发酵工艺原理（发酵工程）讲义
王莘
2012.8.20
第一章绪论
发酵工业应用：
生物生物学
一、发酵定义：
从工业微生物角度的发酵：利用培养微生物来获得产物的有氧或厌氧的任何过程，现在有扩大到培养生物细胞（含有动物、植物和微生物）获得产物的所有过程。
从发酵工业角度的发酵：借助微生物在有氧和无氧条件下的生命活动来制备微生物体本身，或共同直接代谢产物或次级代谢产物的过程统称为发酵。
传统发酵：酱油、醋、酒、长毛豆腐。
新兴发酵：有机酸、酶制剂、抗生素。
发酵工业的划分：食品工业（酿造工业）和非食品工业（发酵工业）
发酵工业：利用生物的生命活动生产的酶对无机或有机原料进行酶加工获得产品的工业。二、发酵工业具备的条件：
①要有某种适宜的微生物。
②要保证或控制微生物进行代谢的各种条件（培养基组成，温度，溶氧浓度，酸碱度等）。
③要有进行微生物发酵的设备。
④要有将菌体或代谢产物提取出来精制成产品的方法和设备。
三、发酵工业的改革
1．天然发酵阶段
特点：1）家庭作坊式生产；2）容易感染细菌；3）厌氧发酵；4）非纯种培养；
5）凭经验传授技术；6）产品质量不稳定。
2．纯培养技术的建立阶段
纯培养阶段特点：（1）．多为好氧产品；（2）、均为表面培养；（3）、产品生产过程简单；（4）、设备要求不高；（5）、生产规模不大。
3．通气搅拌发酵技术的建立阶段
第二次世界大战爆发，1929年英国人费莱明发现青霉素，迅速形成工业大规摸生产。
1940年英国人费洛里精制分离青霉素医治战伤药物。
发酵工业新篇章：
发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素→抗菌素发酵工业→氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）→基因工程菌→动物细胞大规模培养→植物细胞大规模培养→藻类细胞大规模培养→转基因动物。
发酵工程产业化发展：
发酵工程技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力，涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题。
细胞大规模培养技术：
细胞大规模培养──微生物、动植物细胞、藻类细胞等
4．代谢控制发酵技术
5．开拓发酵原料时期
6．基因工程阶段
四、发酵工业的范围：
现代发酵工业涉及领域按微生物发酵产品的性质分为以下几个方面。
1．微生物菌体发酵
2．微生物酶发酵：
3．微生物代谢产物发酵
4．微生物的生物转化发酵：
生物转化与化学反应相比优点：反应条件温和，对环境无污染。
5．微生物特殊机制的利用
（1）利用微生物消除环境污染环境恶化
（2）利用微生物发酵保持生态平衡
（3）微生物湿法冶金：
（4）利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域
五、发酵工业的特点
1.发酵原料的选择
2.微生物菌种得选育及扩大培养
3.发酵设备选择以及工艺条件控制
发酵工艺控制关键：发酵全过程的无菌状态的保持，防杂菌污染，设备冲洗，培养基灭菌，空气过滤。
4. 发酵产物的分离提取
5.发酵废物的回收和利用
第二章发酵培养基
第一节培养基的类型及功能
培养基：是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。（人工配制的含有营养物质的供微生物生长的介质。）
发酵培养基作用：满足菌体生长+促进产物形成。
一、培养基的营养成分及来源
1、能源
2、碳源
3、氮源
4、有机盐
5、特殊生长因子
二、培养基的类型和用途
1、按物质来源分：自然培养基（化学成分不清楚，异养微生物完全培养基）、合成培养基（化学成分和数量已知配制，实验室用生长慢）、半合成培养基（天然碳、氮、生长因子和化学药品，多数微生物使用）
合成培养基：由已知组成成分的各种营养物质组合的培养基叫合成培养基。
复合培养基（天然+半合成）：由一些组成成分不完全明确的天然有机物与一些无机盐组合的培养基。
2、按物理性状态分：固体培养基、半固体培养基、体培养基
固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产。
半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%～0.8% ,主要用于微生物的鉴定。
液体培养基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。
3、按生产工艺用途分：从发酵生产应用考虑）
孢子培养基、种子培养基、发酵培养基，工业中常用种子和发酵培养基用生产。
（1）孢子培养基：供制备孢子用的。
孢子：某一生长阶段中，在营养细胞内形成一个圆形，卵圆形或圆柱形的休眠体叫孢子。
（2）种子培养基：供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。
（3）发酵培养基：是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。
三、发酵培养基的选择：
培养基供菌生长、繁殖、代谢、合成产物的营养物质。培养基成分和配比的适合与否影响菌的生长代谢，对产物的工艺质量和产量影响大。
1、选择和培植发酵培养基对应考虑的基本原则：
（1）、必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。
（2）、有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。（3）、有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。
（4）、有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。
（5）、尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。
（6）、原料价格低廉，质量稳定，取材容易。
（7）、所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。（8）、有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。
2、工业化发酵培养基选择步骤：
（1）、了解菌种来源、生活习惯，理化特性和营养要求。
（2）、了解生产菌种的培养条件、生物合成代谢途径、代谢产物化学性质、结构、工艺、产品质量要求。
（3）、选化学合成培养基进行摇瓶试验→每小发酵罐培养，氮、碳产物代谢能力情况的摸索，选择适宜的pH值。
（4）、确定培养基配比→确定金属（非）离子的影响→无机要素营养要求，按高低、适中进行确定→做复合培养基试验→做发酵条件与培养基关系试验→用碳酸钙调pH值→中间补料法控制碳、氮、养料、前体类物质代谢→引导发酵向合成产物的途径发展。
四、配制工业发酵培养基的一般要求：
1、营养物组成较丰富，浓度适当，能满足菌丝体菌种发芽和生长繁殖成大量具有生理功能的需要（产物合成潜力提高）
2、在一定条件下，各种原材料彼此不产生化学反应，理化性相对稳定。
3、粘度适中，渗透压适当。
4、原材料品种及浓度对代谢产物生物合成过程要有利于主产物的生物合成，高产率维持时间长，副产物合成率要降至最低。
5、不影响发酵过程的通气和搅拌，便于产物的分离纯化。
6、原材料尽量选质优价廉、成本低。
第二节发酵培养基的成分及来源
培养基原料：C（50%）、N、无机盐、微量元素、水、生长因子、前体。
一、碳源：（微生物自身细胞物质、糖类、脂、蛋白质等和能源构成菌体的主要元素及各代谢产物的主要原料。）
定义：凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称碳源。
功能：提供能量的重要元素。
碳源：糖（碳水化合物）、脂肪、有机酸、醇、碳氢化合物（烃类）
1、碳水化合物（糖类）
（1）单糖：葡萄糖（实验室培养基）
所有的微生物都能利用葡萄糖；但是会引起葡萄糖效应；工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标；
糖蜜：
糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。
糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。
糖蜜使用的注意点：
除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。
（2）双糖：乳糖、麦芽糖、蔗糖
（3）多糖：糊精、淀粉及其水解液，工业化过程常用淀粉水解物酶法水解为发酵糖。（4）淀粉、糊精：
使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类
缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。
优点：来源广泛、价格低，可以解除葡萄糖效应
2、脂肪：霉菌和放线菌利用油脂作碳源，其具有消沫和补充碳源的双重作用。
3、无机酸、醇：在单细胞蛋白、氨基酸、维生素、抗生素发酵中作碳源和补充碳源。
4、碳氢化合物（烷烃）：微生物表面糖脂吸收系统乳化后利用碳。
二、氮源（细菌、酵母菌氮含量大，霉菌含蛋量低，—NH2基存在不提供能量）：指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营养物质。
1、主要功能：构成微生物细胞和含氮的代谢产物，补充碳源，是细胞合成蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸及抗生素等重要代谢物成分。
2、有机氮源（有碳有氮）：含有蛋白质、肽类、游离氨基酸、糖类、脂肪、无机盐、生长因子。微生物对这类氮源的利用具有选择性。土霉素生产中玉米浆和氨基酸的利用率增加；选择有机氮时要注意品种、产地、加工方法对质量的影响。
3、有机氮源：氨基酸、蛋白质水解物及尿素。
4、无机氮源（无碳有氮）：铵盐、硝酸盐及氨气、氯化铵。
5、实验室用培养基氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等蛋白水解物。
6、工业化生产常用氮源：硫酸铵、尿素、氨水、黄豆粉、花生粉、鱼粉、棉籽粉、玉米浆、酒精水及屠宰场废水等。
氮源使用的一些相关问题：
有机氮源和无机氮源应当混合使用；早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源；
中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质；有些产物会受氮源的诱导和阻遏
例：蛋白酶的生产
有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力；
开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴的课题；
三、无机盐和微量元素
1、定义：是微生物代谢所需的重要物质。
2、功能：构成菌体成分，作为酶的辅基或激活剂，调节微生物体内氧化还原电位、pH值及维持渗透压。无机元素对菌体生长的影响：
浓度降低→促进生长；浓度提高→抑制生长
3、无机盐：磷酸、硫酸盐、氯化物、钠、钾、钙、镁、铁。
4、微量元素：一般参与酶的组成或使酶活化。微量元素缺乏，导致细胞生理活性下降，甚至停止生长。
P：构成菌体核酸、核蛋白及磷脂成分，组成高能磷酸化合物及许多酶的活性基，参与氧化磷酸化反应必须元素。
Fe：是细胞色素及其氧化酶的激活剂。
Zn（脱氢酶）、Mg（糖化酶）、Co（B2辅酶）：是某些酶的辅酶或激活剂。
Na：维持细胞渗透压。
K：影响细胞膜透性。
Ca：调节细胞透性作用。
使用注意事项：
1、对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子
青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml 发酵罐必须进行表面处理
使用时注意盐的形式（pH的变化）
例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响
pH 酶活
不加 4.25 120分钟
加K2HPO4 5.45 30分钟
加KH2PO4 4.62 75分钟
四、生长因子、消沫剂、前体和产物促进剂
1、生长因子：微生物生长必需而少量的，自身不能合成或少量合成，以满足机体生长需要的有机化合物，如维生素。
功能：构成辅酶的组成部分，促进生命活动进行。如维生素B族是各种酶的活性基的组成部分，没有维生素B，E就不能活动。
有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。
2、消沫剂：工业化生产中消除发酵中产生的泡沫，防止逃液和染菌，保证生产的正常运转。常用的消沫剂：植物油、动物油、高分子化合物。
3、前体：在产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质称为前体。前体可自身合成（缬氨酸、半胱氨酸→青霉素合成时用）；外源性前体（苯乙酸→青霉素G）
青霉素：分子量356 苯乙酸:分子量136
作用：前体有助于提高产量和组份
用法：前体使用时普遍采用流加的方法
前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前体的转化率4、产物促进剂
所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。促进剂提高产量的机制尚不清楚。
有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；
五、水：是培养基的主要组成成分，是构成菌体细胞的主要成分，是营养物质传导介质。功能：水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的，并且水直接参与代谢作用中的许多反应。
对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。
水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。
对于酿造行业，水的重要性不言而喻。
对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。
六、影响培养基质量的因素
工业发酵过程中，生产水平波动大，菌体代谢异常等现象。
1、原材料质量的影响
2、水质的影响
3、灭菌的影响
4、其他影响因素
第三节发酵培养基的设计和优化
一、培养基成分选择的原则
菌种的同化能力、代谢的阻遏和诱导100∶0.2～2.0、合适的C、N比、pH的要求
二、培养基实验设计：
培养基成分的含量最终都是通过实验获得的；
合理的实验方法：多因子实验；
多因子实验：均匀设计、正交实验设计、响应面分析等；
在筛选培养基中使用的原材料种类和浓度配比时，经常采用的方法：单因子试验法、正交试验设计和均匀试验设计。
1、单因子试验法：适用培养基组成和单一营养成分的选择（费时，准确性低）
2、均匀试验法：试验点均匀分散特点，实验组数与因素的水平数相同，试验结果分析采用计算机对试验数据进行多元回归系统处理，求得一回归方程→定量预测最优的条件和结果，最佳培养基组成和浓度→由菌种的生长情况、C/N代谢规律、pH值变化、产物合成速率决定。
3、正交试验设计:是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。
三、培养基设计的步骤
①根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑；
的问题，初步确定可能的培养基成分；
②通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；
③当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。
例1：类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化原培养基:
初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)
通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)
考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源
进一步：乙酸钠的浓度2%比较好
结果：碳源：乙酸钠0. 2%；氮源：氯化铵0.2%；酵母膏0.03%；无机盐: 复合无机盐0.05%
例2：正交设计确定优化的配方
例3：发酵培养基
改进后培养基的发酵结果；摇瓶水平到反应器水平的优化配方；
摇瓶、反应器培养基研究的两个层次；
摇瓶——培养基设计的第一步；反应器—最终的优化的基础配方
第三章工业发酵的染菌及灭菌
第一节发酵染菌的危害
发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。
所谓“杂菌”，是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。
几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。
一，染菌对不同品种发酵的影响
青霉素；疫苗；柠檬酸；谷氨酸；肌苷、肌苷酸；酶制剂
二，不同种类的杂菌对发酵的影响
青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大；
链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大；
四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大；
柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌；
肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大；谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体；
高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大；
三，不同染菌时间对发酵的影响
种子培养期染菌、发酵前期染菌、发酵中期染菌及发酵后期染菌。
四，不同染菌途径对发酵的影响
种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性；
空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐；
培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性；
设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大；
五，染菌对产物提取和产品质量的影响
对过滤的影响：
发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度增加；造成的后果：过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率；
对提取的影响
有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开。
离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量。
对产品质量的影响
对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。
六，染菌对三废处理的影响
使过滤后的废菌体无法利用；
发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加三废治理费用和时间
第二节发酵过程中染菌的检查判断
一、染菌的检查与判断
目前生产上常用的杂菌检查方法有：
①显微镜检查：染色；镜检
②平板划线检查：
到平板→空培养→待测样品划线→培养观察。
③酚红肉汤培养检查：
无菌肉汤培养基空培养→接入样品→培养观察
1、显微镜检查（镜检）：革兰氏染色法
2、平板划线培养或斜面培养检查法
3、肉汤培养检查法
判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据
无菌试验的目的：
1，监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底；
2，监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入；
3，了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角；
二，各种检查方法的比较
显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜检取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌。
平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，而且结果也更为准确；
三，杂菌检查中的问题
检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为主要根据；
平板划线和肉汤培养应做三个平行样；要定期取样；
酚红肉汤和平板划线培养样品应保存至放罐后12小时，确定为无菌时方可弃去；
取样时防止外界杂菌混入的措施；
表4-1
四，发酵异常现象判断是否染菌
除了以上的方法外，在实际生产中还可以根据以下参数的异常变化来判断是否染菌
溶解氧、pH值、尾气中CO2含量
1、发酵异常现象判断是否染菌：溶解氧、pH、二氧化碳含量及菌体酶活力。
溶氧浓度（谷氨酸发酵时）
谷氨酸发酵时止常利J异常的溶解氧曲线
——正常发酵溶解氧曲线；‥‥‥异常发酵溶解氧曲线；
－·－·一异常发酵光密度曲线
发酵初期：菌体适应期→溶氧浓度不变→耗氧量↓染好氧杂菌→溶解氧↓接近于0 发酵中期：菌体对数生长期→溶氧浓度↓→耗氧量↑染厌氧杂菌→溶解氧↑→耗氧量↓发酵后期：菌体衰老期→溶氧浓度↑→耗氧量↓
2）二氧化碳的含量
杂菌染菌→糖耗↑二氧化碳含量↑；噬菌体染菌→糖耗↓二氧化碳含量↓
耗气性发酵排气中二氧化碳含量与糖代谢有关。
第三节发酵染菌和染菌原因分析
一、发酵染菌率
发酵染菌率：定义：指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。
总染菌率（一年内）= 发酵染菌批数/ 总投料批数×100%
发酵染菌率以发酵罐染菌批（次）为基准，染菌罐批（次）应包括染菌重消后的重复染菌的罐批（次）在内。
设备染菌率：统计发酵罐或其他设备的染菌率，有利于查找因设备缺陷而造成的染菌原因不同品种发酵的染菌率：统计不同品种发酵的染菌率，有助于查找不同品种发酵染菌的原因。不同发酵阶段的染菌率：将整个发酵周期分成前期、中期和后期三个阶段，分别统计其染菌率。有助于查找染菌的原因。
季节染菌率：统计不同季节的染菌率，可以采取相应的措施制服染菌。
操作染菌率：统计操作工的染菌率，分析染菌原因，考核操作工灭菌操作技术水平。
二、发酵染菌和染菌原因分析
避免在发酵生产中污染杂菌应以预防为主。“防重于治”，事前防止胜于事后挽救。如果一旦发生染菌现象就要尽快找出原因及时纠正、堵塞漏洞才能减少损失，并从中吸取经验教训，避免以后有类似情况发生，保持生产的正常进行。但在发酵生产中，往往因为生产过程的环节很多，同时各工厂的生产设备、产品种类和管理措施不尽相同，引起染菌的原因比较复杂，有时不能及时找出而耽误了生产。
1、国外一抗生素发酵染菌原因的分析
2、国内一制药厂发酵染菌原因的分析
3，从染菌的规模幅度来分析染菌原因
大批（多个）发酵罐染同一种菌：空气系统问题
部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的
个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象
个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。
4，从染菌的时间来分析
发酵前期：种子、无菌空气、培养基、设
备灭菌不彻底、接种操作不当、设备或管道有死角。
发酵后期：中间补料、操作不合理问题、设备渗漏。
5，从染菌的类型来分析
浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌) ：发酵罐的冷却管、夹套渗漏或水污染。
耐热性芽孢杆菌：死角、培养基、设备灭菌不彻底。
球菌、酵母、不耐热无芽孢杆菌：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的、种子带菌、设备渗漏、操作问题。
霉菌：无菌室及灭菌不彻底或操作不严格问题
第四节发酵杂菌污染途径及防止
一、种子带菌的原因及防止
1、种子带菌原因问题
培养基及用具灭菌不彻底，灭菌温度达不到要求。
菌种在移接过程，操作和管理不当。
菌种在培养过程或保藏过程中外界空气和杂菌进入（试管有长度、
紧度，应恒温，严检）
④无菌室的无菌条件不符合要求。
2，种子带菌的防止
种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。
（1）无菌室
无菌室的基本要求：
无菌室面积不宜过大，一般约4—6米2高约2．6米。
为了减少外界空气的侵入，无菌室要有1—3个套间(缓冲过道)
无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成形。
室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。
无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。
化学灭菌药剂：用作喷洒或揩擦的(以揩擦为主) ：
75%酒精;0.25%新洁而灭(季胺盐)；0.6~1%漂白粉；0.5%石炭酸；0.5%过氧乙酸；1%煤酚皂(来苏尔)；0.5%高锰酸钾；300单位／毫升土霉素；50单位／毫升制霉菌素等。
用作熏蒸：甲醛(每立方米空间约用10毫升)或硫磺(每立方米空间约用2-3克)。
（2）培养基要求无原料性状（颗粒、结块等）及原料无发霉变质现象出现。
（3）种子培养基灭菌灭菌操作时需要注意排气管是否畅通；固体培养基可采用两次灭菌的方法；通入蒸汽后使瓶内培养基温度达到121oC所需的时间与瓶内培养基的体积有关。
二、设备灭菌不彻底：
1、实罐灭菌未充分排除罐内空气，造成“假压”，使罐顶空间局部温度达不到要求→开排气阀使蒸汽透过所有管线彻底灭菌。
2、培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，达不到灭菌温度→自控装置。
3、设备管道存在“死角”，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定到达的局部灭菌部位→形成不彻底灭菌部位“死角”。
4、设备渗漏引起染菌及防止：砂眼（腐蚀）裂缝（振动）→选优质材料。
5、操作问题：移料+罐压=0，外界空气进入+泡沫顶盖+压缩空气压力突降+发酵液倒流入空气过滤器→高度责任心+管理+高素质。
三、发酵设备、管件的渗漏与配置
设备和管件的渗漏一般是指设备和管件由于腐蚀、内应力或其他原因形成微小漏孔所发生的渗漏现象。这些漏孔很小，特别是不锈钢材料形成的漏孔更小，有时肉眼不能直接觉察，需要通过一定的试漏方法才能发现。
1，设备渗漏的原因
发酵液中腐蚀性物质对设备的腐蚀；
设备加工不良；弯管时，弯头处管壁变薄；焊接不良；
2，盘管渗漏的防止
放罐后要认真清洗发酵罐；控制冷却水质量，降低其中氯离子含量；对盘管定期检查、试漏，及时发现漏隙；
3，空气分布管渗漏的防止
空气带菌：空气净化设备、流程、过滤介质选用和装填、介质灭菌管理等。
4，罐体渗漏的防止
5，管件的渗漏
与发酵罐相连接的管路很多，有空气、蒸汽、水、物料、排气、排污等管路，管路多，相应的管件和阀门也多。管道的连接方式、按装方法以及选用的阀门形式对防止污染有很大的关系。所以，与发酵有关的管路不能同一般化工厂的化工管路完全一样，而有其特殊的要求。
四、发酵罐与管件的死角
所谓死角是指灭菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。发酵罐及其管路如有死角存在，则死角内潜伏的杂菌不易杀死，会造成连续染菌，影响生产的正常进行。1，法兰连接的死角
发酵工厂的有关管路要保持光滑、通畅、密封性好，以避免和减少管道染菌的机会。例如法兰与管子焊接时受热不匀使法兰翘曲密封面发生凹凸不平现象就会造成死角(图7—8c)。垫片的内圆比法兰内径大或比较小以及安装时没有对准中心也会造成死角(图7—8a、b)。
2，渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角3，不锈钢衬里的死角
4，接种管路的死角
采用种子罐时是利用压力差将种子罐中培养好的种子输入发酵罐内，种子罐与发酵罐的一段连接管路的灭菌是与发酵罐的灭菌同时进行的。如下图所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角，所以应在阀1的半截上装设旁通，焊上一个小的放气阀，此段管路即可得到蒸汽的充分灭菌。
5，排气管的死角
罐顶排气管弯头处如有堆积物，其中窝藏的杂菌不容易彻底消灭，而当发酵时受搅拌的震动和排气的冲击就会一点点地剥落下来造成污染。另外排气管的直径太大，灭菌时蒸汽流速小也会使管中部分耐热菌不能全部杀死。所以排气管要与罐的尺寸有一定比例，不宜过大或过小。
6，不合理补料管配置造成的死角
7，压力表安装不合理形成的死角
五、染菌后的挽救措施
种子培养或种子罐中发现污染。
发酵早期染菌可以适当添加营养物质，重新灭菌后再接种发酵。
中后期染菌，如果杂菌的生长将影响发酵的正常进行或影响产物的提取时，应该提早放罐。有些发酵染菌后发酵液中的碳、氮源还较多，如果提早放罐，这些物质会影响后处理提取使产品取不出，此时应先设法使碳、氮源消耗，再放罐提取。
有时发酵罐偶而染菌，原因一时又找不出，一般可以采取以下措施：
(1)连续灭菌系统前的料液贮罐在每年4~!10月份(杂菌较旺盛生长的时间)加入0.2%甲醛，加热至80°C，存放处理4小时，以减少带入培养液中的杂菌数。
(2)对染菌的罐，在培养液灭菌前先加甲醛进行空消处理。甲醛用量：0.12~0.17L/m3罐体积。
(3)对染菌种子罐罐内放水灭菌，灭菌后水量占罐体的2/3以上。细菌芽孢较耐干热而不耐湿热的缘故。
六、制服染菌对发酵过程的要求
1、对空气净化系统的要求。
2、对蒸汽要求。
3、对设备的要求。
4、对工艺的要求。
第五节灭菌
培养基+设备+空气→灭菌→防止发酵过程染菌+保证生产。
染菌：营养物质消耗+抑制产生菌生长+改变培养液性质+产生破坏代谢产物的酶类。
一、灭菌的方法
灭菌：指用化学的或物理学的方法杀灭或除掉物料或设备中所有的有生命的有机体的技术或工艺过程。
工业常用的灭菌方法：化学物质灭菌；热灭菌；辐射灭菌；过滤介质除菌。
（一）、消毒和灭菌的区别：
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。（杀死引起感染的微生物）或（用物理、化学方法除去表面的致病微生物）
灭菌：用物理、化学方法杀死或除去环境中所有微生物。（杀死一切微生物）
消毒→不一定灭菌（无菌态）；灭菌→无菌态（可消毒）
（二）、常用的灭菌方法
1、干热灭菌法
干热灭菌法一般认为繁殖型细胞在100℃以上干热1小时即被杀死。耐热性细菌芽胞在120℃以下长是时间加热也不死亡，介140℃前后则杀菌效率急剧增长。所以，关于干热灭菌条件，有的药典规定为180℃1小时以上，有的药典规定为160－170℃2－4小时，此仅是大至的标准而已.
2、湿热灭菌
1）湿热灭菌定义：借助蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。
2）优点：①来源容易，操作无毒。②穿透力强，灭菌彻底。③具有很大的潜热，蒸汽冷却的水有利于灭菌。④蒸汽输送可借助于本身的压力。⑤经济快捷。
3）湿热灭菌的原理：在有水分存在的情况下，蛋白质更易受热而发生不可逆的凝固变性。
3、辐射灭菌
1）定义：利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。
2）紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用的波长范围：250—270nm杀菌率高。
3）放射性同位素C O60，密封包装灭菌（产品成品包装的灭菌）
4、化学物质灭菌
1）定义：化学物质用于消毒和防腐。
2）作用：药物易与细胞中的某些成分起化学反应，使蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性而杀灭微生物。
3）适用范围：药残难除，易于蛋白质产生化学反应，不适合培养基灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。
4）化学药品：①高锰酸钾：氧化蛋白质、氨基酸，浓度为0.1~0.25%;
②次氯酸钠（漂白粉）：强烈氧化作用;③75%酒精：细胞脱水作用，使乙醇分子进入蛋白质的肽键空间，引起蛋白质变性或沉淀。范围为皮肤和器具表面杀菌。
④新洁尔灭和杜灭芬：阳离子表面活性剂与微生物菌体表面结合，引起菌外膜损伤和蛋白变性。对芽孢无灭菌作用。范围：器具和环境。使用浓度：0.25%（5%加水稀释20倍）。
⑤甲醛：还原作用杀菌，与蛋白质氨基结合使其变性。
37%甲醛溶液称为福尔马林。范围：无菌室和车间空间消毒。
⑥戊二醛：应用广泛，使用范围为碱性条件下杀死孢子，浓度为2%。范围：器具和仪器。
⑦过氧乙酸：强氧化剂，对营养细菌、真菌（孢子）、病毒起作用；杀菌浓度0.01%；无害浓度0.2%；-40℃仍可杀菌，有腐蚀性。
⑧酚类：有毒性，水溶性差，污染环境。浓度为0.1—0.15%，15分钟灭大肠杆菌。
⑨抗生素：抑菌灭菌剂，有选择性（细菌）。
二培养基湿热灭菌
（一）、影响培养基灭菌的因素
1、培养基成分：油脂越高，糖类越高，蛋白质的浓度越高，都会使微生物的耐热性增高。
2、pH值：pH值为6.0—8.0，微生物耐热性好；pH值<6.0↓灭菌时间↓
3、培养基中的颗粒：颗粒越大，灭菌越难，反之，越易。颗粒小于1mm 培养基无影响。
4、泡沫：培养基形成泡沫对灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热量很难穿透去杀灭空气中的微生物。解决办法加消泡剂。
（二）、培养基灭菌方式
1、分批灭菌（实罐灭菌）：将配制好的培养基输入发酵罐内，用直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后，维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺称为分批灭菌或实罐灭菌。
适用于小批量生产，固体颗粒培养基，产泡沫多时采用。
通常必须灭菌条件：110-130℃，5-20分钟，培养液灭菌采用高温短时加热的方式。
2、连续灭菌：培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程称为连续灭菌。
使用于大规模生产、小颗粒液体培养基，产少量泡沫。
利用板式换热器进行连续灭菌的流程图，其流程的能量利用较合理。
三空气除菌
（一）、空气中的微生物：
好氧性微生物的生长繁殖和形成代谢产物都需要消耗氧气。
1、大气空气：尘埃+沙土+各种各样的微生物;
2、空气中悬浮的微生物一般为：103～104个/立方米;
3、空气除菌的目的为除去或杀灭空气中的微生物;
4、空气中的微生物：细菌、细菌芽孢、酵母、霉菌、放线菌及噬菌体。空气在引进发酵罐之前必须进行严格处理，除去其中含有的微生物和其他有害成分;
（二）、空气除菌方法：
1、加热灭菌：可用蒸汽、电能、空气压缩机产生的热量进行灭菌。
2、电除尘：含有灰尘和微生物的空气通过高压气流电场，正极电场强度>1000V/cm2时，气体产生电离，产生的离子使灰尘和微生物等成为载电体，被捕集与电极上。
3、介质过滤除菌：经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌目的。
1）绝对过滤：介质的之间的空隙小于被滤除的微生物，当空气流过介质层后，空气的微生物被滤除。节约能量和时间，操作简便。
微孔滤膜（孔径小于0.5nm）；纤维介质：纤维素膜微孔滤膜
2）深层过滤：以纤维状（玻璃纤维）+颗粒状（活性炭）介质过滤层
用超玻璃纤维，聚乙烯醇等为介质的过滤层
3）影响介质过滤效率的主要因素：颗粒性质、介质性质（介质填充长度L、介质填充密度
ρ和介质纤维直径φ）和气流速度.
4）空气过滤器：
A、纤维状或颗粒介质过滤器：特点：过滤层厚度L↑体积V↑压力降△P↑操作麻烦。
介质：棉花（上下）、玻璃纤维、活性炭（中）
B、过滤纸类过滤器：以微孔滤纸、滤板、滤棒构成的过滤器。
特点：阻力、压力降低，强度下降;介质：超细玻璃纤维、聚乙烯醇制成旋风式或套管式; 5）、空气过滤除菌的工艺流程
空气净化工艺流程图
1．空气吸气口；2粗过滤器；3．空气压缩机；4．一级空气冷却器；STh级空气冷却器；6．分水器；7空气贮罐；8．旋风分离器；9．丝网除沫器；10．空气加热器8 11．总空气过滤器；12分过滤器
无菌空气制备控制要点：①提高空气入口洁净度（加粗过滤和增高吸气口高度）
②防压缩空气中夹带的油水，影响无菌空气质量（压缩机出口空气要升温至120～150℃）
第四章生产菌种的培养与保藏
第一节种子制备的过程（菌种的扩大培养）
种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
种子扩培的目的：接种量的需要；菌种的驯化；缩短发酵时间、保证生产水平。
一、工业对微生物的要求
1、能在廉价原料制成的培养基上迅速生长并生成所需的代谢生产物，产量高。
2、可以在易于控制的培养条件下，迅速生长和发酵，且所需酶活力高。
3、生长速度和反应速度较快，发酵周期短。
4、根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株。
5、选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易感染噬菌体。
6、菌种纯粹，其不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。
7、菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素、毒素等），以保证安全。
二、工业常用的微生物
三、种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段; 生产车间种子制备阶段
实验室种子的制备
实验室种子的制备一般采用两种方式
对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。
四、孢子制备
孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。
（一）放线菌孢子的制备
1、放线菌的孢子培养常采用：琼脂斜面培养基
2、培养基成分要求：C：1%；N：0.5%
C↑→造成生理酸性环境↑→孢子形成↓;N↑→菌丝繁殖↑孢子形成↓
干燥和限制营养是直接或间接诱导孢子形成的原因。
3、放线菌斜面培养：T：28℃；5～14天。
4、放线菌发酵生产工艺过程
5、成分：麸皮、豆汁、蛋白胨、无机盐
（二）霉菌孢子的制备
1、霉菌的孢子培养成分：大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品。
2、霉菌培养条件：T：25～28℃，培养4～14天。
（三）、细菌孢子的制备：
1、细菌的斜面培养基：多采用碳源限量而氮源丰富的配方。C↑N↑→牛肉膏、蛋白胨
2、培养条件：T多37℃；T少28℃；培养1～2天；产孢5～10天
五、种子制备
生产车间种子制备：
实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
1、一级种子：孢子（或摇瓶菌丝）被接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子。
2、二级种子：把一级种子转入到体积较大种子罐内发酵，经培养后形成大量菌丝，这样的种子称为二级种子。
3、二级发酵：把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。
4、三级发酵：把二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。（50吨罐）
5、种子罐的作用：
主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。
6、种子罐级数：决定菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。
种子罐级数取决于：
①种子的性质（生长繁殖性能）；②孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）；③孢子发芽及菌丝繁殖速度；④发酵罐中种子的最低接种量；⑤种子罐与发酵罐的容积比；
细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。
茄子瓶→种子罐→发酵罐
霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵
孢子悬浮液→一级种子罐（27?C,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27?C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐
放线菌：生长更慢，采用四级发酵
酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子
7、确定种子罐级数需注意的问题：
种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会
种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会
虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
8、种子制备的目的：形成一定数量和质量的菌体。
9、发酵目的：获得大量发酵产物。
六、种子扩大培养
1、菌种扩大培养的目的：就是要为每只发酵罐的投料，提供相当数量的代谢旺盛的种子。
2、种子扩大培养的任务：不但要得到纯而壮的培养菌，而且要获得活力旺盛，足够量的培养物。
七、工业微生物的培养类型
1、工业微生物的培养方法：静置培养、通气培养
静置培养法：将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行发酵，又称为嫌气性发酵。
通气培养法：其生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌属多，它的生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。
2、种子扩大培养阶段
1)液体培养法：试管+摇床;2)表面培养法：茄子瓶、克氏瓶、瓷盘;3)固体培养法：三角瓶、培养皿;
A、固体培养：
曲法培养：浅盘固体培养和深层固体培养（固体曲霉活性高）
深层固体通风制曲：在曲房周围用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温度和湿度，灵活调节适应菌种不同的生理需要。
B、液体深层培养：由罐底部通气搅拌培养，相当于由气、液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养为深层培养。
特点：容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基中氢离子浓度等条件选择最佳培养条件。（好气性发酵采用此法）
C、载体培养：以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类固态基质作为微生物生长的载体，营养成分可严格控制，发酵结束只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。载体要求：材料耐蒸汽加热、药物灭菌、多孔结构有足够表面积，可允许空气流通。
D、两步法液体深层培养：应用于酶制剂，氨基酸生产
氨基酸两步法：
第一步：菌种+培养基→有机酸或氨基酸发酵
第二步：在某种酶作用下，把第一步产物转化为所需的产物氨基酸（酶转化法）
第二节种子质量的控制
种子质量影响发酵水平。种子质量的优劣取决菌种本身的遗传特性和培养条件。
一、影响孢子质量的因素及其控制
（一）培养基
培养基是微生物获得生存的营养来源，对于微生物生长繁殖，酶的活性与产量都有接的影响。生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。（二）培养温度及湿度
1、温度
T↑→菌体代谢活动↑→培养时间↓
温度对微生物影响，因菌体表面作用的热平衡关系，热传递至菌体内，对菌体内部所有的结构物质都有作用。生命活动进行的酶反应和生化反应都和温度有关。
T=T最适菌体生长↑T>T最高生长→菌体死亡T 大多数微生物最适生长温度：25～37℃ 2、湿度： 空气相对湿度↑培养基水分蒸发↓→影响菌体生长 北方相对湿度40%～45% ，南方相对湿度35%～42%→孢子质量好↑ 真菌对湿度要求↑放线菌对湿度要求↓ （三）培养时间和冷藏时间 1、孢子培养时间 孢子培养工艺：选择孢子成熟阶段时终止培养 孢子培养时间：应控制在孢子量多，孢子成熟，发酵产量正常的阶段终止培养。 2、孢子的冷藏时间： 孢子冷藏时间→影响孢子质量;冷藏时间：要短不应长 （四）接种量 对生长期接种→发酵周期↓→产量↑ 接种量↑→生产过程↓短→发酵周期↓短→设备利用率↑→代谢产物↑多→动力消耗↓少接种量↓→生产过程↑长→发酵周期↑长→代谢废物↓少→设备利用率↓→动力消耗↑多 二、影响种子质量的因素及其控制 1、培养基 发酵工程重点 ————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期： 啤酒 啤酒概念：啤酒是以优质大麦芽为主要原料，啤酒花为香料，经过制麦芽、糖化、发酵等工序制成的富含营养物质和二氧化碳的酿造酒。 啤酒的分类 1、据工艺分类 可分两大类： 以德国、捷克、丹麦、荷兰为典型的下面发酵法啤酒； 以及以澳大利亚、新西兰、加拿大等的上面发酵法啤酒。 2、根据是否巴氏灭菌 分为：生啤酒/熟啤酒 3、根据麦芽度 可分为：8o啤酒/10o啤酒/12o啤酒/14o啤酒/18o啤酒 4、根据色泽 可分为：黑啤酒/黄啤酒/淡色啤酒 啤酒作用：含二氧化碳，饮用时有清凉舒适感，促进食欲。 啤酒花含有蛋白质、维生素、挥发油、苦味素、树脂等，具有强心、健胃、利尿，镇痛等医疗效能，对高血压病、心脏病及结核病等均有较好的辅助疗效。产妇喝啤酒，以增加母体乳汁，使婴儿得到更充分的营养。 适量饮用啤酒对心脏和高血压患者亦有一定疗效。 啤酒是夏秋季防暑降温解渴止汗的清凉饮料，据医学和饮料专家们研究，啤酒含有4%的酒精，能促进血液循环。过度饮用冰冻啤酒伤脾胃，加重体内湿气，影响健康。 啤酒酿造对大麦质量的要求 1．感官 （1）色泽：良好大麦有光泽，淡黄；受潮大麦发暗，胚部呈深褐色；受霉菌侵蚀的大麦则呈灰色或微兰色 （2）气味：良好大麦具有新鲜稻草香味 （3）谷皮：优良大麦皮薄，有细密纹道 （4）麦粒形态：以短胖者为佳 （5）夹杂物：杂谷粒和沙土等应在2%以下 2．物理检验 （1）千粒重：以无水物计千粒重应为30~40g （2）麦粒均匀度：按国际通用标准，麦粒腹径可分为2.8、2.5、2.2mm三级 （3）胚乳性质：胚乳断面可分为粉状、玻璃质和半玻璃质三种状态 3．化学检验 （1）水分：原料大麦水分不能高于13%，否则不能贮存，易发生霉变，呼吸损失大（2）蛋白质：蛋白质含量一般要求为9~12%，蛋白质含量高，制麦不易管理，易生成玻璃质，溶解差，浸出物相应的低，成品啤酒易浑浊 （3）浸出物：间接衡量淀粉含量的方法，一般为72~80% 4．酿造大麦的质量标准：1986年正式制定和通过了啤酒大麦国家标准，编号为QB—1416—87 《发酵工程》课程教学改革与实践 摘要：《发酵工程》课程是生物工程专业的一门核心课，该课程内容丰富、涉及面广、实践性强。针对课程的特点，从教学内容整合、教学手段优化和教师素质提高，以及实践教学体系的建立等方面思考与探索该课程教学思路，提高学生学习本门课程的积极性和实践能力，获得了良好的效果。 关键词：发酵工程教学改革实践教学 中图分类号：G642 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）04（a）-0140-02 生物技术是当前世界最前沿的科学技术，目前正以前所未有的深度和广度迅速发展。发酵工程在生物技术中扮演着产业化的关键角色。生物技术的迅速发展对科学技术人才的培养提出了更高的要求，需要具有扎实的理论基础、又有一定的实践技能的高素质人才。《发酵工程》生物工程和生物技术专业的一门核心课，在专业课程体系中起着承上启下的作用，其教学体系的合理编排和设置对生物工程专业的人才培养起着至关重要的作用。我们仅就14年来的《发酵工程》授课实践，结合其他兄弟院校的教学经验谈谈感悟。 1 精选教学内容，整合课程体系 1.1 精选教学内容 河南科技学院（后简称我校）生物工程专业的《发酵工程》课程是在修完微生物学、生物化学和化工原理等课程之后，本科三年级第一学期开设，与《生物分离工程》、《生化工程》和《生物工程设备》同期开设，《酶制剂》、《酒类工艺学》和《生物制药》等专业课程在其后开设。生物工程各专业核心课程之间的知识具有较高关联性，教学过程中避免与其它课程交叉重复。我校每四年进行一次本科培养方案的修订，在参与的制定2005年、2009年和2013年新修订的教学大纲中，《发酵工程》课程的课时由72学时不断被压缩为现在的48学时。如何在有限的课时内使学生掌握发酵工程最基本的内容，提高他们在实践中分析问题、解决问题的能力，并为今后的发展打下坚实的基础，是《发酵工程》教师需要认真思考的问题。我们的《发酵工程》授课内容提炼为：以发酵工业过程共性环节为主线，按照发酵工艺过程串联为菌种―培养基―种子扩培―发酵过程控制一条主线。发酵工程的教学中还应对发酵企业经济效益的评价方法和体系进行分析和阐述；同时经济学的知识和理论体系比较宽泛，只需结合发酵工厂的实际有选择地讲授，做到重点突出，详略得当。 基于此将发酵工程教学内容从章节编排上为：绪论（2学时），工业微生物（4学时），微生物发酵机理（4学时）， 发酵工程与设备实验 1.决定摇瓶溶氧量的因素有哪些？它们如何影响摇瓶溶氧量？答：⑴摇瓶的透气性：8层纱布，纱布透气性越好，摇瓶溶氧量越大。⑵摇瓶的转速：转速越大，培养基流动越剧烈，增大与气体接触面积。⑶培养基的粘稠度：粘稠度越大，氧气越难进入，溶氧量越低。 2.采用磷钼蓝法测定发酵液中的植酸酶活性实验中，空白对照中并未发生酶和底物的水解反应，但经过显示后，颜色却呈较深的蓝色，试解释其原因。 答：①磷钼蓝受热，易被氧化成蓝色还原物。②植酸钠中含杂质磷太多。 3.红曲米发酵实验中，为何要添加酸水？无菌酸水如何制得？答：是为了洗脱菌种，同时为红曲霉生长创造酸性环境。 制备：取一烧杯的蒸馏水，往水中加入乳酸并调PH至4.0.然后取10ml配制好的溶液于干净的试管中，密封包扎后，放入高压灭菌锅灭菌，即可得到无菌酸水。 4.产植酸酶黑曲霉的分离实验中，为何选用植酸钙而不选用植酸钠？ 答：钠盐易溶解、钙盐难容，易形成透明圈，从而筛选。 5.产植酸酶黑曲霉的分离实验中，为什么不将脱氧胆酸钠溶液 和氯霉素眼药水加入到筛选培养基中一起灭菌？ 答：①脱氧胆酸钠会与铁盐高温时反应。②细菌性抗生素、自身就是杀菌的，且本身无菌，也不能灭菌。 6.请详细说明产植酸酶黑曲霉的分离实验的实验原理。 答：以植酸钙为唯一磷来源的选择培养基，同时以透明圈法，从土壤中分离筛选产植酸酶的黑曲霉 7.产植酸酶黑曲霉的摇瓶发酵实验中，摇瓶的作用有哪些？答：①气体和营养分布均匀②温度保持恒定③代谢产物分散④避免影响其他菌丝生长⑤防止细胞沉淀 8.植酸酶酶活力测定实验中，若显色后的反应体系测定吸光度值为2.23，说明什么问题？该如何调整实验方案？ 答：浓度过大，该稀释。 9.植酸酶活力测定时做标线的目的是什么？ 答：标线是反应吸光度与无机磷浓度之间的关系，待我们测的样品吸光度后即可在标线上读出对应无机磷浓度，从而进行酶活计算。 10.简述灭菌锅的使用方法及步骤。 答：①向锅内注入水至三脚架上边缘、预热。 ②放入物品，将直排气管并放入排气槽。 ③关盖，拧紧对应螺栓，打开开关加热 ④待压力达到0.05MPa，排冷空气，归零。 ●发酵工程：以微生物、动植物细胞为生物作用剂进行工业化生产的工程，包括发酵工艺和发酵设备。 ●主要研究内容：菌种选育与构建、大规模培养基和空气的灭菌、大规模细胞培养过程、细胞生长和产物形成动力学、生物反应器的优化设计和操作、发酵产品的分离纯化过程中的技术问题等。 ●发酵工程原理：指导发酵产品研究与开发，发酵工厂设计与建设以及发酵生产实践的理论。 ●初级代谢：是许多生物都具有的生物化学反应，蛋白质、核酸的合成等，均称为初级代谢。 ●初级代谢产物：指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、多糖等。 ●次级代谢：微生物以初级代谢产物为前提合成的对微生物本身的生命活动没有明确功能的物质的过程。 ●自然选育：不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程。 ●杂交育种：将两个基因型不同的菌株经吻合使遗传物质重新组合，分离和筛选具有新性状的菌株。 ●诱变育种：利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显着提高的基础上，采用简便、高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的 的突变株，以供科学实验或生产实践使用。 ●原生质体融合育种：两个亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两个亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。 ●前体：某些化合物加入发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物中去，而自身结构并没有明显变化，产物的产量却因前体的加入而有较大的提高。 ●抑制剂：某些化合物可以抑制特定代谢途径的进行，使另一种代谢途径活跃，获得人们所需产物的积累。 如生产甘油加抑制剂亚硫酸钠，它与代谢过程中的乙醛生成加成物。这样使乙醇代谢途径中的乙醛不能成为NADH 2(还原型辅酶I)的受氢体，而使NADH 2在细胞中积累， 从而激活α－磷酸甘油脱氢酶的活性，使磷酸二羟基丙酮取代乙醛作为NADH 2的受氢体而还原为α－磷酸甘油，其水解后即形成甘油。 ●促进剂：指那些既不是营养物质又不是前体，但却能提高产量的添加剂，如加巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉菌推迟自溶，延长分泌期。 ●灭菌：用化学或物理的方法杀灭或除掉物料及其器皿中所有的生命体。消毒是指杀死病原微生物的过程。 ●分批灭菌：培养基置于发酵罐中加热，达到预定温度后维持一段时间，再冷却到发酵所需温度的灭菌。 第一章 1．简述发酵工程的概念及其主要内容。 发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。它是应用生物学、化学和工程技术学的原理，大规模（工厂化）培养动植物和微生物细胞，生产生物量或产物的科学。发酵工程可分为上游工程、中游工程和下游工程。 生产微生物细胞（或生物量）； 生产微生物的酶；●生产微生物的代谢产物；?生产基因重组产物；?将一个化合物经过发酵改造其化学结构——生物转化。 2.什么叫次级代谢产物？次级代谢产物是微生物在哪些生长时期形成的？其与初级代谢产物有什么关系？ 以初级代谢产物为原料通过次级代谢合成的，对自身无明确生理作用的代谢产物叫次级代谢产物。关系：先产生初级代谢产物，后产生次级代谢产物；初级代谢是次级代谢的基础；次级代谢是初级代谢在特定前提下的继续与发展。 3.发酵过程有哪些组成部分？ 用于菌种扩大培养和发酵生产用的培养基配方； 培养基、发酵罐和辅助设备的灭菌；●足量的高活性、纯培养的接种物；?在适宜条件的发酵罐中培养菌体生产产物；?产物的提取和纯化；?生产过程的废物的处理。 第二章 1.发酵工程菌株的选育方法有哪些？各有何特点？ 自然选育：自发突变率低，变异程度较轻微，变异过程十分缓慢；自发突变不定向，负向变异可能性大，正向变异可能性小 诱变育种：方法简单，快速，收效显著。 原生质体融合：打破种属间的界限，提高重组频率，扩大重组幅度。 杂交育种：使不同菌株的优良性状集中在重组体中，扩大变异范围，具有更强的方向性和目的性。 基因工程育种：按人们的愿望使生物体的遗传性状发生定向变异。 2.发酵工程对菌种有何要求？菌种的分离和筛选基本流程是怎样的？ 要求：能大量高效合成产物；发酵培养基原料廉价；培养条件容易控制；易于液中提取产物；不易污染其它杂菌和噬菌体；无毒无害；性能稳定，不易退化 （建筑工程管理）第五章第三节发酵工程简介 第五章第三节发酵工程简介 教学目标 1．知识方面 （1）发酵工程的概念（知道）。 （2）发酵工程中培养基的配制、菌种选育、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离、提纯等相关内容（知道）。 （3）有关发酵工程在医药工业和食品工业中应用的内容（知道）。 2．态度观念方面 （1）通过学习发酵工程的有关内容，培养学生理论联系实际的科学态度。 （2）通过学习有关发酵工程在医药工业和食品工业中应用的知识激发学生学习生物学的兴趣，提高学生把所学知识转化为技术，且服务于社会的STS意识。 3．能力方面 通过对发酵过程中菌种选育、发酵条件控制等相关内容的讨论，培养学生综合运用知识去解决实际问题的能力。 重点、难点分析 1．教学重点： （1）通过对谷氨酸发酵实例的分析、讨论，使学生了解发酵工程的概念，了解菌种选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离、提纯等内容是本节的重点。（2）让学生收集有关发酵工程应用的资料，且相互交流、讨论，使学生了解发酵工程在医药工业、食品工业中的应用知识也是本节的教学重点之壹。 2．教学难点： 有关发酵工程的内容是本节教学的难点，因为这些内容中涉及了细胞工程、基因工程、杂菌污染对发酵工业造成的危害以及发酵条件对菌种代谢途径的影响等多点知识，比较繁杂，学生较难理解。 教学模式 启发讲解和学生讨论相结合。 教学手段 谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的代谢途径及发酵的的示意图的投影片，影响谷氨酸代谢途径的因素表格及谷氨酸发酵所用培养基的成分的表格。 课时安排二课时。 设计思路 1．前期知识准备： （1）复习有关谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径及其人工控制的内容。 （2）复习有关微生物群体生长的规律及影响微生物生长的环境因素的内容。 （3）复习有关微生物的营养、培养基、代谢产物等内容。 2．通过讨论谷氨酸发酵过程，使学生了解从菌种选育、培养基配制到产品生成等简要的发酵生产过程，了解发酵生产的主体设备发酵罐及其控制部分，且了解发酵工程的概念。3．通过分析、讨论有关发酵过程的内容，使学生了解培养基的配制、菌种选育、灭菌、扩大培养接种、发酵过程和产品的分离、提纯等相关知识。 4．通过学生讨论、交流等活动，总结出发酵工程在医药工业和食品工业上的应用的知识。第壹课时 壹、设疑引出新课题 前面我们学习了有关微生物的代谢的内容，我们知道了微生物的代谢是指微生物细胞内所发生的全部的化学反应。在微生物的代谢过程中，会产生多种多样的代谢产物，如氨基酸、维 第一章发酵工程概述 一、发酵工程：是利用微生物特定的形状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用与工业化生产的技术体系，是将传统发酵与现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的发酵技术。二、发酵工程简史： 1590 荷兰人詹生制作了显微镜 1665 英国人胡克制作的显微镜观察到了霉菌 近代发酵工程建立初期1864 巴斯德灭菌法 1856 psateur 酵母导致酒精发酵 19世纪末Koch 纯种分离和培养技术 三、发酵工程技术的特点 （1）主体微生物的特点 ①微生物种类繁多，繁殖速度快、代谢能力强，容易通过人工诱变获得有益的突变株； ②微生物酶的种类很多，能催化各种生化反应 ③微生物能够利用有机物、无机物等各种营养源 ④可以用简易的设备来生产多种多样的产品 ⑤不受气候、季节等自然条件的限制等优点 （2）发酵工程技术的特点 ①发酵工程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应能够在发酵设备中一次完成 ②反应通常在常温下进行，条件温和，耗能少，设备简单 ③原料通常以糖蜜，淀粉等碳水化合物为主 ④容易生产复杂的高分子化合物 ⑤发酵过程中需要防止杂菌污染 (3)发酵工程反应过程的特点 ①在温和条件下进行的 ②原料来源广泛，通常以糖、淀粉等碳水化合物为主 ③反映以生命体的自动调节形式进行（同（2）①） ④发酵分子通常为小分子产品，但也很容易生产出复杂的高分子化合物 四、发酵工程的一般特征 ①与化学工程相比，发酵工程中微生物反应具有以下特点： 作为生物化学反应，通常在常温常压下进行，没有爆炸之类的危险，不必考虑防爆问题，还有可能使一种设备具有多种用途 ②原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，加入少量的各种有机或无机氮源，只要不含毒，一般无精制的必要，微生物本身就有选择的摄取所需物质 ③反应以生命体的自动调节方式进行因此数十个反应过程能够像单一反应一样，在称为发酵罐的设备内很容易进行 ④能够容易的生产复杂的高分子化合物，是发酵工业最有特色的领域 ⑤由于生命体特有的反应机制，能高度选择性的进行复杂化合物在特定部位的氧化还原官能团导入等反应 发酵工程课后思考题 第一章绪论 1、发酵及发酵工程定义？ 答：它是应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。由于它以培养微生物为主，所以又称为微生物工程。 2、发酵工程基本组成部分？ 答：从广义上讲分为三部分：上游工程、发酵工程、下游工程 3、发酵工业产业化应抓好哪三个环节？ 答：发酵工程产业化就是将有关应用微生物的科学研究成果转化为发酵产品，并投向市场的过程。 三个环节：投产试验、规模化生产和市场营销。 ①投产试验：涉及到”上、中、下三游”工作，即研究成果的验证、小试、中试和扩大试验。 ②规模化生产：值得注意的是产品质量问题，其检测必须符合相应产品标准。 ③市场营销：市场开拓对技术本身影响不大，但参与市场竞争却是产业化成败的决定因素。 4、当前发酵工业面临三大问题是什么？ 答：菌种问题 纯种，遗传稳定性，安全，周期短、转化率高产率高抗污染能力强：噬菌体、蛭弧菌； 合适的反应器 生产规模化原料利用量大，并且具有一定选择性，节能，结构多样化、操作制动化，节劳力。 基质的选择 价廉原料利用量大，并且具有一定选择性易被利用、副产物少，满足工艺要求。 5、我国发酵工业应该走什么样的产业化道路？发酵过程的组成部分？ 答第一步为技术积累阶段、第二步为产业崛起阶段、第三步为持续发展阶段 典型的发酵过程可划分成六个基本组成部分： （1）繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定； （2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌； （3）培养出有活性、适量的纯种，接种入生产容器中； （4）微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长； （5）产物分离和精制； （6）过程中排出的废弃物的处理。 第二章菌种的来源(1) 1、自然界分离微生物的一般操作步骤？ 答：标本采集，预处理，富集培养，菌种分离（初筛，复筛），发酵性能鉴定，菌种保藏 2、从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集？ 答：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 3、什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？ 答：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。 意义：自然选育是一种简单易行的方法，可达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的。虽然其突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。 4、诱变育种对出发菌株有哪些要求？ 发酵工程相关定义 1、发酵: 通过微生物的生长繁殖与代谢活动,产生与积累人们所需产品的生物反应过程 2、发酵工程(传统): 微生物培养与代谢过程 3、发酵工程(现代): 采用现代工程技术手段,利用天然生物体或人工改造的生物体对原料进行加工,为人类生产有用的产品,或直接把生物体应用于工业生产的过程 4、筛选——初筛 从分离得到的大量微生物中筛选出目的菌 5、复筛 在初筛的基础上进一步鉴定菌种的生产能力 6、菌种退化:接种传代或保藏之后,群体中某些生理特征与形态特征逐渐减退或完全丧失的现象 7、营养缺陷型突变株:指原菌株由于发生了基因突变,致使合成途径中某步骤发生缺陷,而丧失了合成某些营养物质(氨基酸、维生素、碱基等)的能力 8、原养型:营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株,其营养要求在表型上与野生型相同 9、基本培养基(minimal medium,MM):仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基 10、完全培养基(complete medium,CM):可以满足一切营养缺陷型菌株需要的天然或半合成培养基 11、补充培养基(supplemented medium,SM):只能满足相应营养缺陷型生长需要的合成培养基 12、杂交育种:将两个基因型不同的菌株经吻合(或结合)使遗传物质重新组合,从中分离出具有新性状的菌株 13、原生质体:由细胞质膜包围的原生质部分 14、具有活性的原生质体制备:通过物理、化学的方法将微生物细胞壁破碎释放出原生质体的过程 15、再生:原生质体重新合成细胞壁物质,恢复其完整的细胞形态的过程 16、转化:外源DNA进入宿主细胞的过程 17、原生质体转化育种:整条染色体DNA、片段DNA或质粒DNA转化原生质体获得转化子的育种技术 18、原生质体融合:通过人为的方法,使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合,并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程 19、基因组改组育种:微生物全基因组改造中快速进行特定群体的基因交换重组,从而增加群体多样性、改良群体中个体性能等的连续遗传改变及表型选择过程 杨淑芳 （天津市农业信息中心，天津 ３００２０１） 摘 要： 发酵工程技术在农产品加工方面的应用越来越广泛，该文阐述了发酵工程的概念；论述了发酵工程在农产品加工方面的应用，提出了与生产实践相结合的实例；展望了发酵工程技术在农产品加工领域中的美好发展前景。 关键词：发酵工程；农产品加工 收稿日期：２００８－０４－０３ 作者简介：杨淑芳（１９５６－），女，高级工程师，研究方向为农业信息。 发酵工程是现代生物技术的组成部分，是采用现代发酵设备，使经优选的细胞或经现代技术改造的菌株进行放大培养和控制性发酵，获得工业化生产预定的产品。基因工程和细胞工程是生物技术的主要领域，是发酵工程、酶工程的基础；发酵工程和酶工程又是基因工程、细胞工程研究成果的实际应用，其中发酵工程占有重要位置。从生物工程的过程看，只有通过发酵工程，才能使由基因工程或细胞工程获得的某种目的菌种实现工业化生产，获得经济效益。可见，发酵工程是生物技术产业化的基础。生物技术中的基因工程、酶工程、单克隆抗体、生物量的转化等研究成果为发酵工程注入新的内容，使传统的发酵工艺焕发“青春”，赋予微生物发酵技术新的生命力，使微生物发酵制品不断增加，也使发酵工 程在制药业、食品工业和农产品加工业显示出强大的生命力。该文主要介绍发酵工程在农产品加工方面的应用。 １ 发酵工程在甜高粱茎秆加工上的应用 随着经济和社会的高速发展，能源的需求量越来越大。在国际国内石油价格不断上涨的情况下，世界各国都在积极探索利用可再生能源发展可再生的石油替代燃料。甜高粱茎秆发酵制取燃料乙醇是目前生物质能领域的研究热点之一。试验研究表明，甜高梁每年的乙醇产量为６１０６Ｌ／ｈｍ２，而号称太阳能最有效转化器的甘蔗只有４６８０Ｌ／ｈｍ２，玉米为２３９０Ｌ／ｈｍ２。甜高梁光合效率为大豆、甜菜和小麦等作物的２￣３倍。在生物能源系统中，甜高粱是第一位竞争者，是世界公认的高能作物。甜高粱同普通高粱一样，每亩地也能产出２００￣５００ｋｇ的粮食籽粒，但甜高粱的精华在于它亩产４０００￣５０００ｋｇ、富含１８％￣２４％糖分的茎秆。巴西政府自１９７５年开始用甜高粱发酵生产酒精，并提出一项以甘蔗、木薯、红薯、甜高粱为原料发酵生产酒精替代汽油的计划。美国从１９７８年开始进行甜高粱发酵生产酒精的研究，美国能源部还将甜高梁列为制取酒精的主要作物，他们计划用甜高粱逐渐取代玉米生产酒精。从１９８２年开始，欧洲开展了甜高梁的研究，首先估价了甜高粱作为一种有潜力的工业和能源作物的可能性，并于１９９１年在欧共体内成立了甜高粱网，在不同国家分工开展甜高梁研究。Ｗｙｍａｎ ［１］就中国北方的 发酵工程在农产品加工上的应用 微生物生物技术重点 第一章 1 发酵的概念 传统概念：指酵母作用于果汁或发芽谷物，进行酒精发酵时产生CO2的现象。 生物学概念：发酵是指微生物在无氧条件下分解代谢有机物质释放能量的过程。（生化）工业生物学家概念：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程 现代概念：培养生物细胞（含动植物和微生物）来制取产物的所有过程 2 生物工程（Microbial engineering ）是利用微生物的特定性状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系；是将传统发酵与现代DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的现代发酵技术。 发酵工程的发展简史 1、传统的发酵时期——天然发几千年 酒（古埃及龙山文化）啤酒、黄酒、酱油、泡菜等 特点 多数产品为嫌气性发酵 非纯种培养 单凭经验传授技术，使产品质量不稳定 （不了解微生物与发酵的关系） 2、近代发酵工程时期——纯培养技术 1665 英国物理学家Robert Hooke（罗伯特·胡克）细胞壁 1680 荷兰列文·虎克(Antonie vanLeeuwenhoek) 活细胞人类认识到微生物的存在 特点 多数产品为嫌气性发酵 非纯种培养 单凭经验传授技术，使产品质量不稳定 （不了解微生物与发酵的关系） 由天然发酵阶段转向纯培养发酵（第一次转折 过程特点 产品的生产过程较为简单，对生产要求不高，规模不大 3、近代发酵工程时期——深层培养技术 出现于20世纪40年代，以抗生素的生产为标志青霉素的发现与大量需求 表面培养法(surface culture) 效价40U/mL，纯度20%，收率30% 二战期间，青霉素发酵生产成功 青霉素发酵生产的成功，给发酵工业带来两大功绩： 开拓了以青霉素为先锋的庞大抗生素发酵工业 建立深层培养法（submerged fermentation），把通气搅拌技术引入发酵工业。它使得需氧菌的发酵生产从此走上了大规模工业化生产途径。通气搅拌液体深层发酵技术是现代发酵工业最主要的生产方式 机械搅拌通气发酵技术的建立是第二次转折 4、近代发酵工程时期——代谢控制发酵技术 定义：以动态生物化学和微生物遗传学为基础，将微生物进行人工诱变，得到适合于生产某种产品的突变株，再在人工控制的条件下培养，即能选择性地大量生产人们所需要的物 发酵工程》理论教学大纲 一、课程说明 课程编号： 学时：64 学分数：4 适用专业：生物技术及应用 课程类型：必修课 先修课程：生物化学、微生物学 二、课程教学目的与要求： 《发酵工程》课程是生物技术专业的必修课。通过本课程的学习，使学生在生物化学、微生物学等课程的基础上，系统的掌握发酵工程的基本理论、基本知识和基本技能，建立较深刻的微生物学观点，形成科学的思维方式。同时要求学生能了解现代发酵工程理论和技术的新发展。 三、课程教学基本内容及学时分配 第一章绪论（2学时） 知识点：发酵工程的概念；发酵工程的发展简史；发酵工程的基本内容；发酵工程的后处理。重点：发酵的概念；发酵工程简史；发酵工程的应用。 难点：发酵工程的一般过程。 学生掌握要点：发酵工程的发展史中四个时代和发酵工程应用领域。 第二章工业发酵菌种的选育（4 学时） 知识点：菌种的来源；发酵高产菌种选育；菌种退化和菌种保藏。 重点：微生物选择性分离；自然选育和诱变育种。 难点：诱变育种的方法。 学生掌握要点：自然选育和诱变育种技术。 第三章工业发酵培养基（2 课时） 知识点：发酵营养基质的组成；工业发酵中营养基质的种类；工业发酵中营养基质的选择；工业发酵中营养基质的配制方法。 重点：掌握工业发酵用培养基的要求、培养基的构成以及培养基各组分的作用；掌握影响培养基质量的因素及控制措施；熟悉淀粉糖的制备原理、方法和工艺过程。 难点：影响培养基质量的因素及控制措施；淀粉糖的制备原理、方法和工艺过程。第四章工业发酵过程灭菌（4 课时）知识点：常用的灭菌方法；培养基与发酵设备的灭菌；空气除菌。 重点：掌握微生物热死动力学；掌握影响灭菌效果的因素及控制方法；重点掌握分批灭菌和连续灭菌的工艺过程及操作要点；掌握空气介质过滤除菌的工艺过程。 难点：无菌空气的制备方法和要点。 学生掌握要点：分批灭菌和连续灭菌的工艺过程及操作要点；无菌空气的制备方法和要点。 第五章种子扩大培养（2 课时）知识点：种子制备工艺，影响种子质量的因素重点：影响种子质量的因素，工业发酵种子扩大培养的工艺过程及操作要点。难点：影响种子质量的因素。 学生掌握要点：影响种子质量的因素，工业发酵种子扩大培养的工艺过程及操作要点。第六章发酵罐及其附属设备（4 课时）知识点：需氧发酵罐，嫌气发酵罐，表面培养设备，发酵设备的清洗与检修，发酵罐选型 注意事项。重点：理解气升式发酵罐、自吸式发酵罐、酒精和啤酒发酵罐的结构、工作原理和特 点； 理解表面培养设备类型、特点和工作原理；理解发酵罐选型注意事项；掌握通用式发酵罐的结构、工作原理。 难点：理解气升式发酵罐、自吸式发酵罐、酒精和啤酒发酵罐的结构、工作原理和特点；理解表面培养设备类型、特点和工作原理；理解发酵罐选型注意事项。 学生掌握要点：理解气升式发酵罐、自吸式发酵罐、酒精和啤酒发酵罐的结构、工作原理和特点；理解表面培养设备类型、特点和工作原理；理解发酵罐选型注意事项；掌握通用式发酵罐的结构、工作原理。 第七章发酵工艺控制（24 课时）知识点：工业发酵的主要类型；营养基质和菌体浓度的影响及其控制；溶解氧浓度对发酵的影响及控制；pH的影响及其控制；温度的影响及其控制；二氧化碳对发酵的影响及控制；泡沫的影响和控制；发酵异常现象及染菌分析；染菌对发酵的影响及防治；发酵终点的判断；发酵的过程的自动控制。 重点：发酵条件的影响及其控制；泡沫对发酵的影响及其控制；发酵终点的判断与自溶的监测；发酵染菌的分析、染菌污染的途径和防止染菌。 23讲发酵工程简介 一、应用发酵工程的生产实例 1．谷氨酸的产生菌有_________________、__________________ 。 2．所使用的培养基从物理性质上看属于_________ 培养基，从组成成分上看属于_____________培养基。 3、发酵罐搅拌器的作用： 二、发酵工程的概念和内容 （一）发酵工程的概念：采用现代工程技术手段,利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用产品或直接把微生物应用于工业生产过程的新技术。 （二）发酵工程的内容 1．菌种的选育：生产用菌种的获得方法有____________________________ 2．培养基的配制： 3．灭菌：防止杂菌污染的方法是在发酵前用高温、高压的方式对__________和_______ 进行严格的灭菌处理，从而杀死所有杂菌的_____ 、________和________。 若青霉素生产过程中出现杂菌污染，结果是什么 4．扩大培养和接种： 注：扩大培养是将培养到对数期的菌种分开，在分别培养，以促进菌体数量快速增加，在短时间内获得大量菌种；发酵生产过程的培养是为了获得代谢产物；它们培养目的不同，条件也就可能不同：如酒精发酵过程中，在有氧条件下快速增殖，就是说酵母菌扩大培养必须有充足的氧气；酵母菌在无氧的条件下才能产生酒精，所以酒精发酵的条件必须缺氧。 5．发酵过程——发酵的中心阶段，此阶段的主要工作有： （1）随时取样检测培养液中的________________——了解发酵进程； （2）及时添加必需的___________________——延长菌种生长稳定期的时间； （3）严格控制_________ 、______________、____________以及通气量和转速等发酵条件。在谷氨酸发酵过程中ph值的变化对产物的影响是什么 6．分离提纯： 两类产物： 提取方法是什么： 三、发酵工程的应用 1．在医药工业上的应用： （1）发酵工程能生产人们所需要的药品。如：通过青霉发酵能生产。（2）通过发酵工程能生产基因药品。如：将人工合成的人的胰岛素基因转移到大肠杆菌细胞内构建成“工程菌”，即先通过______工程再通过________ 工程培养工程菌就可获得人的胰岛素。 2．在食品工业上的应用：（1）生产丰富优质的传统发酵产品；（2）生产各式各样的食品添加剂；（3）发酵工程能为解决人类粮食缺问题开辟新途径。如通过发酵工程可获得大量的微生物菌体 四、课后练习 1．对谷氨酸发酵叙述正确的是 Ａ．菌体是异氧厌氧型微生物Ｂ．培养基属于液态的合成培养基 Ｃ．谷氨酸的形成与搅拌速度无关Ｄ．产物可用离子交换法提取 2．关于菌种的选育不正确的是 Ａ．自然选育的菌种不经过人工处理Ｂ．诱变育种原理的基础是基因突变 Ｃ．通过有性杂交可形成工程细胞Ｄ．采用基因工程的方法可构建工程菌 3．用于谷氨酸发酵的培养基需添加的生长因子是 Ａ．氨基酸Ｂ．碱基Ｃ．核苷酸Ｄ．生物素 4．谷氨酸棒状杆菌扩大培养时，培养基应该是 Ａ．C∶N为4∶1 Ｂ．C∶N为3∶1 Ｃ．隔绝空气Ｄ．加大氮源、碳源的比例 5．大量生产酵母菌时，不正确的措施是 Ａ．隔绝空气Ｂ．在对数有获得菌种 Ｃ．过滤沉淀进行分离Ｄ．使菌体生长长期处于稳定期 6．连续培养酵母菌的措施中不正确的是 Ａ．及时补充营养物质Ｂ．以青霉素杀灭细菌 Ｃ．以缓冲液控制pH在5.0-6.0之间Ｄ．以酒精浓度测定生长状况 7．用发酵工程生产的产品，如果是菌体，则进行分离提纯可采用的方法是 Ａ．蒸馏过滤Ｂ．过滤沉淀Ｃ．萃取离子Ｄ．沉淀萃取 8．下列物质中，不能为异养生物作碳源的是 Ａ．蛋白胨Ｂ．含碳有机物Ｃ．含碳无机物Ｄ．石油、花生饼 9．培养生产青霉素的高产青霉素菌株的方法是 Ａ．细胞工程Ｂ．基因工程 Ｃ．人工诱变Ｄ．人工诱变和基因工程 10．以下发酵产品中不属于微生物代谢产物的是 Ａ．味精Ｂ．啤酒Ｃ．“人造肉”Ｄ．人生长激素 11．利用酵母菌发酵生产酒精时，投放的最适原料和产生酒精阶段要控制的必要条件是Ａ．玉米粉和有氧Ｂ．大豆粉和有氧Ｃ．玉米粉和无氧Ｄ．大豆粉和无氧 12．关于单细胞蛋白叙述正确的是 Ａ．是微生物细胞中提取的蛋白质Ｂ．通过发酵生产的微生物菌体 Ｃ．是微生物细胞分泌的抗生素Ｄ．单细胞蛋白不能作为食品 13．基因工程培育的工程菌通过发酵工程生产的产品有①石油、②人生长激素、③紫草素、④ 发酵工程重点总结 第一章 发酵：通过微生物的生长繁殖和代谢活动，产生和积累人们所需产品的生物反应过程发酵工程：利用微生物（或动植物细胞）的特定性状，通过现代工程技术，在生物反应器中生产有用物质的技术体系。该技术体系主要包括菌种选育与保藏、菌种扩大生产、代谢产物的生物合成与分离纯化制备等技术。 发酵工业的特点？（7点） 1.发酵过程一般是在常温常压下进行的生化反应，反应安全，要求条件较简单。 2.可用较廉价原料生产较高价值产品。 3.反应专一性强。 4.能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位的生物转化修饰。 5.发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。 6.菌种是关键。 7.发酵生产不受地理、气候、季节等自然条件限制。 工业发酵的类型？ 厌氧发酵 1. 按微生物对氧的不同需求需氧发酵 兼性厌氧发酵 液体发酵（包括液体深层发酵） 2.按培养基的物理性状浅盘固体发酵 深层固体发酵（机械通风制曲） 分批发酵 按发酵工艺流程补料分批发酵 单级恒化器连续发酵 连续发酵多级恒化器连续发酵 带有细胞再循环的单级恒化器连续发酵 发酵生产的基本工业流程？ 1. 用作种子扩大培养及发酵生产的各种培养基的配制； 2. 培养基、发酵罐及其附属设备的消毒灭菌； 3. 扩大培养出有活性的适量纯种，以一定比例接种入发酵罐中； 4. 控制最适发酵条件使微生物生长并形成大量的代谢产物； 5. 将产物提取并精制，以得到合格的产品； 6. 回收或处理发酵过程中所产生的三废物质。 工业发酵的过程的工艺流程图？ 第二章 1、发酵工业菌种分离筛选的一般流程? 调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计 含微生物样品的采集（如何使样品中所含微生物的可能性大？） 样品预处理（如何在后续的操作中使这种可能性实现） 菌种分离 根据目的菌株及其产物特点分 选择性分离方法随机分离方法 (定向筛选←选择压力) (用筛选方案- 检测系统进行间接分离） 富集液体培养固体培养基条件培养 (初筛) 菌种纯化 复筛 菌种纯化 初步工艺条件摸索再复筛生产性能测试 较优菌株1-3株 保藏及进一步做生产试验某些必要试验和 或作为育种的出发菌株毒性试验等 2、菌种选育改良的具体目标。(4点)？ 1.提高目标产物的产量 最近，拉式生产是工业界最时髦的话题，无论是精益生产还是敏捷供应链都以拉式生产快速反应为核心。我们大多企业都准备转 向按单生产，随需而动。难道按单计划生产就是拉式生产了吗？本文就是想探讨推拉的本质，来阐述拉式生产的基本规律。 一，推-拉的基本概念 这里有两个概念必须澄清，不能混淆：第一个是MRP和看板比较，MRP是推，看板是拉，这主要是指执行层。MRP是按生产订单执行。看板是前工序是按后工序的指令或消耗执行。第二个是计划的推拉概念，计划可以是推也可以是拉，也可以推拉结合，如ATO模式就是前推后拉模式：如按单装配（拉，MTO），一些关键装配件用MPS（推，MTS）。 我这里重点讨论的推-拉是指执行层的。推拉的关键区别主要体现在执行层，而不是计划层。计划强调远瞻性和透明性。根据市场竞争性可以按实际需求计划，也可以按预测需求计划。 那么什么是推式系统呢？它是依赖批量计划来执行，成批送到下游工序或仓库排队。集中控制，不考虑下一个工序的实际节拍，独立的工序控制，关注资源能力。没有形成连续流。 那么什么是拉式系统呢？它是实时响应实际需求或消耗来执行，一种由下游向上游提出实际生产需求的生产控制方法。分散控制，灵活和容易的适应性，关注物料的流动。 二，MRP和看板的本质区别 （1），为什么MRP是推式系统？ 这里不是指的计划而是指的是执行过程，它是利用客户的订单发货和预测来决定将要供应和生产的需求。生产车间用生产订单和工序段排程来沟通。在车间没有真正优先级的方法来执行。 （2），为什么看板是连续拉式系统？ 看板是一个卡或传票，是一套执行规则的系统，可视化的连续拉动，通过消耗点移动物料，是精益生产理想的拉式方法用于车间执行的工具。 MRP计算需求运行要求采购和生产。精益用MRP的毛需求严格地作为看板需求的计算的投入。只有出现需要生产的信号，精益实际才生产。举个例子：假设MRP算出今天需要500个，在MRP系统里，产生一个生产订单500个。而在精益里，每天500个将转成5 个看板，每个看板数量100个。现在我们知道预计需要生产多少，但是，我们只有等到前道工序的信号才能生产。如果今天只接受4个空看板信号，那就只能生产4个看板的数量400个。不象MRP盲目的生产500个。所以，在精益里，我们只能生产需要的，而不是预计的。 （3），为什么APS或DBR是广播式拉动系统？ APS或DBR是实时的，基于事件的按单承诺和履约的有限资源系统，可视化的广播拉动或鼓点拉动，可以快速调整的，模拟计划排程并优化执行的工具。 发酵工程与设备 第一章绪论 生物技术作为21世纪高新技术的核心，对人类面临的食品、资源、健康、环境等重大问题发挥越来越大的作用。大力发展生物技术及其产业已成为世界各国经济发展的战略重点。 一．发酵工程的主要内容 发酵工程（Fermentation Engineering）属于生物技术的范畴，生物技术又称生物工艺学，最初是由一位匈牙利工程师Karl.Ereky于1917年提出的。当时他提出的生物技术这一名词的涵义是指甜菜作为饲料进行大规模养猪，即利用生物将原料转化为产品。现在的生物技术的定义为：生物技术是应用自然科学及工程学原理依靠生物催化剂的作用将物料进行加工以提供产品或社会服务的技术。因此，生物技术是一门综合性多学科技术，他涉及的基础学科有生物学、化学和工程学。下图为生物技术与基础学科关系的示意图。它逐渐成为与生物学、生物化学、化学工程等多学科密切相关的综合性边缘学科。 现代生物技术作为一门新兴的高科技术产业，它的生命力在于他对社会经济和发展的各个方面都带来了极大冲击和影响。 发酵工程是指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的技术。 发酵工程由于涉及到生物催化剂，因而与化学反应有关。由于生物技术的最终目标是建立工业生产过程为社会服务，因而该生产过程可称为生物反应过程（亦称为生化反应过程）。 在发酵技术中一般包括微生物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利用固定化酶，固定化细胞所做的反应器加工底物（即有生化催化剂参加），以及培养加工后产物大规模的分离提取等工艺。主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。如酸碱度、湿度、底物浓度、通气量以及保证无菌状态等研究内容。 二、发酵工程的发展历史 生物技术的发展和利用可以追溯到1000多年（甚至4000多年）以前如酒类的酿造。而人类有意识地利用酵母进行大规模发酵生产是在19世纪。当时进行大规模生产的发酵产品有乳酸、酒精、面包酵母、柠檬酸和蛋白酶等初级代谢产 《发酵工程课程设计》 实习指导书 主编：邵威平 甘肃农业大学 食品科学与工程学院 二OO七年八月 前言 《发酵工程课程设计》是生物工程专业的一门实用性和技术性很强的专业课程，属于专业实践教学环节。通过这个实习环节的学习和锻炼，使学生在掌握了生物工程专业基础理论、专业理论和专业知识的基础上，初步掌握发酵工程工厂设计的基本原则、发酵工艺参数的设计及检测方法的建立，培养学生具备发酵工厂工艺、工程设计的能力，使学生得到生物工程专业技术人员的综合性基本训练。 本指导书主要叙述了课程设计的目的与要求、课程设计的任务、课程设计的内容、课程设计报告的要求、考核方法与评分办法等内容，其中课程设计的内容为本书重点，阐明了啤酒、酒精、味精和酶制剂工厂设计要求等指导性内容。 编写本指导书的目的，旨在指导学生掌握微生物发酵工厂设计工作的原理、步骤和方法，培养正确的辨证的工程设计观点，提高综合运用专业理论与基础理论知识及技能，分析解决发酵工程实际问题的能力。 尽管作者力图在编写过程中注重系统性、实践性和指导性，但限于作者能力和水平，书中难免存在纰漏和不足，望读者批评指正。 目录 一、课程设计的目的与要求 (3) 二、课程设计的任务 (4) （一）课程设计的基本环节 (4) （二）课程设计具体任务 (4) 三、课程设计的内容 (6) （一）啤酒发酵车间（工厂）设计 (6) （二）酒精发酵车间（工厂）设计 (8) （三）味精发酵车间（工厂）设计 (10) （四）糖化酶发酵车间（工厂）设计 (14) （五）其他参考选题 (15) 四、课程设计报告要求 (16) 五、考核方法与评分办法 (18) 六、参考资料 (19) 附一：课程设计报告撰写指南 (20) 附二：课程设计报告样式与格式规范要求 (23) 第一章 1.简述发酵工程的概念及其主要内容。 发酵工程就是生物技术的重要组成部分,就是生物技术产业化的重要环节。它就是应用生物学、化学与工程技术学的原理,大规模(工厂化)培养动植物与微生物细胞,生产生物量或产物的科学。发酵工程可分为上游工程、中游工程与下游工程。 生产微生物细胞(或生物量); 生产微生物的酶;●生产微生物的代谢产物;?生产基因重组产物;?将一个化合物经过发酵改造其化学结构——生物转化。 2、什么叫次级代谢产物？次级代谢产物就是微生物在哪些生长时期形成的？其与初级代谢产物有什么关系？ 以初级代谢产物为原料通过次级代谢合成的,对自身无明确生理作用的代谢产物叫次级代谢产物。关系:先产生初级代谢产物,后产生次级代谢产物;初级代谢就是次级代谢的基础;次级代谢就是初级代谢在特定前提下的继续与发展。 3、发酵过程有哪些组成部分？ 用于菌种扩大培养与发酵生产用的培养基配方; 培养基、发酵罐与辅助设备的灭菌;●足量的高活性、纯培养的接种物;?在适宜条件的发酵罐中培养菌体生产产物;?产物的提取与纯化;?生产过程的废物的处理。 第二章 1、发酵工程菌株的选育方法有哪些？各有何特点？ 自然选育:自发突变率低,变异程度较轻微,变异过程十分缓慢;自发突变不定向,负向变异可能性大,正向变异可能性小 诱变育种:方法简单,快速,收效显著。 原生质体融合:打破种属间的界限,提高重组频率,扩大重组幅度。 杂交育种:使不同菌株的优良性状集中在重组体中,扩大变异范围,具有更强的方向性与目的性。 基因工程育种:按人们的愿望使生物体的遗传性状发生定向变异。 2、发酵工程对菌种有何要求？菌种的分离与筛选基本流程就是怎样的？ 要求:能大量高效合成产物;发酵培养基原料廉价;培养条件容易控制;易于液中提取产物;不易污染其它杂菌与噬菌体;无毒无害;性能稳定,不易退化发酵工程重点
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