值之间的关系。 2、蛋白质的紫外吸收性质。 3、血清蛋白的组成与分类。 二、课堂教学过程 1.复习层析概念 2.交待离子交换层析概念，并提出引导性问题。 3.进行实验操作第一个环节——DEAE纤维素的处理，在处理间歇期穿插实验理论的讲述。 3.1 膨润阶段讲述内容： 3.1.1 离子交换层析的本质—化学反应平衡，引申出离子交换层析的分类与应用范围；
3.1.2 复习蛋白质表面电量与溶液PH之间的关系，引申出PH值梯度洗脱的意义； 3.1.3 讲解双电层理论，引申出离子强度梯度洗脱的意义； 3.1.4 离子交换介质处理的理想状态，初步理解交换层析介质处理的要求； 3.1.5 待分离蛋白质与交换剂的结合，引申出离子交换层析的分离范围概念。 3.2 转型阶段讲述内容： 3.2.1 离子交换层析的分离理论，以及PH值梯度洗脱与离子强度梯度洗脱的不同意义； 3.2.2 离子交换剂处理的原理及其对实验结果的影响 3.2.3 仪器的连接与使用方法 4.平衡阶段进行仪器的调试等上样前的准备 5.上样 6.梯度洗脱 7.中午轮流休息 8.实验结果与结果分析 【实验报告要点】 1.离子交换层析的原理 2.实验操作步骤 3.实验结果与结果分析 【思考题】 1.阴阳离子交换剂如何选择？ 2.离子强度梯度洗脱的意义？ 3.本实验中，判断依次被洗脱的蛋白质性质差异？ 【专业英语选读】 The molecular details of a biochemical process cannot be fully elucidated until the reacting molecules have been isolated and characterized. Therefore, our understanding of biochemical principles has increased at about the same pace as the development of techniques for the separation and identification of biomolecules. Chromatography has been and will continue to be the most effective technique for isolating and purifying all types of biomolecules. In addition, it is widely used as an analytical tool to measure quantitative properties.
离子交换分离纯化蛋白原 理总结 Prepared on 22 November 2020
离子交换分离纯化蛋白原理及应用 离子交换剂 基质主要有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和硅胶（HPLC）等 离子交换树脂一般只适合分离小分子物质如氨基酸等，不适合分离蛋白质等大分子物质，一方面是因为大分子不易进入树脂紧密交联结构的内部，另一方面因为交联聚苯乙烯骨架疏水性很强，用于蛋白质分离时，会出现疏水性的不可逆吸附。此外，离子交换树脂的机械强度较差，而且树脂的体积常随着溶剂离子强度的变化发生溶胀和收缩。 根据交换基团的电荷性质进行分类： 阳离子交换树脂：强酸型含磺酸基团(R-SO3H) 中等酸型含磷酸基团(-O-PO2H4) 弱酸型含酚基、羧基 阴离子交换树脂：强碱含季胺基团[-N+(CH3)3] 弱碱含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。 弱酸型—只能在碱性pH范围内使用弱碱型—只能在酸性pH范围内使用 离子交换纤维素的种类很多，可分为阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素两大类。由于这些材料是纤维状的，大部分活性基团分布在表面，所以，适合于分离蛋白质等生物大分子。阴离子交换纤维素—DEAE-纤维素,具二乙胺乙基，阳离子交换纤维素—CM-纤维素,具有羧甲基，分别是应用得最广泛的阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维
素。另外，根据纤维素颗粒的物理结构不同，可分为“纤维型”和“微晶型”两大类。“微晶型”因颗粒细、比重大，能制成紧密的柱，交换容量大，分辨率高。 离子交换凝胶：离子交换葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶具有许多优点，分离大分子物质，不会引起被分离物质的变性戒失活，非特异性吸附很低；交换容量大(为离子交换纤维素的3-4倍)；容易制成微球型，因此装柱和层析时的流速都较易控制。它的缺点是随着洗脱液的离子强度和pH的变化，床体积变化大，明显影响流速;另外,由于它的凝胶性质,有时会把大分子物质排阻在网络结构之外。 如：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose） 平衡缓冲液：它的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合。 增强洗脱液与离子交换剂的结合力，降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱缓冲液：在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH 两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pH从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。 强酸性阳离子换剂H+的结合力比对Na+的小；H型SPSepharoseFF Nacl、NaOH、NH4OH、NH4Cl洗脱磷酸缓冲液平衡 弱酸性阳离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大；Na型CM-纤维素 NAOH或HCLH+或Na+洗脱 强碱性阴离子交换剂对OH-的结合力比对C1-的小得多；OH型 弱碱性阴离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的大。Cl型DEAE-纤维素
离子交换层析法（ion exchange chromatography，简称IEC） 是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。蛋白质由氨基酸组成，不同的氨基酸是具有不同的等电点的，因此每个蛋白质都具有等电点，不同的蛋白质，其等电点也不相同。这个决定了在同一pH下，蛋白质所带的电性和电荷量是有差异的，比如在pH在7.0的情况下，有些蛋白质带正电，有些蛋白质带负电，有些蛋白质不带电；在带正电的蛋白质中，不同的蛋白质所带的电荷量也是不同的，带负电的蛋白质也是如此。即使假设存在两种蛋白质所带的在同一pH下所带的电性和电荷量都相同，不同的蛋白质的分子量以及其折叠而成的空间结构决定了这两种蛋白质的表面电荷密度也是不同的。以上论述的结论就是每一种蛋白质在同等条件下都有唯一的特征常数。蛋白质的离子交换柱层析正是利用了这个蛋白质的特征设计的。蛋白质离子交换层析在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。蛋白质的特征常数决定了在相同pH下蛋白质与离子交换剂的亲和力是唯一的。也就是说，在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷密度存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离的目的。离子交换层析具有浓缩效应，可以实现低浓度蛋白质的提取，这是非常具有实际意义的。
化工专业实验蛋白质的离子交换层析实验 一、实验目的 1．了解离子交换层析分离蛋白质的基本原理。 2．掌握离子交换层析分离操作的基本步骤及方法。 二、实验原理 1. 离子交换层析蛋白质的基本原理 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析分离方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成，带负电荷能吸附正电荷的称之阳离子交换树脂，而带有正电荷能吸附负电荷的称之阴离子交换树脂。 蛋白质（protein）是生命的物质基础，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的生物大分子物质。蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的。虽然蛋白质是大分子有机物，但由于蛋白质中含有氨基、羧基等亲水基团，蛋白质长链中的亲水基团向外而疏水基团向内，可以形成特定的三维结构，所以大部分蛋白质仍能较好的溶解在水溶液中。在一定的离子强度范围内，溶液中的小分子离子在静电作用下吸附包裹在蛋白质表面亲水基团外侧，形成双电层结构，一定程度上有助于稳定蛋白结构及其水溶性。但蛋白质在不同的pH条件下，其带电状况不同。当pH较低时，蛋白质表面正电荷多于负电荷，总体电性为正；当pH较高时，蛋白质表面正电荷少于负电荷，总体电性为负；当蛋白质表面正电荷量与负电荷量相当时，蛋白质总体显示电中性，双点层结构解体，蛋白质亲水性降到最低，将表现出明显的疏水性，发生疏水性团聚和沉淀，此时的pH值即为蛋白质的等电点。不同蛋白质结构不同，等电点亦不同，但大部分已知蛋白多属于阴离子蛋白，在中性溶液中显示出电负性。 离子交换层析可以用于蛋白质的分离纯化：阴离子交换基质能吸附带有负电荷的蛋白质，阳离子交换基质能结合带有正电荷的蛋白质。一般而言，pH越低，蛋白质净正电荷数越多，pH越高，蛋白质净负电荷数越多；蛋白质分子个头越小，净电荷数越多，离子交换吸附作用越强，越难被洗脱；溶液中小分子离子含
阴离子交换柱使用手册 Chrompack HPLC IonoSpher A Columns 注意 Chrompack IonoSpher A色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（p H>6.5）或酸性溶剂（pH<2.5）会溶解硅胶材料导致柱子损坏。 在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。 1．简介 Chrompack IonoSpher A 柱填充硅胶基质的强阴离子交换材料，含有季胺功能团。特别设计用于使用常规HPLC分析有机和无机阴离子。 2．色谱柱老化 在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。 要老化这类柱子，首先要使用甲醇淋洗，然后使用去离子水。再用你选用的洗脱液进行平衡。 在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。 3．洗脱液 推荐在这类柱上使用的洗脱液要求低电导，或者UV吸收的缓冲液，例如磷酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5。 绝对不能使用水杨酸缓冲液，因为水杨酸分解产物会改变固定相的性质。另外，硝酸铵（1mM）可以改善峰型，而且不会明显影响保留时间，检测或定量结果。 洗脱液在使用以前要脱气，并用0.45微米滤膜过滤，防止发生检测和泵送问题。 一定要在开始使用系统以前检查有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。
4．流量和压力 注意：最高压力：不锈钢柱：4500psi；玻璃柱：3000psi 增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。 如果你想更换柱子，，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。 高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。 使用保护柱（见第6节）会防止污染物沉积在分析柱上。 5．样品准备 保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。你必须防止将疏水性/与流动相极性差别很大的化合物泵入色谱柱，不管是来自流动相还是样品。特别地，要禁止导入颗粒杂质。这些最终都会造成操作压力的增高而且非常困难或者不可能去除。 6．保护柱 一定要使用保护柱，因为样品和洗脱液污染可能会造成柱压力的增高而且影响选择性。对于ChromSep 柱我们建议使用ChromSep Anion 交换保护柱。当柱压增高的或者观察到柱效降低的时候就需要更换保护柱了。对于常用不锈钢柱，我们建议使用Chromguard Anion exchange High Efficiency（高效）柱(10X3.0mm)或High Capacity（高容量）柱(50X3.0mm)。 7．进样量和浓度
离子交换柱交换层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸 一、实验原理 离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力（静电引力）而达到分离目的的分离技术。离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和离子强度的电解质溶液。 树脂（惰性支持物）上结合了阳离子或阴离子后，可与阴离子或阳离子结合，改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。由于不同的氨基酸在不同的pH值和离子强度溶液中的所带电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。从而可以在洗脱过程中按先后次序洗出，达到分离的目的。带电荷量少，与交换剂亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量大，与交换剂亲和力大的后被洗脱下来。 本次实验采用的是Amberlite IR-120阳离子交换树脂作为离子交换剂，分离的样品为Asp和Lys两种氨基酸的混合液。在一定的pH下，Asp和Lys的带电情况不同，与磺酸集团的亲和力不同，因此被洗脱下来的次序不一样。将各收集管分别用茚三酮显色后，测定吸光度，从而得到洗脱曲线。 二、实验器材 实验仪器：层析柱、恒流泵、试管*30、吸管、移液枪、烧杯、紫外分光光度计实验试剂：Amberlite IR-120阳离子交换树脂、柠檬酸缓冲液（pH5.3）、 0.5%茚三酮、0.1%CuSO4、氨基酸样品（0.005mol/L的Asp和Lys，用 0.02mol/L的HCl配制） 三、实验操作记录 1、树脂的处理
干树脂经蒸馏水膨胀，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCl及2mol/L NaOH依次浸洗，每次浸2h，并分别用蒸馏水洗至中性。再用1mol/L NaOH浸半小时（转型），用蒸馏水洗至中性。 2、装柱前的准备 选择直径1cm，长度15~20cm的层析柱，观察柱底端滤膜是否完好，分别用流水和蒸馏水冲洗干净。 将层析柱垂直装在铁架台上，柱进水口和出水口装上橡皮管，关闭柱底端出口，在柱内注入少许（约1cm高）的洗脱液，打开出水口，排净管内空气后关闭出水口。 3、装柱 向盛有已处理好的树脂的烧杯中加适量洗脱液，用玻棒轻轻将树脂搅成悬浮状，然后沿柱内壁小心地加至适当高度。倒入速度不要太快，以免产生泡沫和气泡。 待树脂在柱底部有明显沉积（约1cm高）后，缓慢打开出口（或用滴管吸出柱内上层过多的洗脱液），继续加入树脂直至树脂沉积达5cm高。装柱要求连续，均匀，无文格、无气泡，表面平整，液面不得低于树脂表面，否则要重新装柱。 4、平衡 层析柱装好后，接上已调好流速的恒流泵，用洗脱液以0.4mL/min的流速进行平衡，直到流出液的pH与洗脱液pH相同（约需2~3倍柱床体积）。5、加样