微生物学实验
实验一实验室环境和人体表面微生物的检查
实验二油镜的使用和细菌的简单染色
实验三细菌的革兰氏染色和芽孢染色
实验四微生物大小的测定和酵母菌死活细胞的鉴定
实验五培养基的配制与消毒灭菌
实验六土壤微生物的分离纯化与鉴定
实验七食品微生物检验 (一)细菌总数测定
实验八食品微生物检验（二）大肠菌群数测定
实验九大肠杆菌生长曲线的测定
实验十IMViC与硫化氢试验
实验一、实验室环境和人体表微生物的检查
1.一、目的：
1.比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量与类型；
2.观察不同类型微生物的菌落形态特征；
3.体会无菌操作的重要性。
2.二、原理：
1.微生物无孔不入，无处不在。
2.微生物→营养琼脂平板→菌落或菌苔。（37 ℃倒置培养24 h）
3.描述：菌落的大小、表面光滑或粗糙、干燥或湿润、隆起或扁平、
边缘整齐或锯齿状、菌落透明或不透明、颜色以及质地均匀与否、
疏松或紧密等，以便检查环境中细菌的类?秃褪 俊?
4.细胞、放线菌、酵母菌和霉菌四大类型都可能存在，本实验重点观
察细菌。
3.三、器材：
1.培养基：营养琼脂平板（牛肉膏蛋白胨培养基）
2.器具：无菌水、灭菌棉签、接种环（针）、酒精灯等。
4.四、步骤：
1.标记。组号/姓名、日期、样品来源。
2.接种。
3.倒置培养，37℃ 24 h
4.观察结果。
5.五、结果
6.
样品来源菌落数菌落
类型
特征描写
本实验室（流动空气30 min）1 大小形态干湿扁/隆透明度颜色边缘2
3
接种室
（不流
动空气
30
min）
洗手前
洗手后
头发屑
指甲垢
实验台
门把
1.六、思考题：
1.人多的实验室与少人走动的实验室比较，平板上的菌落数和菌落类
型有区别吗？试解释。
2.通过本实验，在防止培养物的污染和防止细菌的扩散方面，你有何
体会？
3.
4.
实验二油镜的使用和细菌的简单染色
一、实验目的
1、学习和掌握油镜的原理和使用技术。
2、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。
二、实验原理
1．油镜使用原理：光镜的几种物镜中以油镜的放大倍数最大，尤其适用于微生物学研究。
2．由于油镜在使用时利用了与玻璃的拆射率相近的镜油作为载玻片与镜头之间的介质，因此，提高了油镜头的分辨力和增加了照明度。
3．细菌单染法：
常用碱性染料进行单染。因为在中性、碱性或弱酸性溶液中细菌细胞常带负电荷，而碱性染料在电离时其分子的染色部分带正电荷，很容易与细菌结合使细菌着色。
常用的单染染料：美蓝、结晶紫、碱性复红。
如果细菌分解糖类产酸，pH降低，细菌带正电荷，则可与伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
三、仪器、材料
菌种：枯草杆菌（培养时间、温度的要求，避免出芽孢）
染料：草酸铵结晶紫、石炭酸复红、美蓝、番红
四、步骤
（一）油镜的使用方法。
1、先用低倍镜和高倍镜找到最适宜的观察目标。
2、上升镜筒（约2cm），滴加镜油。
3、从侧面注视，将镜筒慢慢下降，使油镜头浸在镜油中，直至油圈不再扩大为止。（注意：勿使油镜头与载玻片接触！）
4、从目镜观察，上升镜筒调焦（注意：此时只准向上而不能向下转动粗聚焦器！）直至视野出现清晰物像。
5、观察完毕，须将镜筒上升，才能取下玻片，并将镜头上的油用擦镜纸擦去，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留的香柏油，最后用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。
6、收镜。
观察顺序：低倍镜→高倍镜→油镜。初学者不能省缺高倍镜这步。根据同焦现象，在低倍下已清晰聚焦后转到高倍观察时，只移动物镜转换器，不上下移动镜筒，因为同焦现象将基本保持准焦状态，保证了使用高倍镜和油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，避免使用粗调节器可能带来的误操作。
（二）细菌的简单染色
涂片（接种环、生理盐水一滴、涂片，要求载片无油污、取菌不宜多、涂片要均匀、不宜厚。）↓
干燥（风干、可用点吹风的冷风）
↓
固定（热固定的温度不宜过高，只2－3下过火）
↓
染色（染料刚好覆盖涂片薄膜为宜）
↓
水洗（不宜直接水冲涂面，应使细细流水从一端流下，不宜过急过大）
↓
干燥（风干、自然干、吸干）
↓
镜检（涂片要完全干燥下才能油镜观察）
五、绘图：
绘出油镜下观察到的枯草芽孢杆菌的形态图。
六、思考题：
1.用油镜观察时应注意哪些问题？用何镜油？起?裁醋饔茫?
2.物镜的同焦现象在显微镜观察中有何意义？
3.涂片未经热固定会出现什么问题？若温度过高时间过长情况又怎么样？
4.
实验三革兰氏染色和芽孢染色
一、实验目的
1、初步掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。
2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。
3、巩固微生物无菌操作、涂片和染色的基本技术。
二、实验原理
1．革兰氏染色原理：看实验指导书。
2．芽孢染色法：用着色力强的染料（石炭酸复红、孔雀绿等）加热条件下染色，染料进入菌体并进入芽孢内，水洗使菌体的着色褪去而芽孢不退色。再用复染剂复染时，菌体和芽孢囊染成复染剂的颜色，而芽孢仍保留初染的颜色，从而使芽孢和菌体分开。
三、仪器、材料
油镜
菌种：大肠杆菌、苏云金杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌等。
染料：革兰氏染色液：结晶紫、碘液、95％乙醇、番红
芽孢染液：7.6％孔雀绿
废报纸垫台
四、步骤
（一）细菌的革兰氏染色法。
1、涂片、干燥、固定。
2、染色。
①草酸铵结晶紫1—2滴，初染1分钟、水洗。
②路哥氏碘液1—2滴、媒染1分钟，水洗。
③95%酒精脱色，约半分钟，水洗。
④番红染色液1—2滴，复染1分钟，水洗。
3、干燥。
4、镜检。
（二）细菌的芽孢染色。
制片（涂片、干燥、热固定）
↓
染色（7.6％孔雀绿水溶液、加热至出现蒸汽，保持4－5 min,冷却后水冲至不再褪色为止。番红复染。
↓
镜检。（油镜下芽孢绿色，菌体红色。）
五、绘图：
1．绘出在油镜下观察到的大肠杆菌、葡萄球菌形态图，并注明它们各染成何色？是革兰氏阴性菌？还是革兰氏阳性菌？
2．绘出带芽孢的枯草杆菌形态图。
六、思考题：
1.革兰氏染色影响其成败的关键一步是哪一步？
2.为什么芽孢染色要加热？为什么芽孢及其营养体能染成不同颜色？
3.
4.
实验四微生物大小的测定和酵母菌死活细胞鉴定
一、实验目的
1、学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。
2、学习区分酵母的死活细胞的方法。
二、实验原理
1 测微尺的使用：
包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载片。一般每格10μm。台尺不直接测大小，只用于校正目尺每格的相对长度。（用于标定目尺，使台尺与目尺重合）。
目镜测微尺（目尺）是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度。不同透镜组合放大倍数不同，目尺每小格代表的实际长度也不一样。
计算：n目尺×每小格目尺所代表的长度＝n台尺×10 μm
2.酵母菌死活细胞的鉴定：
酵母菌的形态多为圆形，少数为椭圆型及不规则型，本实验面包酵母近圆形。美蓝作为无毒性染料，其氧化型呈蓝色，还原型呈无色。活的酵母细胞具有新陈代谢活性，能使美蓝由氧化型（蓝）变为还原型（无色），染约3 min，死的酵母或衰老的细胞代谢能力弱，菌体呈蓝色或浅蓝色。据此区分死活酵母。
三、材料
高活性干酵母（安琪牌）
仪器：目镜测微尺（目尺），镜台测微尺（台尺）
四、步骤
1 安装目尺，校正目尺。→放台尺→调焦→低倍镜下使目尺与台尺零点对齐，并在某一刻度上完全重合（准焦）→低倍、高倍、油镜下分别计算目尺每格所代表的长度。
2 制作酵母的美蓝水浸片：载片上加一滴美蓝染液，挑取酵母与之混匀。用镊子取盖片，注意避免产生气泡。
3.菌体大小测定：校正完毕，移走台尺，换上制好的面包酵母的水浸片，先
低倍后高倍。面包酵母几乎圆形，测其直径占目尺多少格，将格数乘上目
尺每格代表的长度，即为面包酵母的实际大小。
4.计算菌体大小，将目尺取出放入盒内保存。
五、实验结果
1．目尺校正结果
接物镜放大倍数目尺格数台尺格数目尺每格代表的长
度（μm）
低倍镜
高倍镜
2．面包酵母的大小：￠＝。
六、思考题
1.更换不同放大倍数的目镜和物镜时，为什么必须用台尺重新校正目尺？
2.目镜和目尺不变，改用不同放大倍数的物镜来测同一细菌时，其测定结果
是否相同？为什么？
3.
实验五培养基的配制与消毒灭菌
一、目的
1.学习并掌握配制培养基的一般方法和步骤。
2.学习并掌握高压灭菌锅的使用。
二、原理
高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽产生的高于100℃的高温、以及热蒸汽的穿透能力，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
三、仪器
1. 天平：扭力托盘天平、电子天平
2. 台式自动电热高压蒸气灭菌器受、手提式高压蒸气灭菌器
四、步骤
（一）培养基的配制
操作步骤：称药品——加热搅拌溶化——调PH——过滤——分装——加塞——包扎——灭菌——摆斜面——无菌检查。
1.无氮培养基（土壤微生物的分离纯化培养用）
甘露醇或葡萄糖 10 g
KH2PO4 0.2 g
MgSO4.7H2O 0.2 g
NaCl 0.2 g
CaSO4.2H2O 0.2 g
CaCO3 5 g
蒸馏水 1000 ml
（调pH 7.0-7.2）
2.LB肉汤培养基（大肠杆菌生长曲线测定用）
蛋白胨 10 g
酵母膏 5 g
NaCl 10 g
蒸馏水 1000 ml
调pH 7.0，每支试管分装5 ml /支。
3.营养琼脂平板（细菌总数测定）：按说明配制。
4 乳糖胆盐发酵培养基（大肠菌群的测定用）：先放小倒管。据说明配制双料管和单料管。按说明配制，试管准确分装为10 ml/支。
5.EMB平板：按说明配制。
6.蛋白胨水培养基：按说明配制，试管分装为10 ml/支。
7.葡萄糖蛋白胨水培养基：
蛋白胨 5 g
葡萄糖 5 g
K2HPO4 2g
加蒸馏水至1000 ml，调pH 7.0－7.2，试管分装为10 ml/支。
8 柠檬酸盐斜面培养基：按说明书配制。注意斜面的摆放。
（二）分装、包扎、作标记（培养基名称、操作人、日期）。
（三）高压蒸气灭菌
①加水：往锅内加入适量的水，切勿加少了。
②装料：把要灭菌的材料装入锅内。
③加盖：关严灭菌锅盖和其它阀门，勿使漏气。
④加热。（编灭菌的程序）
⑤排放冷空气：当压力上升至0.05 MPa时，打开放气阀，将锅内的冷空气放走，待压力下降为“O”时，再关闭放气阀门。
⑥升压。
⑦保压：当压力上升至所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
⑧降压：达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到“O”后，打开放气阀，再开盖。
⑨无菌检查。
(附：使用高压蒸汽灭菌器的注意事项)
第一，严格按照操作程序进行，灭菌时，操作者切勿擅自离开，以免发生事故。
第二，增压前必须充分排尽锅内的冷空气，否则压力虽然升高，而温度达不到要求，造成灭菌不彻底的结果。这是高蒸汽灭菌是否彻底的一个重要关键。
第三，灭菌完毕后，压力未降到0.05 MPa以下时，切勿打开放气阀，否则锅内突然减压，培养基和其它液体会从容器内喷出，或沾湿棉塞，则使用时容易污染杂菌甚至造成人身伤害。
五、思考题：
1 试述高压蒸气灭菌的主要操作过程和注意事项。
2 培养基配好后为什么要立即灭菌？如何检验灭菌后的培养基是否无菌？
实验六土壤微生物的分离纯化以及鉴定
一、实验目的
1、学习从土壤中分离纯化微生物的基术操作技术。
2、掌握样品稀释的方法和稀释倒平板等几种常用的分离纯化微生物的方法。
3. 掌握荚膜染色法，学习圆褐固氮菌的分离和鉴定。
二、实验原理
土壤中有大量混杂的微生物，以土壤作为菌源，通过稀释分离，使其分散成单个存在的菌体、芽孢或孢子，以便在固体平板上经过培养，长成内眼可见的并具有一定特征的菌落，经鉴定或进一步纯化，即可转入相应的培养基成纯培养。
从无氮培养基分离出的圆褐固氮菌具荚膜，它是包在细菌细胞壁外的一层粘液性物质，与染料亲和力低，故一般采用负染色的方法，使背景与菌体之间形成一透明区，便于观察。
三、实验仪器、材料
微量移液器、无N培养基、染料等。
四、实验方法
（一）稀释倒平板法分离圆褐固氮菌。
1、采土壤：取表层以下5—10cm处的菜园土。
2、制备土壤悬液：称土样5g→45ml无菌水（带玻璃珠）→振荡5—10分种，即成10-1的土壤悬液。
3、10倍稀释：10-1取1ml→放到9ml无菌水稀释管中，即成10-2的稀释液，10-2取1ml→放到9ml无菌水稀释管中，即成10-3的稀释液。
4、稀释倒平板：取10-2、10-3两管稀释液各1ml，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿，然后，每个平皿分别倒入约15ml已融化并冷至50℃左右的察氏培养基，轻轻摇匀，凝固后即成霉菌平板。
5、培养：28～30℃，倒置培养3—4天。
（二）种土法分离圆褐固氮菌。
用灭菌镊子取火柴头大小（绿豆般大小）的土粒，接种于无氮培养基平板表面，28～30℃，倒置培养3—4天。
（三）荚膜的染色。
挑取圆褐固氮菌的可疑菌落进行菌涂片，进行荚膜染色。
单染法：菌体紫色、荚膜浅色或无色。
五、思考题：
1、稀释倒平板法分离微生物时应注意什么问题？吸取菌悬液时为什么要从低浓度到高浓度？
2、平板培养时，为什么要倒置培养？
六、绘图：
绘出圆褐固氮菌的形态图。
实验七大肠杆菌生长曲线的测定
一、目的
1.了解细菌生长的规律和生长曲线的测定原理。
2.学习光电比浊法测定大肠杆菌的生长曲线。
二、原理
将一定量的大肠杆菌接种到新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。实验中每隔一定时间测定培养液的菌量，一培养时间为横坐标，以细菌数目的对数为纵坐标绘出生长曲线。
不同的细菌在相同培养条件下其生长曲线不同，同种细菌在不同培养条件下其生长曲线亦不同。可见，生长曲线是细菌等微生物在一定条件下于液体培养出来的群体生长规律。
本实验利用细菌数量与菌悬液的浊度（OD值）成正比，用721分光光度计测生长曲线。
三、材料
1.菌种：大肠杆菌
2.培养基：LB培养基
3.仪器：恒温振荡培养箱、721分光光度计
四、步骤
1.试管编号。共11支管。
2.接种。
准确移取0.2 ml菌悬液接种到各试管中。
3.培养：37 ℃分别培养不同时间
4.测OD值。
在530 nm处有最大吸收值，本实验测OD530。对于OD值大于0.7的管，应用LB培养液适当稀释后进行测定，保证OD值的读数在0.2－0.7之间，结果才算准确。
五、绘图：绘制大肠杆菌的生长曲线。
六．思考题
1 影响细菌生长曲线走向的因素有哪些？
2 比浊法和平板计数法绘出的生长曲线有何区别？哪个方法更科学？
实验八食品微生物检验（一）菌落总数测定
1.一、小组设计实验方案并经审核才能做实验
2.二、思考题：
1 为什么采样要有代表性？如何做到采样的代表性？
2 你认为采样时要注意什么细节？菌落计数有哪些技巧？
实验九食品微生物检验（二）大肠菌群测定
一小组设计实验方案并经审核才能做实验
二思考题：
1 如何判断乳糖胆盐发酵管阳性？它与革兰氏染色阳性有何关系？
2 通过食品卫生的微生物检验，你有何体会？
实验十微生物的生理生化试验
一目的:
1 学习细菌的分类鉴定方法(鉴定大肠杆菌和产气肠杆菌).
2 通过不同细菌对碳源和氮源的利用情况,了解微生物代谢的多样性.
3 了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义.
二原理
IMViC是吲哚,甲基红,V-P试验和柠檬酸盐四个实验的缩写.这四个试验主要用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌.多用于水的细菌学检查,大肠杆菌虽非致病菌,但在饮用水中以此为指标指示受粪便污染情况.产气肠杆菌也广泛存在于自然界,因此检查水时要将两种分开。
(1) 吲哚反应:有分解色氨酸能力的细菌产生吲哚和丙酮酸,吲哚与二甲基氨基苯甲醛结合,形成红色玫瑰吲哚；
(2)甲基红试验:检测由葡萄糖产生的有机酸如甲酸,乙酸和乳酸等, 甲基红试剂由橘黄色(pH6.3)变为红色(pH4.2).大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4,但产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物,如乙醇,丙酮酸等,使pH升至大约6,因此大肠杆菌为阳性反应而产气肠杆菌为阴性反应.
(3)V-P试验:测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力, 丙酮酸.丙酮酸进行缩合,脱羧生产乙酰甲基甲醇,此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰.二乙酰与蛋白质中精氨酸的胍基作用,生成红色化合物,即V-P试验阳性.产气肠杆菌为V-P 试验阳性,二大肠杆菌为阴性反应。
(4)柠檬酸盐试验:检测细菌利用柠檬酸盐的能力.大肠杆菌不利用柠檬酸盐作为碳源,而产气肠杆菌能利用柠檬酸盐.细菌在分解柠檬酸盐及其培养基中的磷酸铵后,产生碱性物质使培养基的pH升高,当加入1%溴麝香蓝指示剂时,培养基由绿变深蓝色.
(5)硫化氢试验:检测硫化氢的产生.用于肠道菌的常用生化试验.有些细菌能分解含硫有机物如胱氨酸,半胱氨酸,甲硫氨酸等产生硫化氢,硫化氢遇到培养基中的铅盐或铁盐等,形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物.大肠杆菌为硫化氢试验阴性,产气肠杆菌为阳性.
三培养基
蛋白胨水培养基,葡萄糖蛋白胨水培养基,柠檬酸盐斜面培养基,
溶液与试剂:甲基红指示剂,40% KOH,5%a-奈酚,乙醚,吲哚试剂等.
四步骤
1 接种和培养
2 观察结果
五、结果
将实验结果填入下表。“＋”表阳性反应，“－”表阴性反应
菌名吲哚试验甲基红试验V-P试验柠檬酸盐试验硫化氢试验大肠杆菌
产气肠菌
结论
六、思考题
1 讨论IMViC试验在医学检验上的意义。
2 为什么大肠杆菌是甲基红试验反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？
课程编号： 《微生物学实验》教学大纲 学时数：108讲课：108 学制：四年制本科 适合专业：生物科学相关专业 一、本课程的性质和任务 （一）课程的性质： 微生物学实验主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。 （二）课程的任务： 微生物学实验是生物学重要的基础课之一，要求学生熟悉微生物学方法与技术，掌握无菌操作技能和建立无菌概念是微生物学实验中最重要的内容，重点掌握最基本的无菌操作技能，如接种、纯培养、计数等。 二、本课程与其他课程的联系： 1. 通过教师示范、讲解与学生实际操作相结合方法，使学生牢固树立无菌概念，掌握显微镜的使用、生物染色技术、形态学观察的方法、微生物计数、培养基的配置和灭菌方法、微生物分离、纯化等基本操作技能，基本了解常用的仪器设备的基本原理、构造、使用方法及使用中的注意事项，树立严谨求实的科学态度，提高观察、分析问题和解决问题的能力，培养勤俭节约、爱护公物和相互协作的优良作风。 2. 本实验课内容包括验证性实验、综合性实验两个部分。验证性实验主要
通过光学显微镜镜检观察方法进行教学，综合实验在教师指导下学生根据所掌握的理论基础和实验技能，由学生自己动手完成。实验过程要求学生仔细观察实验现象，完整记录原始实验数据、结果，分析实验现象并认真填写实验报告。 三、教学内容 （一）实验一实验室安全教育与微生物学实验室常用的器皿 目的要求 掌握实验室安全规则，了解微生物学实验所用的器皿，因其大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此了解其质量、洗涤和包装方法的要求。 实验内容 一、器皿的种类、要求与应用： 1、试管 大试管(约18mm×180mm) :可装倒平板用的培养基；可作制备斜面用；装液体培养基用于微生物的振荡培养 中试管[(13～15)mm×(100～150)mm]: 装液体培养基培养细菌或做斜面用；用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。 小试管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。 2、容量瓶 主要用于准确配制一定浓度的溶液，它是一种细长颈、梨形的平底玻璃瓶，配有磨口塞，瓶颈上刻有标线。 3、量筒 用来量取液体体积的一种玻璃仪器，外壁上有刻度。常用量筒的规格有5ml、10ml、25ml、50ml、100ml、250ml等。 4、三角瓶 用来装无菌水、培养基和振荡培养微生物等。 5、烧杯 呈圆柱形，顶部的一侧开有一个槽口，便于倾倒液体，有些烧杯外壁标有刻度，可以粗略地估计烧杯中液体的体积，这种烧杯叫印标烧杯，也叫刻度烧杯，其分度并不十分精确，允许误差一般在±5%。 6、烧瓶 通常具有圆肚细颈的外观，因瓶口很窄，不适用玻璃棒搅拌，若需要搅拌时，
微生物实验知识总结与实践应用经过这学期学习和实验操作，我对《微生物实验》有了一些初步的认识，也从中学习到了有用的知识。《微生物学实验》是要求我们掌握实验知识的基本操作和技能训练，初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的科学前沿接轨。微生物：包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。我将我这学期学到的微生物学知识，结合生活和工业当中的一些应用，归纳如下：在吾尔恩老师的带领下，我们先从最基本的知识学起。 （1）无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因此微生物在转接过程中，一般再火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌的目的。在做实验时要保持严谨的态度，以后的实验中多数操作都必须再火焰旁进行。 （2）培养基的制备：培养基是人工配置的生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别微生物或积累代谢产物。自然界中培养基的种类很多，但是不同的培养基中，一般含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等，不同类别的微生物对PH值的要求一般不同。 （3）消毒与灭菌：灭菌是用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或
环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。是指用物理或化学的方法杀灭全部微生 物，使之达到无菌保障水平。经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。 （4）平板分离与活菌计数：平板分离计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上。经培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。平板分离法主要有：1.平板划线分离法。2.稀释涂布平板法。 （5）革兰氏染色法：革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G-）两种类型。这是两种细菌细胞壁结构和组成的差异决定的。大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，经过革兰氏染色后两者呈现不同的颜色，在显微镜下便于进行观察…… 我们学习微生物实验技术，就是要把微生物的实验技能应用于实践生产，培养繁育细菌收集细菌代谢产物，应用于药业、工业，产生经济利益。制备培养基是微生物实验技术操作的重要环节，按照培养基的功能分类培养基的类型有：1.选择培养基。2.鉴别培养基。在工业生产中常常应用于培养微生物的主要是-发酵罐。我将微生物在生产生活中的应用总结如下： 微生物技术的应用在当今社会中已取得了很大的作用，在工业、农业、医药业、畜牧业等各个行业中都取得了长足的进展，但相对于
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
2012级制药专业 工业微生物学实验报告 姓名: 刘甜甜学号: 2012304090 班级: 制药12-2班指导老师：王健 日期：2014.6.11
一、实验目的 1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。 2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。 3、了解细菌的形态特征、染色特点。 4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。 5、掌握细菌分离划线培养的方法。 6、掌握细菌的初步生化反应。 7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌K-B药敏纸片法。 二、实验内容 1 细菌Gram’s stain染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征 1.1 实验原理：染色原理：G+菌与Gˉ菌细胞壁不同，G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高，G+菌比Gˉ等电点低。 1.2 实验步骤： 1.2.1.制片：○1涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混匀，均匀涂布约1cm2大小，自然干燥； ②固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面； 1.2.2染色：①初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域； ②媒染：取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗； ③脱色：取95%酒精2~3滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗； ④复染：取1：10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水冲洗； ⑤吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥； 1.2.3 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜（100倍目镜）下。 图1：Gram’s stain（1000×）图2：染色试验 三、分离培养 1实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
《微生物学》实验教学教案[实验项目] 实验一微生物学试验常用玻璃仪器洗涤及干热灭菌 [教学时数] 3学时 [实验目的与要求] 1．认识微生物实验所需要的各种器皿，了解常用工具和仪器的名称、用途。 2．掌握对玻璃器皿的清洗、包扎方法与干热灭菌的操作过程。 [实验原理] 微生物学实验要求较高的无菌状态，因此，实验所用的器皿，大多数要进行消毒、灭菌从而用以培养微生物，所以对其质量、规格、洗涤和包扎方法均有一定要求。 清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防止污染杂菌。 干热灭菌的原理，空的玻璃器皿一般用干热灭菌。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。 [实验材料与设备] 1．培养皿、大试管、三角瓶6只、烧杯（500ml）2只、烧杯（1000ml）1只、小试管6只、吸管（0.2ml 2支，0.5ml 2支，1ml 2支，5ml 2支）共8支。 2．去污粉、肥皂、清洗剂、毛刷。 3．棉花、扎绳、包扎纸。 [实验步骤] （一）学习下列常用仪器的种类、规格和应用范围 1. 培养皿 由一底一盖组成一套，常用的培养皿皿底直径90 mm，高15mm,皿底皿盖均为玻璃制成。制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种、活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。 2. 试管 (1)大试管(约18mm×180mm) : 可装倒平板用的培养基，可作制备斜面用（需要大量菌体时用），装液体培养基用于微生物的振荡培养。 (2)中试管[(13～15)mm×(100～150)mm]: 装液体培养基培养细菌或做斜面用，用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。 (3)小试管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。 3.三角瓶
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
《微生物学》课程教学大纲 课程名称：微生物学 课程类型: 必修课 总学时： 108 讲课学时： 54 实验学时：54 学分：3 适用对象: 生物工程专业 先修课程：普通生物学，生物化学 一、课程性质、目的和任务 微生物学是生命科学的一个重要分支，是生物工程专业的一个重要的学科基础必修课。通过本课程的学习，使学生掌握微生物学在生命科学领域发展中的作用；微生物的主要类群；微生物的生长规律及控制；病毒的结构、复制、防治；了解微生物学的研究方法和手段；培养学生“综合”生物学的科学思想，从而使学生能够运用“综合”思想解决生物学中的问题，为学生学习有关后续课程提供必要的理论基础。 二、教学基本要求 通过本课程的学习，要求学生系统掌握微生物学在生命科学领域发展中的作用；微生物的主要类群；微生物的生长规律及控制；了解微生物学的研究方法和手段。 三、教学内容及要求 （一）绪论 1.教学基本内容： （1）微生物与人类； （2）微生物的发现和微生物学的建立与发展； （3）微生物的类群及特点； （4）微生物学研究对象与任务； （5）本课程的目的、要求及范围。 2.要求：通过教学，引导学生走进微生物世界，了解微生物的概念和作用以及它们与人类的特殊关系；明确微生物学作为一门独立学科在生命科学发展中的重要作用和地位；展望未来，激发学生的学习兴趣和明确肩负的重任。 （二）微生物细胞的结构和功能——原核微生物 1.教学基本内容： （1）细菌的形态、结构和繁殖，细菌的群体形态； （2）放线菌的形态、结构和繁殖，放线菌的群体形态； （3）蓝细菌的形态、结构和繁殖；（3～5部分用图表形式概要描述）
（4）支原体、立克次氏体和衣原体的形态、结构、功能和繁殖； （5）古生菌的概念、细胞形态和细胞结构。 2.要求：掌握细菌、放线菌的个体形态、细胞结构、化学组成、群体形态特征、繁殖方式。了解蓝细菌、支原体、立克次氏体、衣原体及古生菌的基本结构特点和生活特性。 （三）微生物细胞的结构和功能——真核微生物 1.教学基本内容： （1）真核微生物的概述； （2）酵母菌的形态、结构和繁殖，酵母菌的群体形态； （3）霉菌的形态、结构和繁殖方式，重点以青霉和曲霉为主，霉菌的群体形态； 2.要求：掌握酵母菌、霉菌的个体形态、结构、群体形态特征、繁殖方式。 （四）病毒 1.教学基本内容： （1）病毒的定义和特点； （2）病毒的形态、种类、结构和化学组成与功能；（重点） （3）病毒的复制和感染；（重点） （4）病毒与宿主的相互作用；（重点与难点） （5）亚病毒因子； （6）病毒与实践：危害人类健康的病毒。 2.要求：了解病毒类群的划分，掌握病毒的形态、结构、化学组成，重点掌握病毒的复制及病毒与宿主的相互作用。 （五）微生物的营养 1.教学基本内容： （1）微生物细胞的化学组成和营养物质及其生理功能； （2）微生物的营养类型（光能营养型微生物和化能营养型微生物）； （3）微生物吸收营养的方式（单纯扩散、促进扩散、主动运送和膜泡运输）； （4）选用和设计培养基的原则和方法、培养基的类型及应用。（重点与难点） 2.要求：掌握微生物所需营养素、微生物营养类型、吸收营养的方式，学会培养微生物的各类型的培养基配制原则及其应用。 （六）微生物的代谢 1.教学基本内容： （1）微生物产能代谢 异养微生物的生物氧化，自养微生物的生物氧化，光能营养微生物的能量转换过程，能量转换方式（2）微生物特有的耗能代谢——二氧化碳的固定，固氮作用，肽聚糖的合成及其它
《微生物学》学习指南 一、课程的基本情况 本课程总学时：104 学时，其中理论教学：40学时，实验教学40学时，实习周教学1周（24学时），一个学期内完成全部授课内容。 《微生物学》课程是我校微生物技术及应用、生物技术及应用、食品加工技术、饲料与动物营养、食品安全与质量管理等9个专业的必修课程。《微生物学》是建立在学生学完《化学应用技术》、《生物化学》等课程之后开设的课程，是一门实践性较强的专业基础课。是微生物技术及应用专业、生物技术及应用专业和酿酒技术专业的核心主干课程。 本课程的主要内容：微生物形态观察、微生物培养、微生物生长测定、微生物分离纯化及鉴定、微生物检测、微生物育种和微生物的保藏。本课程的主要任务是使学生掌握微生物的形态构造、营养代谢、生长控制、遗传变异等方面的基本理论知识，掌握无菌操作技术、微生物的分离和培养技术、微生物鉴定技术、工业微生物菌种选育及保藏技术等关键技能，学习无菌操作室、微生物菌种室的建设，并掌握微生物技术常用仪器和设备的运行与维护，并培养学生之间的团结协作及沟通能力。学完该课程，为学生今后的学习及工作奠定坚实的基础。二、基本学习方法 《微生物学》课程理论、实践性均强，内容丰富，知识点琐碎，技能训练要求严格，许多学生反映该学科难学。因此，如何教与学好这门学科是很值得探讨的问题。这需要师生共同努力，教与学相辅相承。 1.明确目的是前提 要学好一门课程，首先要充分认识学科的性质及其重要性，才会有学习的动力，由“要我学”变为“我要学”，这样，你才能认真地、刻苦地去钻研它。这就要求你要听好第一堂即“认识微生物和微生物学”的讲解，明确学习的目的，激发学习的兴趣。明确微生物学与人们的生产生活联系非常紧密，与多学科联系紧密，有“桥梁”学科之称。如后续的发酵工艺课中的酶制剂、微生态制剂、酒
食品微生物学实验技术思考题答案 1. 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？ 答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比. 2. 列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作答：使用高倍镜和油镜时镜头距离标本较近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。 3. 什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 4. 影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：物镜的NA 值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长 5. 根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察 答：细菌用油镜，真菌用高倍镜。都是先用低倍镜找到目标后，再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。 答：放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大40 倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大1000 倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。 6. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节 7. 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 答：着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌 8. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 答：不可以。因为碘与染料会结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞的细胞壁，对
微生物学教程期末复习文档编制序号：[KK8UY-LL9IO69-TTO6M3-MTOL89-FTT688]
一、名词解释：微生物:微生物是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚或无细胞结构，用肉眼看不见或看不清的低等生物的总称。 微生物学:微生物学是一门在细胞、分子或群体水平上研究微生物的形态构造、生理代谢、遗传变异、生态分布和分类进化等生命活动基本规 律，并将其应用于工业发酵、医药卫生、生物工程和环境保护等实践 领域的科学，其根本任务是发掘、利用、改善和保护有益微生物，控 制、消灭或改造有害微生物，为人类社会的进步服务。 原核生物：即广义的细菌，指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作核区的裸露DNA的原始 细菌：是一类细胞细短、结构简单、胞壁坚韧、多以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物。 病毒：是超显微的，无细胞结构，专性活细胞内寄生，在活细胞外具一般化学大分子特征，一旦进入宿主细胞又具有生命特征。 烈性噬菌体：凡在短时间内能连续完成吸附、侵入、增殖、成熟、裂解这五个阶段而实现其繁殖的噬菌体，称为烈性噬菌体。 C/N比：所谓C/N是指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子的摩尔数与氮源中氮原子的摩尔数之比。 生长因子：一类对微生物正常代谢必不可少且又不能从简单的碳、氮源自行合成的所需极微量的有机物。
培养基：是一种人工配制的适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料，它具备微生物所需的六大营养元素，且其间比例合适。 基因：是生物体内一切具有复制能力的最小遗传功能单位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段。 纯培养：微生物学中将在实验条件下从一个单细胞繁殖得到的后代称为纯培养。 次生代谢产物：指某些微生物的生长到稳定期前后，以结构简单、代谢途径明确、产量较大的初生代谢作前体，通过复杂的次生代谢途径所合成的各种结构复杂化学物。 发酵：无氧条件下，底物脱氢后产生的还原力不经呼吸链而直接传递给某一中间代谢物的低效产能反应。 抗生素：微生物在其生命过程中所产生的一类低分子量代谢产物，在很低浓度下就能抑制或杀死其它微生物的生长。 最小抑制浓度:表示抗生素的抗菌活性，单位是g/ml。 抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，这种作用范围称该抗生素的抗菌谱。广谱：对多种微生物有作用（如：土霉素、四环素）； 窄谱：仅对某一类微生物有作用（如：多粘菌素） 生态学（ecology）：是一门研究生命系统结构，及其与环境系统间相互作用规律的科学。 微生物生态学：是生态学的一个分支，它的研究对象是微生物与其周围生物和非生物环境条件相互作用的规律。
实验一实验室和人体表面微生物的检查 一实验目的 1 证明实验室环境与体表存在微生物 2 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型 3 体会无菌操作的重要性 二实验原理 平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内每一菌体能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通过平板培养基来检查环境中微生物的数量和类型。 三、器材 1、培养基牛肉膏蛋白胨琼脂平板 2、仪器或其他用具无菌水、灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯，记号笔，废物缸。 四、操作步骤 1、写标签 任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号（包括班级、姓名、日期、样品来源等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。 注：培养皿的记号一般写在皿底上，如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时容易混淆。 2、实验室细菌检查 （1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在实验台上，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中，将另一块肉膏蛋白胨琼脂平板放在洁净工作台内或无人走动的实验室中，移去皿盖，1h后盖上两个皿盖。 （2）实验台 ①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。 ②取棉签 左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞，将其取出，将管口很快地通过酒精灯的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。放回棉塞，并将空试管放在试管架上。 ③弄湿棉签 左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞，并将灭菌水试管放在试管架上。 ④取样将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围。 ⑤接种在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下），立即闭合皿盖。将原放棉签的空试管拔出棉塞，烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。
实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 （一）实验目的 1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。 2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤 （二）实验内容 1．学习油浸系物镜的使用方法。 2．制作细菌染色装片。 3．进行革兰氏染色法操作。 4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。 二、实验原理 （一）油镜的基本原理 普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。 图1-1 显微镜物镜参数图 显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.
从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。 （二）革兰氏染色 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
微生物学实验报告格式 专业学号 姓名 实验一、···培养基的配制和高压蒸汽灭菌 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（实际用到哪些试剂、材料、玻璃器皿等都要写出，包括数量） 四、实验步骤（按照实际步骤填写,切忌抄袭） 五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 六、思考题 1、简述培养基的配制原则？ 2.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？ 3.高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的冷空气完全排尽？ 实验二自生固氮菌的分离纯化 （这是个综合实验，请大家回顾三周来的所有操作步骤，将其整理成连贯完整的一份报告，注意每次实验的衔接，不要把其他的实验项目写进来，但也不要漏写该实验的相关步骤。） 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（整个综合实验有涉及到的材料都要列出）
四、实验步骤（详叙每周所做的相关步骤） 五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 六、思考题 1、划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？ 2、如何从自然界中分离自己所需要的纯培养？ 实验三平板培养测数法 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（实际操作有涉及到的材料都要列出） 四、实验步骤（详叙相关步骤） 五、实验结果 六、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 七、思考题 1、平板菌落计数法中，为什么溶化后的培养基再冷却至45℃左右才能倒平板？ 2、本次实验是否成功？如果失败，试分析原因。 实验四简单染色 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并描述所观察到的细菌的显微形态）
六、思考题 1、简单染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？ 实验五革兰氏染色 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并判断自己分离到的菌种是G还是G+-？） 六、思考题 1、革兰氏染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？ 2、什么情况下会导致结果出现假阳性或假阴性？ 实验六放线菌的印片染色法 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并描述放线菌的显微形态特征） 六、注意事项 微生物学实验报告格式
绪论微生物与人类 微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。个体微小(一般小于0。1nm）、构造简单。 微生物种类：①原核类：细菌（真细菌，古生菌)，放线菌，蓝细菌，枝原体，立克次氏体，衣原体。②真核类：真菌(酵母菌，霉菌，蕈[xun]菌）,原生动物，显微藻类.③非细胞类：病毒，亚病毒(类病毒，拟病毒，朊病毒）。 微生物五大共性：体积小，面积大；吸收多,转化快；生长旺,繁殖快；适应强，易变异；分布广，种类多。 第一章原核生物的形态、构造和功能 一般构造:细胞壁，细胞膜,细胞质，核区.特殊构造：鞭毛，菌毛,性菌毛，糖被（包括荚膜和粘液层）和芽孢，伴孢晶体。 细胞壁是细胞的外被，主要成分肽聚糖。功能：①固定细胞外形和提高机械强度②为细胞生长、分裂和鞭毛运动所必需③阻拦大分子有害物质（某些抗生素和水解酶）进入细胞④赋予细菌特定的抗原性以及对抗生素和噬菌体的敏感性⑤与革兰氏染色反应密切相关革兰氏阳性细菌细胞壁：磷壁酸，脂磷壁酸,肽聚糖。厚度大（20层）,90%肽聚糖和10％磷壁酸。 革兰氏阴性细菌细胞壁：肽聚糖，脂蛋白，磷脂，脂多糖，孔蛋白，外膜蛋白。壁薄，层次多，成分复杂，机械强度较弱。 革兰氏染色法：涂片固定→结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红覆染 阳性菌：紫色.阴性菌:红色。 缺壁细菌1。实验室中形成：①自发缺壁突变：L型细菌。②人工方法去壁：彻底除尽（原生质体）、部分去除(球状体）2.自然界长期进化中形成：枝原体。 L型细菌:专指稳定的L型即那些实验室或宿主体内通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺损菌株。 芽孢形成：①DNA浓缩，形成束状染色体；②细胞膜内陷，细胞发生不对称分裂，其中小体积部分即为前芽孢；③前芽孢的双层隔膜形成,这时芽孢的抗热性提高；④在上述两层隔膜间充填芽孢肽聚糖后,合成DPA-Ca（吡啶2，6—二羟酸钙）,开始形成皮层，再经脱水，使折光率提高；芽孢衣合成结束;⑥皮层合成完成，芽孢成熟,抗热性出现；⑦芽孢囊裂解,芽孢游离外出. 渗透调节皮层膨胀学说:芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中的水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种失水的核心才赋予了芽孢极强的耐热性。 放线菌：是一类主要呈菌丝状生长和一孢子繁殖的陆生性较强的原核生物。也可以将其定义为一类主要呈丝状生长和以孢子繁殖的革兰氏阳性细菌。 枝原体,立克次氏体，衣原体寄生性逐步增强，是介于细菌和病毒间的一类原核生物。 枝原体的特点：①细胞很小,光镜下勉强可见；②细胞膜含甾[zai］醇，比其他原核生物的膜更坚韧；③因无细胞壁，故呈革兰氏阴性细菌且形态易变，对渗透压较敏感,对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感；④菌落小（0.1~1。0mm），在固体培养基表面呈特有的“油煎蛋”状;⑤以二分裂和出芽等方式繁殖；⑥能在含血清、酵母菌和甾醇等营养丰富的培养基
实验须知 普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。 7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前需浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。 8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。 11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。
微生物学实验报告 (格式标准) (生命科学专业) 教师:黎勇 目录索引 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5 实验三常用培养基的配制7 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8 实验五、微生物大小的测定与显微计数10 实验六环境中微生物的检测与分离纯化11 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12 实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13 课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科 实验日期: 指导教师:黎勇 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1、 N·A=n·sinα 2、 D=λ/2N、A 3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。 4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕: (一) 油镜的使用 镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图 取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。 (二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察 (三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。(描绘时按视野实际大小5－10倍绘制)
南京大学生物技术系实验报告 题目放线菌、酵母菌和霉菌的形态观察 【一、实验目的】 1、通过菌落及细胞形态的观察和比较，掌握区分细菌、放线菌、酵母菌和霉 菌的要点。 2、掌握观察放线菌孢子的方法。 3、掌握观察霉菌孢子及根霉假根的方法。 4、了解酵母菌子囊孢子形成的方法。 【二、实验原理】 1、三类微生物菌落形态特征： 霉菌形态比细菌、酵母菌复杂，个体比较大，具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。霉菌营养体的基本形态单位是菌丝，包括有隔菌丝和无隔菌丝。营养菌丝分布在营养基质的内部，气生菌丝伸展到空气中。营养菌丝体除基本结构以外，有的霉菌还有一些特化形态，例如假根、匍匐菌丝、吸器等。霉菌的繁殖体不仅包括无性繁殖体，例如分生孢子，孢子囊等，包裹其内或附着其上的有各类无性孢子；还包括有性繁殖结构，例如子囊果，其内形成有性孢子。在观察时要注意细胞的大小，菌丝构造和繁殖方式。 放线菌一般由分枝状菌丝组成，它的菌丝可分为基内菌丝(营养菌丝)、气生菌丝或有孢子丝三种。放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。 酵母菌是单细胞的真核微生物，细胞核和细胞质有明且分化，个体比细菌大得多。酵母菌的形态通常有球状、卵园状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。酵母菌的无性繁殖有芽殖、裂殖和产生掷孢子；酵母菌的有性繁殖形成子囊和子囊孢子。酵母菌母细胞在一系列的芽殖后，如果长大的子细胞与母细胞并不分离，就会形成藕节状的假菌丝。 2、三点接种法与霉菌菌落形态的观察 霉菌的菌落形态是分类鉴定的重要依据。为便于观察，通常用接种针挑