流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚
流式细胞术得临床应用 一、在肿瘤学中得应用 这就是FCM在临床医学中应用最早得一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞得DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA与RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到得与DNA结合得PI得荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量得多少。由于细胞周期各时相得DNA含量不同，通常正常细胞得G1 / GO 期具有二倍体细胞得DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞得DNA含量((4 N)，而S期得DNA含量介于二倍体与四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期与G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相得百分率，DNA含量直接代表细胞得倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变得漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常得体细胞均具有比较稳定得DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能得癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量得异常改变，FCM可精确定量DNA含量得改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中得一个有价值得标志，能对癌前病变得性质及发展趋势作出估价，有助于癌变得早期诊断。有资料证实，癌前病变得癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度得加重，DNA非整倍体出现率增高，这就是癌变得一个重要标志。 2、在肿瘤得诊断、预后判断与治疗中得作用 FCM在肿瘤诊断中得重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰得存在可为肿瘤诊断提供有力得依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后得判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变得复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤得预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图得变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要得意义。临床医师可以根据细胞周期各时相得分布情况，依据化疗药物对细胞动力学得干扰理论，设计最佳得治疗方案，从DNA直方图直接地瞧到瘤细胞得杀伤变化，及时选用有效得药物，对瘤细胞达到最大得杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡与多药耐药基因得研究中得作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡得早期阶段，胞浆膜磷脂得不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异得Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不就是细胞凋亡特有得，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡得早期细胞膜就是完整得，而细胞坏死时细胞膜得完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整得活细胞与早期凋亡细胞就是拒染得，而对膜完整性被破坏得晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞与坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死与
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 流式细胞技术临床应用及研究 1 流式细胞技术临床应用及研究流式细胞技术是激光为光源，集流力学技术，电子物理技术，光电测量技术，计算机技术以及细胞荧光化学技术，单克隆抗体技术为一体的新型技术仪，应用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒经行快速的，多参数的，定量分析和分选技术称为流式细胞技术（FCM）［1］。 其中生物颗粒包括大的免疫复合物，DNA，RNA，蛋白质，病毒颗粒，脂质体，细胞器，细菌，染色体，真核细胞，杂交细胞，聚集细胞等，所检测的生物颗粒理化性质包括大小，细胞形态，胞浆颗粒化程度，DNA 含量，总蛋白含量，细胞膜的完整性和酶活性学。 由于融合了单克隆抗体技术，定量细胞化学和定量荧光化学，流式细胞技术作为一门生物检测技术已经日臻完善，流式细胞或在生物学，免疫学，胞瘤学，血液学，病理性，遗传学，临床检验等学科中都得到广泛的应用，并将为医学科学研究发挥更大的作用。 1 生物分析原理将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放入样品管，在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品在喷嘴附近组成一个圆 2 柱流束自喷嘴的圆形孔喷出，于水平方向的激光束垂直相交，相交点成为测量区。 染色的细胞经激光照射后发出荧光，同时产生光散射。 1 / 6
山西大学研究生学位课程论文（2013 ---- 2014 学年第一学期） 学院（中心、所）：生物技术研究所 专业名称：微生物学 课程名称： 论文题目：流式细胞仪的原理及其应用 授课教师（职称）：崔晓东 研究生姓名：常姣 年级：研一 学号：201323001003 成绩： 评阅日期： 山西大学研究生学院 年月日
流式细胞仪的原理及其应用 姓名常姣专业微生物学 摘要本文简要论述了流式细胞仪( flowcyt ometry, FCM) 的工作原理, 并对其某些科学领域研究中的应用进行阐述, 包括在生物学、免疫学、临床学中的研究应用。 关键词 FMC；生物学；免疫学；临床学 流式细胞仪( fl o w c y to me tr y, F CM) 研制、发展、革新和应用领域的扩展，都是由生物学、生物技术、计算机科学、电子工程学、流体力学、激光技术、分子生物学、有机化学和物理学等多个学科综合发展和应用而实现的。近代流式细胞仪，由于单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、临床医学等众多研究领域的应用愈来愈广泛和重要，尤其在生物学中对细胞周期的动力学分析、细胞因子、细胞凋亡、信号传导、R N A / D N A 的分析、细胞表面受体及特异性抗原的分析等领域发挥着独特作用，具有操作简单、分析精确、重复性好、费用低廉、分析速度快等优点。 1流式细胞仪的构成及工作原理 流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统和细胞分选系统五个部分组成。将待测细胞制成单细胞悬液, 经荧光染料染色后加入样品管, 在一定气体压力下待测样品被压入流动室。待测细胞在鞘液的包裹下单行排列, 依次通过检测区, 被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后, 产生散射光和荧光信号。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管(PMT) 接收。散射光分为前向角散射(forwardscatter, FSC) 和侧向角散射(sidescatter, SSC) 。前者主要反映被测细胞的大小, 后者主要反映被测细胞的胞质、胞膜、核膜的折射等, 以及细胞内颗粒的性状。光信号通过波长选择通透性滤片后, 经光电倍增管接收后转为电信号, 再经数/模转换器转换为可被计算机识别的数学信号, 以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来[1,2]。 流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选, 它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体, 可以产生高频振荡, 使液流断裂为均匀的液滴, 待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷, 当带电液滴通过电场, 便会在电场的作用下发生偏转, 然后落入相应的收集器中, 从而实现细胞分选[2]。 2流式细胞仪的应用 流式细胞术的应用，简单用一句话概括就是，凡能被荧光分子标记的细胞或微粒均能用流式细胞仪检测。其中细胞生物学领域是流式细胞术在基础研究中应用范围最广泛的领域，因为最初这个技术就是为此目的而设计的。 2.1流式细胞仪在生物学中的应用 流式细胞仪在生物学中的应用越来越广泛,如在细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学、神经生物学、微生物学、分子免役学、植物学等等许多生物学基础学科的应用和在细胞凋亡、细胞周期调控、细胞因子及细胞分型等研究中的应用[3]。 2.1.1 对凋亡细胞的分析 细胞凋亡是生物体生长发育过程中出现的正常现象, 在生物体形态构成、正常细胞更替以及维持
流式细胞术的原理及临床应用 马洪星1 张春斌2 汪晶冰1 庞玉军1 张丽岩2 (1.黑龙江省大庆油田总医院检验科,163001 2.黑龙江省佳木斯大学基础医学院生物教研室)中图分类号: R331 文献标识码:A 文章编号:1006-9534(2003)04-0145-02 流式细胞术(flow cytometry)是20世纪70年代发展起来的对单细胞定量分析的一种新技术,它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,具有极高的检测速度与统计精确性,而且从单一细胞可以同时测得多个参数,为生物医学与临床检验提供了一个全新视角和强有力的手段。目前,随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,在细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等领域内发挥着重要作用[1]。 一、流式细胞仪检测的原理[2,3] 流式细胞仪主要包括以下几个组成部分:激光系统、流动系统、信号处理及放大的系统、计算机系统。当待测标本被制成单细胞悬液,经染色后进入流动室,流动室充满流动的鞘液,鞘液压力与样品流压力是不同的,当两者的压力差异达到一定程度时,鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。若将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料,那么这些染料将在细胞通过激光检测区时受激发产生特定波长的荧光,通过一系列信号转换、放大、数字化处理、就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料,可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征,如果对具有某种特征的细胞有兴趣,还可以利用流式的分选功能将其分选出来,以便进一步培养、研究。 二、流式细胞仪在免疫学中的应用[4] (1)淋巴细胞亚群分析:淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群,在免疫应答过程中,末梢血淋巴细胞发育成为功能不同的亚群。各亚群的数量和功能发生异常时,就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化。FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原,将不同的淋巴细胞亚群(包括CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++56+)区分开来,并计算出CD4+/CD8+的比例,可通过对患者淋巴细胞各亚群数量的测定来监控患者的免疫状态,指导治疗。 (2)感染及其疗效观察:由于T淋巴细胞在人体的免疫系统中承担着重要功能,因此当感染发生时,T淋巴细胞各亚群的变化往往能很敏感地反映感染的状态和程度。当病毒感染发生时(如乙型肝炎.EB病毒和巨细胞病毒)CD8+细胞增多,对CD8+T细胞测定有助于对感染的诊断、治疗效果的动态观察。 (3)流式细胞仪可以对器官移植和骨髓移植后的患者进行监控。当患者CD3+、、CD25+持续增加提示已开始发生排异,CD4/CD8持续下降,表明有感染发生,当其比值小于012时必须停用免疫抑制剂。 (4)免疫性疾病分析:SL E患者的淋巴细胞变化可以反映该病的活动情况和器官侵犯程度,活动或非活动性伴有多系统疾病,但无肾脏损害的患者可出现CD4/CD8T比值增高,伴有严重肾脏损害的SL E患者可出现低CD4+。高CD8+的现象。 (5)利用流式细胞术检测阵发性睡眠性血红蛋白尿(PHA),根据血细胞的细胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂(GPI)所连接的蛋白,如DFA(CD55)与MIRI(CD59),来确诊此病,比传统的血清溶血试验具有更高的特异性与敏感性。 (6)HLA群体分析:FCM运用HLA-B27特异性单克隆抗体检测抗原,其敏感性较传统的微量细胞毒实验大大提高,有助于强直性脊柱炎的辅助诊断。 (7)AIDS中的应用:用于CD4+细胞的绝对计数(CD4+阳性细胞是HIV病毒特异侵染细胞),另外还可以监测病程和治疗过程中患者的免疫状态,估计预后。 三、FCM在细胞生物学中的应用 (1)细胞周期分析 在细胞周期内,DNA含量随时相发生周期性的变化。通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定,可分析细胞周期各时相细胞的百分比,周期动力学参数以及DAN异倍体。 (2)可利用与钙离子特异结合的荧光染料和激发光谱或发射光谱是p H值依赖荧光染料进行细胞内钙离子浓度测定和细胞内p H值测定。 四、FCM在肿瘤中的应用 (1)肿瘤诊断 DNA非整倍体的出现是癌变的一个重要标志。细胞的增值能力大小也可反映肿瘤的生物学特征。因此临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍体分析。辅助肿瘤诊断,包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面[5]。 (2)肿瘤预后估计 异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道,在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中,异倍体和/或较高的S期比率都是不良的预后标志。同样地,在肺癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和白血病中,亦有类似发现。因此在病理组织学分级、临床分期等指标基础上,用流式细胞仪监测肿瘤
流式细胞仪（Flow Cytometry） 1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。 1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。 宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。 2 流式细胞仪的工作原理和技术指标 2．1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。 流动室和液流系统
流式细胞术及其应用教程 The course of flow cytometry and its application 课程简介 该课程包括理论和实习两部分，理论课程重点介绍与流式细胞术密切相关的基本原理、结构及其在临床和科研工作中的应用。内容包括流式细胞术的基本原理、流式细胞仪数据的采集和分析、血细胞分化发育过程、流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学及科研工作中的应用。通过理论授课使研究生能够掌握上述领域的基本理论和最新研究进展，达到提高研究生流式细胞术应用水平、拓展研究生思路、开阔眼界，为培养复合型人才打下基础。实习内容包括标本制备、仪器的调节与质控、淋巴细胞亚群分析、HLA-B27检测、胞膜、内抗原检测、红细胞CD55、CD59检测、血小板膜糖蛋白分析、DNA倍体分析及细胞因子检测。通过实习使研究生进一步熟悉流式细胞仪的使用程序，操作规程，为今后的工作、学习提高帮助。 This course includes in lecture teaching and practice lesson. The lecture teaching will be focused on flow cytometric basic theory, structure, data collection and analysis, application in clinic and research. The practice lesson will be focused on sample preparation, instrument setting, analysis of lymphocytes, HLA-B27，extracellular antigen and intracellular antigen, analysis of CD55,CD59, DNA ploidy analysis and cytokine detection. 教学大纲 一、课程名称：流式细胞术及其应用教程 二、总学时数：38学时，2学分 理论课18学时 实验课20学时 三、授课对象： 博士生、硕士生，专业不限
流式细胞术样品制备技术 流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。 流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。 第1节样本单细胞悬液的制备方法 一新鲜实体组织样本的制备 FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。 （一）酶消化法 1 作用原理： 对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。 2 注意事项： ①酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。 3 方法学程序 （1）将适合于酶消化的组织置于离心管中； （2）将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中； （3）一般消化20-30分钟（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打； （4）终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速成离心除去细胞碎片；
一、诊断性指标
如图1所示，图（左）白血病细胞成为一个单一的群体，很难区分原始或病态的白血病细胞和成熟的细胞。但是通过CD45和（SSC）设门法之后（图右），看到图（左）无法区分细胞被分成了五群。在这五群中，成熟细胞CD45表达的荧光比较强。A门里是淋巴细胞，B门里是单核细胞，C门里就是粒细胞群，D门里是原始细胞，一般CD45表达较弱。一些细胞碎片、红细胞和转移来的瘤细胞，由于不表达CD45，可能位于D门、D门偏下或者E门的位置。CD45结合侧向散射光之后能把白血病细胞找出来，减少了其它细胞的干扰。对D门里的白血病细胞做进一步的分型，就能准确看到白血病细胞群免疫分型的表达情况。 图1 3.白血病的特异性标志 免疫表型分析主要是根据细胞的特异表面标志，把白细胞分成T细胞、B细胞和原始细胞。 T淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cCD3、抗TCRαβ、抗TCRγδ、CD2、CD5、CD8 、CD10和CD7；B淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cCD79a、CD22、CD19 、CD10和CD20；髓系白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cMPO、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15和CD64；NK淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有CD16、CD56和CD57；红白血病一般表达的分化抗原有GlyA和CD36；巨核细胞白血病一般表达的分化抗原有CD41、CD42和CD61；一系列非特异标志在不同的白血病中可能都有表达，尤其是表达在早期的造血干组细胞上，一般表达的分化抗原有CD34和HLA-DR。 其中，对T淋巴细胞白血病来讲比较特异的是胞浆内的CD3，当胞浆内CD3出现阳性的时候，高度怀疑是T淋巴细胞白血病。对于B淋巴细胞白血病来讲，胞浆内的CD79a和CD19是比较特异的，cCD79a最具特异性。cCD3和cCD79a分别表达于早期T细胞和B细胞。cMPO是髓系特异标志。 如图2所示为B-ALL的表达图。白血病免疫分型采用的是CD45和侧向散射光的设门方案，通过CD35和侧向散射光设门可以准确地找到一群CD45表达较弱的白血病细胞，也就是D门里的细胞。把D门的细胞再做进一步的分型，发现表达CD19、CD10和HLA-DR。这是B淋巴细胞白血病的表型分析。
流式细胞仪工作原理与应用范围 2008-11-01 10:30 流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。 流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。 工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 应用范围 可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开
流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，是对快速直线运动状态中的细胞、生物颗粒或液体中的大分子物质进行多参数的、快速的定量分析和分选的一种技术。它可测量细胞大小、内部颗粒的性状；可检测细胞表面和细胞浆抗原，细胞内DNA、RNA 含量等；可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，并能在短时间内检测分析大量细胞，以及收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析；能够分类收集（分选）某一亚群细胞，分选纯度超过95%。随着各种相关技术的发展，流式细胞术已成为日益完善的分析细胞学和肿瘤标志学研究的重要工具。 1 流式细胞仪的结构及工作原理 流式细胞仪主要分为科研型（又称大型机、分析型）和临床型（又称小型机、台式机）两类，科研型的仪器功能齐全，分析灵活，但操作较繁琐，必须由经过培训的专业人员进行操作；临床型的仪器易于操作，稳定性好，分析速度快，适合在临床实验室中应用。流式细胞仪主要由 以下五部分构成：① 流动室及液流驱动系统；② 激光光源及光束形成系统；③ 光学系统；④ 信号检测与存储、显示、分析系统；⑤ 细胞分选系统。其主要技术指标有分析速度、荧光检测灵敏度、前向角散射（FSC）光检测灵敏度、分辨率、分选速度等。 流式细胞仪的工作原理是将待测标本制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满流动的鞘液；当鞘液压力和样品压力的压力差达到一定程度时，在鞘液的约束下细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱经过激光聚焦区，与入射的激光束垂直相交，经特异性荧光染料染色的细胞被激光激发产生特定波长的荧光；仪器中一系列光学系统，如透镜、光阑、滤片和检测器等，收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号；计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测 定的各种信号，对各种指标做出统计分析[1]。 科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来，其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动，流动室即随之振动，使液柱断裂成一连串均匀的液体。一部分液滴中 流式细胞术的工作原理及其临床应用 Working Principle and Clinical Application of Flow Cytometry [摘 要] 流式细胞术是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。随着其分析技术和方法的日臻完善，流式细胞术在医学临床及科学研究上发挥了非常重要的作用。本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍，并对其在肿瘤学、血液学及免疫学等方面的临床应用进行了综述。 [关键词] 流式细胞术；工作原理；临床应用 Abstract : Flow cytometry is a new kind of technology which can analyze single cells by qualitative analysis and quantitative analysis quickly. With the development of analyzing techniques and methods, flow cytometry has being played an important role in the clinical medicine and scientific research. This paper introduced the working principle of flow cytometry synoptically and summarized its clinical application in oncology, hematology and immunology, etc. Key words: flow cytometry; working principle; clinical application [中图分类号] R459.5；R446.11+3 [文献标志码] B doi：10.3969/j.issn.1674-1633.2011.03.033[文章编号] 1674-1633(2011)03-0091-03 吴晓娜，蒋红兵 南京医科大学附属南京第一医院 设备科，江苏 南京 210006 WU Xiao－na,JIANG Hong－bing Equipment Department,Nanjing First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Nanjing Jiangsu 210006, China 收稿日期：2011-01-06 修回日期：2011-03-09作者邮箱：naiadsnowal@https://www.doczj.com/doc/de15763994.html, 2011年第26卷 03期 VOL.26 No.03 临床工程CLINICAL ENGINEERING 91
流式细胞术最新进展及临床应用 流式细胞术( F l o w cy t o m e t r y, F C M), 临床上也被称为流式细胞分析,是利用流式细胞仪同时对单个细胞的多个参数进行定性/ 定量( 相对/ 绝对) 分析的生物医学分析技术,检测速度快、通量高、灵敏度高、采集数据量大、节约样本及成本,在临床上已经广泛应用于血液学、免疫学、肿瘤学、精子学等检验领域,是未来临床检 验不可替代的检测方法之一。传统流式细胞术,也被称为荧光流式细胞术,是基于荧光标记及荧光发射光谱检测的一门综合性技术,定量方式多为定性分析,检测参数类型单一、数目有限,数据分析复杂且缺乏标准化分析流程,不同检测中心间数据重现性差,这些都限制了它在临床检验中进一步的推广及应用。近年来,为克服以上问题,流式细胞术不断突破与创新,从定性检测发展为定量检测;从单参数分析、双参数分析发展成为多参数分析;从检测细胞表面抗原到胞内抗原及分泌到胞外的抗原;从检测蛋白表达水平发展为检测蛋白定位、蛋白功能及蛋白翻译后修饰等;从一维定量检测发展为二维定量定位分析,从体外检测发展为体内检测等;这些突破使得流式细胞术可以实现从单细胞水平去认识细胞在生理或病理状态下的免疫表型、分子表型甚至各种复杂的信号通路变化等,因此将更为广泛应用于临床检测。 1定量流式细胞术 定量流式细胞术( Q u a n tit a ti ve fl o w cy t o m e t r y, QFCM),即通过流式细胞仪定量检测细胞或微球上荧光素的中值荧光强度 ( M e d i a n fl u o r e s ce n t i n t e n s it y, M F I ) 或每个细胞结合的抗体单位( A n ti b o d i e s b o und t o p e r ce ll,A BC) 来对生物分子进行相对或绝对定量的流式细胞技术。定量流式细胞术已被证明是一种功能强大的临床检验技术,但由于M F I缺乏标准化度量方法,容易引起不同检测中心检测结果重现性差,导致诊断和治疗决策的不确定性及不可靠性, 限制了其在临床的推广应用, 因此,标准化M F I测量为流式细胞术实现精确定量分析,在临床广泛应用的必经之路。目前,在临床应用过程中,为提高检测结果的准确性及重现性,定量流式细胞术必须做到以下几点:淤样本及试剂处理严格按照标准操作规程,每一次检测必须设置质控管; 于流式细胞仪维护及校准。每一次检测前进行仪器校准;盂检测流程标准化及规范化;榆数据分析自动化。流式检测数据量庞大,分析难度大,经验性强, 人工分析存在主观性和低保真度等特点。实现机器操控及数据分析的标准化、自动化将会大大提高检测数据的再现性及可靠性。 2多色流式细胞术 多色流式细胞术 ( M u lti co l o r fl o w cy t o m e t r y, MFC) 是指利用超过三种的荧光素实现多个参数同时检测的流式细胞技术。近年来,随着流式细胞仪硬件( 激光管、滤光片等)、软件( 数据分析等) 的不断改进,荧光素的不断开发及应用,临床诊断领域的不断发展及需求,MFC 应运而生。大部分临床检验中心的流式细胞仪具备 2 ~ 3 个激光器,可以同时检测9 ~ 10 色荧光,甚至出现了 5 激光20 参数同时检测的流式细胞仪。多色流式细胞术可以快速准确高灵敏的检测细胞内多个指标,实现从复杂样本中识别罕见细胞群,为疾病诊断、药物开发等提供了强大的工具,是流式细胞术未来发展的主要趋势,也是流式细胞术在临床应用的主要方向。但由于结果分析的复杂性,MFC 目前在临床应用中还主要是作为探索或辅助手段。例如,吴江等[1] 利用多色流式细胞术分析急性 HIV 感染者外周血酌啄T 细胞的表型,探索哪一种酌啄T 细胞在急性 HIV 感染及疾病进展中发挥重要作用。流式细胞术评分系统经常被整合到疾病诊断和预后评分系统中,辅助精细评分。例如, 基于CD79b( 或 CD22 )、CD23、CD5、FMC7 及 SmIg检测的流式细胞术免疫分型评分参与辅助诊断慢性淋巴细胞白血病[2] ;利用 MFC 检测骨髓祖细胞侧向角散射光、CD117 表达以及单核细胞 CD13 表达等参数建立的流式检测积分系统可以补充目前的骨髓增生异常综合征国际预后评分系统( IPSS鄄R),实现更为精确的预后评估[3] ;利用 MFC 检测分析来自骨髓的造血细胞的免疫分型可以辅助慢性髓细胞白血病的诊断、预后和治疗[4] ;利用MFC 检测白血病细胞表面分化抗原可以辅助白血病分型诊断及白血病微小残留物诊断[5] ;基于G P I锚连蛋白缺失检测的MFC 可以辅助阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断;基于多种分子标记物[ 血小板特异性膜糖蛋白( GP域b / 芋a、GP玉b鄄御鄄吁、GP玉a / 域a 等)、血小板颗粒膜糖蛋白( CD62P、CD63、CD107a、CD107b 等)]、Ca2+ 流及RNA 含量等检测的 MFC 可以辅助血小板功能分析等
流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
二代流式技术产品-成像流式细胞分析 邱又彬 Merck&Millipore旗下品牌Amnis于近期推出了新一代高速细胞成像系统ImageStreamX Mark II。这是第三代ImageStream成像流式细胞仪，具有无与伦比的细胞分析能力。 显微镜可提供详细的细胞图像和形态信息，是研究细胞功能的重要工具。然而，显微图像的解释却是主观、定性且费力的。流式细胞仪擅长定量的表型分析，可产生统计学上可靠的结果，不过，流式细胞仪却缺乏成像能力，因此无法了解亚细胞定位。 ImageStream系列开创性地将流式细胞检测与荧光显微成像结合于一体，既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供了细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的完整信息。 ImageStreamX Mark II能实时捕获每个流动细胞最多12幅高分辨率图像，检测速率可达5000细胞/秒，并具有更强荧光灵敏度。ImageStreamX Mark II的这些功能可以对细胞形态、荧光探针的强度和定位进行检测，进而为科学家提供广泛的图像分析应用，包括细胞间相互作用、吞噬、凋亡和自噬、核易位、形态变化等。 ImageStreamX Mark II的特征如下： ?速度更快：Mark II对进样速度进行了提升，每秒可以分析多达5000个细胞，简单易用的补偿向导可以指导您轻松完成多色补偿运算。 ?操作更简单：全新而直观的用户界面提供了每一个细胞的图像及实时绘图相关的图形化控件。 ?样品适应性更强：Mark II可选配7个激光；样品容量20-200 μl，增加了实验的灵活性，适用于多用户实验室。 ?样品利用率更高：Mark II将样品利用率提高到了95%，更适用于稀有的细胞样品，而且未使用的样品也可回收用于进一步分析。 从2005年开始，Amnis量化成像流式分析仪被广泛应用于各个研究领域。其中超过300篇的文章发表在高水平的同行评议杂志（peer-reviewed journal）上。这些研究领域包括生物化学、药物研发、血液、免疫、微生物、海洋、肿瘤、寄生虫、干细胞、毒理、病毒等等。并且由于Amnis与众不同的实验理念和卓越性能，使得这个名单不断变长。 1.生物化学： 经典的生物化学技术主要用于分子定位和共定位检测，这非常适合使用Amnis量化成像流式分析系统，比如转录因子从细胞质到细胞核的转位、分子在亚细胞器间的运输、蛋白质在细胞内和细胞间的共定位。它可以获取复杂样品每个细胞中探针定位和共定位的统计学结果，这对于传统生物化学研