M T T法测定HM与HCPT细胞毒作用的体外研究
赵春芳1Ξ,李 岩2,阿孜古丽?吐尔逊1,孙殿甲2,温 浩1
(1新疆包虫病临床研究所,2新疆医科大学药学院药剂学教研室,新疆 乌鲁木齐 830000)
摘要:目的:通过去氢骆驼蓬碱(HM)微球与羟基喜树碱(HCPT)注射液对大鼠正常肝细胞(BRL)的毒性作用的比较研究,为HM的临床应用提供佐证。方法:采用M T T法测试一定浓度范围内HM与HCPT对大鼠正常肝细胞(BRL)的细胞毒作用大小。结果:在一定浓度范围内,HM与HCPT的细胞毒作用与药物浓度均呈线性关系;针对BRL细胞,在一定的浓度范围内HM的细胞毒作用较HCPT注射液的细胞毒作用为小,经检验差别有统计学意义(P<0.01)。结论:M T T法操作简单、快速、敏感,是较好的体外实验方法之一。HM微球新剂型对BRL 的毒性作用小于HCPT注射液,体外实验表明其毒副作用小,结合其剂型的靶向性、缓释性、栓塞性等特点,有潜在的临床应用价值。
关键词:M T T法;去氢骆驼蓬碱;羟基喜数碱;大鼠正常肝细胞
中图分类号:R96512;R97911 文献标识码:A 文章编号:100925551(2002)022*******
去氢骆驼蓬碱(H arm ine,HM)微球是将去氢骆驼蓬碱制成可供肝动脉栓塞用的微球新剂型,利用其化疗栓塞作用拟将其用于治疗肝癌,本实验通过其与临床上常用的羟基喜树碱(H ydroxycam p2 to thecin,HCPT)的比较,体外测试其对大鼠正常肝细胞的细胞毒作用的大小,为进一步探讨HM的体内应用奠定实验基础。
1 材料与方法
111 药物、试剂和培养基 HM微球由新疆医科大学药学院药剂学教研室研制生产,HCPT注射液为湖北黄石飞云制药有限公司生产(批号为20000701)。四甲基偶氮唑盐(32(4,52di m ethylth ia2 zo l222yl)22,52di p henyl tetrazo lium b rom ide, M T T)和二甲基亚砜(di m ethyl su lfox ide,DM SO)均为AM R ESCO产品。R PM I1640系G I BCO公司产品。
112 细胞来源及培养 大鼠正常肝细胞(BRL)购自上海,在37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中松盖培养。培养液为R PM I1640,内含15%灭活小牛血清和10mm o l L H EPES,细胞贴壁生长,隔日更换培养液,每4～5d传代1次,传代时用含0.25%胰蛋白酶及0104%ED TA的磷酸缓冲盐溶液消化。113 细胞毒性测定
11311 药物配制 实验所用药物的浓度参照临床用药剂量换算成血浆药物浓度1,选用血浆浓度峰值的0125、015、1、2、4倍的药物浓度为测试浓度范围,HM为2m g L(L2)、4m g L(L1)、8m g L
(M)、16m g L(H1)、32m g L(H2);HCPT为015 m g L(L2)、1m g L(L1)、2m g L(M)、4m g L (H1)、8m g L(H2)。
11312 实验分组 实验分2个给药组:HM给药组与HCPT给药组,每个给药组又分为3组:(1)空白对照组(3个复孔):只加培养液;(2)阴性对照组(6个复孔):加培养液和细胞;(3)实验处理组(4个复孔):加培养液、细胞和药物。实验重复3次。11313 实验方法 用0125%胰酶消化处于对数生长期的细胞,用培养液调成浓度为2×105 m l单细胞悬液,在96孔培养板上接种细胞(100Λl 孔),实验孔再分别加入不同浓度的药物(20Λl 孔),对照孔加等量培养液。96孔板置37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中孵育40h后,加5m g m l的M T T液20Λl 孔,继续培养4h,然后轻轻吸尽上清液,加DM2 SO150Λl 孔,旋涡震荡器上震荡10m in,使结晶物充分溶解,在酶联仪(B I O2RAD M ode1550)上比色测光密度(OD值),测量波长为490nm,取4个OD 值平均数,按下列公式计算细胞毒性指数(C I)2:
细胞毒性指数(C I)=(1-
处理孔OD值
对照孔OD值
)×100% 114 统计学处理 用PE M S210统计软件包进行处理,采用计量资料的配伍组资料方差分析和q检验,Α=0.05为检验水准。
2 结果
两种药物对BRL的细胞毒性指数,见表1。
在一定浓度范围内,两种药物的细胞毒作用与
121
新疆医科大学学报 JOU RNAL O F X I N J I AN G M ED I CAL UN I V ER S IT Y 2002Jun.,25(2)Ξ作者简介:赵春芳(1972-),女,甘肃甘谷县人,助理研究员,硕士学位,研究方向:细胞生物学。
剂量均呈线性关系,即随着药物浓度降低,细胞毒性
指数也降低。HM 的浓度范围是2～32m g L ,
HCPT 的浓度范围是015～8m g L 。在一定的浓度
范围内,HM 对BRL 的毒性作用也小于HCPT (P <0.01)(图1)。
表1 HM 和HCPT 对BRL 的细胞毒性指数(%,x
θ±s )药物药物浓度(m g L )
H 2
H 1
M
L 1
L 2
HM
33.98±2.1128.65±1.4122.95±0.3418.30±3.5415.96±2.68
HCPT 53
.47±4.7046.11±2.2540.23±1.3532.80±1.6826.09±0.83 注:q =13.78,P <0.
01
图1 HM 和HCPT 对BRL 细胞的细胞毒性指数的比较
3 讨论
M T T 法可精确测定细胞的生长与存活,可用
于药物对细胞的杀伤效果的研究3。近年来,M T T 法已被广泛应用于细胞系筛选新的抗肿瘤药物,并
正试用于临床实体瘤的药敏检测4。本方法检测快速,重复性好,操作可半自动化,并同时可做多种药物,有足够的灵敏性。用M T T 法进行药敏检测时,如何选择药物浓度是一个重要问题,本研究选用血浆峰值的0125、015、1、2及4倍的药物终浓度,结果发现在此范围内,随着药物浓度降低,细胞毒性指数也降低。
HM 系新疆地产民族药材骆驼蓬种子中的主要有效成分。国内学者经大量体内外研究表明,HM 对人肝癌、胃癌、鼻咽癌、S 2180肉瘤、
网织细胞瘤等均有明显抑制作用5～8,而动脉栓塞微球这一新型微球给药体系除具有普通微球靶向性、缓释性的特点外,还具有栓塞性这一显著特征,十分有利于肿瘤的治疗。肝癌是东南亚地区包括我国在内的高发性疾病,其发病率在各类癌症中居第3位,中晚期肝癌手术切除率很低,以往手术后5年生存率仅为20%～
40%,而目前的化疗药物大多数选择性不高,往往治
癌的同时产生严重的毒性反应,特别是肝细胞癌、肝
转移癌,化疗药物的疗效更差,故临床迫切需要选择性强、靶向性好、毒副作用小的新药及制剂治疗肝癌。新疆医科大学药剂学教研室将去氢骆驼蓬碱研制成可供肝动脉栓塞用的微球新剂型,利用其化疗栓塞作用,拟将其用于治疗肝癌。胥彬等9认为HCPT 的抗癌活性高,毒副反应低,经临床医院试用认为是较好的抗癌药物。而且大量临床实践证明HCPT 是一种较好的抗肿瘤药物,现已作为常规抗癌药物之一用于临床。本实验用它作为对照来衡量HM 微球这一新药新剂型对正常细胞的毒性反应,结果表明:HM 微球的毒性反应较HCPT 注射液的毒性反应小,表明HM 微球的毒副反应低这一较好的药物特性,结合其剂型的靶向性、缓释性及栓塞性等特点,有潜在的临床应用价值。本实验为体外试验,其实验结果需进行体内试验进一步验证。
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16:22224.
[收稿日期:2001210217
D etection of cell tox ic ity for H M and HCPT usi ng M TT m ethod i n v itro
ZHAO Chun -fang ,L IYan ,Az igul i ,et a l
(X inj iang H y d a tid C lin ica l R esea rch Institu te ,F irst A f f ilia ted H osp ita l ,
X inj iang M ed ica l U n iversity ,U rum qi 830054,Ch ina )
Abstract :Objective :In o rder to offer evidence fo r the clin ical app licati on of HM (harm ine ),tox icity of HM
2
21新疆医科大学学报 JOU RNAL O F X I N J I AN G M ED I CAL UN I V ER S IT Y 2002Jun .,25(2)
and HCPT(hydroxycam p to thecin)again st the rat no rm al liver cell(BRL)w as com p ared.M ethods:U sing the M T T(32(4,52di m ethylth iazo l222yl)22,52di p henyl tetrazo lium b rom ide)m ethod to detect the cell tox ic effect of HM and HCPT again st the rat no rm al liver cell(BRL)at certain concen trati on scop e.Result: T here w as line relati on sh i p betw een the cell tox icity of HM and HCPT and their drug concen trati on s;the tox icity of HM again st the BRL cell w as s m aller than the HCPT w ith statistical sign ificance(P<0.01). Conclusion s:M T T m ethod is a si m p le、rap id and sen sitive m ethod fo r assess m en t of cell tox icity.HM m i2 cro2sp heres is a k ind of new drug fo rm u lati on of HM,its cell tox ic effect again st BRL is s m aller than HCPT in jecti on.In vitro,the low tox icity of the HM m icro2sp heres is found,com b ing its o ther charac2 ters,i.e,targeting、slow2releasing and em bo lis m,there m ay have a po ten tial clin ical app licati on fo r the HM m icro2sp heres again st the liver cancer and alveo lar ech inococco sis.
Key words:M T T m ethod;harm ine;hydroxycam p to thecin;BRL
颈丛神经阻滞颈动脉内膜剥脱术1例
艾合买提?哈斯木,张建军,叶力肯?叶尔道提
(新疆医科大学第二附属医院麻醉科,新疆 乌鲁木齐 830028)
中图分类号:R61414 文献标识码:B 文章编号:100925551(2002)022*******
颅内或颅外脑动脉(A)阻塞引起脑血供障碍、脑梗塞常威胁中老年患者的生命,死亡占据第3位,仅次于心肌梗死1。目前常用颈A内膜剥脱术治疗颅脑A阻塞,可改善大脑循环,并预防缺血性脑卒中。我科2001年11月在颈丛麻醉下行颈A内膜剥脱术治疗1例右侧颈A粥样硬化狭窄闭塞的患者,现报道如下。
1 临床资料
患者男性,63岁,高血压、糖尿病 型,右侧颈动脉粥样硬化狭窄及血栓形成,收入内科保守治疗。经血管造影及彩色多普勒图像显示:右侧颈A粥样硬化狭窄及闭塞,转外科手术治疗。颈丛麻醉下经右侧胸锁乳突肌前缘斜行切口,长约12c m,分离颈阔肌,暴露术野,钝性分离颈总A、颈内A、颈外A。右颈总A直径约0.8c m,颈内A直径0.6c m,颈外A直径0.6c m,壁厚,分别胶管环绕牵引,并在颈A窦处用利多卡因浸润麻醉,直视避开迷走神经、舌下神经。外周静脉点滴肝素钠625U,5m in后阻断颈内A,阻断2m in后患者神志清醒,上、下肢肌力同术前,并阻断颈总A、颈外A。颈总A上纵行切口向上延长至颈内A斑块远端,切口约6c m,逐步剥脱血管内硬化组织。冲洗后用聚四氟乙烯血管补片缝合血管,缝合完毕,外周静脉静滴鱼精蛋白50m g,对抗肝素化。开放颈总A、颈外A,观察缝合针眼有无渗血,无渗血,关闭手术切口。随访1个月,患者术后恢复良好,有待进一步随访观察。
2 讨论
颈丛神经阻滞,患者意识清醒,术者阻断颈A后,可随时观察患者神志和肢体活动情况,并行上、下肢肌力对抗测定。术中脑细胞新陈代谢需氧增加,可充分吸氧弥补。吴阶平等2主张全麻下行颈A内剥脱术。全麻虽有许多优点,但无法观察患者神志及判断上、下肢肌力,因此认为颈丛神经阻滞行颈A内膜剥脱术可取。麻醉中注意事项:颈A血栓内膜剥脱术,主要并发症是术中发生脑缺血、脑中风以及心肌梗死。因此,手术中必须保持充足的颅脑血流供应和心脏功能,术中应维持血压或使血压稍高于原水平,以保障颅脑和心脏的血、氧供应。术前、术中避免应用抑制呼吸和心功能的药物,并用握手法测试双手肌力及双下肢活动情况。在手术操作接近颈A时,加用局部浸润以阻滞颈A窦反射。术中阻断颈内A、颈外A及颈总A近端2m in后,观察患者意识、双手肌力及双下肢活动情况,以后每2m in观察1次。在剥除内膜及缝合修补颈A时,避免患者缺氧、躁动,可应用小剂量的镇痛、镇静药,使患者安静。完成缝合修补后,放松阻断颈A前,应用硝酸甘油等药物控制性降压,使血压降至正常或稍低于正常水平10～20mmH g。放松阻断颈A后,使血压逐渐回升至正常或稍高于正常,观察颈A缝合修补处有无出血。颈A内膜剥脱术是我院新开展的手术方法之一,能进一步改善脑梗塞后脑血流供给量,极大改善脑部循环,减少中风引起脑部并发症的发生,降低死亡率,提高患者生存质量。有关麻醉方法选择及镇静、镇痛药物的全程应用,仍需积累病例进一步观察。
参考文献:
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2 吴阶平,裘发祖.黄家驷外科学[M.第6版.北京:人民卫生出版社,1999.865.
[收稿日期:2001210209
321
新疆医科大学学报 JOU RNAL O F X I N J I AN G M ED I CAL UN I V ER S IT Y 2002Jun.,25(2)
细胞毒性检测方法总结！ 细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。 细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法： MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测 一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性 其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等 细胞增殖能力分析试剂 原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态 优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。 二.荧光素发光法细胞生存能力检测 原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。 特点： 1）简单、快速。2）板式检测，可进行高通量 。 三.LDH法细胞毒性检测 原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度 特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测
０引言 细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测。四唑盐（MTT）比色法是细胞毒性检测常用方法之一，利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测。体外细胞毒性试验方法经常用于对医疗器械进行生物学评价，其结果常常用于判断该器械产品的基本生物安全性。 医用敷料，是包伤的基本常用器械产品，是用以覆盖疮、伤口或其他损害的医用材料。随着对创面愈合过程的病理生理的深入研究，人们对创面愈合过程的理解也越来越深刻，从而导致了医用创面敷料 的不断改进与发展。现在人们对医用敷料的需求也在不断增加，所以相对对各种医用敷料的生物学安全要求也在不断提高。随着产品种类的增多，各种功能的增加，通过适当的体外试验方法来加强其生物安全性的控制与保障显得格外重要。 １材料与方法 1.1材料 （1）仪器设备 311CO2恒温培养箱，Thermo公司；XDS-1B倒置显微镜，COIC公司；BS2000S电子天平，Sartorins （北京）有限公司；MULTISKAN GO酶标仪，Thermo 公司；全自动立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司。 （2）试剂试药 医用无菌敷料细胞毒性的检验方法 ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＭｅｄｉｃａｌＳｔｅｒｉｌｅＤｒｅｓｓｉｎｇＣｅｌｌＴｏｘｉｃｉｔｙＴｅｓｔＭｅｔｈｏｄｓ 罗丹洪燕 Luo Dan Hong Yan （江西省食品药品检验所，江西南昌330029） （Jiangxi Institute for Food and Drug Control，Jiangxi Nanchang330029） 摘要：目的：比较医用无菌敷料不同浸提方法所获得的供试液对其细胞毒性的影响。方法：采用四唑盐（MTT）比色法进行细胞毒性试验。结果：面积浸提法得供试液细胞毒性为3级，质量浸提法得供试液细胞毒性为2级。结论：采用质量浸提法得供试液比面积浸提法得供试液的细胞毒性小。 关键词：医用无菌敷料；四唑盐（MTT）比色法；细胞毒性 中图分类号：R-331文献标识码：A文章编号：1671-4792（2012）12-0241-03 Ａｂｓｔｒａｃｔ：Objective：Compared medical sterile dressing different leaching method was obtained by liquid on the cell toxicity effect.Method：Using tetrazolium salt(MTT)colorimetric method in cell toxicity test.Result：Area extraction to the liquid cell toxicity for level3,quality extraction to the liquid cell toxicity to level2.Conclu-sion：Using the mass extraction to the liquid ratio area extraction to the liquid cell toxicity small. Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Medical Sterile Dressing；Tetrazolium Salt(MTT)Colorimetric Method；Cytotoxicity 医用无菌敷料细胞毒性的检验方法 ２４１
9301 注射剂安全性检查法应用指导原则
本指导原则为化药及中药注射剂临床使用的安全性和制剂质量可控性而 定。 注射剂安全性检查包括异常毒性、细菌内毒素（或热原） 、降压物质（包括 组胺类物质） 、过敏反应、溶血与凝聚等项。根据处方、工艺、用法及用量等设 定相应的检查项目并进行适用性研究。 其中， 细菌内毒素检查与热原检查项目间、 降压物质检查与组胺类物质检查项目间，可以根据适用性研究结果相互替代，选 择两者之一作为检查项目。 一、注射剂安全性检查项目的设定 1.静脉用注射剂 静脉用注射剂，均应设细菌内毒素（或热原）检查项。其中，化药注射剂一 般首选细菌内毒素检查项；中药注射剂一般首选热原检查项，若该药本身的药理 作用或对家兔的毒性反应影响热原检测，可选择细菌内毒素检查项。 所用原料系动植物来源或微生物发酵液提取物， 组分结构不清晰或有可能污 染毒性杂质且又缺乏有效的理化分析方法的静脉用注射剂， 应考虑设立异常毒性 检查项。 所用原料系动植物来源或微生物发酵液提取物时,组分结构不清晰且有可能 污染异源蛋白或未知过敏反应物质的静脉用注射剂， 如缺乏相关的理化分析方法 且临床发现过敏反应，应考虑设立过敏反应检查项。 所用原料系动植物来源或微生物发酵液提取物时， 组分结构不清晰或有可能 污染组胺、类组胺样降血压物质的静脉用注射剂，特别是中药注射剂，如缺乏相 关的理化分析方法且临床发现类过敏反应， 应考虑设立降压物质或组胺类物质检 查项。 检查项目一般首选降压物质检查项,但若降血压药理作用与该药具有的功能 主治有关，或对猫的反应干扰血压检测,可选择组胺类物质检查项替代。 中药注射剂应考虑设溶血与凝聚检查项。 2.肌内注射用注射剂 所用原料系动植物来源或微生物发酵液提取物时， 组分结构不清晰或有可能 污染毒性杂质且又缺乏有效的理化分析方法的肌内注射用注射剂， 应考虑设立异
首先，可进行细胞的毒性检测，通过台盼蓝拒染法检测细胞存活率变化，MTT或WST法检测细胞的活力。 其次，细胞功能的正常有赖于膜结构的完整及膜特性的保持，所以通过以下方法检测某种物质对细胞膜的毒性 1.细胞膜通透性的变化： 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）广泛存在于生物细胞内，是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可泄漏至细胞外介质中。泄漏出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I 变成还原型辅酶I，通过测定NADH在340 nm处吸光度增加的速度可求得乳酸脱氢酶的活力，从而得到细胞膜是否损伤的结果。国外有通过试剂盒检测腺苷酸激酶的释放以及通过共聚焦激光扫描显微镜检测碘化丙啶的吸收量。 检测膜胆固醇采用邻苯二甲醛比色法。测定波长为510 nm，按照试剂盒说明检测。 2.可通过透射电镜观察细胞膜结构及以PI为荧光染料检测核膜完整性，现在更有利用原子力学显微镜（AFM）观察细胞的形态结构及比较细胞表面粘弹力的变化，比较药物对细胞膜作用前后的膜表面结构变化。利用AFM的力曲线得到能表明机械性能参数的粘弹力来分析比较未作用药和作用药后的细胞，一般，作用药组细胞其弹性小于未作用药细胞。 3.细胞膜表面整合素的变化：
整合素是一类广泛存在于细胞表面的糖蛋白，由α和β两个亚基以非共价键连接的异二聚体，目前发现由19种α亚基和8种β亚基以不同方式组合形成24种整合素亚型。用流式细胞仪检测细胞表面整合素(integrinpl)的表达(平均荧光强度） 4.Western blot检测细胞骨架蛋白F-actin和Tubulin-β 细胞骨架是由蛋白质纤维构成的胞内网络，相当于细胞的骨骼，支持着整个细胞，它紧贴在细胞膜下，赋予细胞一定的形状,对细胞及细胞器的运动也起着至关重要的作用。应用流式细胞仪检测细胞内F-actin和tubulin-β蛋白表达的情况（通过平均荧光强度来体现）。一般，药物作用后，使细胞内的钙离子浓度升高，引起一定的信号转导，破坏actin网络，使F-actin解聚，影响到细胞骨架结构对细胞形态的支持作用，造成细胞收缩，形态异常，细胞连接松散，易脱落，细胞生长稀疏，故在倒置荧光下观察药物作用后，细胞数目明显减少。 5.细胞膜Na+—K+—ATP酶及Ca2+—Mg2+—ATP酶活性的测定 按照试剂盒的方法进行，测定Na+—K+—ATP酶及Ca2+—Mg2+—ATP 酶活性。 6.细胞膜膜电位的变化：DIBAC4(3)为膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料,利用它可以快速检测膜电位的动态变化，且不损伤细胞。当DIBAC4(3)进入细胞内增多，荧光增强，表明细胞膜电位负值减小，出现去极化变化；反之，荧光减弱，表明细胞膜电位负值增大，出现超级化变化细胞的去极化与细胞损伤密切相关，造成大量Na+内流,K+外流，细胞内呈高钠低钾状态，细胞膜皱缩。
CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项 一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理 Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖 和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。 用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验 CCK8的优点： ?使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； ?CCK-8法能快速检测； ?CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度； ?CCK-8法的重复性优于MTT 法； ?CCK-8法对细胞毒性小； ?CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。 CCK8的缺点： ?与MTT法相比，CCK8和XTT的价格比较贵。 ?CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。 与以往的增殖/毒性测定试剂相比较： 检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢产物的水差（需加有机好好好
溶性溶剂溶解） 产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液 使用方法配成溶液后 使用 现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高 检测时间较长较短较短最短 检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm 细胞毒性高，细胞形态 完全消失很低，细胞形 态不变 很低，细胞形 态不变 很低，细胞形 态不变 试剂稳定性一般较差一般很好 批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷 二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法 实验一：细胞增殖分析 1、制备细胞悬液：细胞计数 2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。 3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果 不需要贴壁，这步可以省去。 4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或 者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。 5、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如 果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形 成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。 6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。 实验二：细胞毒性分析 1、制备细胞悬液：细胞计数 2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。 3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果 不需要贴壁，这步可以省去。
第12章病毒感染的检查方法与防治原则 学习要点 一、病毒感染的检查方法 1.检材的采集与送检 病毒分离标本的采集原则是：①早期取材；②注意无菌操作；③正确处理含菌标本；④低温保存与尽快送检。 2.病毒的分离培养与鉴定 （1）动物接种 （2）鸡胚接种 （3）组织培养：原代细胞；二倍体细胞；传代细胞系 （4）病毒增殖的指标：①细胞的变化；②红细胞吸附；③干扰现象；④培养基pH改变。 3.病毒感染的血清学诊断 (1)中和试验； (2)补体结合试验； (3)血凝抑制试验 4.病毒感染的快速诊断 (1)形态学检查法：光学显微镜检查法；电镜和免疫电镜检查 (2)免疫学检查法：检查病毒抗原；检查病毒特异性IgM (3)检测病毒核酸：核酸杂交技术；PCR技术 二、病毒感染的防治原则 1.病毒感染的预防 (1)人工自动免疫用于人工自动免疫的生物制品有：①灭活疫苗；②减毒 活疫苗；③基因工程疫苗；还有亚单位疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗等。 (2)人工被动免疫人工被动免疫常用的制剂有：动物免疫血清、人血清丙 种球蛋白、转移因子等。 2.抗病毒治疗 (1)抑制病毒穿入与脱壳金刚烷胺
(2)抑制病毒生物合成核苷类化合物（疱疹净、阿昔洛韦、阿糖腺苷、病毒唑、 叠氮脱氧胸苷、拉米呋啶等）；病毒蛋白酶的抑制物（沙喹纳伟、英迪纳伟等）；IFN及其诱生剂等。 (3)免疫制剂特异性免疫球蛋白、治疗性疫苗等。 (4)抗病毒中草药 复习题 一、名词解释 1.二倍体细胞 2.细胞病变效应 3.红细胞吸附试验 4.血凝抑制试验 5.减毒活疫苗 6.灭活疫苗 二、选择题 A1型题 1.从患者体内分离病毒，采集标本时的错误 ．．做法是： A.在发病早期采集 B.选取正确部位取材 C.标本冷藏 D.标本尽快送实验室 E.疾病恢复期取材 2.细胞病变效应不．包括： A.细胞圆缩、脱落 B.细胞融合 C.形成包涵体 D.干扰现象 E.细胞裂解 3.病毒凝集红细胞(血凝试验)的机制是： A.红细胞表面抗原和血凝素抗体结合 B.红细胞表面受体与病毒表面血凝素结合 C.红细胞表面病毒抗原与相应抗体结合 D.病毒与结合在红细胞表面的抗体结合 E.红细胞上的血凝素与病毒结合 4.预防病毒病最有效的方法是使用： A.抗毒素 B.抗病毒化学疗剂 C.中草药 D.疫苗 E.抗菌药物 5.以下描述正确的是 A.人工被动免疫接种的物质为抗原 B.人工被动免疫不能用于治疗
MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 简介： MTT 比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测。MTT 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色Formazan 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解。然后通过酶标仪可以测定波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。 Leagene MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒采用了Leagene 自主研发Formazan solvent ，使检测本底低，灵敏度高，线性范围宽。 组成： 自备材料： 1、 细胞培养液 2、 胰蛋白酶消化液 3、 低速离心机 4、 96孔培养板 5、 细胞计数板或计数器 6、 细胞培养箱 7、 摇床 8、 显微镜 9、 酶联免疫检测仪 操作步骤(仅供参考)： 1、 细胞用含血清的培养液培养至对数生长期，常规胰蛋白酶消化液消化细胞(悬浮细胞无需消化)。 2、 低速离心，收集细胞沉淀。 3、 用培养液重悬细胞沉淀，制备成单细胞悬液，并计数。 编号 名称 CT0026 500T Storage 试剂(A): MTT solution(5mg/ml) 5ml -20℃ 避光 试剂(B): Formazan solvent 60ml RT 使用说明书 1份
4、细胞接种于96孔培养板，一般接种密度为3000～10000个细胞/孔。通常细胞增殖实 验每孔加细胞，细胞毒性实验每孔加入细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定。 5、CO2继续培养或按照实验具体需要进行培养。 6、按照实验具体要求，给予干预药物处理，CO2继续培养至合适时间。 7、弃培养液，每孔加入MTT solution和100μl 新鲜培养液，在细胞培养箱内继续孵育。 8、弃培养液，每孔加入Formazan solvent，置摇床上低速振荡，使结晶物充分溶解。如 果紫色结晶较小或较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大或较多，溶解的时间会长一些。 9、在酶联免疫检测仪570nm测定各孔吸光度。 注意事项： 1、MTT solution尽量减少反复冻融的次数，当颜色变为灰绿色时，请勿使用。 2、由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，应注意蒸发问题。 3、MTT solution在低温情况下会凝固，置于室温或20～25℃水浴至全部融解后使用。 4、Formazan solvent可以-20℃储存，当产生沉淀或凝固时可以37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。 5、观察formazan是否完全溶解，亦可以借助光学显微镜观察。 6、培养细胞时尽量细菌避免污染。 7、应注意设立OD调零孔和对照。 8、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效。 相关： 编号名称 CC0033Hanks平衡盐溶液(1×HBSS,无酚红) CC0130胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%:0.02%) CT0025MTT溶液(5mg/ml) DA0065台盼蓝染色液(0.4%) NR0001 DEPC处理水(0.1%) PW0053 Western抗体洗脱液(碱性) TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)
关于注射剂安全性检查法应用指导原则（修订稿）的讨论（续）(2007-11-18 13:59:42)标签：知识/探索分类：药品安全性检查 检查限值的设定 一、异常毒性检查： 本法系将一定量的供试品溶液注入小鼠体内，规定时间内观察小鼠出现的死亡情况，以判定供试品是否符合规定。供试品的不合格表明药品中污染了超过正常产品毒性的剧毒杂质，临床用药将可能增加急性不良反应。 （一）、方法：参照中国药典2005年版（二部）附录异常毒性检查法。 （二）、设定限值前研究：参考文献资料数据并经单次静脉注射给药毒性试验确定该注射剂的小鼠急性毒性数据（LD50和LD1及其可信限）。有条件时，有不同实验室用不同供试品和动物来源进行试验求得的LD50和LD1数据。静脉注射速度0.1mL/秒，观察时间为72小时。 （三）、设定限值：异常毒性检查的限值应低于该注射剂的正常产品的毒性最小致死剂量，一般应高于人临床一次公斤体重最大剂量。考虑到实验室间差异、动物反应差异和制剂的差异，建议限值至少应小于LD1可信限下限的1/3(建议采用1/6) ，或小于LD50的1/4(建议采用1/8)。如药品半数致死量与临床体重剂量之比小于20时，可采用LD1可信限下限的1/3。静脉注射最大剂量0.8ml/20g体重仍未见毒性反应或死亡，可以此作为检查限值。注射速度可按常规速度（0.1mL／秒），如有特殊要求可在限值中注明。 一般采用静脉注射给药，特殊品种采用其他适宜方法，应说明理由并在正文中字明。 讨论： 1．确定异常毒性检查限值时，应避免因药品正常毒性出现的假阳性。据文献报告，实验室间同一药物静脉注射LD50有差异但相对较小（同种系小鼠一般不超过1倍）。由于异常毒性检查观察时间为48小时，因此，限值设定前必须进行以一定注射速度静脉单次给药观察72小时急性毒性试验（常用昆明种小鼠），求得LD50和LD1及其可信限。如用14天的结果，有的药品因LD50变小而降低限值水平。 小鼠急性毒性数据（LD50和LD1及其可信限），可采用2组以上动物（每组10只）进行试验，结果用简化机率法（顾汉颐法）或点斜法计算LD50和LD1及其可信限（参考周海钧著“药品生物检定”和孙瑞元著“定量药理学”）
优势：利用SpectraMax i3x多功能微孔板读板机所具有的超灵敏化学发光检测功能进行细胞活力和细胞毒性的评价 简介 方法 准备试剂 ? 仪器具有超高灵敏度化学发光检测功能，最低至10个细胞/每孔；? 微孔板读板高度自动优化设置，可提高检测信号强度? 软件预置模板可以更快分析出检测结果SpectraMax i3x是Molecular Devices公 司最新推出的一款多功能微孔板读板机， 可利用仪器所具有的化学发光检测功能， 进行细胞活力和细胞毒性相应检测。仪器 可灵敏、快速检测出培养基中活细胞的数 目和经相应处理后细胞毒性情况。 Promega公司推出的CellTiter-Glo试剂是 利用了萤火虫荧光素酶反应体系中需要 ATP参与才能使其发光的特点，化学发光 信号强弱取决于培养基中ATP含量的高 低，也就是依赖于其中活细胞数目的多 少。来自于BioVision公司基于生物化学发 光原理的细胞毒性检测试剂盒，目的是检 测腺苷酸激酶(AK)的含量，AK为一种存在 于所有细胞中的常见蛋白，当破坏了细胞 膜完整性后其会释放至培养基中，AK可转 化ADP至ATP，所以可以利用类似方式进 行化学发光检测。 材料 ? CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega P/N G7570) ? Bioluminescence Cytotoxicity Assay Kit (BioVision P/N K312-500) ? HeLa 细胞(ATCC P/N CCL-2) ? 黑色底透 96孔细胞培养板 (Corning P/N 3904) ? 白色96孔细胞培养板(Corning P/N 3917) ? SpectraMax i3x多功能微孔板读板机使用前预先将CellTiter-Glo缓冲液和底物解冻并且平衡其至室温，将CellTiter-Glo 缓冲液加至含有CellTiter-Glo底物的棕色小瓶中，按照试剂盒说明书提示，将试剂轻轻反复颠倒进行混匀。对于生物化学发光细胞毒性检测试剂盒，其中包含了1瓶AK检测试剂，此试剂使用前预先将1.1ml AK试剂缓冲液加入其中并轻轻混匀，需在室温环境下平衡15分钟后使用。这个10X 的AK试剂的储存液需要稀释后才能成为试剂缓冲液。细胞数目与化学发光信号关系Hela 细胞培养在含有10%胎牛血清和双抗的MEM培养基中，细胞经胰酶消化后，使其悬浮于培养基中进行计数。处理后的细胞铺在96孔板中，经细胞培养基稀释后其密度从50,000细胞每孔/100ul至10个细胞每孔/100ul。如果将细胞铺在384孔板时，稀释后密度从12,500细胞每孔/25ul至6个细胞每孔/25ul。对照孔中仅需加入细胞培养基用于检测其背景的化学发光信号值。细胞试验过程中，精确的细胞数目可用于生成标准曲线，将不同体积的CellTiter-Glo试剂加入相应的孔板中，如100ul(96孔板)或25ul(384孔板)。将微孔板放置于 振荡器上轻混2分后，室温条件下孵育10分 钟，等化学发光信号值稳定后再进行检 测。
细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检 测方法 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 作者：王政, 田菲菲, 刘丁, 吕凤林 【关键词】 T淋巴细胞生物杀伤细胞毒性 细胞介导的免疫效应在机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫、移植排斥效应和自身免疫性疾病发生机制中发挥重要作用, 主要效应细胞之一为细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphoclyte, CTL)。近年来, 基于CTL特异性表位的多肽疫苗已经成为研究热点之一, CTL的活化及对靶细胞的杀伤效应成为衡量疫苗质量的重要因素之一。目前已经报道许多新的评价CTL活性及其杀伤效应的方法, 现就此做一综述。 1 单个细胞水平测定CTL活性 目前一般常用的有产生细胞因子的细胞记数法和有限稀释分析法(LDA)。活化的T淋巴细胞可分泌一些功能性的细胞因子, 如IL2、IFNγ、TNFα等, 由于分泌不同种类细胞因子可以区分不同免疫功能的记忆细胞或效应细胞, 这样可以在体外评价外周血
单个核细胞（PBMC）中抗原特异性T细胞的数量和功能状态。目前常用的检测细胞因子的方法如ELISA、ELISPOT、PCR/RT PCR及细胞内因子检测等。 1.1 有限稀释分析法(Limiting dilution analysis, LDA) 该方法是迄今应用较广泛的定量分析系统［1］。LDA 法使我们能够详细了解免疫反应动力学和记忆CTL(Memory CTL, mCTL) 细胞亚群的细胞周期［2］, 也是对pCTL和mCTL亚群细胞表面的激活标志物进行研究的良好方法。但此方法也存在缺点, 主要是: (1)在LDA条件下, 深入刺激会使效应CTL(eCTL)细胞加快凋亡［3］, 使CTL活性测定值变动较大, 对eCTL细胞数量不能测定或测定值偏低。(2)实验较繁琐, 因为在实验之前, 首先需要将淋巴细胞表面表达的CD分子, 如CD44或CD62L进行染色, 再用FACS法分类筛选, 然后在LDA条件下培养6 d; 这样就会造成T细胞数量损失, 特别是在活化状态进行筛选和分离时。 1.2 ELISA ELISA可直接检测肿瘤患者体液如血液中的细胞因子(如IL2、IFNγ或TNFα)水平, 也可用于测定激活的淋巴细胞(诸如LAK或CIK细胞) 培养液中各细胞因子水平, 这是评估免疫活性细胞激活程度和免疫状态的重要指标。当然, ELISA法检测的是一群细胞产生的细胞因子总量, 无法给出单一细胞的信息和精确估算抗原特异性T细胞数量, 而且, 它不能检测淋巴细胞被抗原刺激后产生细胞因子的能力。在肿瘤免疫检测中, 随着ELISPOT技术的发展, ELISA法的应用已逐渐减少。