基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达技巧
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达 前言 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。 基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。 第一节基因的表达系统与表达策略 一、最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。 二、宿主细胞的选择 （一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求: 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。 （二）宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 ②有各类菌株和载体系列。 ③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。 ④易培养，成本低。 缺点： ①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。 ②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
(完整版)基因表达练习题
基因表达练习题 班级姓名 一、选择题 1．下图所示的过程，正常情况下在动植物细胞中都不可能发生的是 ( ) A．①② B．③④⑥ C．⑤⑥ D. ④⑤⑥ 2．关于蛋白质生物合成的叙述，正确的是( ) A．一种tRNA可以携带多种氨基酸 B．DNA聚合酶是在细胞核内合成的 C．反密码子是位于mRNA上相邻的3个碱基 D．线粒体中的DNA能控制某些蛋白质的合成 3．基因、遗传信息和密码子分别是指( ) ①信使RNA上核苷酸的排列顺序 ②基因中脱氧核苷酸的排列顺序 ③DNA上决定氨基酸的三个相邻碱基 ④信使RNA上决定氨基酸的三个相邻碱基 ⑤转运RNA上一端的三个相邻碱基 ⑥有遗传效应的DNA片段 A．⑤①③ B．⑥②④ C．⑤①② D．⑥②③ 4．下列图示的生理过程(图中④代表核糖体，⑤代表多肽链)的叙述中，不正确的是( ) A.图中所示的生理过程主要有转录和翻译 B.图中所示的全过程可发生在人的线粒体中 C.遗传信息由③传递到⑤需要tRNA作中介 D.图中①在该过程中起模板作用 5．翻译时出现肽链终止，是因为( ) A．一个与mRNA链终止密码相应的tRNA不能带氨基酸 B．不具有与mRNA链终止密码相应的反密码子 C．mRNA在mRNA链终止密码处停止合成 D．tRNA上出现终止密码 6．下列有关如右图所示的生理过程（图中④代表核糖体，⑤代表多肽链）的叙述，不正确的是( )
A．图中所示的生理过程包括转录和翻译 B．图中所示的过程发生在原核细胞中 C．遗传信息由②传递到⑤需要mRNA作中介 D．图中①在该过程中不起作用，由此可确定①在遗传上不具功能 7．艾滋病病毒(HIV)为逆转录病毒。但无法独立繁殖，其繁殖过程需要在活细胞内进行。其原因不包括( ) A．需要活细胞提供核糖体和tRNA B．需要活细胞提供各种酶和ATP C．需要活细胞提供DNA D．需要活细胞提供各种原料 8．关于基因表达的叙述中，正确的是( ) A．基因表达的最终场所都是核糖体 B．DNA聚合酶催化DNA转录为RNA C．遗传信息只能从DNA传递到RNA D．tRNA上的反密码子是由mRNA转录而来 9．下列关于“中心法则”含义的叙述中，错误的是( ) A．基因通过控制蛋白质的合成来控制生物性状 B．②③过程可在RNA病毒体内发生 C．⑤③④过程所需的原料分别是脱氧核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸 D．②过程中碱基互补配对时，遵循A－U、U－A、C－G、G－C的原则 10．在信使RNA分子结构中，相邻的碱基G与C之间是通过什么结构连接而成( ) A．3个氢键 B．－脱氧核糖－磷酸基－脱氧核糖－ C．－核糖－磷酸基－核糖－ D．－磷酸基－核糖－磷酸基－ 11．遗传学家发现一种某基因的突变对该基因编码的多肽没有影响。这种突变最可能( ) A.缺失了一个核苷酸对 B.改变了起始密码子 C.插入了一个核苷酸对 D.替换了一个核苷酸对 12．组成生物体蛋白质的20种氨基酸所对应的密码子共有( ) A．4个 B．20个 C．61个 D．64个 13．下图示DNA转录过程中的一段，其中核苷酸的种类是( ) A．4种 B．5种 C．6种 D．8种 14．关于转录和翻译的叙述，错误的是( ) A.转录时以核糖核苷酸为原料 B.转录时RNA聚合酶能识别DNA中特定碱基序列
大肠杆菌的基因型
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植物基因在大肠杆菌中的原核表达
植物基因在大肠杆菌中的原核表达 通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。 当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。 以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。 1.准备工作（试剂配置和器材准备） 1)操作流程示意图 主要步骤操作 ①制备pET-32a(+)载体用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收 ②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化，再回收 ③插入片段克隆到pET-32a(+)载体插入片段与pET连接，转化 ④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株 ⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白 ⑥放大试验纯化目的蛋白放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除融合标签 2)配制生长培养基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。 3)宿主菌的保存。长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。 4)感受态细胞的制备，参照其它试验手册。 2.操作步骤 [1] 制备载体 1）载体消化和胶纯化 3μg pET载体 3μl 10×限制性内切酶buffer 10-20U 两种酶（是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%） 3μl 1mg/ml乙酰BSA（根据需要 补足水到30μl
大肠杆菌基因型列表111
A listed gene name means that gene carries a loss of function mutation, a Δ preceding a gene name means the gene is deleted. If a gene is not listed, it is not known to be mutated. Prophages present in wt K-12 strains (F, λ, e14, rac) are listed only if ab sent. E. coli B strains are naturally lon- and dcm-. F- = Does not carry the F plasmid F+ = Carries the F plasmid. The cell is able to mate with F- through conjugation. F'[ ] = Carries an F plasmid that has host chromosomal genes on it from a previous recombination event. This cell can also mate with F- through conjugation. Chromosomal genes carried in the F plasmid are listed in brackets. rB/K+/- = The (B/K) defines the strain lineage. The +/- indicates whether the strain has or hasn't got the restriction system. mB/K+/- = The (B/K) defines the strain lineage. The +/- indicates whether the strain has or hasn't got the modification (methylation) system. hsdS = Both restriction and methylation of certain sequences is deleted from the strain. If you transform DNA from such a strain into a wild type strain, it will be degraded. hsdR = For efficient transformation of cloned unmethylated DNA from PCR amplifications INV( ) = chromosomal inversion between locations indicated ahpC = mutation to alkyl hydroperoxide reductase conferring disulfide reductase activity ara-14 = cannot metabolize arabinose araD = mutation in L-ribulose-phosphate 4-epimerase blocks arabinose metabolism cycA = mutation in alanine transporter; cannot use alanine as a carbon source dapD = mutation in succinyl diaminopimelate aminotransferase leads to succinate or (lysine + methionine) requirement Δ( ) = chromosomal deletion of genes between the listed genes (may include unlisted genes!) dam = adenine methylation at GATC sequences abolished; high recombination efficiency; DNA repair turned on dcm = cytosine methylation at second C of CCWGG sites abolished deoR = regulatory gene that allows constitutive expression of deoxyribose synthesis genes; permits uptake of large plasmids. See Hanahan D, US Patent 4,851,348. ***This has been called into question, as the DH10B genome sequence revealed that it is deoR+. See Durfee08, PMID 18245285. dnaJ = one of the chaparonins inactivated; stabilizes some mutant proteins dut1 = dUTPase activity abolished, leading to increased dUTP concentrations, allowing uracil instead of thymine incorporation in DNA. Stable U incorporation requires ung gene mutation as well. endA1 = For cleaner preparations of DNA and better results in downstream applications due to the elimination of non-specific digestion by Endonuclease I (e14) = excisable prophage like element containing mcrA gene; present in K-12 but missing in many other strains galE = mutations are associated with high competence, increased resistance to phage P1 infection, and 2-deoxygalactose resistance. galE mutations block the production of UDP-galactose, resulting in truncation of LPS glycans to the minimal, "inner core". The exceptional competence of DH10B/TOP10 is thought to be a result of a reduced interference from LPS in the binding and/or
基因表达
生物信息前沿研究进展讲座结课论文 ——基因表达调控网络研究文献综述 物理学院张玉萍 10304830 摘要 近些年来，基因序列测序的完成、大规模测定基因表达水平的基因芯片（Microarray）技术的出现和高性能计算机的使用使得用模拟计算的方法大规模的研究基因表达调控成为可能，一些研究者已经开始绘制控制整个活细胞基因表达的调控网络。例如λ噬菌体的溶原/裂解活性的调控网络的数学模型已经构建出来。用数学模型的方法预测网络结构是目前研究的热点。本文对表达转录调控网络的研究现状进行综述。 基因表达调控网络 Wyrick(2002)[1] 中给出了一个基因表达调控网络的定义：一组调控因子如何调控一套基因表达的过程称为基因表达调控网络。基因表达调控网络是基因调控网络的一个重要部分。参与基因表达调控网络的元素主要包括cDNA、mRNA、蛋白、小分子等。从元素间相互联系的角度来看，基因表达调控网络是一个由节点（调控元素）、边（调控作用）组成的一个有向图结构。如图1 图1：简单基因网络结构示意图 图中每一个圆圈代表一个节点，也就是调控网络的元素，如基因。有向箭头表示表达增强作用，末端断线表示表达抑制作用。在基因网络中，存在基因对自身表达的自调控的现象。 总的来说表达调控网络有如下特点：
A：网络结构复杂 网络中节点和边的数目庞大。在人体中总共有3万到4万左右的基因，而且真核生物中大多数的基因会同时被两个和两个以上的基因调控，这就使网络形成了一个非常高维的结构。 B：网络结构变化 生物学的实验表明，相同的基因在人和动物的细胞周期中可以参加不同的生理过程，实现不同的生理功能。还有一些基因只在某些时刻和特定的外界条件下是有相互作用的，在其他条件下不会发生作用。简单的说就是两个基因间的那条边是否存在、作用的方向在不同时期是可能不一样的。 C：相互作用类型多变 在生物体中，基因间相互作用可以有很多类型（如图1），包括了很多作用的特征：两个基因间谁影响谁、影响的方式、增强的作用还是抑制的作用、影响产生的条件、影响的强弱量级、被调控基因的表达量和调控基因的表达量直接的关系等。目前的研究表明，基因间的相互作用可能是一种非线形的作用关系。在多因子调控模式中还要考虑不同的调控因子对同一个目标调控基因产生作用时的某种逻辑关系，这种逻辑关系是由调控模式中各调控因子的相互关系决定。 D：节点类型多样 网络节点的元素可以是DNA、mRNA、蛋白、分子、大分子、外界环境等等。 E：节点状态变化 在细胞周期过程中，每一个基因的表达量不是固定的，会随着条件的变化而变化、蛋白质在不断的合成，同时也在不断的被降解。在不同的调控模式下，蛋白合成和降解的比率会发生变化，从而会使蛋白处在不同的水平上。基因的表达量的变化会影响到相互作用的变化，会引起网络结构的变化。 F：有向循环结构 在生物体中各种生理上的周期现象，我们很容易理解生物体中的相互作用存在周期性。至少在网络的局部上是循环的。在已经研究的比较多的低等生物E.coli的表达调控网络[2]中已经发现了循环的结构。 表达转录调控网络的研究现状 目前关于基因调控的绝大部分问题还没有解决。除了生物学家努力通过新的实验技术和生物理论来研究问题外，近几年，利用数学、统计学、神经网络、人工智能等方法在计算机上分析模拟表达调控机理，是计算分子生物学方面一个飞速发展的方向。由于分析模型的不同和采用的数据类型的差异，目前研究主要分为两个方面：基于基因芯片数据的关系推断模型和基于基因序列信息的调控因子结合位点推断模型。 下面分别就这两个方面的一些方法做一个简要介绍。 （一）基于基因芯片数据的关系推断方法 基因芯片的数据形式为：
外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤
目的基因在大肠杆菌中的诱导表达 一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。 [主要试剂] 1、LB培养基。 2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 [操作步骤] 1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。 PCR反应体系为： 模板（含R基因的重组质粒）1μl 上游引物PR11μl 下游引物1μl dNTP（2.5mmol/L）5μl 10×PCR buffer（含Mg2+）10μl Taq酶1μl ddH2O补至100μl PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。 2、构建重组表达载体 （1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）
进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 （2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。连接反应体系为： pRSETA1μl R基因片段3μl T4 DNA连接酶（5U/μl）1μl 5×buffer2μl ddH2O补至10μl 3、获得含重组表达质粒的表达菌种 （1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 （2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 （3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。 4、诱导表达 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。 2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.5-0.8（最好0.6，大约需3hr）。 3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。 4、分别取菌体1ml,，离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀，70℃10min。 5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。 6 5500rpm 15min 收集细胞
常用大肠杆菌及其基因型
Commonly used strains https://www.doczj.com/doc/ed648897.html,/wiki/E._coli_genotypes 1.AG1 endA1 recA1 gyrA96 thi-1 relA1 glnV44 hsdR17(r K - m K +) 2.AB1157 thr-1, araC14, leuB6(Am), Δ(gpt-proA)62, lacY1, tsx-33, qsr'-0, glnV44(AS), galK2(Oc), LAM-, Rac-0, hisG4(Oc), rfbC1, mgl-51, rpoS396(Am), rpsL31(strR), kdgK51, xylA5, mtl-1, argE3(Oc), thi-1?Bachmann BJ: Derivation and genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12. Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular Biology (Edited by: F C Neidhardt J L Ingraham KB Low B Magasanik M Schaechter H E Umbarger). Washington, D.C., American Society for Microbiology 1987, 2:1190-1219. See CGSC#1157 3.BL21 E. coli B F- dcm ompT hsdS(r B - m B -) gal [malB+] K-12 (λS) ?The "malB region" was transduced in from the K-12 strain W3110 to make the strain Mal+λS. See Studier et al. (2009) J. Mol. Biol. 394(4), 653 for a discussion of the extent of the transfer. ?Stratagene E. coli Genotype Strains 4.BL21(AI) F– ompT gal dcm lon hsdS B (r B - m B -) araB::T7RNAP-tetA ?an E. coli B strain carrying the T7 RNA polymerase gene in the araB locus of the araBAD operon q. ?Transformed plasmids containing T7 promoter driven expression are repressed until L-arabinose induction of T7 RNA polymerase.
真核基因在大肠杆菌中的表达形式
真核基因在大肠杆菌中的表达形式 大肠杆菌被内膜和外膜隔成3个腔：胞内、周质和胞外，表达的蛋白定位于这3个腔内。真核基因在大肠杆菌的表达形式根据表达产物的定位一般可分为两类：胞内表达和蛋白分泌表达。胞内表达是最主要的表达形式，表达产物以可溶性蛋白和/或不溶性的包涵体形式存在于大肠杆菌细胞内。而根据表达产物本身的性质又分为融合表达和非融合表达。 一、胞内表达 1、非融合表达 非融合表达即直接表达天然蛋白，所表达的真核生物蛋白肽链的N端不含有任何原核肽段。真核基因通常缺乏能被原核生物的转录和翻译系统识别的序列，包括启动子、有效地核糖体结合位点，有时还缺乏ATG起始密码子和转录终止子，因此必须插入带有这些调控序列的表达载体方能表达。 有时，非融合表达不能产生目的蛋白，尤其是目的蛋白的氨基酸含有甲硫氨酸时。由于甲硫氨酸是由ATG编码的，在大肠杆菌中，氨基端的甲硫氨酸会被不同程度地去除。此外，非融合蛋白易被宿主蛋白酶破坏，产生无活性的蛋白，这是影响表达效率的重要因素。克服的方法有：①采用Ion-营养缺陷型宿主。大肠杆菌蛋白酶的合成主要依赖于黄嘌呤核苷（Ion），用Ion-宿主，使蛋白酶不能合成，从而保护真核蛋白；②克隆Pin基因。T4噬菌体Pin基因产物为细菌蛋白酶抑制剂，将Pin基因克隆到质粒上，并转化大肠杆菌，可保护真核蛋白。 2、融合表达 融合表达即表达的真核蛋白肽链N端含原核生物肽段，融合表达的方法是将真核基因插入启动子后已证实能高效表达的原核结构基因的下游，以产生融合蛋白的方式表达目的基因。由于融合基因5'端为表达载体中的原核基因序列，已优化的翻译起始区的二级结构不受插入外源基因的干扰，因此，融合表达的效率高。需要注意的是，插入基因的转录方向和阅读框架必须与原核片段的阅读框架相吻合，不能产生移码，否则不能表达。 融合蛋白需经处理后方能释放出真核蛋白，常用的后处理方法有溴化氰和蛋白酶裂解，这就要求融合蛋白在其原核肽段与目的蛋白间应含有能被溴化氰和蛋白酶裂解的序列，而且目的蛋白内部不能含有溴化氰和蛋白酶切割位点。溴化氰能切割蛋氨酸残基后的肽键；牛凝血因子X用Russel蝰蛇毒液活化成因子X a后，能在四肽序列Ile-Glu-Gly-Arg中的精氨酸（Arg）后特异地切割肽链；凝血酶（thrombin）也能识别和切割特定的肽序列，这些
大肠杆菌基因型说明
大肠杆菌基因型及遗传符号说明 前言：实验室的一般大肠杆菌拥有4288条基因，每条基因的长度约为950bp，基因间的平均间隔为118bp（基因Ⅷ）。E.coli基因组中还包含有许多插入序列，如λ-噬菌体片段和一些其他特殊组份的片段，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的，由此表明了基因组具有它的可塑造性。 利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种能观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)，把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基因型（Genotype）。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。 分子克隆中常用的大肠杆菌及其遗传标记按Demerec等1966年提出的命名原则，采用的菌株所有的基因都假定处于野生型状态，除非在基因型上另外注明。 大肠杆菌基因型的表示方法（Demerec, et, al. 1966）： 一、一般规则： 1、根据基因产物或其作用产物的英文名称的第一个字母缩写成3个小写斜体字母来表示。例如：DNA Adenine Methylase→dam。 2、不同的基因座，其中任何一个突变所产生的表型变化可能相同，其表示方法是在3个小写斜体字母后加上一个斜体大写字母来表示区别。例如：Recombination→recA、recB、recC。 3、突变位点应通过在突变基因符号后加不同数字表示。如supE44（sup基因座E的44位突变）。如果不知道几个等位基因中哪一/几个发生了功能性突变，则用连字符“-”代替大写字母，如trp-31。 4、细菌的基因型中应该包含关于其携带的质粒或附加体的的信息。这些符号包括菌株携带的质粒或附加体、质粒或附加体上的突变基因座和突变位点。其基因符号应与基因座的表示符号明显区别，符号的第一个字母大写、不斜体并位于括号内；质粒或附加体上的突变基因座和突变位点的基因符号的表示方法与染色体上突变基因座、突变位点的符号相同。 5、对于携带附加体的菌株的完整基因型描述应包括附加体的状态（游离或整合）。以F因子为例，F-：F因子缺失；F+：自主性F因子，不携带任何遗传可识别染色体片段；F’：携带有遗传可识别细菌染色体片段的自主性F因子；Hfr：整合到染色体上的F因子（high frequency of recombination）。当这些质粒或噬菌体片段变异或缺失时，用（）”或“/”等以区别。例如：/F' [traD3 6、proAB、lac I q、lacZ M15] 6、某个基因或某个领域缺失时，在其基因型前面加上“ ”表示。例如：lac-proAB基因缺失时它的基因型表示为( lac-proAB)。 7、由于某种基因的变异导致大肠杆菌可以明显观察到特征变化，有时也用其表现型代替基因型进行表示。例如：某些抗药性的获得或丧失，用如下方式表示：Streptomycin抗性→Str
