石蜡切片制作流程表
一. 取材
1，样品要求：长，宽各1cm左右，厚不超过5mm
2，固定液：10%福尔马林固定液或4%多聚甲醛：组织块=20:1为宜
3，固定时间：依大小而定，一般3-5h即可，如24h或更长，应密封瓶口，封前换液
4, 修块
二.脱水
1，水洗：将固定组织块放入广口瓶，瓶口用纱布包好，置流水下水洗，水洗时间依固定时间而定，一般12h以上，固定时间越长水洗时间越长。
2，脱水
1）75%酒精1h
2) 80%酒精1h
3）95%酒精Ⅰ1h
4) 95%酒精Ⅱ1h
5) 100%酒精Ⅰ1h
6) 100%酒精Ⅱ1h
组织块在进入下一阶段梯度酒精前要用吸水纸吸干水，尤其在95%酒精（Ⅱ）中进入100%酒精（Ⅰ）中，切记防止带入水分，所有过程要在瓶口加盖，防止水分进入。
三．透明
1)酒精（100%）：二甲苯=1：1 10min
2)二甲苯Ⅰ透明10min
3二甲苯Ⅱ10min
四．浸蜡
1）二甲苯：石蜡=1：1 30min 温箱56—58℃
2）石蜡Ⅰ1h 温箱56—58℃
3) 石蜡Ⅱ1h 温箱56—58℃
4) 石蜡Ⅲ1h 温箱56—58℃
温度保持在56—58℃，温度太高会烧坏组织块，太低石蜡会凝固。
五．包埋
首先在金属框架上涂抹凡士林，以保证石蜡到入后不会外溢。将包埋用石蜡及浸蜡组织块放在有石棉网的电炉上保温。在框架中先倒入少许包埋用石蜡，再用镊子将组织块迅速移入框架，再倒入石蜡，待完全凝固后取出待用。
六．切片和烘片（烘片温度38℃）
七．附贴（45℃）；烤片
（一）附贴（45℃）
附贴液的配制：新鲜蛋白20ml,麝香草酚少许，用玻璃棒混匀，再加入甘油20ml,继续混匀。若有多聚懒氨酸处理的切片则直接用之。
（二）烤片：温箱内的温度应保持在40-45℃之间，烤片时间至少1小时。
八．H．E染色
（一）脱蜡
1 二甲苯Ⅰ（脱蜡） 10min
2 二甲苯Ⅱ（脱蜡） 10min
3 100%酒精Ⅰ（脱二甲苯） 10min
4 100%酒精Ⅱ（脱二甲苯） 10min
5 95%酒精Ⅰ（脱二甲苯） 5 min
6 95%酒精Ⅱ（脱二甲苯） 5 min
7 80%酒精（脱二甲苯） 5 min
8 自来水或蒸馏水洗（去酒精）5 min （二）染色
1 苏木素染液 6 min
2 冲洗清水（兰化）15 min
3 酸水分化视情况而定 10-20S
4 冲洗淡蓝色即可 20 min
5 伊红染液视情况而定
6 min （三）脱水，透明
13 80%酒精颜色淡化
14 95%酒精Ⅰ 5min
15 95%酒精Ⅱ 5 min
16 100%酒精Ⅰ 5min
17 100%酒精Ⅱ 10min
18 二甲苯Ⅰ（透明） 5min
19 二甲苯Ⅱ（透明） 10 min 九．封片：用中性树胶将切片标本封固。
动物病理组织学 石蜡切片制作标准操作程序（SOP） 一、\器材和试剂准备 （一）载玻片和盖玻片的清洁 1.载玻片和盖玻片清洗方法 (1)锅内倒入适量清洗液（100 mL水+30 m L洗洁精+30 mL 84消毒液）； (2)将玻片逐片放入锅中, 加热至沸腾10 min, 停止加热, 自然冷却; (3)捞出玻片流水冲洗10min,彻底冲净泡沫（弹簧夹上后，单片过水）; (4)将玻片从水中取出, 用蒸馏水冲洗三遍（最好单片过水）; (5)将玻片放入 95%乙醇（分析纯）中浸泡； （6）取出玻片，码在切片盒，自然干燥（或无风适度高温干燥）备用； 注意：由于盖玻片很薄，不能同载玻片放在一起处理；盖玻片从95%乙醇溶液中取出后要放在吸水纸上摊开，干燥后，放在小盒子中备用。 2.粘片剂（蛋白甘油）的制作及载玻片的预处理 （1）蛋白甘油的制作取新鲜鸡蛋，先将其尖端用眼科剪或拨针挑破一小孔，再将蛋的另一端挑破一小孔并稍加扩大，大孔端朝下，使蛋白流入100~200毫升的烧杯中（不要蛋黄），以玻棒打拌蛋白完全变为雪花状泡沫，然后倒入垫有几层纱布的漏斗中过滤而得到透明、清凉的的蛋白液，再加入等量甘油，振摇使之充分混合，加入1%麝香草酚或樟脑防腐。一般将其盛入滴瓶或树胶瓶中备用，不用时盖好防尘。 或1个鸡蛋的蛋清+500mL双蒸馏水，混匀，加10mL浓氨水。 （2）将蛋白甘油倒在小烧杯中，载玻片用弹簧夹夹上后侵入蛋白甘油中，贴壁刮干，放在切片盒内晾干备用。 二、石蜡组织切片的制作 （一）取材 注意事项： 1.材料质量：材料必须新鲜，应争取在死后半小时内处理完毕。 2.取材体积：组织块力求小而薄（厚度不要超过5mm，以2mm最佳） 3.取材力度：取材器具锋利。勿使组织块受挤压，切割时不可来回挫动。夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 4.固定形状：固定尽量保持组织的原有形态新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能雅持原形。对神经、肌肉、皮肤组织等，则可将其两端用线扎在木片上或硬纸片上固定。 5.切向选择：选好组织块的切面应熟悉器官组织的结构并据此决定其切面的走向。纵切或横
说明 石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。文档来自于网络搜索 取材 应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。文档来自于网络搜索 固定 用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa 液（配方见有关技术书籍）。因此，应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液。10％福尔马林（4％甲醛）或10％磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，不仅适用于常规HE（苏木精-伊红）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。文档来自于网络搜索 洗涤与脱水 固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相
石蜡切片制作 大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材 植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。 取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。 取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定 用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。 固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇） 固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水 固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。 酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明 选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片
石蜡切片的制作 试验药品和仪器 试验药品：酒精、二甲苯、石蜡、番红、固绿、冰醋酸、甲醛、明胶、甘油、石碳酸、中性树胶。 试验仪器：石蜡切片机、组织包埋机、水浴锅、染缸、烘箱。 试验方法 1 叶片组织结构的观察 对叶片组织结构的观察采用石蜡切片法。具体操作步骤如下： 1. 取材。选取生长良好的叶片，用水清洗干净，擦干，沿主脉切取2mm x 5mm 的小段。 2. 固定。将切取的植物材料立即放入FAA 固定液中（材料与固定液比例1:20），用真空泵抽气（使固定液尽快渗入材料中，并排除材料内气泡的干扰），固定时间 48h以上。FAA固定液配方：50%酒精、冰乙酸、甲醛（37%-40%）按18:1:1的比例配置。 3. 冲洗。材料从固定液中取出后，用70%的酒精冲洗3次，每次间隔2h,并在70%酒精中过夜。 4. 脱水。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为 了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行：70%酒精一80%酒精一95%酒精一无水酒精一无水酒精，每级酒精中放2h，无水酒精分2次，一次2h。 5. 透明。纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍 1?2小时，再转入纯透明剂中浸渍。具体为：1/3二甲苯+2/3无水酒精（加番红染色，以便透明后找到材料）一1/2二甲苯+1/2无水酒精一2/3二甲苯+1/3无水酒精一二甲苯一二甲苯，每级二甲苯中放2h，纯二甲苯分2次，每次放1h。材料进入无水的透明剂
石蜡切片的制作 目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。 一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况 生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法 当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类 切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法
石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法 火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法 冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。 冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。 新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片
（一）材料与用具 1．材料： 鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。 2．用具： 溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。 （二）实验内容与步骤 1．取材及固定 取动物体上的小块组织成为组织块。组织块的大小以不超过 0.5立方厘米为宜。切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。 组织块取下后，先用 0.85％的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。 由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。 如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。 材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。不同的组织应选用适当的固定液。固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2．冲洗
固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。AFA固定液则不需要水洗。 3．脱水和硬化 经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。 常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。 脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30％—→50％—→70％—→80％—→90％—→95％—→100％(Ⅰ)—→100％(Ⅱ)组织块在各级较低浓酒精（小于70％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过 0.5立方厘米的组织块脱水时间为6～12小时，在高浓度酒精中（大于70％）脱水时间为3小时左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15～30分钟左右。 在脱水瓶中酒精的量与组织块之比约为50：1。 简化步骤如下： 70%（一夜）——80%（1小时）——90%（30分）——95%（30分）——100%（15分）——酒精+二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+二甲苯（30分）——石蜡（80分） 4．透明
石蜡切片的制作 石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法，它有很多优点，例如，比较省时间，容易操作，可切成极薄的切片，能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存等。缺点是只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好容易破碎，组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆，制片时间太长。 一、石蜡切片的制作过程 石蜡切片的制作过程主要是：取材→水洗→固定→水洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→染色。 （一）取材及水洗 根据实验要求选取材料来源及部位，取要求部位的小块组织成为组织块，组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时，因此一般情况下，将动物处死后立即取需要的材料。 组织块取下后，先用相应的生理盐水漂洗以洗去血液、污渍以及粘液等。如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。 （二）固定 材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内
液的用量与组织块体积之比一般在20:1，不应使组织块贴于容器壁上。材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。固定的时间长短依据材料大小而定。 固定液有许多种，在固定的过程中应该根据需要选取合适的固定液，一般固定液都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化而失去固定作用。有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早固定时就没有作用了。 （三）水洗 固定液的颜色以便后续的染色。水洗时，一般将其置于水龙头下以自来水流水冲洗，这样可以使组织中的固定液随时溢出，洗得更干净彻底，有些还需要进行特殊的洗涤。 （四）脱水 固定之后的组织要进行脱水。由于组织内的水不能和支持剂混合，所以必须把组织中的水分彻底脱除。脱水有利于组织的透明和浸蜡，有利于组织的永久保存。乙醇既可做固定剂也可做为脱水剂，再用酒精脱水的过程中，首先用50%的酒精进行脱水，然后再依次增加酒精浓度，直到最后用100%的酒精进行脱水。如50%→60%→70%→80%→90%→95%→100%，使用100%的酒精可以脱水两次到三次。脱水的时间应该视组织块的大小而定。脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象。 （五）透明
石蜡切片的制作 一：试验目的 掌握石蜡切片的制作 二：器材和试剂 实验动物、手术刀、手术剪、镊子、托盘、标本缸、石蜡切片机、恒温箱、水浴锅、温度计、烧杯、电磁炉、石蜡、包埋纸盒、毛笔、载玻片、盖玻片、中性树胶、染色架、鸡蛋清、甘油、甲醛、各级浓度的酒精(50%、70%、80%、85% 、90%、95%、100%)、二甲苯、苏木精、伊红、盐酸、蒸馏水、30%三氯化铁液。 三：试剂配制 苏木精染液：甲液：苏木精1g、无水酒精100ml;乙液：30%三氯化铁液4ml、蒸馏水 100ml、盐酸1ml。使用时将甲液、乙液等量混合。 伊红染液：伊红1g、95%酒精100ml、冰醋酸1-2滴。 1%盐酸酒精：盐酸1ml、70%酒精99ml。 福尔马林：甲醛10ml、蒸馏水90ml。 蛋白甘油1:1配制 四：实验步骤 1.取材和固定 处死实验动物，迅速取出所需的组织，清洗干净放入福尔马林中固定，12h后换福尔马林。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。 （3）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的标本缸里，同时在容器外上标签。标签上注明固定液、材料来源、日期等。 ⑷如需清洗的材料可用生理盐水轻轻擦洗。 2.清洗 材料固定后，用清水清洗4小时 2.脱水： 50%酒精12h,在依次经70%、85%、95%、100%各级酒精溶液脱水1-2h。 注意事项： (1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分和酒精挥发。 (2)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
常规石蜡切片制片规范 1．制片过程中的每一个环节，应确保切片号和蜡块号一致，自始至终不能将号码弄错，一旦发生应重新取材，以防事故发生。 2．制片完成后，应在HE切片上及时粘贴写好本病理科病理号的标签，并认真仔细地核对。 3．认真检查制片质量。切片优良率（甲、乙级片所占的比例）≥90％，优级率（甲级片所占的比例）≥35%。不合格切片应立即重做。4．制片完成后，技术人员应将所制作的切片连同相应的申请单/记录单、取材工作单等一并移交给病理医师，双方经核对无误后，办理移交签字手续。 5．制片工作一般应在取材后2个工作内完成（需要脱钙、脱脂等特殊处理的除外）。 6．制片过程中如发生意外情况，有关技术人员和技术室负责人应及时向病理科主任汇报，并积极设法予以补救。 7．具体HE切片制作技术参见《病理组织学常规制片技术》。 附： 1．取材组织取材的方法是制作切片的一个重要程序，根据教学、科研及外检的具体要求取自人体（外科手术切除标本、活检标本、尸检标本）或动物，并确定取材的部位和方法。取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌握实际操作技术，每个组织器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取组织作为制片材料，不然，无法达到教学、科研和临床诊断的目的，具体要求如下： (1)材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，应迅速固定，以保证原有的形态学结构。
(2)组织块的大小：所取组织块较理想的体积为 2.0cm×2.0cm×0.3cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～0.2cm即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3 ～0.5cm，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。 (3)勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。 (4)规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。 (5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。 (6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用水冲洗干净后再放入固定液中。 (7)保持组织的原有形态:新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形。 2．固定 (1)小块组织固定法：这是最常用的方法，从人体取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，通常，标本与固定液的比例为1:4～20，但组织块不宜过大过厚，否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一般为2.0cm×2.0cm×0.3cm。 (2)注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需要对整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入血管，经血管分支到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。 最常用的固定液有10%甲醛固定液和95%乙醇固定液。
小鼠部分组织的石蜡切片制作 一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包 埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状。用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其 组织结构。 二、材料与用具 1 ?材料：小鼠肝脏、脾脏等。 2 ?用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。 三、实验内容与步骤 1 .取材及固定 取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm的组 织块。用先用0.85%的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污 物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀 或其他器具刮之。 由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr。如果是 管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。 取下的材料马上进行固定，采用FAA固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1 , 固定时间2 hr以上，超过24hr时可继续浸泡或转入70%酒精中保存。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2 .冲洗 固定后的组织块在进行脱水前用70%酒精洗去固定液。 3 .脱水和硬化 经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换 出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。 常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。 脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30%> 5C%> 7%> 80%> 9%> 95%> 10（% （I ）> 10（% （n ） 组织块在各级较低浓酒精（小于70% ）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过 0.5立方厘米的组织块脱水时间为6?12 hr，在高浓度酒精中（大于70%）脱水时间为3 hr 左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆 的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15?30 min左右。在脱水瓶中酒 精的量与组织块之比约为50:1。 简化步骤如下： 70% （一夜）——80% （1 hr）——90% （30 分）——95% （30 分）——100% （15 分）——酒精+二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+二甲苯（30分）——石蜡（80分） 4 .透明 透明是石蜡切片法切片前必经的一步。其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒 精，以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的。经
小鼠部分组织的石蜡切片制作一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状。用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其组织结构。 二、材料与用具1．材料：小鼠肝脏、脾脏等。 2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。 三、实验内容与步骤 1．取材及固定取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm 的组织块。用先用0.85 ％的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。 由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr 。如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。 取下的材料马上进行固定，采用FAA 固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1 ，固定时间2 hr 以上，超过24hr 时可继续浸泡或转入70% 酒精中保存。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2．冲洗固定后的组织块在进行脱水前用70% 酒精洗去固定液。 3．脱水和硬化 经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。 脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30 % 50 % 70 % 80 % > 90 % > 95 % > 100 % （I ）100 % （n ） 组织块在各级较低浓酒精（小于70 ％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过
石蜡切片的具体步骤与做法？ 石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法，因此用得最多，它有很多优点：比较省时间，容易操作，可切成极薄的切片（4um以下），能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好，容易破碎，组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 石蜡切片的制作过程 （一）材料与用具 1．材料：鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。 2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。 （二）实验内容与步骤 1．取材及固定 取动物体上的小块组织成为组织块。组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。 组织块取下后，先用先用0.85％的生理盐水漂洗以戏曲血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。 材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。不同的组织应选用适当的固定液。固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2．冲洗 固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。AFA固定液则不需要水洗。 3．脱水和硬化 经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。 常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。 脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30％—→50％—→70％—→80％—→90％—→95％—→100％(Ⅰ)—→100％(Ⅱ) 组织块在各级较低浓酒精（小于70％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过0.5立方厘米的组织块脱水时间为6～12小时，在高浓度酒精中（大于70％）脱水时间为3小时左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15～30分钟左右。在脱水瓶中酒精的量与组织块之比约为50：1。 简化步骤如下： 70%（一夜）——80%（1小时）——90%（30分）——95%（30分）——100%（15分）——酒精+ 二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+ 二甲苯（30分）——石蜡（80分）
石蜡切片操作 一、试剂配制 1、固定剂：36％~40％福尔马林液5ml ；冰醋酸5m1；50%酒精89ml； 2、1%番红染液：番红2g，乙醇100ml，水100ml 3、0.5%固绿溶液：固绿0.5g，乙醇95ml，水5ml 4、各级浓度酒精的配制70%；85%；95%；100%酒精。70%和85%酒精用95%酒精配制；（取70ml95%酒精，加水至95ml，即为70%酒精） 6、粘片剂：鸡蛋清一个，打碎，除去泡沫，加入等量的甘油 二、实验步骤 1、固定：组织块大小：1.5×1.5×0.2 CM 固定液> 4倍组织体积 福尔马林固定液12—24 h后用蒸馏水洗 2、脱水： 70%乙醇1h 85%乙醇1h 95%乙醇1h 100%乙醇0.5—1h 100%乙醇0.5-1h 3、透明： 100%乙醇：二甲苯（1：1）2h (加少量番红) 二甲苯1.5h 二甲苯1.5h （溶液占瓶子1/3，不倒掉，直接加小蜡块透明）注意：时间太长变脆 4、浸蜡：材料和蜡块不相接触，置换组织中的透明剂，为包埋做准备。 方法一：石蜡熔点52—56℃温箱：56℃二甲苯：石蜡（1：1）1-2小时；石蜡1-2小时；石蜡1-2小时 方法二：1）常温加蜡至饱和（大概加6-7快）；2）35℃加蜡块3-6h，不溶为止，可过夜3）60℃盖瓶盖2h(3-4块)，开盖6h（溶液是原来的2倍，占瓶子2/3），至二甲苯完全挥发，可过夜 4）纯蜡（60℃-65℃）2h 5）纯蜡（60℃-65℃）2h 5、包埋 准备包埋蜡：硬蜡（56~58℃或60~62℃）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性。 ②折纸盒，写好标签。 ③点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子 ④在纸盒中倒入56℃-58℃的石蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。可室温下冷却。 ⑤当纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝结形成一层固体状，即可放入冷水中，加速其凝固。 ⑥待蜡块完全凝固以后，便可拆开纸盒，取出蜡块。 6、切片 （一）切片前的准备 1．磨刀：传统的切片刀在使用之前，一定要在显微镜下检查刀口的损伤程度，然后进行磨刀。现在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。 2．修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，上下两边必须平行。 3．蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。 5．准备好毛笔、镊子、染色架。 6．调好展片器内水的温度（45℃），有时也可以加些酒精到水中。
常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备 ㈠组织块依序进行：①水洗，②脱水，③透明，④浸蜡，⑤包埋和⑥切片。 ㈡组织切片制备及其HE染色过程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡等为易燃、有毒物，必须专人管理，2m以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。 ㈢常规切片的手工操作（步骤次序和各步骤的持续时间） 1．水洗：用流水冲洗已经固定的组织块30min。 2．脱水（常温下） （1）乙醇－甲醛（AF）液固定 60~120min （2）80%乙醇 60~120min （3）95%乙醇Ⅰ 60~120min （4）95%乙醇Ⅱ 60~120min （5）无水乙醇Ⅰ 60~120min （6）无水乙醇Ⅱ 60~120min （7）无水乙醇Ⅲ 60min ［注意事项］①未经充分固定的组织不得进入脱水程序。②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。④脱水试剂应及时过滤、更换（500ml乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换）。⑤较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。⑥组织置于无水乙醇内的时间不宜过长（以免硬化）。⑦丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。 3．透明 （1）二甲苯Ⅰ 20min （2）二甲苯Ⅱ 20min （3）二甲苯Ⅲ 20min ［注意事项］①二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。②组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长（以防组织硬、脆），并依不同种类组织及其大小而异；组织呈现棕黄或暗红色透明即可。③二甲苯应及时过滤、更换。④组织
经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。 4．浸蜡 （1）石蜡Ⅰ（45~50℃） 60min （2）石蜡Ⅱ（56~58℃） 60min （3）石蜡Ⅲ（56~58℃） 60min ［注意事项］①熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70 ℃）进行，不得用明火加温。②熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中。④浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分（组织过软），过长时组织硬脆。⑤熔蜡应及时过滤、更换。 5．包埋 （1）先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲钝头镊子轻轻夹取已经过浸蜡的组织块，使组织块的最大面或被特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中；应将组织块平正地置放于包埋模具底面的中央处；包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近并位于同一平面上；腔壁、皮肤和黏膜组织必须垂直包埋（立埋）。 （2）将与组织块相关的病理号小条置入包埋模具内熔蜡的一侧。 （3）待包埋模具内的熔蜡表面凝固后，即将模具移入冷水中加速凝固。 （4）从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块（简称蜡快），用刀片去除组织块周围的过多石蜡（组织块周围保留1~2mm石蜡为宜）。将包埋蜡块修整成为规则的正方形或长方形。 （5）将病理号小条牢固地烙贴在蜡块一侧（编号应清晰可见）。 （6）把修整好的蜡块烙贴在支持器上，以备切片。 （7）使用包埋机的方法按有关厂商的说明书操作。 （8）注意事项 ①应将组织块严格分件包埋。包埋时一定要首先认真核对组织块的病理号（包括亚号）、块数和取材医师对包埋面的要求，准确地包入相应的病理号小条。发生包埋差错时，必须立即与取材医师和病理科当班负责人取得联系，及时处置。
1、取材与固定： 从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(1 0％福尔马林，Bouin氏固定液等)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。Bouin氏液是常用的混合固定液配方： 苦味酸饱和液（1.22％）75ml 福尔马林25ml 冰醋酸5ml 2、脱水透明： 一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。 3、浸蜡包埋： 将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。（生物秀实验频道https://www.doczj.com/doc/e314174061.html,） 4、切片与贴片： 将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。 5、脱蜡染色： 常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。 HE染色过程是：
①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。 ②酸水及氨水中分色，各数秒钟。 ③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。 ④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。 ⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。 6、脱水透明： 染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。 7、封固： 将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。
石蜡切片 1 仪器 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2 试剂 FAA固定液（70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml）、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3 方法与步骤 固定： FAA固定液固定48小时以上。 脱水： 50%酒精——70%酒精——83%酒精——95%酒精——100%酒精——100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精可长期保存。 透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇（2h）——纯二甲苯（1.5h）——纯二甲苯（1.5h） 浸蜡： 将处理的材料置于1/2石蜡（固体粉末状）+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 包埋： 先提升恒温想的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水喷中放置过夜。 切片： 对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固的粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。 粘片： 将粘贴剂置于薄玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在载玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30-40℃中过夜。 脱蜡： 脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯（10-20min）——纯二甲苯（5-10min）。 染色： 将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2二甲苯+1/2纯酒精——100%酒精——95%酒精——85%酒精——70%酒精——50%酒精——1%番红染色（4h以上）——50%酒精——70%酒精——85%酒精——95%酒精——0.5%固绿（1min）——95%酒精——100%酒精——100%酒精（未注明时间各级均为3min）。 胶封： 滴加加拿大树胶封藏。 镜检，拍照。
石蜡切片的制作过程 石蜡切片的制作过程主要包括：取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏等步骤。 1．取材 材料的好坏直接影响到切片的质量，无论取哪一种动植物材料，以下几点是必须注意的。 （1）植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分；动物材料取用时常对动物施以麻醉，常用的麻醉剂有氯仿和乙醚，或将动物杀死后迅速取出所需要的组织。 （2）取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要，应该尽可能割取生活着的组织块，并随即投入固定液。 （3）切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 （4）切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5×5mm2。 2．固定 组织和细胞离开机体后，在一定时间内仍然延续着生命活动，会引起病理变化直至归于死亡。为了使标本能反映它生前的正常状态，必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞，阻抑上述变化，并将结构成分转化为不溶性物质，防止某些结构的溶化和消失。这种处理就是固定。除了上述作用外，固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理，还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色。 固定剂的作用对象主要是蛋白质，至于其他成分如脂肪和糖，在
一般制作时不加考虑，如要观察这些物质，可用特殊的方法将其固定下来。 固定剂的作用表现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面。这些作用的好坏、大小，都依所固定的材料性质而定，同样一种固定液对某一材料来说是良好的，但对另外一些组织可能就不很适用。良好的固定剂必须具备的特征是：穿透组织的速度快。，能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质，不使组织膨胀或收缩以保持原形，硬化组织的程度适中，增加细胞内含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存剂作用。固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分。 简单固定剂即单一的固定剂，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。其中，苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。 简单固定剂的局限性较大，如将其适当混合，制成复合固定剂可以取得更好的效果。常用的混合固定剂有： Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重铬酸钾2.5g＋硫酸钠1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸镏水）、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）等。固定剂的种类甚多，我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。 19 固定时，须注意以下几点：