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七叶皂甙钠对大鼠视网膜缺血再灌注损伤和IL-17、TNF-α表达的影响

A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for

the Degree of Master of Medicine

Effect of Sodium Aescinate on the expression of IL-17 and TNF-α in rats retinal ischemia-reperfusion injury Graduate Student: Song Qinglei

Major: Ophthalmology

Supervisor: Prof. Huo Ming

China Three Gorges University

Yichang, 443002, P.R.China

May, 2015

三峡大学学位论文原创性声明

本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果,除文中已经注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明,本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。

学位论文作者签名:

日期:

三峡大学研究生知识产权承诺书

本人承认:我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间,在导师指导下,依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。

本人承诺:我有义务维护三峡大学的知识产权,凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果,或实验数据为基础所形成的研究论文及成果,无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励,均以三峡大学为第一作者单位或完成单位,并事先征得导师或学校相关部门的同意。

我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。

学位论文作者签名:

日期:

内容摘要

目的:观察七叶皂甙钠对大鼠视网膜缺血再灌注损伤及白细胞介素-17(IL-17)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。

方法:将180只健康无眼疾SD大鼠随机分为正常组、模型组、七叶皂甙钠低剂量组和高剂量组四组,每组45只;每组再按照12h、24h、72h和144h四个不同的时间段再分为四个小组。采用前房灌注生理盐水升高眼压法建立RIRI模型。右眼为实验眼,正常组右眼不作任何处理。七叶皂甙钠低剂量组和高剂量组于建模前30min和建模后每天定时分别以5mg/Kg和10mg/Kg腹腔注射七叶皂甙钠溶液。建模后12h、24h、72h 和144h处死大鼠,取眼球,分别作苏木精-伊红染色观察视网膜组织结构变化;免疫组化和实时荧光定量PCR分别检测IL-17、TNF-α 蛋白和mRNA表达。

结果:苏木精-伊红染色染色观察正常组大鼠视网膜组织结构正常,细胞排列紧密;模型组、七叶皂甙钠低剂量组出现视网膜水肿、组织疏松等病理改变,而七叶皂甙钠高剂量组视网膜组织结构与正常组相似。免疫组化显示IL-17、TNF-α主要表达于视网膜神经节细胞层。在正常组视网膜中鲜有表达,而在模型组、七叶皂甙钠低剂量组表达明显增多。实时荧光定量PCR发现TNF-α和IL-17 mRNA分别在建模后24h、72h 达高峰。建模后各时间点模型组、七叶皂甙钠低剂量组和高剂量组IL-17、TNF-αmRNA的表达均较正常组升高,差异有显著性(P <0.01)。七叶皂甙钠低剂量组12h、72h与144h TNF-α mRNA表达较模型组降低,差异有显著性,12h、72h(P <0.05),144h(P <0.01),24h TNF-α mRNA表达虽较模型组降低,但差异无显著性(P>0.05);高剂量组各时间点TNF-α mRNA表达较模型组明显降低,差异有显著性(P<0.01);高剂量组各时间点TNF-α mRNA表达较低剂量组下降,差异有显著性,12h、24h和72h (P <0.05),144h(P<0.01)。七叶皂甙钠低剂量组24h、72h与144h IL-17 mRNA表达较模型组降低,差异有显著性(P <0.05),12h IL-17 mRNA表达虽较模型组降低,但差异无显著性(P>0.05);高剂量组各时间点IL-17 mRNA表达较模型组明显降低,差异有显著性(P<0.01);七叶皂甙钠高剂量组各时间点IL-17 mRNA表达较低剂量组下降,差异有显著性(P<0.05)。

结论:1)IL-17和TNF-α在大鼠RIRI后视网膜组织中有表达,分别在24h、72h 出现峰值,可能在亚急性期参与了RIRI后的炎症反应过程,为药物干预提供了时间窗。2)七叶皂甙钠降低RIRI后IL-17和TNF-α表达,提示可能一定程度上抑制了视网膜炎症反应,对视网膜有保护作用。

关键词:视网膜缺血再灌注损伤七叶皂甙钠白细胞介素-17 肿瘤坏死因子-α

Abstract

Objective To observe the effect of Sodium Aescinate on the expression of interleukin-17(IL-17)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in rat retina after ischemia-reperfusion injury.

Methods:A total of 180 Sprague-Dawley rats were divided into four groups, the normal group, model group, low-dose Sodium Aescinate group and high-dose Sodium Aescinate group, 45 rats each group. In accordance with 12h, 24h, 72h and 144h four periods of time, each group was classificated into four groups according to random number table method. Anterior chamber perfusion was adopted to make intraocular hypertension animal models with different IOP, and thus to creat a retinal ischemia-reperfusion injury (RIRI)model. The right eye of each group was injected into Unilateral retinal I/R except the rats in normal group, which was made as control with nothing processtion. The rats in low-dose Sodium Aescinate and high-dose Sodium Aescinate group received intraperitoneal injection with 5mg/Kg or 10mg/Kg curcumin respectively 30min prior to ischemic injury, and the injections would continue once daily until be killed. Killed several rats at 12h, 24h, 72 h and 144h after RIRI, and removed it’s eye, which was exami ned by H-E,thus to observe the change of the retinal structure. Then used immunohistochemistry staining and western-blot to detect the expression of IL-17 and TNF-α protein and used real-time fluoreasent quantitative PCR(RT-qPCR) to detect the expression of mRNA .

Results The retinal structure of normal group was normal. Pathologic changes were observed in the model group and low-dose curcumin group, such as retinal edema, disorganized structure and loosely packed cell, but the structure retinal of high-dose Sodium Aescinate group was silimar to the normal control group. Immunohistochemistry staining results showed that positive signal mainly located in ganglion cell layer and a few inner nuclear layer of retinal. The expression of IL-17 and TNF-α was very few in normal control group, but was increased significantly in other three groups. The detection of RT-qPCR showed that the expression of TNF-α and IL-17reached to the highest level at 24h and 72h. Moreover, 12h, 24h, 72h and 144h after RIRI, compared with the normal control group, the expression of IL-17 and TNF-α in model group, low-dose Sodium Aescinate group and high-dose Sodium Aescinate group all increased, and the difference had a statistical significance(P<0.01). 12h, 24h, 72h and 144h after RIRI, compared with model group, the expression of TNF-α in low-dose Sodium Aescinate group decreased, and

the difference at 12h and 72h had a statistical significance(P<0.05), the difference at 144h also had a statistical significance(P<0.01), but the difference at 24h had nothing statistical significance(P>0.05); Compared with model group, the expression of TNF-α in high-dose Sodium Aescinate group decreased at each time point, and the difference had a statistical significance(P<0.01); Compared with low-dose Sodium Aescinate group, the expression of TNF-αin high-dose Sodium Aescinate group decreased at each time point, and the difference at 12h, 24h and 72h had a statistical significance(P<0.05), the difference at 144h also had a statistical significance(P<0.01). Compared with model group, the expression of IL-17 in low-dose Sodium Aescinate group decreased at each time point, and the difference at24h, 72h and 144h had a statistical significance (P<0.05), although the the expression of IL-17 decreased at 24h, the difference had no statistical significance (P>0.05); Compared with model group, the expression of IL-17 in high-dose Sodium Aescinate group decreased at each time point, and the difference had a statistical significance (P<0.01); Compared with low-dose Sodium Aescinate group, the expression of IL-17 in high-dose Sodium Aescinate group decreased at each time point, and the difference had a statistical significance (P<0.05).

Conclusion:1)The IL-17 and TNF-α expressed in retinal tissue, and reached to the highest level at 24h and 72h after rats RIRI, and maybe involved in inflammatory reaction process subacute stage, which provied time window for us to use drug intervention. 2) Sodium Aescinate could down-regulated the level of IL-17 and TNF-α expression in RIRI rats, which means Sodium Aescinate could inhibited the retinal inflammation to some extent and then protected the retinal tissue.The anti-inflammatory mechanism might provide a new theoretical basis for Sodium Aescinate treating RIRI in the delayed phase, and accumulated basic experiment data for the treatment of ischemic ophthalmopathy.

Key words: retinal ischemia-reperfusion injury Sodium Aescinate IL-17 TNF-α

IV

目录

英文缩略词表 (1)

引言 (2)

材料与方法 (3)

结果 (11)

讨论 (17)

小结 (21)

参考文献 (22)

综述 (26)

后记 (35)

附录:攻读硕士学位期间发表的部分学术论著 (36)

V

英文缩略词表

英文缩写英文全称中文全称RIRI Retinal ischemia-reperfusion injury 视网膜缺血再灌注损伤IL-17 Interleukin-17 白细胞介素-17

Th17 IL-6 T help cell 17

Interleukin-6

辅助性T细胞17型

白细胞介素-6

TNF-αTumor necrosis factor-α肿瘤坏死因子-αH-E Hematoxylin-eosin staining 伊红染色法

PBS SA Phosphate buffered saline

Sodium Aescinate

磷酸盐缓冲液

七叶皂甙钠

TBS Tris-buffered saline Tris缓冲液

ECL Enhanced chemiluminescence 强化化学发光法

MAPK Mitogen activated protein kinase 有丝分裂原活化蛋白激酶NCG Normal control group 正常对照组

MG Model group 模型组

LDSAG HDSAG Low-dose Sodium Aescinate Group

How-dose Sodium Aescinate Group

七叶皂甙钠低剂量组

七叶皂甙钠高剂量组

引言

视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-repefusion injury, RIRI)见于多种眼底疾病,严重影响视功能。近年来对炎症反应在RIRI的发病作用进行了探讨,炎症因子介导的免疫炎症反应备受关注[1-3]。通常把缺血性损害的病理生理过程划分为急性期、亚急性期和慢性期三个不同的阶段。在RIRI的亚急性期,炎症基因激活,产生多种致炎因子以及炎症因子的继发连锁反应,最终破坏血-视网膜屏障,诱导视网膜神经元细胞的死亡/凋亡。亚急性期的炎症反应对视网膜缺血再灌注损伤尤为重要,是我们进行干预的最佳时期。

在机体的免疫应答中,发现一种新的CD4+效应细胞——辅助性T细胞17型(T help cell 17, Th17),主要产生白介素17(interleukin 17, IL-17),在炎症、感染、自身免疫性疾病过程中发挥关键作用。IL-17本身作为强大的前炎症因子,促进多种炎症因子、粘附分子和趋化因子的表达,加重组织损伤,尤其是脑组织,是目前研究缺血再灌注模型中的新焦点[4-5]。

TNF-α是具有广泛生物学功能的多效炎症因子,主要参与炎症和免疫反应。研究表明TNF-α产生于组织恢复血流的早期阶段,促进细胞间黏附分子的表达,诱导白细胞粘附于内皮细胞和促进白细胞向缺血组织侵润、聚集;促使兴奋性氨基酸、氧自由基、NO等过度表达,加重组织损伤;诱导内皮细胞活化,产生多种致炎因子,通过各种机制介导组织缺血再灌注损伤[6]。IL-17和TNF-α具有较好的协同效应,IL-17和TNF-α 与受体结合激活NF-kB和MAPK-p38信号通路,共同上调多种炎症因子(IL-1β、IL-6等)、粘附分子(ICAM-1等)、趋化因子(MCP-1和MCP-2等)、NO、NOS、自由基、凋亡蛋白等表达,诱导组织炎症反应、细胞凋亡等损害[6-9]。

七叶皂甙为七叶树或天师栗的干燥成熟种子中提取的一组含酯键的三萜皂苷,具有抗炎、抗渗出、抗水肿、增加静脉张力、改善血液循环以及神经保护等作用,已用于血-视网膜屏障通透性、视网膜氧化应激损伤等相关研究中,证实七叶皂甙具有改善血-视网膜屏障的通透性、神经保护等作用[10-11],但是否在视网膜中有抗炎作用,需要研究证实。

视网膜作为脑组织的延续,与脑组织具有极高的同源性,是否在缺血再灌注后的炎症反应中有IL-17、TNF-α的参与呢?本研究试图通过探讨:

1)IL-17和TNF-α是否参与大鼠视网膜缺血再灌注损伤。

2)七叶皂甙钠干预是否减轻视网膜炎症反应,抑制炎性介质表达,为治疗RIRI 提供新的理论依据。

材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

SPF级SD雄性大鼠180只(质量合格证:42010200000111,许可证号:SYXK鄂2011-0061),体重250-300g,排除眼睛疾患,购买自三峡大学动物中心。

1.1.2主要试剂

注射用七叶皂甙钠粉针剂:白色冻干疏松块状物,10mg/瓶,国药准字H200835372,南京南大药业有限责任公司

复方托吡卡胺滴眼液:无色至微黄色的澄明液体,复方制剂,每1ml含托吡卡胺5mg、盐酸去氧肾上腺素5mg,5ml/瓶,国药准字H20055546,沈阳兴齐眼药股份有限公司盐酸丙美卡因滴眼液:无色至黄色的澄明液体,15ml/瓶,执行标准(进口药品注册标准)JX20000511,批准文号(进口药品注册证号)H20090082,美国s.a. Alcon-Couvreur n.v.公司

IL-17、TNF-α引物合成:北京生物工程技术有限公司

显影定影试剂: 买自武汉谷歌生物科技有限公司

兔抗鼠IL-17抗体:英国Abcam公司

兔抗鼠TNF-α抗体:英国Abcam公司

Trizol Reagent:买自Invitrogen Life Technologie公司

三氯甲烷:买自国药集团化学试剂有限主任公司

dNTP、Taq酶:Ferments公司

异丙醇:买自国药集团化学试剂有限责任公司

无水乙醇:买自国药集团试剂有限公司

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit:买自Thermo(Fermentas)公司

定量PCR试剂盒:买自Roche公司

二甲苯:买自国药集团化学试剂有限责任公司

EDTA(乙二胺四乙酸):买自谷歌生物科技有限责任公司

PBS缓冲液:买自谷歌生物科技有限责任公司

双氧水:买自国药集团试剂有限公司

辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体:买自武汉谷歌生物科技有限公司

BSA(牛血清白蛋白): 买自美国Sigma公司

苏木素染液:买自武汉谷歌生物科技有限公司

0.5%伊红染液:买自谷歌生物科技有限责任公司

盐酸:买自国药集团试剂有限公司

DNA Marker:Ferments

氨水:买自国药集团试剂有限公司

中性树胶:买自国药集团试剂有限公司

二抗(山羊抗兔鼠通用二抗):买自DAKO,K5007

组化试剂盒DAB显色剂:买自DAKO,K5007

1.1.3主要溶液配置

脱色液:甲醇和乙醇分别200ml、100ml,双氧水定容积为1L,常温下保存

4%多聚甲醛溶液:40g多聚甲醛和30g蔗糖溶解于0.1M磷酸盐缓冲液(PBS),取1Nmol氢氧化钠将PH值调到7.4,溶液量为1000毫升

Gel solution (30% w/v acrylamide mix):

0.8 bis-acrylamide 0.8g

29.2% acrylamide 29.2g

总量100ml

抗体稀释液:含5%小牛血清的磷酸盐缓冲液

50×TAE:称取2M Tris 242g,100mM Na2?EDTA?2H2O 37.2g,57.1 ml冰乙酸,加水溶解并充分搅拌,加dH2O定容至1L,室温保存

1‰DEPC水:取1mlDEPC原液溶于999ml双蒸水中,搅拌过夜,分装备用

95%酒精:无水酒精95ml加5ml双蒸水混合

80%酒精:无水酒精80ml加20ml双蒸水混合

70%酒精:无水酒精70ml加30ml双蒸水混合

抗原修复缓冲液:买自北京中杉金桥生物技术有限公司。每袋溶于1000ml双蒸水中,磁力转子搅拌混匀后室温保存

3%H2O2:30%H2O2 0.6 ml,双蒸水5.4ml

磷酸盐缓冲液(PH=7.4):NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4·12H2O 1.49g,KH2PO4 0.2g,溶于800ml双蒸水中,用1M HCl调PH值至7.4,再加双蒸水至1000ml,高压灭菌后室温保存

Tris-HCl缓冲液(PH=7.6):Tris 12.1g,溶于60ml双蒸水中,用1M HCl调PH 至7.6,再加双蒸水至100ml,高压灭菌后室温保存

封闭液:含3%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液

1.1.4主要器械

电子天平:型号PL-203,梅特勒-托利多仪器(上海)有限责任公司

台式离心机:型号TGL-16c,上海安亭科学仪器公司

纯水仪:型号AJC-0501-P,重庆艾科浦公司

磁力搅拌器:型号79-1,常州市澳华仪器

脱色摇床:型号WD-9405A,北京六一仪器公司

电泳仪:型号DYY-6C,北京六一仪器公司

水浴锅:型号TL-420D,姜堰市天力医疗器械公司

冰箱:型号BCD-186,西门子

紫外分光光度计:型号752-P,上海现科仪器有限公司

荧光定量PCR仪:德国Whatman Biometra有限公司

超净工作台:型号SW-CJ-1FD,苏净安泰科技有限公司

眼科显微无齿镊:江苏六六厂

眼科显微有齿镊:江苏六六厂

显微镜及图像分析系统:德国莱卡公司

负压泵:天津奥特赛恩斯仪器公司

眼科显微组织剪:江苏六六厂

UV分光光度计:型号DU 730型,美国Bechman Coulter公司

凝胶成像系统:型号Gel Logic-200,美国Kodak公司

眼科普通组织剪:江苏六六厂

眼科手术显微镜:德国Zess公司

脱水机:型号JJ-12J, 武汉俊杰电子有限公司

包埋机:型号JB-P5,武汉俊杰电子有限公司

病理切片机:型号RM2016,上海市莱卡仪器有限公司

冻台:型号JB-L5,武汉俊杰电子有限公司

恒温水浴锅:型号HH-2,国华电器有限公司

组织摊片机:型号KD-P,浙江省金华市科迪仪器设备有限公司

烤箱:型号DGX-9003B,上海市福马实验仪器有限公司

载玻片及盖玻片:型号10212432C,江苏省世泰实验器材有限公司微波炉:型号P70D20TL-P4,格兰仕微波炉电器有限公司

脱色摇床:型号WD-9405A,北京市六一仪器厂

涡旋混合器:型号TYXH-Ⅱ,天悦电子

倒置荧光显微镜:型号NIKONECLIPSETI-SR,尼康

成像系统:型号NIKONDS-U3,尼康

直接检眼镜:型号TLP-2Y,江苏六六厂

1.2 实验方法

1.2.1实验动物和分组

选用购自三峡大学实验动物中心的清洁级SD雄性大鼠180只(质量合格证:42010200000111,许可证号:SYXK鄂2011-0061),体重250-300g,排除眼睛疾患。随机分为正常组(normal control group,NCG)、模型组(model group,MG)、七叶皂甙钠低剂量组(Low-dose Sodium Aescinate Group,LDSAG)和七叶皂甙钠高剂量组(High-dose Sodium Aescinate Group,HDSAG)四组,每组45只。每组按照12h、24h、72h和144h四个时间点再分为四个小组,其中24h时间点为15只,其余各时间点为10只。右眼作为实验眼,正常组眼球不做任何处理。

1.2.2构建SD大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型

七叶皂甙钠低剂量组和高剂量组于构建模型前30分钟和构建模型后每天定时分别以5mg/kg和10mg/kg的剂量腹腔内注射七叶皂甙钠粉针剂(10ml生理盐水溶解稀释);正常组、模型组同时间点腹腔注入同等剂量的生理盐水。

SD大鼠右眼复方托比卡胺眼水扩瞳,盐酸丙美卡因眼水角结膜表面麻醉。腹腔内注射戊巴比妥钠(20g.L-1 40mg/kg)麻醉至睡眠状态下,盐酸丙美卡因眼水表面麻醉2次(1次/5min),复方托吡卡胺眼水扩瞳3次(1次/5min)。参考Buchi等[12]的方法并加以改进:将与生理盐水输液管相连接的4.5号针头从大鼠颞侧角膜缘穿刺进入前房并加以固定,然后升高输液袋至预先准备好的墙壁挂钩上,使输液袋距大鼠150cm,在眼内形成110mmHg的眼压,观察到眼睑、结膜苍白,直接检眼镜下眼底视网膜色苍白、血管断流,表明已造成缺血性改变。一小时后缓慢降低输液袋,使输液袋高度降至动物水平,拔出前房穿刺灌注针头,观察到眼球潮红,眼睑、结膜充血、视网膜血管血流恢复为视网膜缺血再灌注损伤模型构建成功。排除构建模型时角膜穿通伤和造膜完成后形成的外伤性白内障的大鼠。每小组分别在RIRI后12h、24h、72h 和144h时间点处死大鼠,摘除眼球。

1.2.3病理组织学观察(苏木精-伊红染色法)

1.2.3.1取材和固定

1)模型构建成功后,24h时间段组随机取4只SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠过度麻醉,摘除眼球,放入4%的多聚甲醛溶液中固定24小时,流水冲洗固定40分钟。

2)乙醇脱水:常温下以递升梯度乙醇脱水,依次在50%、75%、85%、95%、95%、100%和100%的酒精中各浸泡3小时。

3)透明:二甲苯3次透明,20min/次。

4)浸蜡:不同温度(450C-500C、540C-560C和560C-580C)的石蜡中各浸泡1小时。

1.2.3.2包埋

1)点燃酒精灯,将已融化的石蜡倒入模型中,加热弯镊子夹取浸蜡的眼球埋入

石蜡。

2)包埋制作的蜡块放入冷水中,加速冷凝。

3)拆除金属框,取出包埋蜡块,切除周围多余的石蜡。

1.2.3.3切片、展片和烘片

1)制作与视神经矢状轴相平行的视网膜石蜡切片,在视神经2mm的范围内连续切片4张,厚度约5μm。

2)视网膜切片放入水浴箱中展开,使视网膜组织充分舒展。

3)将充分舒展的视网膜组织用载玻片捞起,600C的烤箱中烘干过夜。

1.2.3.4染色和封片

1)脱蜡:二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各脱蜡5分钟。

2)水化:递减梯度乙醇水化,依次在100%、100%、95%、95%、80%和70%各2分钟。

3)蒸馏水清洗1分钟。

4)苏木素染色5分钟,而后放入蒸馏水中浸泡30分钟。

5)0.5%伊红染色1分钟,95%、95%、100%和100%的酒精脱水各2分钟。

6)透明:二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各透明5分钟。

7)取经以上处理干燥后的载玻片,将中性树胶滴入组织上封片,留待显微镜下观察。

1.2.4 实时荧光定量(RT-qPCR)检测IL-17、TNF-α mRNA表达

1.2.4.1提取总RNA

为减少RNA的融解,采取以下各种措施:各种所需要的不同规格枪头、eppendorf管,均用1‰DEPC水浸泡过夜,去除RNA酶,高压后,烤干备用。

1)取匀浆器,加入1ml的Trizol Reagent,置冰上预冷。

2)参考Park、Yoshida和Ulbrich等[13-15]的方法收集标本。SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠过度麻醉,摘除眼球(每小组n≥9),在冰状环境、显微镜下沿眼球角膜与巩膜交界处剪开角膜,分离晶体和玻璃体,视网膜与脉络膜之间缓慢注入PBS液体,使视网膜全层脱离,收集视网膜,-80℃冰箱保存备用。

3)取视网膜组织,加入到匀浆器中充分研磨,至无可见的组织块。

4)加入250 μl三氯甲烷,颠倒离心管15秒,充分混合均匀,冰状环境下静置10min后4℃下13000rpm离心8min。

5)将上清转移到新的离心管中,加入0.8倍体积的异丙醇,上下颠倒混合均匀,冰状环境下静置10min后4℃下13000rpm离心8min。

6)弃上清,各管中加入预先冷确的75%乙醇1ml,4℃下7500rpm离心5min,

管底的白色沉淀即为RNA。

7)吸除液体,再加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

8)4℃下13000rpm离心5min。

9)将液体吸除干净,将离心管置于超净台风干,取少量待用,其余-80℃保存。

10)加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。

1.2.4.2反转录

1)取PCR管,加入含2μg RNA的溶液。

2)加入1μl oligo(dT)15。

3)用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

4)于PCR仪上70℃保温5min,迅速置冰上冷却。

5)依次加入4μl 5×buffer,2μl 10mM dNTPs,1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶,用枪抽吸混匀。

6)在PCR仪上42℃保温1h,70℃, 5min,终止反应,将cDNA产物- 80℃保存。

1.2.4.3定量PCR

1)引物序列:GAPDH为内参对照,IL-17、TNF-α引物序列与产物分子量如下:

引物上游序列5’~3’下游序列5’~3’分子量

GAPDH TGCTA TGTTGCCCTAGACTTCG GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG 240bp IL-17 CCCTCAGACTACCTCAACCGT ATGTGGTGGTCCAACTTCCC 145bp TNF-αCCAGGTTCTCTTCAAGGGACAA GGTATGAAA TGGCAAATCGGCT 130bp 2)PCR反应体系:2×qPCR Mix ,12.5μl;上游和下游引物各2.0μL,cDNA模版4μL,加ddH2O至8μl。

3)PCR扩增

基因预变性变性退火循环

次数

采集溶

解曲线

GAPDH 95℃,50s 95℃,30s 60℃,30s 40 60o C-95o C间

IL-17 95℃,50s 95℃,30s 60℃,30s 40 60o C-95o C间TNF-α95℃,50s n 95℃,30s 60℃,30s 40 60o C-95o C间

1.2.4.4结果处理

计算△△Ct值:

1)△Ct值(正常组)=基因Mean Ct值-GAPDH基因Mean Ct值;

2)△Ct值(药物组)=基因Mean Ct值-GAPDH基因Mean Ct值;

3)△△Ct值=△Ct值(药物组)-△Ct值(正常组);

4)根据△△Ct值,计算各组之间的差异,即2-△△Ct。

1.2.5免疫组织化学法观察IL-17、TNF-α蛋白表达

1.2.5.1取材和固定

1)模型构建成功后,SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠过度麻醉,摘除眼球,放入4%的多聚甲醛溶液中固定24小时,流水冲洗固定眼球40分钟。

2)乙醇脱水:常温下递升梯度乙醇脱水,依次在50%、75%、85%、95%、95%、100%和100%的酒精中各浸泡3小时。

3)透明:二甲苯3次透明,20min/次。

4)浸蜡:不同温度(450C-500C、540C-560C和560C-580C)的石蜡中各浸泡1小时。

1.2.5.2包埋

1)点燃酒精灯,将已融化的石蜡倒入金属模型中,加热弯镊子夹取浸蜡的眼球埋入石蜡。

2)包埋制作的蜡块放入冷水中,加速冷凝。

3)拆除金属框,取出包埋蜡块,切除周围多余的石蜡。

1.2.5.3切片、展片和烘片

1)制作与视神经矢状轴相平行的视网膜石蜡切片,在视神经2mm的范围内连续切片4张,厚度约5μm。

2)视网膜切片放入水浴箱中展开,使视网膜组织充分舒展。

3)将充分舒展的视网膜组织用载玻片捞起,600C的烤箱中烘干过夜。

1.2.5.4染色和封片

1)脱蜡:二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各脱蜡5分钟。

2)水化:梯度乙醇水化,依次在100%、100%、95%、95%、80%和70%,其中100%浓度的乙醇各10分钟,其余各5分钟。

3)蒸馏水清洗1分钟。

4)抗原修复:组织切片放置于柠檬酸抗原修复液中,微波炉内进行抗原修复。柠檬酸中火8分钟,停火8分钟,中低火7分钟。修复完成后,载玻片置于PBS (PH7.4)溶液中在脱色摇床上反复晃动洗涤3次,5分钟/次。

5)阻断内源性过氧化物酶:切片置入3%过氧化氢溶液中,室温下避光孵育25 分钟,完毕后,载玻片置于PBS(PH7.4)溶液中在脱色摇床上反复晃动洗涤3次,5分钟/次。

6)加一抗:切片甩干后,组化笔在组织四周画圈(以防抗体流走),圈内分别滴

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