UltraClean SoilDNA Isolation Kit Sample详细过程
全过程戴上手套
1、在2 ml Bead Solution Tubes 里加入0.25—1g 土样（注意：请参照提示和纠错指南确定
加入土壤的量）。
发生的反应：土样或废渣样本被装入到Bead Tube中。这是溶解过程的第一步。Bead Solution 是一种打散土壤颗粒的溶液并开始溶解腐殖酸。
2、轻微地漩涡混合。
发生的反应：混合样本和Bead Solution。
3、检查S1溶液，如果S1溶液有沉淀，使用前加热到60℃使沉淀溶解。
发生的反应：S1溶液中含有SDS。如果冷却了就会产生沉淀。加热到60℃会使SDS 溶解。S1溶液在温热的时候可以使用。
4、加入60 μl S1溶液，漩涡几次或简短地漩涡（3-4s）。
发生的反应：S1溶液含有SDS。这是一种帮助细胞溶解的洗涤剂。这种洗涤剂可以破坏脂肪酸和几种微生物细胞膜相关的脂类。
5、加入200μl IRS溶液（抑制剂去除的溶液）。只有当DNA要用于PCR时才进行此
步。
发生的反应：IRS是一种专门设计的用于沉淀腐殖酸和其他PCR抑制物的试剂。DNA 要用于PCR时需要进行此步沉淀。腐殖酸通常呈棕色。他们属于有机化合物的一个大组分，存在于大多数富含有机质的土壤中。
6、确保使用MO BIO Vortex Adapter tube holder 进行漩涡时bead tube 是水平放置
的。最大速度漩涡10min。（更少量的DNA剪切见可选择的溶解方法）
注意：如果使用可放置多于12支试管的24空位的Vortex Adapter，增加5—10min 的漩涡时间。
发生的反应：略，见使用说明。
7、将试管在10000 × g离心30s。注意：不能超过10000 × g 否则试管会坏。
发生的反应：此时细胞的残骸、土壤、珠子和腐殖酸等的微粒将结合成沉淀。DNA在液体状的上清液中。
8、将上清液转移到另一支干净的2 ml Collection Tube中。
注意：根据不同土壤类型0.25g 土壤将会有400—450μl 上清液。上清液中可能仍然包含一些土壤颗粒。
9、在Collection Tube 中加入250μl S2溶液漩涡5s。4℃静置5min。
发生的反应：S2溶液中含有一种蛋白质沉淀试剂。这一步对于移除可能降低DNA纯度和抑制后续DNA利用的污染蛋白十分重要。
10、10000 × g 离心1min。
11、为了避免聚集成团，将整个上清液转移到另一只干净的2 ml Collection Tube中。
发生的反应：此时的沉淀物包含了腐殖酸、细胞残骸和蛋白质的残渣。为了获得最大量和质量最高的DNA，尽量避免将任何的团状物（颗粒）转移到试管中。
12、使用前摇晃S3溶液，加1.3 ml S3溶液到上清液中漩涡5s。
注意：大量的溶液将会漫到试管边缘，手拿试管时要小心。
发生的反应：S3溶液是一种使NA凝结的盐溶液。DNA在高盐浓度中凝结在硅砂上
13、将700μl 上步的溶液转入Spin Filter 10000 × g 离心1min。
14、弃掉流出液将剩下的上清液加入Spin Filter，10000 × g 离心1min。重复此步
知道所有的上清液都通过Spin Filter。
注意：每个样本需要三次添加过程。
发生的反应：DNA选择性地结合在spin filter的硅膜上。几乎所有污染物都通过了过滤膜，只留下需要的DNA。
15、加入300μl S4溶液10000 × g 离心30s。
发生的反应：S4是一种用于进一步清洁附着在spin filter 硅膜上DNA的清洗溶液。这种洗涤剂移除了使DNA粘附在硅膜上的盐、腐殖酸和其他污染物的残渣。
注意：如果需要可以进行一次以上的进一步DNA清洗。在土壤中含有很高的腐殖酸成分时，重复清洗的步骤很有益。
16、弃掉2 ml Collection Tube中的上层洗涤流出液。
发生的反应：洗涤流出液只是包含了乙醇洗涤溶液和没有粘附到spin filter 膜上的成分的废物。
17、10000 × g 离心1min。
发生的反应：此步移除掉S4溶液。移除所有的洗涤溶液是十分必要的，因为洗涤液将会影响DNA的下游反应。
18、小心地将Spin Filter放入新的干净的2 ml Collection Tube中。避免S4溶液溅到Spin
Filter中。
19、加入500μl S5溶液到白色滤膜的中央。
20、10000 × g 离心 30s。
发生的反应：当S5溶液（洗脱缓冲液）通过硅膜时，DNA脱离下来流经滤膜进入collection tube中。
21、弃掉Spin Filter。试管中的DNA可用于PCR了。
建议DNA冷冻在-80℃—-20℃中。
学校代码学号分类号密级 本科毕业论文 学院、系环境与资源学院 专业名称环境科学 年级2010级 学生姓名 指导教师 2014年5月
不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较 摘要 环境样品DNA的提取和纯化不仅是土壤微生物进行研究的前提条件，而且是环境宏基因组学中最关键的技术问题之一，DNA的产量和纯度对后续的一系列的分子生物学技术操作如：多聚酶链反应(PCR)扩增、核酸内切酶酶切消化、核酸分子杂交等等，都会产生很大的影响，所以后续试验有效进行，必须要先获得一定纯度、数量、有较好代表性和适当片段长度的DNA。本文针对三种典型的土壤类型（壤土、粘土和沙土），对目前应用比较广泛的三种不同的DNA 提取方法和四种不同的DNA 纯化方法的效果进行了比较。经过NanoDrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对从三种典型土壤中提取和纯化的DNA的浓度和纯度进行检测，结果表明：Power Soil? DNA提取试剂盒和苯酚 - 氯仿抽提，异丙醇沉淀纯化方法的结合能提供满足环境组学研究的宏基因组测序要求的DNA。关键词：土壤微生物,DNA,提取,纯化
Comparison of DNA extraction and purification methods from different soils Abstract The extraction and purification of DNA from environmental samples is not only a prerequisite for microbial research, and is one of the environmental metagenomics most critical technical issues, the yield and purity of DNA on the subsequent series of molecular biology techniques operate such as: polymerase chain reaction (PCR) amplification,restriction enzyme digestion, the nucleic acid hybridization, etc. will have a huge impact, if follow-up tests effectively, you must first obtain a certain purity, quantity, better DNA fragments representative and appropriate length. In this paper, we have compared several different methods of DNA extraction and purification for three different soil, loam, sandy clay . After a NanoDrop spectrophotometer and by agarose gel electrophoresis and purified from the extract of the soil of three DNA concentration and purity, and the results showed that: Power Soil ? DNA extraction kit and phenol-chloroform extraction and isopropanol precipitation purification methods' combined provides the right DNA for the study of environmental groups metagenomic sequencing. Keywords:Microbial soil, DNA , Extraction, Purification
磁珠法土壤基因组DNA提取试剂盒 MagBeads Soil DNA Extraction Kit ［目录号】SMDE-5005、SMDE-5010 【运输条件】2~25 C； 【保存条件】磁珠分散液2~8 C；蛋白酶K -20 C；其它组分室温保存; 【试剂盒组成】 【注意事项】 1. 磁珠悬浮液严禁反复冻融和离心，以免磁珠受到损害，使用前务必充分混匀； 2. 使用前请检查裂解液1和裂解液2是否出现沉淀，如有沉淀请将试剂瓶置于65 C水浴中温热至 液体澄清； 3. 蛋白酶K长期不使用，请置于-20 C保存，融化后4C保存，并尽快使用； 【产品简介】 本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的干燥土壤中提取基因组DNA。试剂盒采用独特的缓冲液
体系，在裂解液环境中基因组DNA与磁珠高效结合，经过清洗和洗脱等步骤之后，可去除土壤中的杂质与腐植酸，获得高质量基因组DNA产物，OD260/OD280比值一般在1.7~1.9之间, 可直接用于酶切、PCR、电泳、Southern Blot、分子标记等下游分子生物学实验。 【试剂盒说明】 【自备仪器、耗材和试剂】 手动普通版：涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、EP管（2.0mL ）、EP管配套用磁力架、异丙醇、无水乙醇、RNase A 溶液（100mg/mL，分散液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH值8.0）。 手动高通量版：涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、48孔尖底板、48孔板配套专用磁力架、超强 磁板架48孔板专用硅胶盖、异丙醇、无水乙醇、RNase A溶液（100mg/mL，分散液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 值8.0 ）。 【手动普通版】 本操作方法在2.0mL EP管中进行操作。 1. 释放土壤微生物 称取100~500mg 土壤样本至2.0mL EP管中，依次加入1.0mL裂解液1和20卩蛋白酶K， 涡旋振荡1~3min，将土壤样本分散均匀，58 C温浴10min，期间每隔5min颠倒3次混匀内容物。 注：1）如需去除RNA，请额外加入5 RNase A溶液；2）干燥的土壤样本请研磨至均一细小颗粒，有助于微生物的高效释放。 2. 获得土壤基因组DNA粗液 室温、12000rpm将EP管离心5min，然后转移全部上清液至新的 2.0mL EP管中。加入 400卩裂解液2，颠倒混匀，再次室温、12000rpm将EP管离心5min。 3. 核酸结合 转移全部上清液至另一只2.0mLEP管，依次加入400卩屏丙醇和50卩磁珠悬浮液（提前摇晃均匀），涡旋振荡5min。 4. 磁性分离 将EP管置于磁力架上静置约20s至磁珠吸附完全，如EP管内盖有残留磁珠，可保持EP管
大量全血基因组DNA提取试剂盒 目录号：DN04 DN0401 16次×10ml DN0402 32次×10ml DN0403 96次×10ml 适用范围： 适用于快速提取各种动物全血基因组DNA 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存16次×10ml 32次×10ml 96次×10ml 10x红细胞裂解液室温50 ml 100 ml 300 ml 细胞核裂解液室温180 ml 180×2 ml 250 m l×4 蛋白沉淀液室温55 ml 110 ml 330 ml DNA溶解液室温15 ml 30 ml 90 ml 本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。 储存事项: 1.环境温度低时细胞核裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 2.蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不 能完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 本试剂盒根据全血特点采用几个快速步骤提取基因组DNA。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA 溶解液。 产品特点： 1.从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂。 3.快速，简捷，单个样品操作一般可在1小时内完成。 4.结果稳定，产量高（典型的产量10ml全血可提取出150-500μg），OD260/OD280 典型的比值达 1.7～1.9，长度可达50kb-150kb，可直接用于构建文库、PCR、Southern-blot和各种酶切反应。 注意事项 1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到2,500 x g，并配备容纳50ml心 管转头的传统台式离心机。 2.用户需自备异丙醇和70％乙醇。 3.典型的产量10ml全血可提取出150-500μg基因组DNA（不同样品尤其疾病样品中 中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大）。 4.本试剂盒为溶液型，可以很容易的按照比例扩大或者缩小每次处理的全血量 （20μl-10ml），请联系我们索取其它处理量的操作手册。
1 试验材料 吉林省松江河镇人参栽培土壤。每份土壤样品经多点取样后充分混匀，用前过10 目筛，去除土壤中的须根、枯枝等杂物[2]。 1 . 2 仪器设备及药品 电子分析天平、恒温水浴锅、紫外凝胶成像系统、电泳槽、 电泳仪、高速冷冻离心机、微量加样器、PCR 仪等。 TENP 缓冲液（50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100mmol/L Na Cl，1% PVP，pH 10.0）、CTAB 提取缓冲液（100mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Na3PO4，1.5mol/L Na Cl，1%CTAB，pH 8.0）、 SDS 提取缓冲液（100 mmol/LTris，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L Na Cl，pH8.0，灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L）、 异丙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、EB、Taq DNA 聚合酶、d NTP、6×凝胶上样缓冲液、DNAMarker 等。 主要试剂有十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、异硫氰酸胍，均为分析纯级。 1 .3 试验方法 1.3.1 土壤微生物的洗涤取土壤样品2g，置于50m L 灭菌的离心管中；加入10m L TENP 缓冲液[3]悬浮土样，磁力搅拌器搅拌15 min；10000r/min 离心5min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本无色；最后将沉淀收集至1.5ml 离心管中。 1.3.2 DNA 的提取 1.3. 2.1 CTAB 法按照李钧敏[4]的方法略作改动。将沉淀重悬于500μl CTAB 提取缓冲液→65℃水浴2h→8000r/min，室温离心15 min，取上清→加入等体积氯仿：异戊醇（24∶1），12,000r/min 离心10 min，取上清→加入0.6 倍体积的异丙醇，4℃淀过夜→12000 r/min 4℃离心20min 收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100 μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。 1.3. 2.2 SDS 法按照焦晓丹[5]的方法略作改动。取沉淀，重悬于500μl SDS 提取缓冲液，轻轻混匀→向管中加入50μL 20%SDS 溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA 断裂→65℃保温2h，每隔20min 轻轻摇匀1 次→加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇（24∶1），混匀后12000r/min 离心10min，取上清→加入2 倍体积的无水乙醇，静止于室温下2h →以12000r/min 离心20min，收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。
组织基因组DNA提取试剂盒（磁珠法） 使用说明书（Cat#Yu-TD02-1） 【产品介绍】 组织基因组DNA提取试剂采用国内领先的专利技术合成的纳米磁珠颗粒和多次实验优化的缓冲液体系，能从样品中分离纯化高质量DNA。在一定条件下，磁珠表面修饰的基团高效吸附目的DNA，而当条件改变时，磁珠释放吸附的DNA，达到快速分离纯化DNA的目的。整个过程安全、无毒、便利，提取的DNA质量稳定、纯度高。纯化后的DNA适用于多种后续实验。本试剂盒可以从少量动物组织中分离纯化出高质量、高浓度的DNA。 【产品特点】 1. 效率高：DNA提取得率高，操作简便。 2. 安全、无毒害：整个操作过程无需使用苯酚、氯仿等有毒物质，提取环境更加安全。 3. 高纯度：OD260/230在1.5左右，OD260/280在2.0左右。可直接用于各种分子生物学实验。 【试剂盒组成】 【规格】50T/盒 【自备试剂】无水乙醇，异丙醇 【贮藏与有效期】 裂解吸附液和Buffer AW1必须室温（15-25℃）避光保存；磁珠室温保存；其他所有试剂室温保存，有效期为1年。 【注意事项】
1、Buffer AW1使用前，加入18mL无水乙醇，混匀，使乙醇含量为60%。★ 2、Buffer AW2使用前，加入21mL无水乙醇，混匀，使乙醇含量为70%。★ 3、磁珠使用前必须充分混匀。★ 4、组织最好置于组织核酸（DNA/RNA）保存液（Cat#Yu-TP01）或液氮中保存。【操作步骤】 1、样本的处理 1.1、液氮中保存的组织将组织在液氮中磨成粉末后，使液氮充分挥发。再以50-100mg组织中加入1mL裂解吸附液，充分研磨。以下进入步骤2。 1.2、组织保存液中保存的样本取出在组织保存液中保存的组织，加入1mL无水乙醇洗涤组织两次。再以50-100mg组织中加入1mL裂解吸附液，充分研磨。以下进入步骤2。 2、吸取400μL研磨后的裂解吸附液转入1.5mL的EP管中，加入5μL蛋白酶K，60℃1500rpm10分钟。 3、取出EP管，加入250μL异丙醇和10μL混匀的磁珠，闭盖，充分混匀。室温1500rpm振荡10min。 4、取出EP管，瞬时离心，将EP管放于磁力架上，吸附磁珠4分钟。 5、在磁力架上，打开EP管盖，吸弃液体，保留磁珠。 6、加入600μL Buffer AW1，闭盖。从磁力架上取下EP管，充分混匀使磁珠完全分散至洗液中。 注：可以在漩涡振荡仪上3000rpm振荡20秒，使EP管壁上的磁珠完全分散至洗液中。 7、将EP管放回磁力架，吸附磁珠3分钟至液体清澈（吸附磁珠2分钟后，颠倒磁力架3次，使EP管盖上残留的磁珠被充分回收）。打开EP管盖子，吸弃液体，保留磁珠（需吸干EP管底和管盖中的残留液体）。 注：由于各个实验室磁力架磁力不尽相同，吸附时间可以延长，直至液体清澈。 8、加入600μL Buffer AW2，闭盖。从磁力架上取下EP管，充分混匀使磁珠完全分散至洗液中。 注：可以在漩涡振荡仪上3000rpm振荡20秒，使EP管壁上的磁珠完全分散至洗液中。
土壤总DNA的几种提取方法 SDS 高盐法(方案1) 具体步骤: 称取1 g 土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3 次,使土壤颗粒研成粉末; 将13.5 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸盐[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl 蛋白酶K(10 g/L ) 与5 g 土壤置于50 ml 的离心管中,放入37 ℃恒温摇床上,225 r·min - 1振荡30 min ; 加入1.5 ml20 % SDS ,轻轻混匀,65 ℃水浴加热2 h ,每隔15～30 min 轻轻摇匀1 次;5 000 r·min - 1离心10 min ,将上清液转入新的50 ml 离心管中;取4.5 ml 提取缓冲液加入原离心管,摇匀泥浆,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同样的离心速度离心10 min ,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1 次; 用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000 r·min - 1离心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍体积的异丙醇,室温静置1 h ;25 ℃下12 000 r·min - 1离心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA 及其杂质,并收集于1.5 ml 的微型离心管中. 变性剂加SDS 高盐法(方案2) 具体步骤： 取1 g 土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1 ml 变性剂(4 mol/L异硫青酸胍,10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巯基乙醇) ;液氮冰冻,研磨至溶解,重复3 次; 转入50 ml 离心管中,加入9 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸钠[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 轻轻混匀1 次;5 000 r·min - 1 离心10 min ,取上清; 在原管中加入5 ml 提取缓冲液,混合后,65 ℃水浴10min ,离心,取上清,合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5 000 r·min - 1离心20 min ,取上清;加入0.6 倍体积的异丙醇,室温沉淀1 h ;20～25 ℃,12 000 r·min - 1离心20 min ,TE 溶解沉淀. SDS-酚氯仿抽提法（方案3） 称取1g土壤样品，加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸缓冲液，玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg，使终浓度为 2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min，加125ul 20%SDS振荡处理15min，离心，分装EP管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h,离心，70%乙醇清洗，200Ul TE 溶解。 冻融溶菌酶SDS裂解法（方案4） 取1g土壤样品，加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl , 100 mmol/L EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1.0% PVP, 2.0%CTAB , PH8.0）, 加玻
DNAzol 基因组DNA快速提取试剂 目录号：DN26 DN2601 50ml DN2602 100ml 产品介绍： DNAzol 是一种完全的、可直接使用的基因组DNA提取试剂，简单高效，结果可靠，可快速提取基因组DNA，适用于多种大量或少量样品。DNAzol 可在一个步骤中裂解细胞并水解RNA，经过乙醇沉淀后即可快速得到基因组DNA。整个过程只需10-30 分钟，DNA 回收率可达70-100％，得到的DNA 不需再纯化，可直接用于Southern 杂交、斑点杂交、分子克隆、PCR 反应和其他分子生物学应用。 产品储存： 室温保存至少一年。 注意事项： DNAzol 有毒害性，应避免直接接触皮肤和眼睛。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 1.裂解，匀浆 a.组织：25-50mg 组织加1ml DNAzol ，使用匀浆仪处理5-10 次。少量 （5-10mg）柔软组织，如脾或脑组织，可切成或者捣成小块使用微量取样器吹打
混匀，室温放置5-10 分钟。 b.细胞：单层培养的细胞应直接裂解，倒出培养基，加入DNAzol 用取样器吹 打几次混匀。每10cm2 细胞培养板加0.75-1.0ml DNAzol。 c.细胞沉淀或悬浮液：每1-3×107细胞（体积小于0.1ml）加1ml DNAzol，反复 吹打混匀。 以上均要使用大口径枪头吹打，以免过度剪切断基因组。 2.离心 4 -25℃，10000g 离心10 分钟。将得到的上清转入新管。 此步骤去除组织碎片、部分水解的RNA和多糖。如果所提样品为含较多细胞和细胞外物质的样品，如肝、肌肉和大部分植物组织等，或要提取不含RNA 的DNA 时，可加此步骤。其他样品可省略此步。 3.沉淀 每使用1ml DNAzol 加0.5ml 100%乙醇，颠倒离心管5-8 次，混匀样品至出现DNA 沉淀，室温放置1-3分钟。可以看见DNA 絮状沉淀，让沉淀自然沉降到管底，尽可能吸弃上清。用枪头搅绕DNA贴附在离心管上端壁上，仔细吸弃剩下的在管底和管壁的上清。如果因为剪切太厉害导致形成小片段或者量少的DNA(少于15ug)，无法缠绕到枪头上，可在4 -25℃，4000g 离心1-2分钟沉淀DNA，弃上清。 4.漂洗 用0.8-1ml 75％乙醇漂洗DNA 两次。漂洗时，将DNA 悬浮在乙醇中，颠倒离心管3-6 次，然后静置0.5-1 分钟使DNA 沉降到管底，尽可能吸弃上清。 如果需要，可在4 -25℃，1000g 离心1-2 分钟沉淀DNA。从组织中提取DNA 时，如需去除其他内含物，第一次漂洗可用70％DNAzol 和30％乙醇的溶液代替75％乙醇。
微生物学通报 AUG 20, 2010, 37(8): 1130?1137 Microbiology China ? 2010 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@https://www.doczj.com/doc/e83402689.html, 基金项目：国家973计划前期研究专项项目(No. 2009CB125909) *通讯作者：Tel: 86-471-4991676; : ndzj@https://www.doczj.com/doc/e83402689.html, 收稿日期：2010-01-25; 接受日期：2010-05-24 摘 要: DNA 分子生物学技术的广泛应用, 为全面了解微生物群落提供了有力的工具。本文建立了一种新的从湿地土壤中提取微生物总DNA 的方法, 即氯化钙-SDS-酶法。在直接提取DNA 过程中采用氯化钙去除腐殖酸, DNA 提取缓冲液中不使用EDTA 螯合剂, 提取过程用时4 h 左右。与其他两种方法相比, 该方法高效去除湿地土壤腐殖酸, 纯度较高, 满足PCR 扩增, 为微生物生态学研究提供了一种高效的湿地土壤微生物总DNA 提取和纯化技术。 关键词: 湿地土壤, DNA 提取, 腐殖酸, PCR 扩增, 氯化钙-SDS-酶法 DNA Extraction and Removing Humic Substance from Wetland Soil LI Jing-Yu 1 ZHAO Ji 2* BIAN Yu 2 WU Lin-Hui 2 YU Jing-Li 2 (1. College of Life Sciences , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) (2. College of Environment & Resources , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) Abstract: DNA-based molecular biology techniques have widely been used as a powerful tool to un-derstand the microbial community. In this paper, a new method to extract microbial genomic DNA from wetland soil was established, namely Calcium Chloride-SDS-Enzymatic. Calcium chloride rather than EDTA chelating agent was used to remove humic acids in the process of direct DNA extraction. The extracting time is less than 4 hours. In comparing with other two methods, this method is more efficient in removing humic acids from wetland soil, and the purity of extracted DNA is higher which can be ap-plied to PCR amplification. It provides an efficient technology to extract and purify microbial genome DNA from soil for microbial ecological studies. Keywords: Wetland soil, DNA extraction, Humic acid, PCR amplification, Calcium chloride- SDS-enzymatic 从土壤和沉积物样品中提取微生物总DNA 是研究微生物多样性的前提和基础, 方法大致可以分为直接提取和间接提取两大类[1]。直接提取法获得DNA 的量较大, 但腐殖酸的存在会影响到下游的分 析[2]。为了获得纯度较高的微生物总DNA, 需要对其进行纯化处理。纯化处理的方法有硫酸铝捕获腐殖酸法[3]、PVPP 纯化法[4]、CTAB 法[5]、氯化铯密度梯度离心法[6]、交联葡聚糖和琼脂糖凝胶过滤树
通用基因组DNA提取试剂盒使用说明 货号：D2100 规格：50T/100T 保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。开封后请将RNase A，蛋白酶K于-20℃保存。 试剂盒内容：D2100-50T D2100-100T RNase A1ml1ml×2 蛋白酶K1ml1ml×2 溶液A25ml50ml 溶液B25ml50ml 漂洗液15ml15ml×2 洗脱液15ml30ml 吸附柱50个100个 收集管50个100个 说明书1份1份 产品简介: 本试剂盒为通用型，适合于从土壤，粪便，昆虫，以及其他样本中提取基因组DNA。对细菌，真菌，昆虫等样本都具有很好的裂解效果，最大限度的保留了生物DNA的多态性。 使用本试剂盒提取的DNA产量大、完整性好，可直接用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。
操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、样品的处理： 1）土壤：称取0.1-0.3g(根据干湿)土壤，放入研钵中，倒入适量的液氮，立即研磨，重复3次，使土壤颗粒研成粉末，加500ul溶液A，振荡至彻底悬浮。 2）粪便：称取0.1-0.3g(根据干湿)粪便，加500ul溶液A，振荡至彻底悬浮。 3）昆虫：称取0.1-0.3g昆虫，倒入适量的液氮，立即研磨，重复3次，使昆虫研成粉末，加500ul溶液A，振荡至彻底悬浮。 4）未知样品，如为细未状，可直接称取0.1-0.3g(根据干湿)加500ul 溶液A，如为块状，可0.1-0.3g用液氮研磨成粉未，再加500ul溶液A，振荡至彻底悬浮。 2、向悬浮液中加入20ul10mg/ml的RNase A，55℃放置10min。 3、加入20ul10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，55℃水浴消化，30min。消化期间可颠倒离心管混匀数次，12000转离心10min。将上清转移到一个新的离心管中。如有沉淀，可再次离心。 4、加入500ul溶液B，充分混匀。如出现白色沉淀，于55℃放置5min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致上柱后堵柱子，请增加消化时间。
改良CTAB-SDS法 1、称取1 g土壤样品，加1ml DNA提取液（0.1 mol/L Tris-Hcl；0.1 mol/L EDTA； 0.1 mol/L 磷酸钠；1.5 mol/L Nacl；1％CTAB；pH 8.0,将各种试剂按配置的体积数称量混合即可。），在漩涡震荡仪上混匀。 2、加入100ul溶菌酶温和37℃裂解30min,液氮冷冻10 min，65℃水浴10 min，反复冻融3次。 3、加入20％ SDS缓冲液溶液100μl，65℃水浴2h，每20 min轻轻颠倒几次。8000 r/min离心10 min，取上清。 4、剩余残渣中再加500μl DNA提取液和100μl SDS 缓冲液，65℃水浴30 min，8000 r/min室温离心10 min，取上清，合并两次的上清液。 5、等体积的氛-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提2至3次(氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次)，静置10min，12000rpm，10min取上清。 6、加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的无水乙醇混匀，4℃沉淀过夜。 7、13000 r/min离心5 min，70%乙醇清洗2次，30μl ddH 2 O溶解。 8、提取粗DNA在0.6%（1%）的Agrose，70 V（100V）电压下电泳1.5 h（40min）。注意事项：这个千万不要4℃过夜啊，4℃过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1－2h就好。 提取土壤微生物总DNA的纯度和浓度检测 对提取的土壤微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,同时采用紫外分光光度计分别测定提取土壤微生物总DNA稀释液在230 nm，260 nm，280 nm处的光 密度值。以OD 260/OD 280 （DNA/蛋白质），OD 260 /OD 230 （DNA/腐植酸）比值检测DNA纯 度。 DNA浓度=OD 260 值×50μg／ml×80×DNA 溶液体积／干土质量[68]
1.加2g土壤到15mL Bead Tube中 2.加入0.25mLSR1和0.8mLSR2之后，加入2.5mL Bead Solution到Bead Tube 3.加入3.5mL酚：氯仿：异戊醇25:24:1到试管中，加盖后涡旋混合直到分层消失。 4.最大转速涡旋震荡15min 5.室温，2500g离心10min 6.取出后，小心地转移上层水相到干净的15mL收集管中，弃掉下层酚 7.加1.5mL SR3到水相中，然后涡旋混匀，4℃孵育10min 8.室温，2500g离心10min。转移上清到一个新的15mL收集管中 9.加入5mL SR4溶液到装有上清的收集管中，混匀，室温孵育30min 10.室温，2500g离心30min 11.倒掉上清，将收集管倒置在纸上5min 12.震荡SR5混合。加1mL SR5到15mL收集管中，并反复吹打使完全重悬。 13.为每一个RNA样品准备一个RNA Capture Column A．拿去15mL收集管的盖子，将RNA Capture Column放入15mL收集管中。 B．加2mL SR5到RNA Capture Column中，让其完全流尽。 14.从第12步加入RNA样品至RNA Capture Column中，然后让其在重力作用下流尽。收集 液体。 15.用1mLSR5清洗柱子。重力流尽，收集洗脱液。 16.转移柱子到新的收集管，加入SR6震荡混合，然后加入1mL SR6到RNA Capture Column 洗脱RNA到15mL收集管中，重力流尽。 17.转移洗脱的RNA到2.2mL收集管中，并且加入1mL SR4.颠倒至少一次混合，然后-20℃ 孵育最少10min 18.室温13000g离心15min浓缩RNA 19.倒掉上清并倒转收集管在纸上10min晾干 20.用100μL SR7溶液重悬RNA沉淀，去除其中的基因组
土壤基因组DNA提取试剂盒使用说明 货号：D2600 规格：50T/100T 保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。 试剂盒内容：D2600-50T D2600-100T 溶液A25ml50ml 溶液B3ml6ml 溶液C5ml10ml 溶液D10ml20ml 漂洗液15ml15ml×2 洗脱液10ml20ml 吸附柱50个100个 收集管50个100个 PCR增强剂500ul1ml 说明书1份1份 注：试剂盒开封后溶液A、B、C、D需在2-8℃保存。PCR增强剂-20℃保存。 产品简介: 本试剂盒适合于从褐土、淤泥、火山灰等各种极端土壤环境中提取微生物DNA。对土壤中各种细菌、真菌有很好裂解效果，最大限度的保留了微生
物DNA的多态性。 本试剂盒采用我公司特有的腐殖质吸附材料，可高效专一的去除各种腐殖质成分而丝毫不会影响DNA的产率，纯度较酚、氯仿抽提法提高数倍。使用本试剂盒提取的DNA产量大、完整性好，可直接用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。 操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、称取土壤样本0.1-0.5g，在液氮中充分研磨成细粉末，加入450ul溶液A震荡混匀。 *也可直接称取样本0.1-0.5g于离心管(建议使用2ml圆底管)，加入450ul溶液A剧烈震荡混匀1-2min至没有固体块。使用液氮研磨效果最佳。 2、加入50ul溶液B充分颠倒混匀(不要剧烈震荡)，65℃水浴6min，每2min充分颠倒混匀一次。 3、加入100ul溶液C充分颠倒混匀(不要剧烈震荡)，12000rpm离心10min。 4、将上清转移到新的离心管，12000rpm离心2min。 5、在吸附柱中加入200ul溶液D，将离心后的上清加入到带有溶液D 的吸附柱中，用移液器吹吸几次混匀，12000rpm离心1min。 6、将收集管中的滤出液混匀后重新吸入吸附柱(必须)，12000rpm离心1min。
PowerSoil 试剂盒提取土壤DNA 1、加入0.25g 土壤样品到一个PowerBead Tubes中。 2、轻轻涡旋混匀。 3、检测Solution C1。若出现沉淀，60℃水浴至全溶解。 4、加入60μl Solution C1，上下颠倒数次混匀。 5、把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速（3200rpm，若涡旋仪达不到此速度，可适当延长5~10min）涡旋连续振荡10min。 6、室温10000g离心30s。 7、转移上清至一个干净的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。 8、加入250μl Solution C2到上清中，涡旋混匀5s。4℃孵育5min。 9、室温10000g离心1min。 10、避开沉淀小珠，转移上清≤600μl 到一个新的收集管（2ml Collection Tube）中。 11、加入200μl Solution C3到上清中，涡旋混匀。4℃孵育5min。 12、室温10000g离心1min。 13、避开沉淀小珠，转移上清≤750μl到一个新的收集管中。 14、Solution C4 使用前先摇匀。加入1200μl Solution C4到上清中，涡旋混匀5s。 15、加载约675μl 上清到Spin Filter 中，室温10000g离心1min。弃去滤液，继续加载675μl 上清，室温10000g离心1min。重复直至过滤完所有上清。（每个样品共需加载3 次。） 16、加500μl Solution C5到Spin Filter 中，室温10000g离心30s。 17、弃去上清 18、室温10000g 离心1min。 19、小心转移Spin filter 到2ml Collection Tube 中，尽量避免Solution C5 污染。 20、加入100μl Solution C6到白色滤膜中心。 21、室温10000g 离心30s。 22、弃去Spin Filter。此时收集管中的DNA 可直接用于下游实验，无需进一步纯化。DNA 冷冻保存（-20℃~-80℃）。
粪便基因组DNA提取试剂盒使用说明 货号：D2700 规格：50T/100T 保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复-检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。 试剂盒内容：D2700-50T D2700-100T 溶液SA25ml50ml 溶液SB3ml6ml 溶液SC5ml10ml 溶液SD10ml20ml 漂洗液15ml15ml×2 洗脱液15ml30ml 吸附柱50个100个 收集管50个100个 说明书1份1份 注：试剂盒开封后溶液SA、SB、SC、SD需在2-8℃保存。 产品简介： 粪便基因组DNA提取试剂盒适合于从各种粪便中提取微生物DNA。对粪便中各种细菌、真菌有很好裂解效果，最大限度的保留了微生物DNA的多态性。 使用本试剂盒提取的DNA产量大、完整性好，可直接用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。 操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1、称取粪便样本0.1-0.5g，在液氮中充分研磨成细粉末，加入450ul溶液SA震荡混匀。 *也可直接称取样本0.1-0.5g于离心管(建议使用2ml圆底管)，加入450ul溶液SA剧烈震荡混匀1-2min至没有固体块。使用液氮研磨效果最佳。 2、加入50ul溶液SB充分颠倒混匀（不要剧烈震荡），65℃水浴6min，每2min充分颠倒混匀一次。 3、加入100ul溶液SC充分颠倒混匀（不要剧烈震荡），12000rpm离心10min。 4、将上清转移到新的离心管，12000rpm离心2min。 5、在吸附柱中加入200ul溶液SD，将离心后的上清加入到带有溶液SD的吸附柱中，用移液器吹吸几次混匀，12000rpm离心1min。 6、将收集管中的滤出液混匀后重新吸入吸附柱(必须)，12000rpm离心1min。 7、倒掉收集管中的废液，在吸附柱中加入漂洗液500ul，12000rpm离心1min。 8、倒掉收集管中的废液，重复步骤7两次(共漂洗三次)。 9、倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管，12000rpm离心2min。 10、拿出吸附柱在室温干燥数分钟(因季节及气候等因素不等)，或50℃干燥1min。 11、将吸附柱放入一个新的离心管中，加入50-100ul洗脱液(65℃预热)，12000rpm离心1min。 12、将离心管中的液体重新加入到吸附柱中，12000rpm离心1min。离心管中即为粪便微生物DNA溶液。 注意事项: 1、新鲜的粪便样本会得到更高的产率，不同样本在采样前应先查阅相应的最佳保存条件。 2、若溶液中出现浑浊可在37℃水浴中溶解片刻至清澈，不会影响结果。 3、在需要吸取上清液的步骤中应避免吸到沉淀，否则会堵塞吸附柱，并影响产物纯度。
土壤DNA提取的解决专家简介 土壤样品含有大量的微生物，其中绝大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究。从土壤样品中提取DNA是研究土壤微生物最为有效的方法。目前从土壤样品中提取微生物DNA的方法主要有直接法和间接法。直接法是指把土壤样品放在裂解液中，经过有效的破壁方法使微生物的DNA全部释放到裂解液中，然后再进行分离提取，如Zhou的方法。间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中，如Buffer PBS等，把微生物从土壤中分离出来，然后再进行DNA的提取。间接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金属盐对DNA 提取带来的影响，但是这种方法会丢失许多微生物，得到的DNA 并非土壤样品中的全基因组(宏基因组)，目前已经很少研究者会采用这种方法。从土壤样品中直接提取DNA可最大可能性地获得全基因组，但是这种方法却面临以下几个问题： 1.腐殖酸的污染。土壤中，特别是森林，草地土壤含有非常丰 富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有机物分子，部分分腐殖酸同核酸分子非常类似，在纯化过程中非常难于去除。微量的腐殖酸污染都会导致下游应用，如PCR，酶切的失败。 2.裂解方法。土壤样品中含有各种微生物，如细菌和真菌等。 革兰氏阳性细菌和真菌都含有非常厚的细菌壁，让这些微生物的细胞壁有效破裂是提取高产量宏基因组DNA的关键。由于土壤样品的复杂性，使用酶法(如溶菌酶，破壁酶，蜗牛酶)或液氮研磨都不可行，因为土壤中含有各种金属离子或抑制因子导致消化酶的活性失活，或土壤中的沙粒等会导致液氮研磨很难进行。 3.DNA得率难于控制。土壤样品或因肥沃，或因贫瘠，或因含 水量丰富，或因干枯，或因取样的深浅度，都会造成微生物数量和品种发生剧烈改变。在一个小范围的土壤样品DNA含量往往会差别成千上百倍。此外，某些土壤中含有的化学成分，如重金属盐，粘土物质都会造成DNA得率降低。 Magen公司的HiPure Soil DNA Kit采用硅胶柱纯化技术，是专门为土壤DNA提取为设计的。该试剂盒采用玻璃珠研磨法和热激化学破壁法，可不需特殊的珠磨仪，在涡旋仪就可进行，适合于广大的研究室。试剂盒中Absorber Reagent是Magen公司独家开发的腐殖酸吸附剂，能高效去除各种腐殖酸的污染。此外还采用无醇的硅胶柱纯化方式，可高效去除土壤中各种可溶性金属盐，以及其它可溶性的抑制因子。该试剂盒已经成功地提取如下土壤(部分是客户反馈)：自然保护区森林的土壤(长达30-40年森林土壤，表层有30-50cm落叶层)，红树林土壤，草地，耕地，海底泥，污泥，矿石区泥土，有机物污染的泥土，池塘泥，垃圾泥，空调管道堆积物等。实验方法 为表明该试剂盒的优势性，我们选择以下不同组织样品进行DNA 提取实验，每个样品重复3次。 ●森林类样品：自然保护区森林土壤(广东黑石顶自然保护区) 和海南岛红树林保护区 ●矿石区样品：矿石区水底土壤(湿)和矿石区地表土壤(干) ●耕地样品：稻田土壤，菜地土壤 ●有机物污染地表样品：污水沟衍泥和生活垃圾堆放区 操作方法（按HiPure Soil DNA Kit试剂盒进行）简单描述以下：1.取0.5g土壤到2ml匀浆管中。加入0.9ml Buffer SOL/SDS， 高速涡旋5-10分钟裂解细菌或真菌。 2.70o C水浴10分钟进一步裂解细菌。 3.加入0.3ml Buffer PS涡旋混匀； 4.加入0.3ml Absorber Solution，涡旋混匀。 5.13,000xg离心5分钟。 6.取上清。加入结合液混匀后上柱。 7.洗涤柱子三次。 8.加入适当量的Elution Buffer洗脱即可。 实验结果 1.DNA电泳结果 取10 ul 纯化的基因组DNA上样于0.8%琼脂糖凝胶，80V电泳30分钟，结果如下。 0.5g森林类土壤样品 (前两个自然保护区森林土壤，后两个为红树林土壤) 0.5g耕地类土壤样品 A: 水稻田土壤 , B: 玉米土壤 A: 生活垃圾堆放地 , B: 污水沟底泥