基因工程
实
验
报
告
甘薯ADK基因反义载体的构建
（西南大学生命科学学院，重庆400715）
摘要：以甘薯为材料，提取甘薯的基因组DNA，以其基因组DNA为模板在体外克窿甘薯ADK基因核心片段并电泳检测基因的纯度。利用含有pHB载体质粒的大肠杆菌提取pHB质粒。将PHB质粒和ADK基因片段进行双酶切，构建ADK基因反义载体，检验是否构建成功，最后转入大肠杆菌中检验观察是否转入成功。
关键词：甘薯；腺苷酸激酶基因（adk）；反义载体；PCR
英文摘要：
1.综述
1.1甘薯
甘薯(Ipomoea batatas (L. ) Lam.)属旋花科(Convolvulaceae)甘薯属((Ipomoea)蔓生一年生草本植物，染色体数为2n=6x=90。在我国因各地语言差异，甘薯的中文俗名较多，又名番薯、白薯、地瓜、山芋、红芋、红苔、红薯等[u1，其英文一般写作sweet potato，在美国也有写为sweetpotato[27. 1989年美国甘薯合作者组织规定用Sweetpotato表示甘薯，以便更准确地表达甘薯的特性及与Potato(马铃薯)相区别[37。目前，此表达方式已在美国、澳大利亚等许多英语国家采用，并逐步被其他国家或地区的甘薯研究者所接受〔引。目前学术界一致公认甘薯起源于热带美洲，经“Kumara"路线、"Batata"路线、"Kamote"路线传播到世界各地〔.5J，由于甘薯具有耐旱、耐痔，繁殖力强、适应性广、栽培简便、产量高，用途广泛等特点，现已在全世界广泛栽培。我国的甘薯栽培己有400多年的历史。据史料记载，甘薯于16世纪的1563-1594年间，经陆海多种渠道传入我国。在我国，甘薯的栽培分布很广，南起海南诸岛，北至内蒙古，西北达陕西、陇南和新疆一带，东北经辽宁、吉林延展到黑龙江南部，西南抵藏南和云贵高原。‘四川盆地、黄淮海、长江流域和东南沿海各省是我国甘薯的主
产区
1．2 ADK基因
腺昔酸激酶(EC.2.7.4.3, adenylate kinase, ADK)催化ATP和AMP合成两分子ADP的可逆反应，是调控这三种前体分子在淀粉代谢库和核酸代谢库中分配的关键酶。IbADK全长1314bp，其编码区长度为855bp，编码长度为284个氨基酸残基的ADK蛋白(IbADK)；生物信息学预测IbADK分子量为30.86kDa，等电点为6.46。
1.3 反义载体
将目的基因与载体用相同限制性内切酶酶切后，将目的片段反向插入载体中，可以起到基因沉默的目了，构建过程主要是酶切，连接检测，最后测序确定。
1.4质粒（Plasmid）
是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，他具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
2．材料与方法
2.1材料
2.1.1大肠杆菌：含PHB载体质粒的大肠杆菌；含PMD-T-aIb ADK质粒的大肠杆菌；大肠杆菌DH5α菌株。
2.1.2仪器
PCR扩增仪，PCR用薄壁管，电泳仪，恒温水浴锅，THZ-C水平摇床1台，冷冻离心机1台，涡旋仪1台，超净工作台1台，移液枪1套，锥形瓶若干，培养皿2套，室内使用的大中型枪头各2盒，浮标1个，室内使用的1.5mL的EP管若干，涂棒1根，凝胶成像系统1台，恒温培养箱1台，一次性PE手套，计时器1个，药勺若干。
2.1.3试剂
氨苄青霉素，AP/Amp：溶于无菌水，0.22μm滤膜过滤。
卡那霉素，km/Kan：溶于无菌水，0.22μm滤膜过滤。
TIANGEN质粒小提试剂盒（离心柱型）；BamHΙ、XbalΙ（Fermentas公司）；ddH2O；TIANGEN 普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）；DNAligation连接试剂盒；CaCl21瓶；常规PCR试剂1套；上游引物FaADK；下游引物RaADK；TBE缓冲液；回收级琼脂糖；溴化乙锭；Taq DNA聚合酶；10×PCR buffer；MgCl2；dNTP；marker（DL2000、λDNA/HindⅢ
各1支）。
2.1.4培养基
LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，灭菌后4℃保存。LB琼脂平板（400ml、800ml）：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，pH7.0，灭菌后冷至60℃左右铺平板，视具体需要加相应抗生素做成Amp（50mg/L）或Kan （50mg/L）等平板。
2.2方法
2.2.1常用试剂及培养基的配制
配制LB液体培养基和LB琼脂平板。
2.2.2 质粒DNA的提取、纯化、电泳检验及酶切
1、将含有pHB载体质粒的大肠杆菌和含有PMD-T-aIb ADK质粒的大肠杆菌接种在加相应抗生素（Kan、Amp）的L B液体培养基中摇菌培养至合适浓度后采用质粒提取（小量）试剂盒（TIANGEN）抽提质粒。
具体方法与步骤见试剂盒说明。
2、抽提的质粒DNA用琼脂糖凝胶电泳检测、并拍照。
3、对提取的PHB载体质粒和PMD-T-aIb ADK质粒进行BamHⅠ、XbalⅠ双酶切鉴定。
酶切反应体系为：
去离子水23μL
10×K buffer 5μL
质粒(PHB/ PMD-T-aIb ADK) 20μL
BamHⅠ1μL
XbalⅠ1μL
总体积50 μL
短暂离心混匀后，于37 C水浴过夜反应。反应结束后加入5μL的10×Loading Buffer 停止反应，再进行琼脂糖凝胶电泳检测、照相。
2.2.3酶切片段的回收与表达载体的连接反应
1．目的片段的回收纯化
将质粒pMD-T+aIb ADK进行BamH I＋Xba I完全双酶切后，电泳表明均切下一条0.85 kb 左右的目的条带(aIb ADK，为855-bp)。回收aIb ADK，同时对pHB进行BamH I+Xba I完全双酶切，酶切产生两个分子量差异极大的片段，小片段是多克隆位点，大约几十bp，电泳根本无法看到；大片段就是pHB载体骨架(约12 kb)。回收该大片段。
对酶切后目的基因片段aIb ADK（小片段）和pHB载体骨架(大片段)进行切胶回收。采用胶回收（小量）试剂盒（TIANGEN）进行。操作步骤见试剂盒说明。
2. 回收目的基因aIb ADK小片段与pHB大片段载体骨架的连接
连接体系：
在200 μL Eppendorf管中加入下列组分：
pHB大片段 1.5μl
aIb ADK小片段 3.5μl
Solution I 5μl
总体积10μl
连接条件：混匀，于16?C过夜连接。
2.2.4大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备
大肠杆菌DH5α感受态的制备（CaCl2法）
1）将大肠杆菌DH5α接种于20ml LB液体培养基，37℃振荡（220rpm左右）过夜（12h 左右）培养（至对数生长期）；
2）将2 ml 过夜培养的菌液移入100ml LB培养基（一般为1:50的比例）中，37℃振荡培养至OD600为0.5-0.6，放于冰上30min；
3）取1ml菌液于1.5ml无菌eppendorf管中，4℃，4000rpm离心10min，去上清；4）沉淀用1ml预冷的0.1M CaCl2悬浮，用枪头轻轻吹打混匀，于冰上放置30min；
5）4℃，4000rpm离心10min，去上清，沉淀再加200μl 的0.1M CaCl2重悬，冰上放置2-7h 后，用于转化；或每管加20-30%的灭菌甘油，混匀，－70℃保存。
4）注意：新制成的感受态细胞在0℃放置12-24h这段时期内的转化效率较高
5）
2.2.5重组质粒的转化、筛选及PCR检测鉴定
1、重组质粒的转化、筛选
1）取上述方法制备的DH5α感受态细胞，或从－70℃冰箱中取出一管感受态细胞，融化；按每200 μl 菌液加100ng 已纯化的质粒DNA（无菌操作）的标准，将5-10μl DNA的连接物加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30分种；
注意：同时做两个对照组即受体菌对照组和质粒DNA对照组（检测感受态细胞的质量和有无污染情况）；
2)42℃水浴中热激恰恰90sec，迅速取出立即放于冰上2min，室温下放置3-5min；
注意：在水浴中切勿乱晃动
3）上述各管中分别加入800 μl 37℃预热的LB液体培养基至总体积为1ml，混匀后37℃180 rpm培养1-2h左右至菌复苏（并使转化体产生抗性）；
4）4000 rpm离心10min，去800 μl 上清液，将剩余的200 μl 菌液混匀；
5）用烧烤过的涂布棒将100μl的菌液涂布于加相应抗生素(Kan)的LB固体培养基涂匀，晾于超净台上1h左右至菌液完全被培养基吸收；
注意：涂平板时，一定要等烧烤过的玻棒冷却后再涂布，否则会烫死细菌；另外，以上步骤应无菌操作，防止污染
6）7℃倒置培养12-14h。从平板上用无菌牙签挑取抗性菌落培养，PCR鉴定后（可同目的基因的克隆）再抽提质粒进行酶切验证。
2、PCR检测鉴定
以挑取的单菌落菌液为模板，用反义引物：FaADK，RaADK进行PCR扩增目的基因。反应体系如下：
灭菌蒸馏水18.25μL
10×PCR buffer 2.5μL
MgCl2 1.5μL
dNTP 0.5μL
上游引物FaADK 0.5μL
下游引物RaADK 0.5μL
菌液模板1μL
Taq酶0.25μL
总体积共25μL
反应条件如下：
94℃6min （时间根据模板来确定）
94℃45sec
60℃45sec（退火温度和时间根据引物来确定）30个循环
72℃1min（时间根据扩增片段长度来确定）
72℃8min
反应完成后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果
2.2.6表达载体的酶切鉴定
工程菌的活化：
配制液体LB培养基（含有相应抗生素,Kan），50ml培养基中接种100ul的携带aIb ADK的PHB载体质粒的DH5 ，180rpm，37℃培养6h，即可获得经扩大培养的菌液；
制备质粒DNA（天根提取试剂盒）：
采用质粒小量提取试剂盒（天根提取试剂盒）抽提表达载体质粒（PHB-aIb ADK）。
具体操作步骤见（天根提取试剂盒）说明书。
酶切反应
1．混合以下溶液于一个无菌离心管中（酶切反应体系）：
去离子水13μL
10×K buffer 5μL
载体质粒PHB-aIb ADK (0.1-4ug) 30μL
BamHⅠ1μL
XbalⅠ1μL
总体积共50 μL
2. 混匀，在推荐温度下（一般为37℃，不同的酶及缓冲体系温度和时间可能发生变化）
保温2h，
3．然后琼脂糖凝胶电泳检测，并拍照。
3.实验结果与分析
3.实验结果与分析
3.1质粒DNA的提取
图3.1 抽提的质粒DNA电泳图
M1：DNA分子量标准DL2000(TaKaRa)，从上到下大小分别为2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
M2：DNA分子量标准λHin dIII (TaKaRa)，从上到下大小分别为23130 bp，9416 bp，6557 bp，4361 bp，2322 bp，2027 bp，564 bp，125 bp
泳道1、2、3：pHB质粒
泳道4、5、6：PMD-T-aIb ADK质粒
分析：
（1）．我们小组的条带为第3条与第6条带，从图中可以看出条带明显，亮度高，说明提取的DNA含量高。
（2）.我们组能得到明显亮带，证明我们在提取的过程中菌量适宜，操作规范，反应条件控制得当。
3.2双酶切鉴定
图3.2 PHB载体质粒和PMD-T-aIb ADK质粒
进行BamHⅠ、XbalⅠ双酶切后电泳图
M1：DNA分子量标准DL2000(TaKaRa)
M2：DNA分子量标准λHin dIII (TaKaRa)
泳道1、2、3：pHB被Bam HI+Xba I完全双酶切的电泳结果
泳道4、5、6：pMD-T-aIbADK被Bam HI+Xba I完全双酶切的电泳结果
分析：
图中第3条和第6条带是本组的实验结果，从图中可以看出本组的目的条带较粗且明亮，证明DNA进行了特异性的扩增。
3.3连接转化后的大肠杆菌平板
图3.3 长有转化子的平板
分析：从图中可以看出平板上长有菌落，但菌落数很少，可能大部分ADK基因未能与质粒连接，或者是带有目的基因的质粒没有成功导入大肠杆菌，所以在加有抗生素的LB平板上具有抗性基因的大肠杆菌比较少，也可能是培养的时间不够，大肠杆菌菌落还没有长出来
3.4 PCR产物电泳检测结果
分析:在此步骤中，从图中可以看出，一，二，三班均有菌转化成功，但是一班，二班条带过于模糊不清晰，所以在后面的实验中使用的是三班的转化菌。条带模糊或没有的原因可能为：1，在平板中取菌时，取量过少。2，PCR循环只循环了31次，通常为33次。3，仪器出现误差。4，试剂加入量有误差。
目的片段对应marker区段有误，原本应该对应850bp左右，但是图中对应为650bp左右，原因是扩充的引物出现问题，拿成了仅仅扩充ADK基因的引物，但是对实验结果没有影响。
3.5 反义表达载体的酶切鉴定
因PCR后电泳结果显示我们小组的PCR产物较少，故换用3班号菌株进行反义表达载体的酶切鉴定，结果如下图所示：
图3.5 反义表达载体pHB-aIb ADK双酶切鉴定
M1：DNA分子量标准DL2000(TaKaRa)
M2：DNA分子量标准λHin dIII (TaKaRa)
泳道1-4（1班）、5-7（2班）、8（3班）：pHB-aIb ADK被Bam HI+Xba I完全双酶切的电泳结果
分析：此图中1~4泳道的为三班一号菌种，是09一班实验结果。5~8泳道为三班2号菌种，是09二三班实验结果。可明显看到条带，但是第3,4泳道在PHB目的基因下方还有条带，这是不正常的，应该只出现PHB和ADK条带，如同5~8泳道一样。出现此问题的原因可能为1，原三班一号培养瓶中菌种出现了杂菌。2，在实验操作过程中受到污染。3、质粒提取时，加入P3后离心，沉淀均附着在EP管壁上，于是进行了2次离心，离心前震荡EP 管动作过大，可能混有基因组DNA片段或质粒本身受到破坏。
4.实验小结
基因工程实验总结
这次基因工程的实验基本上算是我们大学期间的最后一次实验课程了，因而显得尤其珍贵，所以我们小组的所有组员对这次实验也都非常用心，做起实验来也是格外认真。这次实验算是是接着以前的分子生物学的实验做的，一共连续四天，四天的时间里又让我们学习了很多，收获了很多，现总结如下：
第一，我们对杨老师的“切、接、转、筛、扩、检”六字口诀有了更深的领悟。无论是以前做的分子生物学实验还是这次的基因工程实验，其核心都可以概括为这六个字。而只要
想到这六个字，我们就能把握整体的实验设计思路，完成实验时也更加得心应手。
第二，基因工程的实验让我们完成了理论到实践的转化。“纸上得来终觉浅”书本上的理论知识要真正消化还是要通过实践，这次的实验就给了我们实践的机会，让我们能把平日里学到的理论知识得以应用，也让我们把理论知识掌握得更加扎实。
第三，在实验过程中，非常重要的是要细心。因为是分子水平的实验，我们肉眼看不到当前的反应现象和结果，只有等到实验结束了，通过检测才能知道成功与否。如果失败了，重新再做的话，是非常耗时的，加上试剂很贵，所以在每一步都要非常细心，绝不能有半点马虎。特别是加试剂的时候，每一种试剂的量、加试剂的顺序，反应的时间等等，都不能出半点差错。
第四，小组内成员的相互合作也是实验成功与否的关键。我们虽然是第二次做基因工程的有关实验，但是构建表达载体却是第一次做，都没有什么经验，有的时候难免忙中出错，所以需要小组内其他成员的监督。第一次操作的话，肯定都很生疏，做实验的速度会很慢，这时候就需要组内成员的协作。在我们所有小组成员的共同努力下，我们的实验是非常成功的。
第五，这次实验体现了我们班班级的凝聚力，实验将我们紧紧的团结在一起。因为实验，原本各顾各的我们重新聚在了一起，一起上课，一起实验，甚至一起说笑都让我们变得非常珍惜，我们都知道以后这样的时日恐怕很难再有。因此，带着感恩、珍惜的心情，我们变得更团结了，同学与同学之间的关系也变得更和谐了。
另外，本次实验也有做的不足之处，那就是实验操作分工不均。由于实验操作的的机会有限，有的同学参与操作的多一些，但有的同学参与操作的非常少，甚至整个实验都没有操作过，我们组也有类似的情况出现，但是基本上是保证了每位组员全程参与实验，每位组员都有机会操作。
最后，这次实验是在杨老师和曾老师的指导帮助下，我们才得以成功的完成了这次实验，在此特向两位老师表示感谢！
人教版高中生物选修三专题一基因工程测试题 一．选择题（共20小题，每题2分，共20分） 1．基因型为AaBbDd的二倍体生物，其体内某精原细胞减数分裂时同源染色体变化示意图如图．叙述正确的是（） A．三对等位基因的分离均发生在次级精母细胞中 B．该细胞能产生AbD、ABD、abd、aBd四种精子 C．B（b）与D（d）间发生重组，遵循基因自由组合定律 D．非姐妹染色单体发生交换导致了染色体结构变异 2．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中． 下列操作与实验目的不符的是（） A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上 3．一对夫妇所生子女中，性状上的差异较多，这种变异主要来源于（） A．基因重组B．基因突变C．染色体丢失D．环境变化 4．不属于基因操作工具的是（） A．DNA连接酶B．限制酶C．目的基因D．基因运载体 5．下列哪一项不是基因工程工具（） A．限制性核酸内切酶B．DNA连接酶 C．运载体D．目的基因 6．下列关于基因重组和染色体畸变的叙述，正确的是（） A．不同配子的随机组合体现了基因重组 B．染色体倒位和易位不改变基因数量，对个体性状不会产生影响 C．通过诱导多倍体的方法可克服远缘杂交不育，培育出作物新类型
D．孟德尔一对相对性状杂交实验中，F1紫花植株自交后代发生性状分离的现象体现了基因重组 7．通常情况下，下列变异仅发生在减数分裂过程中的是（） A．非同源染色体之间发生自由组合，导致基因重组 B．非同源染色体之间交换一部分片段，导致染色体结构变异 C．DNA复制时发生碱基对的增添、缺失或改变，导致基因突变 D．着丝粒分开后形成的两条染色体不能移向两极，导致染色体数目变异 8．下列关于基因突变和基因重组的说法中，正确的是（） A．mRNA分子中碱基对的替换、增添、缺失现象都可称为基因突变 B．基因重组只发生有丝分裂过程中 C．非同源染色体上的非等位基因发生自由组合属于基因重组 D．基因型为DdEE的个体自交，子代中一定会出现基因突变的个体 9．基因工程的正确操作步骤是（） ①目的基因与运载体相结合②将目的基因导入受体细胞③检测目的基因的表达④提取目的基因． A．③④②①B．②④①③C．④①②③D．③④①② 10．如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是（） A．DNA连接酶、限制性核酸内切酶、解旋酶 B．限制性核酸内切酶、解旋酶、DNA连接酶 C．解旋酶、限制性核酸内切酶、DNA连接酶 D．限制性核酸内切酶、DNA连接酶、解旋酶 11．科学家利用生物技术将人的生长激素基因导入小鼠受精卵的细胞核中，经培育获得一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中，在医学研究及相关疾病治疗方面都具有重要意义．下列有关叙述错误的是（） A．选择受精卵作为外源基因的受体细胞是因为这种细胞具有全能性 B．采用DNA分子杂交技术可检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达 C．人的生长激素基因能在小鼠细胞表达，说明遗传密码在不同种生物中可以通用 D．将转基因小鼠体细胞进行核移植（克隆），可以获得多个具有外源基因的后代 12．用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分别降解一个1 000bp（1bp即1个碱基对）的DNA分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，凝胶电泳结果如下图所示．该DNA分子的酶切图谱（单位：bp）正确的是（）
小学自然实验报告模板 教学模式是在一定的教学思想或教学理论的指导下建立起来的，较为稳定的教学活动结构框架和活动程序。“结构框架”意在从宏观把握教学活动整体各要素之间的内部关系；“活动程序”意在突出教学模式的有序性和可行性。 自然学科是人类在认识自然的过程中所积累的知识。它与人的认识过程有较高的一致性，最适用于发现式的学习方法。实验是传授自然科学知识和培养与发展学生各种能力的重要手段。我校的教研组推出的四环节实验课教学模式，以其较完美的操作性、开放性、优效性和灵活性形成了自然实验课的基本框架，较好地揭示课堂教学的一般程序、课堂教学诸因素的内在联系和课堂教学的普遍规律。现就模式谈一下我在教学中的实践与几点体会。 一、教学模式的四个环节在实践中的具体运用 （一）提出问题阶段 提出问题阶段是当研究一个问题时，为了激发学生的求知欲望，引导学生探索并调动他们积极性的阶段。教师可结合要研究的问题，用生动形象的语言恰如其分地提问，让学生在观察和思维中发现问题。 例如，《物体的热胀冷缩》一课，先进行演示实验，在铁架台上放一平底烧瓶，瓶中装满水，用酒精灯加热，水还没烧开，瓶中的水就往外溢。教师接着问大家，你们看了这个现象有什么想法？学生一下子提出许多问题：“为什么水加热后往上溢呢？”
“水难道会变多吗？” 教学时，为了激发学生探求知识的欲望，应千方百计创造性地运用各种方法，如：做游戏、讲故事、变魔术、猜谜语、出示挂图、运用幻灯等。引起学生要研究问题的兴趣，提出自己的想法。 (二)作出假设阶段 学生提出了问题，但在还没有学习有关的知识时，教师引导学生对自己的问题作出假设的回答。教师再从学生假设中引导学生逐渐进入要研究的问题中去。 例如，《水蒸气的凝结》，教师将还在冒白气的温水杯加盖，过一会儿再揭开盖，请同学们看盖上的水珠，水蒸气碰到什么样的物体在上面结成水珠呢？引导学生作出假设，发表不同意见。有的同学说：“水蒸气遇到热的物体结成水珠。”有的说：“水蒸气遇到冷的物体结成水珠。”教师接着说：“那么我们就一起研究一下，水蒸气在什么条件下能变成水呢？”这样就逐渐地把学生引入要研究的课题。 在这个阶段中，学生根据已有知识的经验，通过演绎、归纳、推理而提出的假设，不少带有猜测的性质。此时教师要引导学生积极作出假设，不应压抑学生的思维，不管是对是错，都不要忙于作出评价。 （三）设计实验阶段
基因工程实验 教学方案 湖南人文科技学院生命科学系生物技术教研室 指导教师：吴娟
实验一重组质粒的提取及转化表达型菌株 Ⅰ质粒DNA的提取 实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。 实验原理 1．碱变性法基本原理是，在Ph12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿或硅基质膜柱子进一步纯化DNA。 2．设计构建体外重组DNA分子 构建体外重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱。选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有识别位点，也就是说用一种或两种限制性内切酶就能切割得到完整的外源DNA基因。构建体外重组DNA分子，最简单的重组方式就是在目的基因DNA的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解，产生两个不同的粘性末端。再用这两种限制性内切酶去选择合适的载体进行酶切，也产生这两个不同的粘性末端，这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的，重组的效率高，也易于筛选处重组子。 附表达载体pGEX-6P-1-mreB的构建图：
仪器材料与试剂 （一）仪器 1．恒温摇床 2．台式离心机 3．漩涡混合仪 （二）材料与试剂 1．含pGEX-mreB质粒的大肠杆菌DH5α 2．含pGEX质粒的大肠杆菌DH5α 3．液体LB培养基 4．100mg/mL氨苄青霉素Amp 5．新捷质粒提取试剂盒 实验步骤 分为两组：一组提取质粒pGEX-mreB，另一组提取质粒pGEX。 1）12000rmp 离心30秒收集1-5ml过夜培养的细菌，弃尽培养基。加入250ul 已加入Rnase A的Buffer Ⅰ, 充分悬浮细菌沉淀。 2）加入250ul Buffer Ⅱ, 温和并充分地翻转离心管4-6次。 3）加入350ul Buffer Ⅲ,温和并充分地翻转离心管4-6次。 4）13000 rmp 离心10分钟。 5）将核酸纯化柱置于2ml 离心管中，转移步骤4中的上清液到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rmp离心30秒。 6）弃2ml 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700ul Buffer W2,盖上管盖，12000rmp离心30秒。 7）弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化住置回到2ml离心管中，14000 rmp离心1分钟。 8）弃2ml离心管，将核酸纯化住置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50-100ul Buffer TE ,盖上管盖，室温静置1分钟，12000rmp离心30秒。 9）弃纯化柱，洗脱的质粒可立即用于各种生物学实验，或储存于-20℃。 实验结果 实验安排 3个小时
《基因工程》课程实验指导书 生物技术专业 黄淑坚黄良宗编写 佛山科学技术学院 2005年12月
目录 前言 (Ⅱ) 实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） (1) 实验二DNA目的片段的回收与DNA的体外连接 (7) 实验三重组DNA的转化 (10) 实验四重组DNA的鉴定 (13) 实验五外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 (16) 实验六表达产物的检测与分析——SDS-PAGE (18) 附录 (22) 参考文献 (34)
前言 基因工程学是以生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科为基础而发展起来的一门新兴技术学科，自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。本实验指导书在在方法上，力求可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。 由于基因工程的发展异常迅速，加之编写人员水平有限，难免有疏漏与错误，敬请各位师生批评指正。 编者 2005年12月
实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） 一、目的和要求 了解反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）基本原理和实验应用，掌握RT-PCR 反应的基本技术。 二、实验内容 RT-PCR扩增猪流感病毒M2基因部分片段。 三、仪器、设备和实验准备 1、仪器 恒温水浴槽、移液枪、EP管、PCR管、超净工作台、PCR仪、电泳仪。 2、试剂 反转录酶、RNA酶抑制剂（RNase Inhibitor）、流感病毒RNA、随机引物、流感病毒M2基因PCR引物、dNTP、Taq酶。 3、实验准备 用RNA抽提试剂盒抽提猪流感病毒RNA。 四、实验原理 RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。 反转录反应是在反转录酶作用下，以RNA为模板指导合成互补的DNA链的过程。反转录反应可以使用反转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成，由这三个基本步骤组成多轮循环。
基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）
word基本操作实验报告 一、实验目的与要求 1．掌握word的基本操作； 2．掌握字符格式、段落格式和页面格式等排版技术； 3．掌握图文混排、表格处理和邮件合并技术； 4．熟悉个人名片或毕业论文的设计与制作； 5．学会自己提出问题，并得出解决问题的方法。 二、实验内容与方法 1．word的基本操作，通过上机摸索，并查阅书籍网络了解。 2．word的字符格式，段落格式和页面格式等排版技术，通过上机摸索，并查阅书籍网络了解。 3．word的图文混排、表格处理和邮件合并技术，通过上机摸索，并查阅书籍网络了解。 4. 通过word进行个人名片或毕业论文的设计与制作，通过上机摸索，并查阅书籍网络了解。 三、实验步骤与过程 1.word的基本操作：①启动word软件 (1) 启动“开始”菜单中的microsoft word程序 (2) 双击资源管理器或“我的电脑”中的c:\program files\microsoft office\office11\winword.exe程序 (3) 双击word 文档文件（*.doc） (4) 双击桌面上的word图标 (5)开始-运行-输入“winword”②认识word2003窗口（1）标题栏位于屏幕最顶端的是标题栏，由控制菜单图标、文件名、最小化按钮、最大化（还原）按钮、关闭按钮组成。（2）菜单栏 菜单栏位于标题栏下面。使用菜单栏可以执行word的许多命令。菜单栏共有九个菜单：文件、编辑、视图、插入、格式、工具、表格、窗口、帮助。当鼠标指针移到菜单标题上时，菜单标题就会凸起，单击后弹出下拉菜单。在下拉菜单中移动鼠标指针时，被选中的菜单项就会高亮显示，再单击，就会执行该菜单所代表的命令。如“文件”—“打开”，就会弹出“打开”文件对话框。（3）工具栏 标题栏下面的是工具栏，使用它们可以很方便地进行工作。通常情况下，word会显示【常用】和【格式】两个工具栏。 “常用”工具栏：新建、打开、复制、粘贴、打印、撤消、恢复等“格式”工具栏：字体、字号、下划线、边框、对齐方式等 如果想了解工具栏上按钮的简单功能，只需将鼠标指针移到该按钮上，过一会儿旁边会出现一个小框，显示出按钮的名称或功能。 word窗口中可以有许多工具栏，可以根据需要在“视图”—“工具栏”中增加或减少工具栏。每一个工 具栏都可以用鼠标拖动到屏幕的任意位置，所以又称为浮动工具栏。工具栏内图标按钮体现了“菜单栏”中的一些主要功能。我们可以利用这些按钮进行相应操作。如我要打开一个文件，除了可以使用菜单栏外，还可以使用工具栏上的按钮。 （4）编辑窗口 再往下的空白区域就是word的编辑窗口，输入的文字就显示在这里。文档中闪烁的竖线称为光标，代表文字的当前输入位置。（5）标尺 在编辑窗口的上面和左面有一个标尺，分别为水平标尺和垂直标尺，用来查看正文的高度和宽度，以及图片、文本框、表格的宽度，还可以用来排版正文。（ 6）滚动条在编辑窗口的右面和下面有滚动条，分别为垂直滚动条和水平滚动条，用来滚动文档，显示在屏幕中看不到的内容。可以单击滚动条中的按钮或者拖动滚动框来浏览文档。（7）显示方式按钮
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
植物基因工程实验技术
编者: 赵 燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月
前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重 要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发 出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来 说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一 定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
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目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
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基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
科技实验报告 一、定义与作用 实验报告，就是在某项科研活动或专业学习中，实验者把实验的目的、方法。步骤、结果等，用简洁的语言写成书面报告。 实验报告必须在科学实验的基础上进行。成功的或失败的实验结果的记载，有利于不断积累研究资料，总结研究成果，提高实验者的观察能力。分析问题和解决问题的能力，培养理论联系实际的学风和实事求是的科学态度。 二、写作要求 实验报告的种类繁多，其格式大同小异，比较固定。实验报告，一般根据实验的先后顺序来写，主要内容有： 1．实验名称名称，要用最简练的语言反映实验的内容。如验证某定律，可写成“验证×××”；如测量的实验报告，可写成 “×××的测定。” 2．实验目的实验目的要明确，要抓住重点，可以从理论和实践两个方面考虑。在理论上，验证定理定律，并使实验者获得深刻和系统的理解，在实践上，掌握使用仪器或器材的技能技巧。 3．实验用的仪器和材料如玻璃器皿。金属用具、溶液、颜料、粉剂、燃料等。 4．实验的步骤和方法这是实验报告极其重要的内容。这部分要写明依据何种原理。定律或操作方法进行实验，要写明经过哪儿个
步骤。还应该画出实验装置的结构示意图，再配以相应的文字说明，这样既可以节省许多文字说明，又能使实验报告简明扼要。清楚明白。 5．数据记录和计算指从实验中测到的数据以及计算结果。 6．结果即根据实验过程中所见到的现象和测得的数据，作出结论。 7．备注或说明可写上实验成功或失败的原因，实验后的心得体会、建议等。 有的实验报告采用事先设计好的表格，使用时只要逐项填写即可。 三、撰写时应注意事项 写实验报告是一件非常严肃。认真的工作，要讲究科学性、准确性。求实性。在撰写过程中，常见错误有以下几种情况：1．观察不细致，没有及时、准确、如实记录。 在实验时，由于观察不细致，不认真，没有及时记录，结果不能准确地写出所发生的各种现象，不能恰如其分。实事求是地分析各种现象发生的原因。故在记录中，一定要看到什么，就记录什么，不能弄虚作假。为了印证一些实验现象而修改数据，假造实验现象等做法，都是不允许的。 2．说明不准确，或层次不清晰。 比如，在化学实验中，出现了沉淀物，但没有准确他说明是“晶体沉淀”，还是“无定形沉淀”。说明步骤，有的说明没有按照操作顺序分条列出，结果出现层次不清晰。凌乱等问题。
基因工程实验指导书
缩略词表
实验一植物总DNA 的抽提及电泳检测 一【实验目的】 1、了解植物DNA抽提的主要方法； 2、掌握快速抽提DNA的方法。 3、了解掌握检测DNA质量的方法以及DNA定量的方法； 4、了解影响DNA在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素； 5、训练DNA的琼脂糖凝胶电泳操作。 二【实验原理】 该方法简便、快速，DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作) 。CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。CTAB能溶解于乙醇。 改进的CTAB植物DNA抽提液迅速裂解细胞和灭火细胞内核酸酶，氯仿抽提后通过离心清除多糖、多酚和蛋白质，上清加入异丙醇离心沉淀基因组DNA，进一步去除其它各种杂质，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心步骤，进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将基因组DNA从硅基质膜上洗脱。 琼脂糖凝胶电泳技术是DNA分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA分离纯化的重要实验手段。DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。一般情况下，单位长度双链DNA带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA 片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA分子也可以通过这种方法进行分离。
基因工程实验报告
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基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程： 片段胶 小麦幼苗小麦总RNA RT-PCR扩增小麦pGEX-4T-1 表达载体 表达菌株 目的蛋白 目的蛋白 Western
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
华中农业大学本科课程考试评分标准 考试课程与试卷类型：基因操作原理姓名： 学年学期：学号： 考试时间：班级： 一、填空题（每小题2分，共30分） 1.PCR技术应用广泛，以下不属于PCR应用的为 ___D_____：(A) 随机扩增多态性 DNA(RAPD)； (B) 扩增片段长度多态性(AFLP)； (C) RACE； (D) S1 酶作图。 2.λ噬菌体线性 DNA 分子的两端各有一个____12_____个碱基组成的天然黏性末端。 3.PCR扩增有时会出现弥散的条带，以下原因阐述不正确的是___B______：(A) 退火温度 过低； (B) 退火温度过高； (C) dNTP 浓度过高； (D) 循环次数过多。 4.下列哪一种酶作用时需要引物____B_____：(A) 末端转移酶； (B) 反转录酶；(C) DNA 连接酶； (D) 限制酶。 5.Cosmid 实际上是由_λ噬菌体__和__质粒_____构成的杂合载体，也可以说是带有__cos__ 序列的质粒。 6.限制性内切酶的命名主要根据__来源菌株属名第一个字母，种名头两个字母以及菌株号、 序号_____来确定，以下各种书写方式中哪种或哪几种是正确的____AC____：(A) Pst I; (B) KpnI； (C) Hin dIII; (D) Hind III; (E) T th111I; (F) Bsp1286I； (G) XbaI 7.在分子克隆常用的E.coli菌株中Dam 和Dcm 甲基化酶都是有活性的，它们可在DNA 的特定位点作甲基化修饰。而许多限制性内切酶对甲基化是敏感的，一旦所识别的酶切位点被甲基化就不能切割该位点，如Cla I (AT/CGAT)。请问Cla I不能切割以下哪个或哪些来自dam+ dcm+ E.coli菌株的DNA序列____C_____。 (A) ATCGATA； (B) ATCGATG； (C) ATCGATC； (D) ATCGATT。 8.限制性内切酶有其特定的识别位点，如Eco RI 的识别位点为 ___GAATTC___；有些限制 性内切酶切割DNA后可产生带有相同末端的DNA产物，这些酶称为同尾酶，例如__Bam HI__限制性内切酶与___Sau3AI_________限制性内切酶切割DNA形成的末端相同。（任举一例都可以） 9.在基因操作过程中会使用一些多对人体有害的物质, 操作时应小心谨慎, 常用的有害物 质有UV light、DEPC、____EB___和____苯酚____等。（任举一例都可以） 10.根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。在下列文库中_C_是 cDNA文库。(A) YAC文库； (B) PAC文库； (C) 扣减文库； (D) BAC文库。 11.M13KO7是一种辅助噬菌体，可用它帮助噬菌粒制备单链DNA，这是因为以下原因_B_：
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq