目录
中英文缩略词表---------------------------------------------------------------- 2 中文摘要--------------------------------------------------------------------------3 英文摘要--------------------------------------------------------------------------4 前言--------------------------------------------------------------------------------7 实验材料-------------------------------------------------------------------------10 实验方法-------------------------------------------------------------------------14结果-------------------------------------------------------------------------------19 讨论-------------------------------------------------------------------------------27 结论-------------------------------------------------------------------------------29 参考文献-------------------------------------------------------------------------30 附录-------------------------------------------------------------------------------32 致谢-------------------------------------------------------------------------------32 综述-------------------------------------------------------------------------------33
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中英文缩略词表
英文缩写 英文全称 中文全称 Akt protein-serine-threonine kinase 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶
AP DMSO Ammonium persulphate 过硫酸胺
Dimethylsulfoxide 二甲基亚砜
EPI Epirubicin 表阿霉素
mTOR mammalian target of rapamycin 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白
p70s6k 核糖体蛋白
PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液
PI3K phosphatidylinositol-3-kinases 磷脂酰肌醇3-激酶SDS sodium dodecyl sulphate 十二烷基磺酸钠-丙烯酰胺凝胶PAGE polyacrylamind gel electrophoresis 电泳
TEMED N,N,N’,N’-tetramethylenediamine 四甲基乙二胺
TBST Tris Buffered Salin +Tween-20 Tris缓冲盐水+吐温PMSF phenylmethyl sulfonyl fluoride 苯甲基磺酰氟化物
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PI3K/Akt/mTOR信号通路在介导表阿霉素诱导Jurkat
细胞凋亡中的作用
摘要
背景：恶性淋巴瘤（malignant lymphoma）是原发于淋巴结和其他器官淋巴组织的恶性肿瘤，是造血系统恶性疾病之一 ，分霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL）和非霍奇金淋巴瘤（non- Hodgkin’s lymphoma，NHL）两大类。近年来非霍奇金淋巴瘤的发病率上升较快，为目前增长速度最快的恶性肿瘤。非霍奇金淋巴瘤60%左右起源于淋巴结，40%起源于结外淋巴组织，其预后较差。根据WHO2001分型和WHO2008分型，将非霍奇金淋巴瘤分为B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和NK 细胞淋巴瘤。T细胞淋巴瘤（TCL）是一种来源于T淋巴细胞的恶性克隆增殖性疾病，异质性强，临床表现、诊断及治疗因类型而异。TCL占所有NHL的5-15%，在亚洲地区以结外病变为主。TCL目前尚无标准的化疗方案，普遍应用于临床的是以蒽环类药物为基础的联合方案，但相比B细胞淋巴瘤，化疗有效率低，缓解期短，需要探讨新的药物和治疗方法以改善其不良预后。研究表明：PI3K/Akt/mTOR信号传导通路的激活参与了多种肿瘤细胞的增殖、分化和迁移等调节，且与肿瘤细胞产生化疗药物耐药性密切相关，故作用于该信号通路各靶点抑制剂的研究逐渐成为人们关注的热点，拟在通过抑制该通路的活化来提高肿瘤治疗的疗效、逆转化疗耐药而改善疾病的预后。
目的：以人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞为研究对象，用蒽环类药物表阿霉素（Epirubicin，EPI）作用于Jurkat细胞，探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路在表阿霉素诱导Jurkat细胞凋亡中的作用，以期为临床提高T细胞淋巴瘤治疗疗效提供实验基础。
方法：运用2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）
-2H-四唑单钠盐比色法(CCK8)法检测表阿霉素和PI3K/mTOR双重抑制剂
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（NVP-BEZ235）不同浓度、不同时间点对人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat生长的影响，在此基础上采用western blot方法检测不同浓度、不同时间点的表阿霉素和（或）NVP-BEZ235作用于Jurkat细胞时PI3K/Akt/mTOR信号通路中Akt、mTOR、
p70s6k等蛋白的表达变化，及采用AnnexinⅤ/Pe双染法流式细胞术同时检测Jurkat细胞凋亡率，观察Akt、mTOR、p70s6k表达的变化与细胞凋亡之间的关系。
结果：表阿霉素抑制Jurkat细胞增殖并诱导其凋亡，且凋亡效应具有浓度依赖性；表阿霉素诱导Jurkat细胞凋亡过程中伴随着Akt、mTOR、p70s6k的活化；PI3K/mTOR
双重抑制剂（NVP-BEZ235）降低Jurkat细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路中PI3K、mTOR
的磷酸化水平，显著提高表阿霉素诱导Jurkat细胞凋亡的作用。
结论：表阿霉素诱导Jurkat细胞凋亡与PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化有关，当
表阿霉素与该通路的抑制剂联用时，细胞对表阿霉素的敏感性有一定程度的提高。
关键词：PI3K/Akt/mTOR；表阿霉素；细胞凋亡；Jurkat细胞株；NVP-BEZ235
The role of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in epirubicin-induced apoptosis of Jurkat cells
Abstract
Background：Malignant lymphoma is a malignant tumor originating in the lymph nodes and,lymphoid tissue of other organs, it’s one of the malignant diseases of the hematopoietic system.It includes Hodgkin's lymphoma and non-Hodgkin's lymphoma .
In recent years, the incidence of non-Hodgkin's lymphoma rises faster for the current growth rate of the fastest growing malignancy. About 60% of non-Hodgkin's lymphoma originated in the lymph node, 40% originated in extranodal lymphoid tissue.The
prognosis is poor. Acrodding to the WHO2001 type and WHO2008 type, non-Hodgkin's
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lymphoma is divided into B-cell lymphoma, T-cell lymphoma and NK-cell lymphoma. T-cell lymphoma (TCL) is a malignant clonal proliferation disorders originated in T lymphocytes, the clinical manifestations, diagnosis and treatment are different from different types. The treatment of TCL is different, which commonly used in clinical are anthracycline-based chemotherapy, high-dose chemotherapy and hematopoietic stem cell transplantation, allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and new drugs. Also in the development of new drugs includes a role in the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway drug pre-clinical trials. A large number of studies have shown that the activation of PI3K/Akt/mTOR signal transduction pathways involved in regulating a variety of tumor cells’ proliferation, differentiation and migration.The pathway is also closely related to chemotherapeutic drug resistance of tumor cells. The signaling pathway inhibitors are becoming a focus for researching,in order to reduce the activation of the pathway to improve the efficacy of treatment and the prognosis of the disease.
Objective：We take human T-cell lymphoma cell line Jurkat as our research object,to investigate the role of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in epirubicin-induced apoptosis of human T-cell lymphoma cell line Jurkat.
Methods:The effects of Epirubicin and a Dual PI3K/mTOR Inhibitor(NVP-BEZ235) on human T-cell lymphoma cell line Jurkat proliferation with different doses and time points was assessed by CCK8. The effect of a dose-ranging in Epirubicin at one time point and the change of combining NVP-BEZ235 with Epirubicin on the expression of Akt、mTOR、p70s6k was detected by Western blot.
Results: Epirubicin could inhibit Jurkat cell proliferation ,at the same time, induced its
apoptosis.The Apoptotic effect is concentration-dependent. Epirubicin-induced
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apoptosis of Jurkat cells is along with the activation of Akt, mTOR, p70s6k.The PI3K/mTOR dual inhibitor (NVP-BEZ235) reduced the phosphorylation level of PI3K and mTOR in Jurkat cell,which Significantly improved the apoptosis of Jurkat cells.
Conclusion：Epirubicin-induced apoptosis of Jurkat cells has a relation with PI3K/Akt/mTOR signaling pathway, when the pathway inhibitors combined with epirubicin, the cells sensitivity of epirubicin has improved to some extent.
Key words：Epirubicin；chemotherapy sensitivity；Jurkat；NVP-BEZ235
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PI3K/Akt/mTOR信号通路在介导表阿霉素诱导Jurkat
细胞凋亡中的作用
1.引言
在介导肿瘤细胞凋亡的众多信号转导途径中，以磷脂酰肌醇3-激酶
(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase，Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号转导途径对凋亡的调节作用尤其重要。该信号通路的活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡，从而促进肿瘤细胞的生存，而一些肿瘤细胞则能够通过对负责细胞生长和凋亡的这类细胞信息传导通路进行调控来获得对化疗药物的耐药性。由此可见PI3K/Akt/mTOR 信号传导通路在恶性肿瘤的发生、发展和耐药方面都发挥着重要的作用，因而成为肿瘤干预治疗的新靶点。
PI3K/Akt/mTOR信号传导通路是由 PI3K、Akt和mTOR三种蛋白酶构成，PI3K是一个酯酶，由p85 和p110 组成，其分别具有调节功能和催化功能，当细胞受生长因子等刺激因子刺激后，细胞内PI3K活化，进而磷酸化其底物3,4-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）使其转化为3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）【1】。
Akt，又称蛋白激酶B（PKB），其分子量约为60KD，是原癌基因c-akt表达编码的一种丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶，Akt 家族有Akt1、Akt2、Akt3 三个亚型，又分别称为PKBα、PKBβ、PKBγ，通过血小板-白细胞C激酶同源区和PIP3 结合，并通过磷脂酰肌醇依赖性激酶1,2（PDK1，PDK2）使第308位上的苏氨酸位点（Thr308）和第473位上的丝氨酸位点（Ser473）磷酸化而被激活【2】。活化的PI3K/Akt可能通过TSC1/2复合物进一步激活其下游分子mTOR【3】。mTOR 又称FRAP（FK506-binding protein12 and rapamycin associatedprotein），
由于其羧基末端与PI3K催化区高度同源，故被认为是PI3K相关的蛋白激酶家
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族成员。mTOR可随后磷酸化它的两个下游分子，即翻译抑制分子eIF-4E结合
蛋白1（4E-BP1）和核糖体蛋白p70s6k【4】。4E-BP1磷酸化后失活因而降低与eIF-4E的结合能力使eIF-4E与之分离，并与其他翻译起始因子结合，启动蛋白质的翻译【5、6】。而p70s6k磷酸化后激活其功能，同样促进蛋白质的合成。因此，PI3K/Akt/mTOR被认为是蛋白质合成的主要信号调节通路，参与细胞增殖、分化、迁移等的调节【7】。
PI3K/Akt/mTOR信号传导通路的活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡，促进细胞周期进展，从而促进肿瘤细胞的生存和增殖，同时参与血管形成，在恶性肿瘤的发生、发展和耐药方面发挥重要作用，并参与肿瘤的侵袭和转移。目前，通过基因干预方法敲除或小分子药物抑制PI3K、Akt及相关基因，阻断其对下游多种抗凋亡效应分子的活化，促进细胞凋亡已经成为肿瘤治疗研究的焦点【9】。
在肿瘤细胞系中，抑制mTOR的功能可以消除由PI3K/Akt通路介导的增殖信号，阻断其下游的p70s6k和 4E-BP-1的信号通路，阻断细胞周期在G1期，导致细胞生长停滞【9】。对mTOR有较强特异性抑制作用的药物有3种：Rapamycin、CCI-779和RAD001，前两者的基本作用原理是通过抑制mTOR阻断关键mRNA的翻译，导致细胞周期阻滞；RAD001则是与DNA损伤诱导剂结合，增强肿瘤细胞对其敏感性，促进细胞死亡。CCI-779和RAD001分别进入临床前期实验。抑制PI3K的活化可以避免由于抑制mTOR而产生的Akt反馈性激活【10】，Wortmannin 和LY294002是两种广泛应用的PI3K抑制剂，它们特异性抑制PI3Kpl 10亚单位的催化活性，阻断PI3K/Akt通路的活化，能有效的增加化疗药物对癌细胞的敏感性【11】，但还只限于体外研究。而使用PI3K和mTOR共同的抑制剂进行细胞治疗可以阻滞蛋白质合成和细胞生长。本研究选用的NVP-BEZ235，是一种新型的PI3K/mTOR双重抑制剂。
恶性淋巴瘤（malignant lymphoma）是原发于淋巴结和其他器官淋巴组织的恶性肿瘤，是造血系统恶性疾病之一 ，分霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s
lymphoma，HL）和非霍奇金淋巴瘤（non- Hodgkin’s lymphoma，NHL）两大
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类。近年来非霍奇金淋巴瘤的发病率上升较快，为目前增长速度最快的恶性肿
瘤。非霍奇金淋巴瘤60%左右起源于淋巴结，40%起源于结外淋巴组织，其预后较差。根据WHO2001分型和WHO2008分型，将非霍奇金淋巴瘤分为B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和NK细胞淋巴瘤。
侵袭性T细胞淋巴瘤与侵袭性B细胞淋巴瘤相比，化疗敏感性较差，易复发，预后不良，目前，对于侵袭性T细胞淋巴瘤尚缺乏标准化疗方案，需要探索新的治疗方法予以改善。研究表明：急性T淋巴母细胞白血病中PI3K/Akt/mTOR信号传导通路处于持续活化状态，这就为探讨靶向PI3K/Akt/mTOR信号通路治疗侵袭性T细胞淋巴瘤奠定了研究基础。
大量研究表明，在许多血液性恶性肿瘤中存在该通路的持续激活。Barata 【12】等研究发现，白细胞介素7在维持T淋巴细胞性白血病细胞的存活和增殖的机制中存在PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活；Gray【13】等研究则发现PI3K/Akt/mTOR信号通路是B细胞淋巴瘤细胞株ECH408生长与存活的一个关键调控分子，免疫球蛋白通过PI3K激活其下游的蛋白激酶，促进蛋白合成，从而加速细胞的生长；在套细胞淋巴瘤中Rudelius【14】等通过细胞及活体的分析都发现，侵袭性高的病例都存在磷酸化的Akt，4种MCL细胞株存在磷酸化形式的Akt。
在血液恶性肿瘤中PI3K/Akt/mTOR信号通路还与其耐药机制相关。多药耐药基因P-gp过表达是导致肿瘤细胞抗凋亡能力增强，降低细胞对化疗药物敏感性的原因之一，有研究证实【15】阻断鼠淋巴瘤L121细胞的PI3K/Akt通路，能抑制P-gp基因的转录，从而有效逆转其介导的多药耐药。这为在临床患者治疗中提高化疗疗效提供了很好的实验基础。
本研究旨在探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路在介导人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞对化疗药物表阿霉素诱导细胞凋亡中的作用，通过使用表阿霉素诱导Jurkat细胞凋亡，观察诱导凋亡过程中PI3K/Akt/mTOR信号通路的状态，并了解联合PI3K/mTOR双重抑制剂NVP-BEZ235干预对表阿霉素诱导Jurkat细
胞凋亡的影响，为开展靶向PI3K/Akt/mTOR信号通路治疗侵袭性T细胞淋巴瘤
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提供实验依据。
2.实验材料
2.1细胞
人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞购自上海交通大学医学院细胞分化与凋亡教育部重点实验室 。
2.2主要试剂和抗体
1）胎牛血清及RPMI-1640培养基为GIBCO公司产品。
2）CCK8试剂盒为日本同仁公司产品。
3）表阿霉素由辉瑞公司生产。
4) 注射用青霉素钠，链霉素为哈药集团制药总厂产品。
5）兔抗人Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 、p70s6k单克隆抗体及小鼠抗人p-p70s6k 单克隆抗体均购自美国SANTA CRUZ公司。
6）小鼠抗人β-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠、羊抗兔IgG抗体购自。
7）Bradford蛋白浓度测定试剂盒为碧云天公司产品。
8) Western 一抗稀释液为江苏碧云天公司产品。
9) 分子量蛋白Marker为Fermentas公司产品。
10）Hybond-ECL硝酸纤维素膜为为Amersham公司产品。
11）流式细胞凋亡检测试剂盒购于美国BD公司
12）二甲亚砜（DMSO）、L-谷胺酰胺、乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA， 2Na）、溴酚蓝、Tween-20、Triton X-100、丙烯酰胺（Acr）、亚甲基双丙烯酰胺（Bic）、过硫酸胺（AP）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、抑蛋白酶肽（Aprotinin）、甘氨酸 、十二烷基硫酸钠（SDS）、及Tris碱均为Sigma公司产品。
13）氯化钠、氯化钾、Na
2HPO
4
·12H2O、KH
2
PO
4
、Tween-20、枸橼酸钠、甲醇、盐
酸等国产试剂均为分析纯。
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14）NVP-BEZ235购自上海前尘生物科技有限公司。
2.3主要溶液的配制
2.3.1细胞培养用液：
双抗（青霉素+链霉素）： 青霉素（80万u）溶于40ml超纯水
链霉素（100万u）溶于50ml超纯水
从后者取40ml加入前者，混匀，滤器过滤除菌，
分装后-20℃保存。
RPMI1640生长液： 1640 1000ml
NaHCO3 1.5-2.0g（PH试纸调至7.2）
过滤除菌，分装后4℃保存。
双抗 1%分装DMEM量（现用现加）
胎牛血清 10%分装DMEM量（现用现加）
冻存液 ： 胎牛血清 90%
二甲亚砜（有毒） 10%
分装后-20℃保存。
2.3.2药物：
表阿霉素（EPI）是5%葡萄糖注射液溶解配制成1mmol/L贮存液4℃避光保存。
2.3.3 PBS（pH7.4）： NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Na
2HPO
4
12H
2
O 2.9g
KH
2PO
4
0.2g
超纯水 1000ml
分装后高压灭菌后4℃保存。
2.3.4 Western blot用液：
30 %丙稀酰胺溶液：丙烯酰胺（Acr ） 29 g
亚甲基双丙烯酰胺（Bic ） 1 g
超纯水定容至 100 ml
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37 ℃下溶解后，室温避光保存。
10 % SDS： SDS 10 g
超纯水 100 ml
溶解后，室温保存。
10 % 过硫酸铵（AP）： AP 0.1 g
超纯水 1 ml
现配现用，溶解后4 ℃保存。
1.0 mol/L Tris·HCl（pH 6.8）： Tris 15.14 g
超纯水 200 ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，定容至250 ml，
高压灭菌后4 ℃保存。
1.5 mol/L Tris·HCl（pH 8.8）： Tris 45.43 g
超纯水 200 ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，定容至250 ml，
高压灭菌后4 ℃保存。
电泳缓冲液： Tris 3.03 g
甘氨酸（Gly） 18.77 g
SDS 1 g
超纯水 至1000 ml
溶解后4 ℃保存。
转移缓冲液： Tris 5.8 g
甘氨酸（Gly） 2.9 g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
超纯水 至1000 ml
先用超纯水溶解其它，再加入甲醇，
溶解后4 ℃保存。
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2×SD Sloading buffer： Tris·HCl （pH6.8） 20ml
SDS 20ml
溴酚蓝 5ml
甘油 20ml
β-巯基乙醇 10ml
超纯水 25ml
溶解后分装－20℃保存。
DTT（贮存于－20℃，现用现加）
细胞总蛋白裂解液： 其中PMSF贮存于－20 ℃，临用前加入裂解液中。
10×丽春红染液： 丽春红S 2 g
三氯乙酸 30 g
磺基水杨酸 30 g
超纯水至 100 ml
4 ℃贮存，使用时将其稀释10倍。
20 % Tween： Tween 20 20 ml
超纯水 80 ml
混匀后4 ℃保存。
TBST缓冲液： TBS 400 ml
20 % Tween 1ml
混匀后即可使用，最好现配现用。
封闭液： 脱脂奶粉 5 g
TBST 100 ml
溶解后4 ℃保存。
12 %分离胶和5 %浓缩胶：
（一块胶） 12 %分离胶（5ml） 5 %浓缩胶（2ml）
超纯水 1.6 ml 1.4 ml
30 %Acr/Bic（29：1） 2.0 ml 330 l
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1 JAK-STAT 信号通路 1) JAK 与STAT 蛋白 JAK-STAT 信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。 (1) 酪氨酸激酶相关受体( tyrosine kinase associated receptor ) 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT 信号通路来传导信号，这包括白介素2?7 (IL-2?7 )、GM-CSF (粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)、GH (生长激素)、EGF (表皮生长因子)、PDGF (血小板衍生因子)以及IFN (干扰素)等等。这些细胞 因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK 的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK 的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶JAK ( Janus kinase ) 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体( receptor tyrosine kinase, RTK )，而JAK 却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK 是英文Janus kinase 的缩写，Janus 在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定 SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域(JAK homology domain, JH )，其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3) 转录因子STAT ( signal transducer and activator of transcription ) STAT 被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性 的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具 有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“ GTFLLRFSS ”。 2) JAK-STAT 信号通路 与其它信号通路相比，JAK-STAT 信号通路的传递过程相对简单。信号传递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残 基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位
综述与进展 p38M APK信号转导通路与细胞凋亡研究进展 王誉霖1,张励才2 作者单位：1.安徽省宣城市人民医院麻醉科242000;2江苏徐州医学院作者简介： 王誉霖（1978，女,吉林市人，住院医师，硕士。研究方向：疼痛信号转导及调控。 主题词p38丝裂原活化蛋白激酶类；细胞凋亡;综述 中图分类号R345文献标识码A文章编号1674 8166（201012 1665 03 丝裂原活化蛋白激酶（mitog en2activated pr otein kinase,MA PK级联是细胞内广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶超家族，是将细胞质的信号传递至细胞核并引起细胞核发生变化的重要物质。目前在人类已鉴定了4条MAPK途径:细胞外信号调节蛋白 激酶（ex tra cellular sig nal regulated protein kinase,ERK途径,C Jun 基末端激酶（c Jun N term inal kinase,JN K/应激活化蛋白（stress activated protein kinase,SAPK途 径,ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶1（big MAP MAP kinase,BM K1途径和p38M APK（p38mitogen activated protein kinases,p38MA PK 传导途径［1］。p38 信号途径是 MAPK家族中的重要组成部分，多种炎症因子和生长因子及应激反应可使p38MAPK的酪氨酸和苏氨酸双磷酸化，从而激活p38M APK,使它在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。因此,p38MAPK 通路参与了多种刺激引起的信号级联反应，表明它在引起多种细胞反应中起重要作用，并且,p38在细胞凋亡中也有着重要的调节效应。1 p38M APK信号转导通路 丝裂原活化蛋白激酶（m ito gen activated pr otein kinase,MA PK级联是细胞内重 要的信号转导系统之一。在哺乳动物细胞M APK通路主要有:细胞外信号调节激酶（extracellular signal r eg ulated kinase,ERK ffi路、p38MA PK 通路、c jun 氨基末端激酶（c jun N term inal kinase,JNK通路和ERK5 通路［1］。其中,p38MAPK 是M APK 家族中的重要成员。
经典信号通路之PI3K-AKT-mTOR信号通路 PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，与v．src和v．ras等癌基因的产物相关，且PI3K本身具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。由调节亚基p85和催化亚基p110构成。 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。PI3K活性的增加常与多种癌症相关。 PI3K磷 酸化磷脂酰肌醇PI(一种膜磷脂)肌醇环的第3位碳原子。PI在细胞膜组分中所占比例较小，比磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸含量少。但在脑细胞膜中，含量较为丰富，达磷脂总量的10%。 PI的肌醇环上有5个可被磷酸化的位点，多种激酶可磷酸化PI肌醇环上的4th和5th位点，因而通常在这两位点之一或两位点发生磷酸化修饰，尤其发生在质膜内侧。通常，PI-4,5-二磷酸(PIP2)在磷脂酶C的作用下，产生二酰甘油(DAG)和肌醇-1,4,5-三磷酸。PI3K转移一个磷酸基团至位点3，形成的产物对细胞的功能具有重要的影响。譬如，单磷酸化的PI-3-磷酸，能刺激细胞迁移(cell trafficking)，而未磷酸化的则不能。PI-3,4-二磷酸则可促进细胞的增殖(生长)和增强对凋亡的抗性，而其前体分子PI-4-磷酸则不 然。PIP2转换为PI-3,4,5-三磷酸，可调节细胞的黏附、生长和存活。
PI3K的活化 PI3K可分为3类，其结构与功能各异。其中研究最广泛的为I类PI3K, 此类PI3K为异源二聚体，由一个调节亚基和一个催化亚基组成。调节亚基含有SH2和SH3结构域，与含有相应结合位点的靶蛋白相作用。该亚基通常称为p85, 参考于第一个被发现的亚型(isotype),然而目前已知的6种调节亚基，大小50至110kDa不等。催化亚基有4种，即p110α, β,δ,γ，而δ仅限于白细胞，其余则广泛分布于各种细胞中。 PI3K的活化很大程度上参与到靠近其质膜内侧的底物。多种生长因子和信号传导复合 物，包括成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、人生长因子(HGF)、血管位蛋白I(Ang1)和胰岛素都能启始PI3K 的启动 过程。这些因子启动受体酪氨酸激酶(RTK)，从而引起自磷酸化。受体上磷酸化的残基为异源二聚化的PI3Kp85亚基提供了一个停泊位点 (docking site)。然而在某些情况下，受体磷酸化则会介导募集一个接头蛋白(adaptor protein)。比如，当胰岛素启动其受体后，则必须募集一个胰岛素受体底物蛋白(IRS)，来促进PI3K的结合。相似的，当整连蛋白 integrin(非RTK)被启动后，粘着斑激酶(FAK) 则作为接头蛋白，将PI3K通过其p85停泊。但在以上各情形下，p85亚基的SH2和SH3结构域均在一个磷酸化位点与接头蛋白结合。PI3K募集到活化的受体后，起始多种PI中间体的磷酸化。与癌肿尤其相关的PI3K转化PIP2为PIP3。 PIP3作为锚定物(anchor) 许多蛋白含有一个Pleckstrin Homology(PH)结构域，因而可使其与PI-3,4-P2或PI-3,4,5-P3相结合。这种相互作用可以控制蛋白与膜结合的时间与定位，通过这种方式来调节蛋白的活性。蛋白与脂质间的这种相互作用亦可能引起蛋白构像的变化而改变蛋白的功能。PI3K启动的结果是在质膜上产生第二信使PIP3, PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT和PDK1(phosphoinositide dependent kinase-1)结合, 促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308导致AKT活化。其它PDK1的底物还包括PKC(蛋白激酶C)、S6K(p70S6)和 SGK(serum/glucocorticoid regulated kinases)。AKT, 亦称为蛋白激酶B(PKB)，是PI3K下游主要的效应物。AKT可分为3种亚型(AKT1、AKT2、AKT3或PKBα, PKBβ,PKBγ)，3种亚型的功能各异，但也有重迭。该家族主要有三个成员：AKT1，AKT2和AKT3。其中，Akt1通过抑制细胞凋亡过程参与了细胞生存途径，Akt1酶也能诱导蛋白质的合成途径，因此是一个重要的信号蛋白介导组织的生长。因为它可以阻止细胞凋亡，从而促进细胞的存活，AKT1参与了在许多类型的癌症发生。AKT2是胰岛素信号转导通路中的一个重要信号分子，而AKT3则是主要表达在脑部。它的启动机制是：PI3K可以被g蛋白偶联受体或者受
1 JAK-STAT信号通路 1) JAK与STAT蛋白 JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。 (1) 酪氨酸激酶相关受体（tyrosine kinase associated receptor） 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这包括白介素2?7（IL-2?7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生长激素）、EGF（表皮生长因子）、PDGF （血小板衍生因子）以及IFN（干扰素）等等。这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶JAK（Janus kinase） 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase, RTK），而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK是英文Janus kinase的缩写，Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAK homology domain, JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3) 转录因子STAT（signal transducer and activator of transcription）STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3
【研发前沿】 雷帕霉素衍生物的开发进展 栗东方，陈秀华? （上海医药工业研究院药理室，上海２００４３７） ?综述? 摘要：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ｍＴＯＲ）是很有希孥的抗肿瘤药物的新靶点，针对ｒｏＴＯＲ的小分子抑制剂已成为国内外药物研究的热点，目前已有药物获美国药品食品管理局批准上市。本文综述ｒｏＴＯＲ信号通路的研究进展，以及国外ｒｏＴＯＲ抑制剂的开发进展。 关键词：雷帕霉素：哺乳动物；雷帕霉素靶蛋白；抗肿瘤药物；信号通路 中图分类号：Ｒ９７９．１．９文献标志码：Ａ文章编号：１６７２—９１８８（２０１０）０１—００３１－０４ Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎａｎａｌｏｇｕｅｓ ＬＩＤｏｎｇ－ｆａｎｇ，ＣＨＥＮＸｉｕ－ｈｕａ （ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００４３７，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）ｉｓａｐｒｏｍｉｓｉｎｇｎｅｗｔａｒｇｅｔｆｏｒａｎｔｉｃａｎｃｅｒｄｒｕｇｓ．ＳｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｍＴＯＲｈａｖｅｂｅｃａｍｅａｈｏｔｓｐｏｔｉｎｔｕｌｎｏｒｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄｔｗｏｏｆｔｈｅｍｈａｖｅｂｅｅｎａｐｐｒｏｖｅｄｂｙｔｈｅＦＤＡ．ＴｈｉｓｒｅｖｉｅｗｄｅｓｃｒｉｂｅｄｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｍＴＯＲｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ，ａｓｗｅｌｌａｓｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｍＴＯＲｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒａｐａｍｙｃｉｎ；ｍａｍｍａｌｉａｎ；ｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ；ａｎｔｉｃａｎｃｅｒｄｒｕｇｓ；ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ 酪氨酸激酶主要分为受体型和非受体型，其中受体型酪氨酸激酶（ＲＴＫ）的两条下游信号通路，即Ｒａｓ．促分裂原活化蛋白酶（ＭＡＰＫ）信号通路和磷脂酰肌醇．３激酶／蛋白激酶Ｂ／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Ｐ１３Ｋ／Ａｈ，ｍＴｏＲ）信号通路，是抗肿瘤药物研发的潜在靶点。针对ｒｏＴＯＲ的小分子抑制剂——酪氨酸激酶抑制剂（ＴⅪ）的研究进展很快，已有雷帕霉素衍生物获美国食品药品管理局（ＦＤＡ）批准上市，如ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ于２００７年５月获ＦＤＡ批准用于晚期肾细胞癌（ＲＣＣ）治疗，依维莫司（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）于２００９年３月获ＦＤＡ批准用于治疗舒尼替尼或索拉菲尼治疗失败的晚期ＲＣＣ，同时也有多个关于ｄｅｆｏｒｏｌｉｍｕｓ的临床研究正在进行。目前开发上市的药物克服了雷帕霉素溶解性和稳定性差的问题，有望成为新型抗肿瘤药物。国内有关研究报道尚不多， 收稿１３期：２００９－０７．１５；修回日期：２００９－１０－３０ 作者简介：栗东方，在读硕士研究牛，专业方向：肿瘤药理学。 通讯作者：陈秀华，研究员。硕士研究生导师，从事肿瘤药理学研究。 基金项目：“重大新药刨制”科技重大专项资助（项目编号： ２００９ＺＸ０９３０１－００７） ３ｌ本文就ｍＴＯＲ信号通路及雷帕霉素衍生物的研究开发进展作一综述。 １ｍＴＯＲ信号通路 酪氨酸激酶是与细胞增生分化密切相关的细胞信号转导通路的关键酶，其与肿瘤发生发展关系密切，其异常表达可直接导致肿瘤的发生，并与肿瘤转移、血管生成和对化疗的耐药有关。 ＲＴＫ是目前抗肿瘤药物潜在靶点研究的重点（已报道５８种）Ⅲ。其Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号通路中，Ｐ１３Ｋ可激活Ａｋｔ，并最终激活ｍＴＯＲ。ｍＴＯＲ是细胞生长增生的中心调控者旧４Ｊ，直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调控。人体多种肿瘤细胞中可见ｍＴＯＲ通路的失调。 ｍＴＯＲ在细胞内以两种不同的复合物形式存在，即Ｃｌ和Ｃ２。已知的ｍＴＯＲ对肿瘤细胞生长、分化和代谢的作用均由Ｃｌ完成。Ｃ１促进蛋白质合成并抑制Ｐ１３刚Ａｋｔ通路的分子机制尚不明确，但很多肿瘤中Ｃ１通路活化，且Ｃ１对雷帕霉素及类似物敏感Ｈｏ。Ｃ１通过两种途径调节下游核糖体和 万方数据
cAMP信号通路 信号分子：1.激素 2.局部介质3.神经递质 受体：G蛋白偶联受体 胞内应答过程：激素→G蛋白耦联受体→G蛋白→腺苷酸环化酶→cAMP→依赖cAMP的蛋白激酶A→基因调控蛋白→基因转录 举例：1.多发性骨髓瘤：通过调变细胞内环腺苷酸浓度可以诱导多种肿瘤细胞增殖阻滞和凋亡，成为肿瘤治疗新途径。 2.肝损伤：对乙酰氨基酚致药物性肝脏损伤可能与cAMP-PKA 信号通路有关。 3.研究人员已经确定了这其中的机制，现在，一种能抑制Epac的新的候选药物——称为ESI Epac特异性抑制剂，也已经被证明能够保护正常小鼠免受致命性立克次氏体感染。目前，研究人员正在设计第二代ESI——更有效，即使在最高剂量也无毒。也有来自预备试验的迹象表明，ESI能够保护动物抗击一些致命的病毒感染。 磷脂酰肌醇信号通路 信号分子：1.激素 2.局部介质3.神经递质 受体：酶耦联型受体 胞内应答过程：Ca2+活化各种Ca2+结合蛋白引起细胞反应，钙调素（calmodulin，CaM）由单一肽链构成，具有四个钙离子结合部位。结合钙离子发生构象改变，可激活钙调素依赖性激酶（CaM-Kinase）。细胞对Ca2+的反应取决于细胞内钙结合蛋白和钙调素依赖性激酶的种类。 IP3信号的终止是通过去磷酸化形成IP2，或被磷酸化形成IP4。Ca2+由质膜上的Ca2+泵和Na+-Ca2+交换器将抽出细胞，或由内质网膜上的钙泵抽进内质网 DG通过两种途径终止其信使作用：一是被DG-激酶磷酸化成为磷脂酸，进入磷脂酰肌醇循环；二是被DG酯酶水解成单酯酰甘油。由于DG代谢周期很短，不可能长期维持PKC活性，而细胞增殖或分化行为的变化又要求PKC长期活性所产生的效应。现发现另一种DG生成途径，即由磷脂酶催化质膜上的磷脂酰胆碱断裂产生的DG，用来维持PKC的长期效应。 举例：1.肿瘤治疗：该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活,其活性异常不仅能导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关。 2.肝癌：PIK3R1在肝癌组织中表达上调,PIK3R1可能通过激活PI3K/AKT信号通路促进HepG2细胞的增殖. 生物技术15-1 曹文祥
1JAK-STAT信号通路 1)JAK与STAT蛋白 JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。(1)酪氨酸激酶相关受体（tyrosinekinaseassociatedreceptor） 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这包括白介素2?7（IL-2?7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生 长激素）、EGF（表皮生长因子）、PDGF（血小板衍生因子）以及IFN（干扰素）等等。这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK 的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2)酪氨酸激酶JAK（Januskinase） 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosinekinase,RTK），而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK是英文Januskinase的缩写，Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸、JAK1个成员：4蛋白家族共包括JAK结构域的信号分子。SH2化多个含特定
JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAKhomologydomain,JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3)转录因子STAT（signaltransducerandactivatoroftranscription）STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“GTFLLRFSS”。 2)JAK-STAT信号通路 与其它信号通路相比，JAK-STAT信号通路的传递过程相对简单。信号传 递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”（dockingsite），同时含有SH2结构域的STAT蛋白被招募到这个“停泊位点”。最后，激酶JAK 催化结合在受体上的STAT蛋白发生磷酸化修饰，活化的STAT蛋白以二 聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录。值得一提的是，一种JAK激酶可以参与多种细胞因子的信号转导过程，一种细胞因子的信号通路也可以激活多个JAK激酶，但细胞因子对激活的STAT分子却具有一定的选择性。例如IL-4激活STAT6，而IL-12 。STAT4却特异性激活
雷帕霉素免疫抑制和抗肿瘤双重效应的研究进展雷帕霉素（RAPA）是一种大环内酯类抗生素，最初RAPA在临床上主要 作为一种强力的免疫抑制剂而广泛使用，其对多种自身免疫性疾病有显著疗效，而且在器官移植术后显示出良好的抗排斥反应活性，副作用较小，近年来又发现其具有抗肿瘤作用，是一种具有免疫抑制和抗肿瘤双重作用的药物。本文就雷帕霉素（RAPA）双重药理作用的研究进展作一简要综述。 标签：雷帕霉素；免疫抑制剂；抗肿瘤 传统的免疫抑制剂如硫唑嘌呤（AZA）、环孢素（CsA）等在临床上得到广泛应用，但其过敏反应、肝肾毒性、骨髓抑制等副反应屡见不鲜，尤其会带来一个严重的并发症，那就是增加肿瘤风险，Guba等[1]动物实验发现，环孢素A可诱发小鼠原发和转移性肿瘤发生，新型免疫抑制剂雷帕霉素免疫效应是环孢素10倍以上，而且还具备抗肿瘤效应，免疫抑制剂量（1.5mg/kg）的雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）可以使小鼠肝脏原发与转移性肿瘤的体积缩小70%，使鼻咽部肿瘤的体积缩小87%，可显著延长带瘤小鼠的生存周期。它的双重功效不仅可以使其单独针对性应用于临床，还可以应用于需免疫抑制和抗肿瘤联合治疗的交叉领域。 1 雷帕霉素 RAPA是Vezina和She gal从加拿大Rapa Nui岛的土壤中分离的一种具有抗真菌作用的三烯大环内酯类化合物，分子式为C51H79NO13，化学结构与同类免疫抑制剂他克莫司（FK506）相似，为白色或微黄色固体结晶，熔点为183～185℃，亲脂性，易溶于甲醇、丙酮、氯仿、乙醇等有机溶剂，几乎不溶于乙醚和水。最初被研究作为低毒性的抗真菌药物，从1977年发现其具有免疫抑制作用，1989年把RAPA首次作为治疗器官移植排斥反应药物，近年又发现其具有抗肿瘤的作用，其独特的双效性使其具有广阔的临床开发应用前景。 2 雷帕霉素的作用机制 2.1 雷帕霉素的免疫抑制机制 （1）雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，将免疫细胞（T细胞和B细胞）滞留于G1/S期，阻止免疫细胞进入S期及抑制DNA的合成，从而抑制免疫细胞的生长、增殖[2]。（2）雷帕霉素抑制IL-2以及其他的免疫分子的合成，从而抑制机体免疫功能的发挥[3-4]。（3）抑制IgG和供者特异性抗体（细胞毒抗体）产生。 2.2 雷帕霉素的抗肿瘤机制 （1）雷帕霉素通过雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路抑制细胞从G1到S
Rheumatol Int DOI 10.1007/s00296-014-3137-5 Role of integrins and their ligands in osteoarthritic cartilage Jian Tian · Fang?Jie Zhang · Guang?Hua Lei Received: 25 May 2014 / Accepted: 17 September 2014 ? Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014 [1]. Radiographic evidence of OA occurs in the majority of people by 65 years of age, and among them about 80 % in people who aged over 75 years [2]. However, the pathogen-esis of this disease is not fully elucidated. Cartilage damage is one of the major pathological changes in OA. Articular cartilage is an avascular, a neu-ral, alymphatic, and viscoelastic connective tissue that functions autonomously to bear loads and provide almost friction-free movement of diarthrodial joints [3]. Chondro-cytes, the only cell population of adult articular cartilage, are strongly involved in maintaining the dynamic equi-librium between synthesis and degradation of the extra-cellular matrix (ECM) [4]. Collagens represent the major structural components of the articular cartilage. Cartilage is made up of two main ECM macromolecules: type II collagen and aggrecan, a large aggregating proteoglycan [5, 6]. Cartilage destruction is thought to be mediated by two main enzyme families: the matrix metalloproteinases (MMPs) are responsible for the cartilage collagen break-down, whereas enzymes from disintegrin and metallopro-teinase domain with thrombospondin motifs (ADAMTS) family mediate cartilage aggrecan loss [7]. Activation of biochemical pathways involves the production of proin-flammatory cytokines, inflammation, degradation of the ECM by MMPs and ADAMTS, and cessation of ECM syn-thesis via dedifferentiation and apoptosis of chondrocytes [8, 9]. Therefore, the ECM is a vital cellular environment, and interactions between the cell and ECM are important in regulating many biological processes, which include cell growth, differentiation, and survival [10, 11]. Cell–matrix interactions control cell function and behav-ior by signal transduction through a variety of cell sur-face receptors. The integrins are the major family of ECM receptors, which can transmit information from the matrix to the cell. Integrin binding of ECM ligands results in the Abstract Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease, which is characterized by articular cartilage destruction, and mainly affects the older people. The extracellular matrix (ECM) provides a vital cellular environment, and interactions between the cell and ECM are important in reg-ulating many biological processes, including cell growth, differentiation, and survival. However, the pathogenesis of this disease is not fully elucidated, and it cannot be cured totally. Integrins are one of the major receptors in chondro-cytes. A number of studies confirmed that the chondrocytes express several integrins including α5β1, αV β3, αV β5, α6β1, α1β1, α2β1, α10β1, and α3β1, and some integrins ligands might act as the OA progression biomarkers. This review focuses on the functional role of integrins and their extracellular ligands in OA progression, especially OA car-tilage. Clear understanding of the role of integrins and their ligands in OA cartilage may have impact on future develop-ment of successful therapeutic approaches to OA.Keywords Chondrocyte · Integrin · Fibronectin · Tenascin C · Osteopontin · Osteoarthritis · Cartilage Introduction Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease and is char-acterized by articular cartilage destruction along with changes occurring in other joint components including bone, menisci, synovium, ligaments, capsule, and muscles Rheumatology INTERNATIONAL J. Tian · F.-J. Zhang · G.-H. Lei (*) Department of Orthopaedics, Xiangya Hospital, Central South University, No. 87 Xiangya Road, Changsha 410008, Hunan, China e-mail: gh.lei9640@https://www.doczj.com/doc/de6904146.html,; lgh9640@https://www.doczj.com/doc/de6904146.html,
目录 actin肌丝 (5) Wnt/LRP6 信号 (7) WNT信号转导 (7) West Nile 西尼罗河病毒 (8) Vitamin C 维生素C在大脑中的作用 (10) 视觉信号转导 (11) VEGF，低氧 (13) TSP-1诱导细胞凋亡 (15) Trka信号转导 (16) dbpb调节mRNA (17) CARM1甲基化 (19) CREB转录因子 (20) TPO信号通路 (21) Toll-Like 受体 (22) TNFR2 信号通路 (24) TNFR1信号通路 (25) IGF-1受体 (26) TNF/Stress相关信号 (27) 共刺激信号 (29) Th1/Th2 细胞分化 (30) TGF beta 信号转导 (32) 端粒、端粒酶与衰老 (33) TACI和BCMA调节B细胞免疫 (35) T辅助细胞的表面受体 (36) T细胞受体信号通路 (37) T细胞受体和CD3复合物 (38) Cardiolipin的合成 (40) Synaptic突触连接中的蛋白 (42) HSP在应激中的调节的作用 (43) Stat3 信号通路 (45) SREBP控制脂质合成 (46) 酪氨酸激酶的调节 (48) Sonic Hedgehog (SHH)受体ptc1调节细胞周期 (51) Sonic Hedgehog (Shh) 信号 (53) SODD/TNFR1信号 (56) AKT/mTOR在骨骼肌肥大中的作用 (58) G蛋白信号转导 (59) IL1受体信号转导 (60) acetyl从线粒体到胞浆过程 (62) 趋化因子chemokine在T细胞极化中的选择性表达 (63) SARS冠状病毒蛋白酶 (65) SARS冠状病毒蛋白酶 (67) Parkin在泛素-蛋白酶体中的作用 (69)
雷帕霉素 NO STRUCTURE 产品编号：ALG-A03574 中文名称：雷帕霉素 英文名称：Rapamycin 别名：雷帕霉素;西罗莫司;雷帕霉素,99%;瑞帕霉素;西罗莫司(雷帕霉素);西罗莫司口服液;雷帕霉素/西罗莫司;雷帕酶素 AY 22989;23,27-EPOXY-3H-PYRIDO(2,1-C)(1,4)OXAAZACYCLOHENTRIACONTINE;NSC-226 080;RAPA;RAPAMUNE;RAPAMYCIN;RAPAMYCIN, STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS;RPM CAS：53123-88-9 MDL：MFCD00867594 分子式：C51H79NO13 分子量：914.17 产品说明
用途:免疫抑制剂。 免疫抑制剂：雷帕霉素(RAPA)是一种新型大环内酯类免疫抑制剂,为白色固体结晶，熔点为183-185℃，亲脂性，溶解于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂，极微溶于水，几乎不溶于乙醚。早在20世纪70年代就被研发出来，起初被作为低毒性的抗真菌药物,1977年发现具有免疫抑制作用,1989年开始把RAPA作为治疗器官移植的排斥反应的新药进行试用,从动物实验及临床应用的效果看，是一种疗效好，低毒，无肾毒性的新型免疫抑制剂。现在经常作为维持移植器官免疫能力的药物（特别是肾移植），以减缓器官移植手术后的免疫排斥反应,然而科学家近期发现它另外一种用途：可用于治疗阿尔茨海默症(老年性痴呆)。令他们颇感兴趣的是，雷帕霉素的主要成分也存在于复活岛隔离土壤中的细菌产物，最新实验表明该物质施用在实验老鼠患体上可起到恢复识记缺陷能力。 雷帕霉素属大环内酯类抗生素，与普乐可复（FK506）的结构相似，但却有非常不同的免疫抑制机制。FK506抑制T淋巴细胞由G0期至G1期的增殖，而RAPA则通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，和FK506相比，RAPA可阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞的钙依赖性和非钙依赖性的信号传导通路。 芝加哥大学医学研究人员利用市售雷帕霉素口服片加上葡萄柚汁治疗黑色素瘤（一种欧美人常见的恶性肿瘤疾病），可大大提高其他化疗药物的抗癌效果，从而延长患者的存活时间。研究表明，雷帕霉素在进入消化道后很容易被酶分解，而葡萄柚汁里含大量的呋喃香豆素类成分，后者能抑制消化道酶对雷帕霉素的破坏作用，故能提高雷帕霉素的生物利用度。据说最早荷兰医生已发现：葡萄柚汁具有提高山地明的口服吸收效果的作用，现欧美国家医生将其应用到雷帕霉素制剂上。 贮存:贮存温度-20℃
CELL DEATH AND CELL-CYCLE CHECKPOINT DURING DNA DAMAGE 细胞死亡及周期阻滞基本信号通路 有哪些因素可引起DNA损伤？DNA损伤的结局如何？ （课件） (一)DNA损伤的原因 环境因素，化学因素，生物因素例如： UV ,离子辐射，基因毒性化学试剂引起ssDNA/dsDNA 损伤，DNA两条链交联或链内交联。正常细胞线粒体的一些代谢物（ROS）活泼氧类过多引起损伤。 (二) DNA损伤结局： 急性效应：干扰核酸代谢，触发细胞周期阻滞或死亡 长期效应：不可逆转突变导致肿瘤 细胞周期阻滞，衰老，肿瘤/癌症，有丝分裂危象 (一)DNA损伤的原因 1.DNA分子的自发性损伤 (1)DNA复制中的错误。 (2)DNA的自发性化学变化 a.碱基的异构互变性损伤 b.碱基的脱氨基作用 c.脱嘌呤与脱嘧啶 d.碱基修饰与链断裂 2.物理因素引起的DNA损伤 (1)紫外线引起的DNA损伤 (2)电离辐射引起的DNA损伤 a.碱基变化 b.脱氧核糖变化 c.DNA链断裂 d.交联 3.化学因素引起的DNA损伤 (1)烷化剂对DNA的损伤 a.碱基烷基化 b.碱基脱落 c.断链 d.交联 (2)碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤 DNA损伤的后果 1.点突变(point mutation)指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transition)；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换(transvertion)。 2.缺失(deletion)指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。 3.插入(insertion)指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动(reading frame shift)，使其后所译读的 氨基酸序列全部混乱，称为移码突变(frame shift mutaion)。 4.倒位或转位(transposition)指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 5.双链断裂已如前述，对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 （2）THE CONSEQUENCES OF DNA INJURY
万方数据
综述?ＲｅｖｉｅｗＰａｐｅｒｓ 图１ｍＴＯＲ信号通路的基本结构 变胰岛素受体酶解物（ＩＲＳＩ）【７Ｊ，进而活化Ｐ｜３Ｋ，从而进一步激活Ａｋｔ（ＰＫＢ），活化的Ａｋｔ可以直接磷酸化ｍＴＯＲ。Ｐ１３Ｋ可催化细胞膜磷脂产生磷脂酰肌醇三磷酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ一３，４，５一ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＩＰ３），从而招募激活更多的Ａｋｔ／ＰＫＢ【８ｌ。近年来，研究发现Ａｋｔ还可能间接通过ＴＳＣｌ／ＴＳＣ２（ｔｕｂｅｒｏｕｓｓｃｌｅｒｏｓｉｓＣＯＢ—ｐｌｘ，ＴＳＣ）复合物激活其下游分子ｍＴＯＲ［９１。ＴＳＣＩ／ＴＳＣ２异二聚体复合物是ｍＴＯＲ上游的负性调控因子，与ｍＴＯＲ结合后起到抑制其活性的作用。当ＡＫＴ磷酸化ＴＳＣ２的Ｓｅｒ９３９和Ｔｈｒｌ４６２后，抑制了ＴＳＣｌｔＩＳＣ２复合物的形成，导致ｍＴＯＲ不再受ＴＳＣｌ／ＴＳＣ２复合物抑制而激活。Ｒｈｅｂ（Ｒａｓｈｏｍｏｌｏｇｅｎｒｉｃｈｅｄｉｎｂｒａｉｎ）是ｍＴＯＲ上游的一个正向调控因子，在哺乳动物细胞中过表达可使ｒｏＴＯＲ在无生长因子作用下活化，ＴＳＣ对Ｒｈｅｂ具有ＧＡＰ活性，可使有活性的ＧＴＰ结合的Ｒｈｅｂ转化成无活性的ＧＤＰ结合形式【１０ｌ。ＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｎｄｔｅｎｓｉｎｈｏｍｏｌｏｇｄｅ—ｌｅｔｅｄｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｔｅｎ）是该通路的负调节剂，它通过抑制Ｐ１３Ｋ和ＡＫＴ实现负调节作用。ＰＴＥＮ的缺失或失活会导致ＡＫＴ的激活…ｌ。 调节ｒｏＴＯＲ活性的另一条信号通路是ＬＫＢＩ／ＡＭＰＫ／ｍＴＯＲ信号通路，ＬＫＢｌ能磷酸化激活ＡＭＰ激酶（ＡＭＰＫ）相关激酶家族蛋白。ＡＭＰＫ是细胞重要的能量感受器，在调节代谢和能量平衡等方面具有重要的作用【１２ｌ。 ２．２ｍＴＯＲ信号通路的下游调控靶点下游信号转导由ｍＴＯＲ调节的下游分子主要是激酶。激活后的ｍＴＯＲ可调节２条不同的下游通路：核糖体Ｓ６蛋白激酶（Ｓ６Ｋ）和真核细胞始动因子４Ｅ结合蛋白１（４ＥＢＰｌ）［１３１。４ＥＢＰＩ和Ｓ６Ｋ１是最广泛研究的ｒｏＴＯＲ的底物。它们是蛋白翻译的关键调节因子。核糖体Ｓ６蛋白经Ｓ６Ｋ作用磷酸化，这样便增强了含嘧啶基 《》中固耄教囊忿 ２０１０年第４６卷第１期 因ｍＲＮＡ的翻译功能，这些ｍＲＮＡ经常编码一些核糖体蛋白和其他翻译调节蛋白【１４１。４ＥＢＰｌ是ｍＴＯＲ的另外一个靶点，它通过和真核细胞翻译启动因子４Ｅ（ｅｌＦ一４Ｅ）结合，从而抑制蛋白翻译。４ＥＢＰＩ经ｍＴＯＲ作用后发生磷酸化，导致４ＥＢＰｌ从ｅｌＦ一４Ｅ释放出来，从而降低了４ＥＢＰｌ对ｅｌＦ一４Ｅ依赖的翻译起始的抑制作用。由于ｅｌＦ一４Ｅ的表达增高，这样便增加了一组促进细胞生长的关键蛋白的翻译ｎ５１。激活ｒｏＴＯＲ信号通路是通过Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ途径来实现的。 ３ｍＴｏＲ在信号通路中的功能 ｍＴＯＲ作为一种蕈要的调节基因通过调节细胞周期、蛋白质合成和降解、细胞能量代谢等多种途径发挥重要的牛理功能，在细胞增殖、生长、分化，以及调节动物摄食，调节脂肪代谢等过程中起着中心调控点的作用【１６ｌ。 ３．１ｍＴＯＲ是一种重要的信号调控分子ｍＴＯＲ通过磷酸化作用调控与生长相关而互不相同的多条信息途径，调控细胞内ｍＲＮＡ的翻译，参与膜蛋白转运，蛋白质降解，蛋白激酶Ｃ信号转导和核糖体合成以及肿瘤的发生【１７１。 ３．２ｍＴＯＲ对动物生长起重要的调控作用ｍＴＯＲ主要通过生长因子和营养来调节细胞生长【１８Ｊ。生长因子包括胰岛素和胰岛素样生长因子（ｉｎｓｕｌｉｎ—ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ’ＩＧＦ）；营养包括各种氨基酸和葡萄糖。ｍＴＯＲ激酶通过多条信号通路实现对细胞生长的调 节作用：一条是生长因子激活通路，经Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ途径；另一条是细胞外氨基酸通路；再一条是经ＬＫＢｌ／ＡＭＰＫ途径。 以ｒｏＴＯＲ激酶为中心环节的信号转导通路可以感受细胞所处环境中营养状况以及ＡＴＰ的状况，并将生长信号传递给下游的靶蛋白；同时ｍＴＯＲ又可以被ＰＤＫ激酶系统所激活，感受生长因子的信号，从而调节细胞的生长、细胞周期的进程以及机体的生长发育。研究证明，营养素进入通路之后可以促进羊体胎儿平滑肌细胞及软骨细胞的增殖与生长，从而证明了ｒｏＴＯＲ对动物机体具有促生长作用。Ｒｕｖｉｎｓｋｙｉｉ９］对小鼠注射雷帕霉素，发现小鼠出现了消瘦乃至死亡的表现，说明ｍＴＯＲ可通过信号通路促进动物机体的生长发育。 ３．３抑制动物摄食、调节能量代谢ｒｏＴＯＲ转换代 万方数据