滨州医学院-生理
教研室 膜片钳系统简介
一、膜片钳系统简介：
膜片钳系统包括：放大器和数模转换器系统、显微成像系统、灌流系统、屏蔽减震系统，
其中核心系统是放大器和数模转换系统。放大器和数模转换系统现在国际上常用的有两家公司生产：德国heka 和美国axcon ，其中双通道分别为heka 的EPC10和AXCON 的700B 。heka 公司是发明膜片钳的公司，放大器和数模转换器整合在一个模块中，信噪比高，技术先进，但价格较贵，操作系统复杂；AXCON 公司放大器和数模转换器是分开的两个模块，信噪比稍差，但性价比高，操作系统入手容易，可以完成绝大多数细胞脑片的电生理记录，因此市场占有率较高。
AXCON 的700B 机器分为放大器（Muliclamp 700B ）和数模转换器（Digidata 1440A ）两个
模块。其中放大器的具体参数为：电脑化双通道电阻反馈高速电流钳放大器，自动的电容，电阻补偿。软件控制放大器的增益、滤波、全细胞电容补偿、记录模式等。噪音： 带宽1kHz 时的开路噪声15毫微微安陪以下，5kHz 时的开路噪声60毫微微安陪以下，10kHz 时的开路噪声最大130毫微微安陪。带宽最大可达100kHz 。电容补偿100PF （β=1）或1000pF （β=0.1）。数模转换器的具体参数为：16位自适应数据采集系统, 16个模拟信号输入通道和2个模拟信号输出通道，16个数字信号输入通道和2个数字信号输出通道，4个外部设备信号输入通道，1个起始触发和1个记录触发。输入信号范围+/-10V ，噪声小于+/-1mV ，最大采样率500kHz 。
二、膜片钳技术发展史：
1976年德国马普生物物理化学研究所Neher 和Sakmann 首次在青蛙肌细胞上用双电极
钳制膜电位的同时，记录到ACh 激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。
1980年Sigworth 等在记录电极内施加5-50 cmH2O 的负压吸引，得到10-100G Ω的高阻
封接（Giga-seal ），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。
1981年Hamill 和Neher 等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技
术，从而使该技术更趋完善，具有1pA 的电流灵敏度、1μm 的空间分辨率和10μs 的时间分辨率。
1983年10月，《Single-Channel Recording 》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。
Sakmann 和Neher 也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。
三、膜片钳技术原理：
1、概念介绍：
在介绍膜片技术之前，先简单的介绍一下什么使电流钳和电压钳技术。简单的说，向细
胞内注射恒定或变化的电流刺激，记录由此引起的膜电位的变化，这就是电流钳技术。它可以模拟细胞真实的自然情况，如神经冲动的传递过程中，神经递质的释放可引起神经元膜电位的去极化或超极化。在具体实验中，可通过给予细胞一系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生电紧张点位、动作电位等；电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小和离子流的大小相同、方向相反，因此它可以反应离子流的大小和反向。电压钳技术是一个负反馈系统，在双电极电压钳记录中，一根电极用于监测细胞膜电位，另外一根电极用于注射电流，当所
滨州医学院-生理教研室监测的膜电位偏离钳制电位时，通过向细胞内注射电流可纠正这一偏差，从而维持细胞膜电位不变。在单电极电压钳记录中，监测电压与注射电流都采用同一电极（现都用单电极记录）。 膜片钳技术和电压钳、电流钳技术在命名上并不一致，后者是从电学概念的角度命名的，而“膜片钳”主要是从机械物理的角度命名的。从字面上理解，膜片钳技术钳制的“膜片”是指采用检点经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其他细胞膜分离，这大大降低了背景噪音，使单通道微弱的电流得以分辨出来。此外，膜片钳技术之所以能够记录到非常微弱的单通道离子电流，除了因为电极与细胞膜之间形成的紧密接触外，还得靠特殊设计的低噪声膜片钳放大器。采用电压钳技术将这片细胞膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术，可记录到流经单通道的电流。后来，随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，出现了全细胞记录等其他模式，而且也不仅仅采用电压钳技术，还常用电流钳技术。在理解膜片钳的概念时候不能将膜片钳技术与电流钳、电压钳技术完全分隔开，实际上在使用膜片钳技术时不可避免的要使用电压钳或电流钳技术，膜片钳放大器也就是电流钳/电压钳放大器。 2、原理介绍 膜片钳技术的基本原理是通过负反馈使得膜电位与指令电压相等，在电压钳制的条件下记录膜电流。上面是电阻反馈式膜片钳放大器的电路示意图。A1为一极高输入阻抗、极低噪声的场效应管运算放大器，由于A1极高的开环增益使得两个输入端的电压几乎完全相等，从而实现电压钳制。Rf 为一数值可切换的反馈电阻，分别对应于不同的电流记录范围，其中高值反馈电阻具有极高的电阻和极低的杂散电容，是决定放大器单通道记录性能的基本元件。A2为一差分放大器，它的输出即为电极电流和反馈电阻的乘积。由放大器A1和A2构成的回路称为电流—电压转换器，是膜片钳放大器前级（headstage ）的核心。
Rs 是由电极和细胞之间的通路所构成的串联电阻，会引起全细胞电压钳记录的点钳制问题，这可通过Rs Comp 回路来消除。电极入液之后会产生所谓的“快电容”Cp ，即内外液相对于电极壁形成的杂散电容，在形成G Ω封接后变得更明显。而当吸破细胞膜形成全细胞模式后，还能观测到“慢电容”Cm ，即对于细胞膜的充放电而产生的电容电流。可以通过电容补偿回路来消除这些电容尖峰的影响。由于阻容藕合电路中电阻和电容值的不同，快慢电容的幅度和时间常数都不同。对于有突起的细胞如脑片中的神经元，还存在空间钳制问题，这就难以从电路上消除它的不利影响。
全细胞膜片钳模式下有电压钳记录和电流钳记录两种。电压钳记录的原理与电压钳技术相似，但有所不同：首先，全细胞电压钳记录只使用单根电极，但在电学效果上同时实现了电压钳制和电流记录。其次，电压钳记录的电极不插进细胞，对细胞造成的损伤较小，因而能用于小细胞如神经元的研究。电流钳记录则是通过钳制电极电流来测量膜电位。电流钳在本质上也是电压钳位，它将差分放大器的输出电流与指令电流相比较，然后将这个差动输出施加到放大器前级的倒相端，通过高速反馈使得同相端的电压与其相等，无论电极电流是否为零，都能从输出电压得到膜电位的准确数值。
根据细胞膜的电路模型，全细胞模式还可用于监测膜电容的变化。当通过电极给细胞膜
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教研室一个高频正弦波时，由于膜电容的存在，膜电阻的反应会有一个明显的相位滞后，这个时间延迟由膜电容、膜电阻和电极电阻三者决定。当后面两个因素固定时，膜电容的变化就会引起膜电阻反应与输入之间的相位差的变化。对于各种分泌细胞：胰岛细胞、肾上腺分泌细胞或神经分泌细胞，细胞的分泌伴随着膜表面积也就是膜电容的变化，可以通过监测相位差的变化来观测细胞的分泌过程。 单通道记录的关键在于降低背景噪声。电阻反馈式放大器存在两个问题：一是反馈电阻本身的热噪声；另一个是反馈电阻本身的杂散电容。对于前者，当采用大电阻值反馈电阻时，就能将热噪声降低到可以接受的范围。但反馈电阻的杂散电容与电阻形成一个低通滤波器，按照现在的工业标准（50G ，0.1pF ），这个滤波器会使采集到的单通道信号严重失真。对于这个问题，可以采用一个高频提升器（high frequency boost ），信号经过这样的处理就会引入高频噪声，因此必须经过低通模拟滤波。 1976年在封接电阻只有10—20M Ω的情况下，记录了蛙去神经支配的肌纤维膜乙酰胆碱受体的单通道电流，由于背景噪声的影响，单通道电流矩形脉冲的形状很不明显。若要记录单个离子通道的微弱电流，就必须将噪声降低到极小，但按照‘Johnson ’公式，由带电粒子的热运动所引起的电流噪声为：Irms = (4kTfc/R)1/2，因此就必须极大地提高电阻。因为放大器输入阻抗、膜片电阻和反馈电阻都很高，所以必须极大地提高封接电阻。 后来发现当略施负压之后封接电阻很快上升到了G Ω的范围，背景噪声急剧下降，使得高分辨率的单通道记录变为可能。随后Hamill 和Horn 等人将小块膜片从细胞膜上分离下来而不影响封接，这样就形成了单通道记录的三种模式：细胞贴附式、内面向外式、外面向外式，连同全细胞模式于是便有了膜片钳的四种经典记录模式。Hamill 等人在1981年发表的奠基性论文标志着膜片钳技术的成熟，随后在全世界各个生理学、神经生物学和生物物理学实验室得到了广泛的应用，极大地推动了离子通道和相关学科的研究。
3、细胞膜的电学模型 用膜片钳技术记录细胞的电流或电压变化首先要将可兴奋的细胞膜想象成一个电学模型：细胞膜由脂类双分子层和和蛋白质构成。脂质层的电导很低，由于双分子层的结构特点，形成了细胞的膜电容，通道蛋白的开闭状况主要决定了膜电导的数值。在细胞膜的电学模型中，膜电容和膜电导构成了一个并联回路。在细胞膜的电兴奋过程中，脂质层膜电容的反应是被动的，其电流电压曲线是线性的；而由通道蛋白介导的膜电导构成了膜反应的主动成分，它的电流电压关系是非线性的。当改变跨膜电位时，膜电容和膜电导分别引发被动和主动电流：Im=Ii ＋CdV/dt ，其中Im 是流过膜的总电流，Ii 是通道电流，CdV/dt 是由膜电容介导的电容电流。为了考察通道电流就必须消除电容电流的影响，此时可以令dV/dt ＝0，即将膜电位钳制在一固定数值，使其不随时间变化，这就是电压钳技术的实质所在。 四、膜片钳技术的记录方式（如下图）： 1、细胞贴附记录 2、全细胞记录 3、outside-out 记录
4、inside-out 记录
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教研室 五、膜片钳技术的应用 1、应用学科 膜片钳技术发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且直接或间接为临床医学研究服务，目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。随着全自动膜片钳技术（Automatic patch clamp technology ）的出现，膜片钳技术因其具有的自动化、高通量特性，在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命力。 2、应用的标本种类 使用的标本种类繁多。从最早的肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元和内分泌细胞发展到血细胞、肝细胞、耳窝毛细胞、胃壁细胞、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、精母细胞等多种细胞；从急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发展到组织片（如脑片、脊髓片）乃至整体动物；从蜗牛、青蛙、蝾螈、爪蟾卵母细胞发展到鸡细胞、大鼠细胞、人细胞等等；从动物细胞发展到细菌、真菌以及植物细胞。此外，膜片钳技术还广泛地应用到平面双分子层（Planar bilayer ）、脂质体（Liposome ）等人工标本上。 3、研究对象
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教研室研究对象已经不局限于离子通道。从对离子通道（配体门控性、电压门控性、第二信使
介导的离子通道、机械敏感性离子通道以及缝隙连接通道等等）的研究发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研究等。
4、应用举例：
(1). 膜片钳技术在通道研究中的重要作用
应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离
子选择性、同时可发现新的离子通道及亚型，并能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率，还可以用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。同时用于研究细胞信号的跨膜转导和细胞分泌机制。结合分子
克隆和定点突变技术，膜片钳技术可用于离子通道分子结构与生物学功能关系的研究。 利用膜片钳技术还可以用于药物在其靶受体上作用位点的分析。如神经元烟碱受体为配体门控性离子通道，膜片钳全细胞记录技术通过记录烟碱诱发电流，可直观地反映出神经元烟碱受体活动的全过程，包括受体与其激动剂和拮抗剂的亲和力，离子通道开放、关闭的动力学特征及受体的失敏等活动。使用膜片钳全细胞记录技术观察拮抗剂对烟碱受体激动剂量效曲线的影响，来确定其作用的动力学特征。然后根据分析拮抗剂对受体失敏的影响，拮抗剂的作用是否有电压依赖性、使用依赖性等特点，可从功能上区分拮抗剂在烟碱受体上的不同作
用位点，即判断拮抗剂是作用在受体的激动剂识别位点，离子通道抑或是其它的变构位点上。
(2).与药物作用有关的心肌离子通道
心肌细胞通过各种离子通道对膜电位和动作电位稳态的维持而保持正常的功能。近年
来，国外学者在人类心肌细胞离子通道特性的研究中取得了许多进展，使得心肌药理学实验由动物细胞模型向人心肌细胞成为可能。
(3).对离子通道生理与病理情况下作用机制的研究
通过对各种生理或病理情况下细胞膜某种离子通道特性的研究，了解该离子的生理意义
及其在疾病过程中的作用机制。如对钙离子在脑缺血神经细胞损害中作用机制的研究表明，缺血性脑损害过程中，Ca2+ 介导现象起非常重要的作用，缺血缺氧使Ca2+通道开放，过多的Ca2+进入细胞内就出现Ca2+超载，导致神经元及细胞膜损害，膜转运功能障碍，严重的可使神经元坏死
(4).对单细胞形态与功能关系的研究
将膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链是反应技术结合，在全细胞膜片钳记录下，将单
细胞内容物或整个细胞（包括细胞膜）吸入电极中，将细胞内存在的各种mRNA 全部快速逆转录成cDNA ，再经常规PCR 扩增及待检的特异mRNA 的检测，借此可对形态相似而电活动不同的结果做出分子水平的解释或为单细胞逆转录多聚酶链式反应提供标本，为同一结构中形态非常相似但功能不同的事实提供分子水平的解释。目前国际上掌握此技术的实验室较少，我国北京大学神经科学研究所于1994年在国内率先开展。
(5).对药物作用机制的研究
在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位（膜内或膜外）施加各种浓度的药物，
研究它们对通道功能的可能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物生理功能的分子机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和“缺血”诱导的大鼠大脑皮层神经元L-型钙通道的开放，从而减少钙内流，对缺血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通道记录法发现乌头碱对培养的Wistar 大鼠心室肌细胞L-型钙通道有阻滞作用。
(6). 在心血管药理研究中的应用
随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用，对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不
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医学院-生理教研室断更新，而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说：“Neher 和Sadmann 的贡献有利于了解不同疾病机理，为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。 (7). 创新药物研究与高通量筛选 目前在离子通道高通量筛选中主要是进行样品量大、筛选速度占优势、信息量要求不太高的初级筛选。最近几年，分别形成了以膜片钳和荧光探针为基础的两大主流技术市场。将电生理研究信息量大、灵敏度高等特点与自动化、微量化技术相结合，产生了自动化膜片钳等一些新技术。
数据流程图 1.定义：是一种能全面描述信息系统逻辑模型的主要工具。用少数几种符号反映信息在系统中的流动、处理和存储情况。 2.特点： 抽象性：表现在它完全舍去了具体的物质，只剩下数据的流动、加工处理和存储。 概括性：表现在它可以把信息中的各种不同业务处理过程联系起来，形成一个整体。 3.符号 库存台帐 数据存储 外部实体处理 数据流 外部实体：指本系统之外的人或单位，凡本系统之外的人或单位，都可以称为外部实体。 数据流：表示流动着的数据，它可以是一项数据，也可以是一组数据，也可以用来表示对数据文件的存储操作。 处理（功能）：又称功能。 数据存储：指通过数据文件、文件夹或账本等存储数据。 4.某企业成品销售管理的数据流程图。 销售科负责成品销售及成品库管理。该科计划员将合同登记人合同台帐，并定期根据合同台帐查询库存台帐，决定是否可以发货。如果可以发货，则填写出库单交成品库保管员。保管员按出库单和由车间送来的入库单填写库存台帐。出库单得另外两联分送计划员和财务科。计划员将合同执行情况登入合同台帐。销售部门的负责人定期进行销售统计并上报厂办。 数据流程图如下： 5. 画出银行储蓄存取款过程数据流程图 储户将填好的存（取）单及存折送交分类处理处。分类处理安三种不同情况分别处理。如果存折不符或存（取）单不合格，则将存折及存（取）单直接退还储户重新填写；如果是存款，则将存折及存款单送交存款处处理。存款处理处取出底帐登记后，将存折退还给储户；如果是取款，则将存折及取款单送交取款处理处，该服务台取出底帐及现金，记账后将存折
与现金退给储户。从而完成存（取）款处理过程。试按此画出数据流程图。 数据流程图如下： 面对强大的对手，明知不敌，也要毅然亮剑，即使倒下，也要化成一座山
膜片钳技术原理 可兴奋膜的电学模型 细胞膜由脂类双分子层和和蛋白质构成。脂质层的电导很低，由于双分子层的结构特点，形成了细胞的膜电容，通道蛋白的开闭状况主要决定了膜电导的数值。在细胞膜的电学模型中，膜电容和膜电导构成了一个并联回路。在细胞膜的电兴奋过程中，脂质层膜电容的反应是被动的，其电流电压曲线是线性的；而由通道蛋白介导的膜电导构成了膜反应的主动成分，它的电流电压关系是非线性的。 当改变跨膜电位时，膜电容和膜电导分别引发被动和主动电流：Im=Ii＋CdV/dt，其中Im是流过膜的总电流，Ii是通道电流，CdV/dt是由膜电容介导的电容电流。为了考察通道电流就必须消除电容电流的影响，此时可以令dV/dt＝0，即将膜电位钳制在一固定数值，使其不随时间变化，这就是电压钳技术的实质所在。 电压钳技术 离子通道的近代观念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代的开创性研究。在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子都可以自由通过。Cole等人在1939年进行的高频交变电流测量实验表明，当动作电位被触发时，虽然细胞的膜电导大为增加，但膜电容却只略有下降，这个事实表明膜学说所宣称的膜破裂的观点是不可靠的。1949年Cole在玻璃微电极技术的基础上发明了电压钳位（voltage clamp technique）技术，基本原理如下： 电压钳技术的核心在于将膜电位固定在指令电压的水平，这样才能研究在给定膜电位下膜电流随时间的变化关系。在上图中，膜电位Vm由高输入阻抗的电压跟随器所测量。钳制放大器在比较了膜电位和指令电位E之后，通过电阻Ra将电流注入膜内以控制膜电位。钳制放大器的输出：Vo=A（E－Vm），因为这个输出由电阻Ra和膜所分压，所以输出电流：I=（Vo－Vm）/Ra。由这两个关系可推出：Vm=EA/(1+A)-RaI/（1+A）。因此若钳制放大器的增益A极大，膜电位Vm和指令电位E之间的差别就可以忽略，即实现了电压钳制。 Hodgkin、Huxley和Katz应用电压钳技术研究枪乌贼巨轴突，结合同位素示踪和胞内灌流等技术发现：动作电位的初期，细胞膜主要对钠离子的通透性发生改变，胞外的钠离子迅速内流，并产生所谓的“超射”现象（overshoot）；随后对钠的通透性的急剧减少并且对钾离子的通透性增加。兴奋期的膜电位存在“超射”现象也是膜学说所不能解释的。 根据这些实验，Hodgkin、Huxley和Katz在其1949—1952年的一系列论文中提出了“离子学说”或“钠学说”。认为当膜的去极化超过一个临界值时，就会触发动作电位的产生。在此期间，钠电导迅速上升，钠离子大量内流，使得膜电位接近钠的平衡电位；随后钠电导迅速失活，钾电导逐渐增加，引起膜电位的复极化。 Hodgkin和Huxley通过对电压钳位实验数据的分析，给出了所谓的Hodgkin—Huxley方程。他们将膜电位钳制在不同的水平，观察钾电导或钠电导随时间的变化，然后用一个常微分方程去逼近所得到的实验曲线，而这些微分方程中的参数则假定跟离子通道上的“粒子”相关。根据H—H方程，能够推导出动作电位的阈值、形状、幅度等性质。并且在去除电压钳制的条件下，可以得到一个以电压和时间为变量的偏微分方程，由它可以给出和真实状况相符合的神经冲动的传导。 膜噪声和噪声分析 Katz等人在1970年代初期研究了蛙神经肌肉接头处肌纤维膜电位的波动。他们根据对这种膜电位“噪声”的分析，提出了量子释放的概念，认为神经递质是以囊泡的形式从突触前膜释放到突触间隙中。并且Katz等人借助这种新的“噪声分析”方法（fluctuation analysis），能从突触后膜电位的“噪声”中推测出单位事件的幅度和时程。Anderson、Stevens、Colquhoun和Sigworth等人进一步发展了“噪声分析”。 “噪声分析”的实质在于二项分布期望和方差之间的关系。假定通道只有开和关两个状态，并且各个通道的开关是独立的。若N是通道的总数，p是通道的开放概率，i是单通道电流，I是膜电流的期望值。则有：I=Npi，var(I)=Np(1-p)i2,即：var(I)=iI-I2/N。用var(I)对I作图，这显然是一个开口朝下的抛物线。微分这个二次方程得到曲线的斜率：dvar(I)/dI=i-2I/N,当I=0时的斜率就是单通道电流，根据钳制电位和反转电位之间的差就可以算出单通道电导；在抛物线的顶点即当：dvar(I)/dI=0时，I=Ni/2，由此可算出
EPC 10膜片钳放大器的使用 EPC 10膜片钳放大器的使用 东乐科技有限公司技术部主任刘振伟 一、概述 德国HEKA公司生产的EPC（Extracellular patch clamp）系列放大器的早期型号为EPC 5，这是世界上最早的膜片钳放大器。此后陆续升级为EPC 7、EPC 8、EPC 9和EPC 10，EPC 9和EPC 10为全电脑控制的膜片钳放大器。目前EPC放大器的最高版本为EPC 10膜片钳放大器（截至到2011年7月），有EPC 10 USB和EPC 10 Plus两大类机型。本文讲解EPC 10 USB的使用。 EPC 10 USB膜片钳放大器主要有如下应用： ●单通道记录：可记录亚pA级的单离子通道电流。 ●低噪声全细胞膜片钳记录、电压钳/电流钳/低频电压钳（LFVC） 记录：可记录全细胞膜各种离子通道电流、细胞动作电位等。 ●传统细胞内记录：可记录动作电位、细胞放电等。 ●使用金属电极的场电位记录：如整体动物与脑片的诱发场电位 记录。 ●突触长时程增强(LTP)/长时程抑制(LTD)记录：整体动物与脑片 的LTP/LTD记录。 ●松散封接记录、人工脂膜离子通道、纳米孔等的记录：放大器 - 1 -
EPC 10膜片钳放大器的使用 - 2 - 探头有足够的大电流测量能力，最大可测量2 μA的电流。 ●离子选择性测量：采用离子选择性电极检测溶液中某一离子浓 度。 ●电化学检测（伏安法/安培测量法）：如采用碳纤电极的细胞或 膜片安培测量法，检测细胞某些物质的释放。 ●细胞胞吞/胞吐或突触递质释放的研究：采用膜电容测定法， 可测量因细胞胞吞、胞吐或突触递质释放所引起的全细胞膜电容的微小变化。 EPC 10膜片钳放大器具有如下显著特点： ●仪器面板的各个功能钮/键均为计算机控制，所有操作均在程 序面板中通过鼠标与键盘进行。 ●面板程序可在PC机（Windows 2000\XP\Vista操作系统）和苹 果机（Mac OS 10.4 及以上版本操作系统）上运行。 ●放大器本底噪声小于90 fA。 ●探头有三种反馈电阻，可测量的最大电流分别为200 pA (50 GΩ)、20 nA (500 MΩ)、2 μA (5 MΩ)，测量范围满足绝大多数电生理实验信号的要求。 ●电极电容（快电容）和膜电容（慢电容）补偿可自动进行。●液接电位实现了自动校正，无需其他常见膜片钳放大器的手工 计算与校正。 ●具有Lock-in放大器功能，可对膜电容微小变化进行精确检测，
膜片钳的发展和应用 1．背景 细胞是生物的基本组成单元，细胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系，细胞间与细胞内的通信、信号传递依靠其膜上的离子通道来进行，离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦是产生生物电的基础。生物电信号通常是用电学或电子学的方法进行测量。早期多采用双电极电压钳技术作胞内记录，近年来逐渐被膜片钳所取代，这项技术为从细胞和分子水平了解生物膜离子单通道“开启”和“关闭”的门控动力学及各种不同离子通道的通透性和选择性等膜信息提供了最直接的手段。 膜片钳记录(patch clamp recording)是利用玻璃微电极吸引封接面积仅为几个um2的细胞膜片，在10-12A水平，记录单个或几个通道的离子电流，已达到当今电子测量的极限。此技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域的研究。从而点燃了细胞和分子水平的生理学研究的生命之火，并取得了丰硕的成果。 2．膜片钳技术简介 2.1 基本原理和记录方法 电压钳(V oltage-clamp)是由英国学者Huxley和Katz最先应用的[1]。其实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化，因此电压钳可用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动，但该技术由于在细胞内插人两根电扳，对细胞损伤很大，在小细胞中难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致，而逐渐被膜片钳所取代。 膜片钳技术(patch-clamp)是在电压钳基础上发展起来一种新技术，与电压钳的主要区别有二：一是钳制膜电位的方法不同；二是电位固定的细胞膜面积不同，即所研究的离子通道数目不同。与电压钳一样，膜片钳也是利用负反馈电子线路，将微电板尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域(膜片)形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接，从而可反映细胞上单一(或多数)离子通道的分子活动[2]。1976年，德国科学家Neher和Sakmann首先用此技术对蛙胸皮肌细胞膜上的己酰胆碱受体通道进行了研究，记录出了量值在皮安级(10-12 A)的微弱电流[3,4]。1981年，经Hamill等[5]后人的进一步完善，其电流测量灵敏度已达1pA，时间和空间分辨率达10 us和1 um。 随着膜片钳技术的出现，目前有几种不同的记录方式： (1)细胞吸附式(cell-attached patch)将两次拉制后，经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面, 形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，即通过微管电极对膜片进行电压钳制，从而测量膜电流。 (2)内面向外模式(inside-out patch)高阻封接形成后，将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中，使小泡的外半部分破裂即得。
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膜片钳使用规则 一、工作原理： 1.膜片钳是一种可以直接观察单一的离子通道蛋白质分子对相应离子通透难易程度等特性的一种实验技术。其基本原理是用一个尖端光洁，直径约为0.5~3um 的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极另一端开口处施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在这一小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密的封接，其电阻可达数个或数十个千兆欧，这实际上把吸附在微电极尖端开口处的那一片膜同其余部分的膜在化学上完全隔离出来，由微电极记录到的电流变化只同该膜片中通道分子的功能状态有关。如果在这一小片膜中只包含了一个或少数几个通道蛋白分子，那么通过微电极测量出的电流，就是某种带电离子经由开放的单一通道蛋白质分子进行跨膜移动的结果。 二、操作步骤： 1.打开总电源。 2.依次打开电脑、显微镜、监视器、微操、放大器。 3.打开PULSE软件，在E盘建立自己的文件夹。 4.灌注玻璃电极并排空气体。 5.装上玻璃电极，浸入液面并调至视野范围。 6.点击set-up，将增益调为0.5，点Auto，记录电极电阻。
7.封接细胞，若上G，提起或吸破细胞。 8.依次点击on-cell，whole-cell补偿。 9.选定In-out或whole-cell模式进行实验。 10.用毕请关闭仪器，并切断总电源。 三、注意事项： 1.每天做实验前请用清水拖地，以防尘埃、静电伤害机器。 2.拉制仪使用前需预热15-30min。 3.银丝电极及地线发白时，请先用砂纸轻微打磨，再浸入新鲜的次 氯酸钠溶液镀氯化银，如果银丝电极30min未变黑，则考虑更换 次氯酸钠。 4.先开放大器，后开软件；先关软件，后关放大器。 5.非必须用到汞灯时请不要打开汞灯电源，打开后至少需1个小时 才可关闭。 6.在放大器打开时绝对不能用手、金属物品或其它导电的物品接触 电极丝（包括地线），在取放细胞片时请关闭放大器。 7.向玻璃微电极灌注内液时切勿灌太多（1cm左右为适），以防液 体进入银丝底部增加噪声。 8.安装玻璃微电极时，电极应与银丝平行，防止刮蹭银丝电极。 9.玻璃微电极需先用甲醇浸泡，再用酒精灯微烧两端，使其平滑。 10.换液时应时刻观察浴槽，防止液面过低或液体溢出污染镜头，最 适液面为微高于出液口。
膜片钳记录和分析技术 2010-12-15 16:41 来源：美国分子仪器点击次数：2186 关键词：膜片钳细胞信号 分享到： ?收藏夹 ?腾讯微博 ?新浪微博 ?开心网 细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信,是依靠其膜上的离子通道进行的，离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科-电生理学（electrophysiology），即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。 早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。现代膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。 1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术）。以后由于吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal, 109W)方法的确立和几种方法的创建。这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。 一、膜片钳技术发展历史 1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位
的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GW10-100G?的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 二、膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来（见下图），由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。 膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起，同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起，改变了既往各个分野互不联系、互不渗透，阻碍人们全面认识能力的弊端。
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膜片钳技术在药学研究中的应用 前言 德国物理学家Neher和Sakmann[1.2]建立的膜片钳技术（patch clamp technique）是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多数的）离子通道活动的技术，已被广泛应用。作为先进的细胞电生理技术，它一直被奉为研究离子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在，并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。 关键词膜片钳技术；药学研究；应用 Abstract [ ]The patch-clamp technique , a dominant technique in cellular electrophysiology , is always being regarded as the gold standard for ion channel research.. Application of the patch-clamp technique can demonstrate the existences of ion channels and provide valuable information for ion channels, including their electrophysiological properties , molecular structures and the mechanism of drug action .Genomics and proteomics research has showed that the development of drugs for ion channel target would be very promising in future. Key words Patch-clamp technique ; Study on Medicinal chemistry ; Application 80年代初发展起来的膜片钳技术（patch clamp technique）为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段，该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其它生物现象有更进一步的了解，而且基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。为了突破由于筛选技术所造成的对离子通道为靶标的药物开发的瓶颈，近年来，对膜片钳技术进行了改进以适合药物高通量筛选的要求，由此产生了一些技术。 一、膜片钳技术原理及特点
膜片钳常见问题解答（一） 1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？ 答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生 的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流 的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。膜片钳技术钳 制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使 尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使 单通道微弱的电流得以分辨出来。采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一 数值，可记录到单通道电流。从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。 随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，也不仅仅采用 电压钳技术，还常采用电流钳技术。 2.离子通道电导的单位是什么？如何换算？ 答：离子通道电导的单位是西门子（ Siemens, S），旧称姆欧，即安培 /伏特。常用皮西门子（ pS），1pS＝10E-12 S， 1,000 pS＝1 pA/mV。 3. MultiClamp 700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的raw output是否需要连接信号器的 ANALOG IN接口? scaled output，raw output有什么区别? 答：Raw output为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、 放大等）， scaled output为定标输出，输出的信号经过了处理。后者的灵活度大，因此多采用。目前膜片钳放大器多设有scaled output，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的 ANALOG IN连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用 Raw output了。若你想记录两个输出， 则需要将 Raw output与数模转换器的另一个 ANALOG IN连接。 4.在 Clampex 的 Edit protocol/Wave 中，Step和 ramp各有什么适用范围？ 答：Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。而像钠通道，其衰减非常迅速，在持续去 极化的情况下，通道很快失活，无法使用 ramp，另外诸如烟碱受体通道等具有明显失敏特征的受体通道也不宜采用 ramp。 5.什么是 ramp？有什么作用？
膜片钳技术原理与基本操作 1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。 一、膜片钳技术的基本原理 用一个尖端直径在1.5~3.0μm 的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。 基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。 二、操作步骤 1.膜片钳微电极制作 (1) 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在 1.1~1.2mm。内径1mm。 (2) 电极的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成二根，其尖端直径一般在1~5μm，充入电极内液后电极电阻在1~5MΩ为宜。调节第一步和第二步拉制时加热线圈的电流强度，即可得到所需要的电极尖端直径。电极必须保持干净，应现用现拉制。 (3) 涂硅酮树酯：记录单通道电流时，为了克服热噪声、封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容性噪声，需要在电极尖颈部（距离微电极尖端50mm）的表面薄薄地涂一层硅酮树酯（sylgard），它具有疏水性、与玻璃交融密切、非导
膜片钳技术SOP 关键词：膜片钳 目的： 研究膜片上几个甚至一个离子通道的电流，对单个离子通道在各种电位状态及每种电位状态下对产生电流的离子作出定性、定量的分析，来反映细胞膜上离子通道活动，为研究离子通道结构与功能关系提供关于生物电特性的新资料。基本原理： 膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。 通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。 膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。
药品和试剂： 根据不同的实验设计选择不同的药品和试剂。 主要仪器设备与材料： ①屏蔽防震实验台(TMC 63-544) ②数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China） ③微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE Japan） ④微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE Japan） ⑤电子刺激器（SEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan） ⑥膜片钳放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments U.S.A） ⑦倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS Germany） ⑧计算机（PⅢ 800） ⑨A/D、D/A转换器（DIGIDATA-1200 Axon Instruments U.S.A） ⑩pClamp软件（10.0）Axon Instruments U.S.A ) 实验对象： 兔、大鼠、猪、和人的组织细胞（直径小于30μm的细胞），都可用于膜片钳实验。动物由泸州医学院（许可证号：SYXK（川）2008-063）提供；人体组织来源于临床手术丢弃物。本SOP以猪冠状动脉平滑肌细胞为例，选取体重约120～150 Kg的猪，雌雄不拘，猪心脏购自泸州市屠宰场。 实验环境： 常温（22o C）下进行, 湿度（70-80%） 操作步骤： 1.液体配制 主要根据研究通道的不同，所用细胞的不同，配制相应的液体，可参考相应的文献进行调整。包括：电极液；细胞外液等。基本原则是保持2个平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。另外，所有液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。（详见细胞的分离与培养SOP：L Y-XJD-SYJS-014/015） 2.标本制备 膜片钳实验一般是在单个细胞上进行。实验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的细胞，也可来自脑片细胞中的原位细胞。常用的酶是胶原酶和蛋白酶，
产品分析流程图怎么画最简单 导语： 对于产品部门而言，产品流程图拥有非常重要的地位，它可以用于表明一个产品的进展过程，也可以用于协调各部分的工作职能。本文小编就来跟大家一起来探讨一下产品分析流程图究竟要怎么做菜最简单。 免费获取亿图图示软件：https://www.doczj.com/doc/e5723810.html,/edrawmax/ 适合新手的产品流程图软件 新手一般用的什么产品流程图软件呢？亿图图示软件可以了解一下。这是一款支持快捷操作的产品流程图制作工具，极大的降低了专业流程设计的门槛，让大多数人可以在很短的时间里绘制出专业的产品流程图。 软件采用最简单的拖曳式作图方式，无需任何基础也能轻松上手使用，自带近千种模板，上万个符号可以自由使用，即使是绘图小白也能轻松创作出令人眼前一亮的图表。
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然后打开软件，新建一个空白文档，在符号库中找到“水平跨职能图形状”，将一个动态泳道图符号用鼠标“拖”进画布。 PS：点击“设置行数”时会弹出一个小窗口，在这里输入需要的泳道数量即可。 接着就是添加符号，在符号库中选择“基本流程图形状”，然后用鼠标直接拖到泳道中，这里有个小技巧，假如你想快速更换流程图符号样式，可以将鼠标
2008级硕士研究生膜片钳技术试题 请用A4纸书面手写，严禁抄袭。下学期开学后两周内交于先知楼2002室陆巍老师处，过期不侯！ 问答题（共100分） 1、什么是膜片钳技术？它的基本工作原理是什么？ 答：膜片钳技术是以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术，具体说来就是利用微玻管（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）(10-12A)进行监测记录的方法。 膜片箝的基本原理是：用一个尖端光洁、直径约0.5-3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极的另一段开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在小片膜周边与微电极开口的玻璃之间形成紧密封接，在理想状态下电阻可达数十兆欧。实际上把吸附在微电极尖端开口的那小片膜同其余部分的膜在电学上完全分开，如果这小片膜上只含一个或几个通道分子，那么微电极就可以测量出单一开放的离子电流或电导，对离子通道的其他功能进行研究。 2、膜片钳记录方法分为四类？各有何特点？ 答：膜片箝有四种分类： （1）单通道记录法-细胞吸附模式（Cell-attached Mode） 微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电极施加一负压，形成高阻抗封接。此时可看到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，以利于不失真的观察一个通道的活动状态。该方法的优点是对细胞膜结构和调制系统干扰最小，能准确反映通道的活动状态并对此进行客观分析。但缺点是电流小，分辨率地，对技术要求高，难度较大，且工作量大而成功率又较低。 (2)全细胞记录法(Whole-cell recording) 在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。该方法的优点是电流大，信噪比好，既可以做电流钳制又可以做电压钳制，且可以改变细胞内容物。但此法只能用于直径小于3μ的细胞，且仅能观察膜电流的变化，不能分析变化的产生机制。 (3)膜内面向外式（Inside-out） 按照细胞密着式将电极封接好之后，再将电极拉开，使之与胞体脱离即可，也是用以记录封在电极尖端口下的膜片中的离子通道电流。是在细胞吸附式的基础上改进而成。其优点是可以观察化学因素对细胞膜内侧面结构的影响，但其操作难度较高。 (4)膜外面向外（Outside-out）在全息胞记录式的基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上改进而成，优点是可以分别观察化学因素对细胞膜外侧面结构的影响。 3、膜片钳技术的应用范围有哪些？ 答：应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性,同时可发现新的离子通道及亚型,并能在记录单细胞电流和全细胞电流
丁香园膜片钳技术讨论区 资料汇编 整理人：xiaoxuanzi 发起人：tianx775 2006年6月
目录 第一节膜片钳技术介绍 (1) 应用 (1) 基本概念 (2) 第二节仪器操作和维护 (3) 仪器的使用 (3) 噪声 (4) 玻璃微电极的制备 (5) 第三节 实验操作 (7) 1.细胞的分离、培养 (7) (1)心肌细胞 (7) (2)平滑肌细胞 (17) (3)其他细胞 (19) 2.电极的拉制与电镀 (23) 3.电极内外液与渗透压 (25) 4.串联、封接、电极电阻 (28) 5.补偿 (37) 6.刺激方案 (40) 7.动作电位记录 (42) 8.电流记录 (42) (1)钙电流 (42) (2)钾电流 (45) (3)钠电流 (47) (4)其他电流 (48) 9.穿孔 (50) 10.单通道记录 (51) 11.脑片 (54) 12.数据分析与处理 (55) 第四节 相关电子文献及书籍 (61)
第一节 膜片钳技术介绍 一、应用 1.全细胞记录技术的应用 [Cactuswzw]（1）离子通道宏观性质的分析，例如，离子通道的性质和分类(电压门控通道、膜受体激活通道、配体门控通道、胞内第二信使激活通道等) （2）离子通道微观性质分析，例如单一离子通道活动的测定的测定，离子通道的构造，分布和机能的分析等。 （3）膜电容的测量及其对细胞分泌活动的研究。 （4）胞内钙离子浓度和钙通道电流的同时定量检测。 （5）组织切片的全细胞记录。 (6)植物细胞的电生理研究。 二、基本概念 1.刚刚接触patch，有些概念都很模糊 holding potential与command potential？ Axon200B的放大器控制面板上有ext. command，又是什么东东？ 都分别什么时候给予？ 在我理解，pipette capacity compesation就是快电容补偿，而Cm补 偿为慢电容补偿，那为何Axon200B的面板上在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的magnitude以及时间常数的调节 扭？ [baxiansheng]Holding potential 是钳制电压，这是实验中从头至尾 通过电极用于钳制细胞的一个电压，和膜电位的关系取决于采用的实验 模式。而command voltage是在holding potential基础上施加的刺激 方案，比如全细胞实验中可以设置Holding potential在-80mV，然后 去极化至+10mV 400ms，那么这个去极化至+10mV的方波就是command voltage，当然command voltage的设置可以根据实验设置得更复杂。 Axon200B放大器控制面板的ext. command是用于接外接刺激器的，通 过外接刺激器来施加command voltage，当然现在完全由计算机代替了。 pipette capacity是电极电容，因为时间常数小，所以称快电容，而 Cm是膜电容，因为时间常数大，所以称为慢电容。Axon200B的面板上 在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的 magnitude以及时间常数的调节扭，那是对电极电容的补偿方式。实际 上电极电容中也有一些时间常数较大的成分，单纯补偿FAST效果并不 完美，需要再稍稍调节一下SLOW。 2.我的课题是关于心血管系统中离子通道方面的研究。离子通道一般有备 用关闭状态（close），激活状态（active）和失活状态（inavtive）。但 最近我看文献有去激活状态,英文为deactivation,我想跟失活肯定不是 一个概念，但又找不到确切的含义，有谁能帮我解释一下这几种通道状 态个代表什么含义？ [coolworm]C<----->O<------->I
膜片钳常见问题解答
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1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别? 答:电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。膜片钳技术钳制的是“膜片”,是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离，这大大降低了背景噪声,使单通道微弱的电流得以分辨出来。采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值,可记录到单通道电流。从这点上看,膜片钳技术是特殊的电压钳技术。随着膜片钳技术的发展,它已经不仅仅局限于“膜片”的概念,也不仅仅采用电压钳技术, 还常采用电流钳技术。?2．离子通道电导的单位是什么？如何换算? 答：离子通道电导的单位是西门子（Siemens, Ｓ），旧称姆欧，即安培／伏特。常用皮西门子（pS),1pS＝１0E-1２ S, 1，００0 ｐS=1 pＡ/mV。 ３. ＭultiClamp ７00A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的raw output 是否需要连接信号器的AＮALＯG IN 接口? scalｅd oｕtｐut,rａw ｏutput 有什么区别? 答:Raw ｏutput为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理(如滤波、放大等），sｃaled output为定标输出,输出的信号经过了处理。后者的灵活度大,因此多采用。目前膜片钳放大器多设有scalｅd ｏutput,你可将其与数模转换器(你所说的信号器)的ＡＮＡLOG IN连接,这样放大器的输出信号就能传送给计算机了,此时已经没有必要再使用Ｒaw oｕtput了。若你想记录两个输出,则需要将Raw ｏuｔput与数模转换器的另一个AＮALOG IN连接。?4. 在Clａmpex 的Ｅdｉｔ pｒｏｔｏcol/Ｗaｖｅ中,Step和ramp各有什么适用范围??答:Ｒa ｍｐ多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的Ｉ-V曲线制作,如多用于钾、钙离子通道。而像钠通道，其衰减非常迅速,在持续去极化的情况下,通道很快失活,无法使用rａmｐ，另外诸如烟碱受体通道等具有明显失敏特征的受体通道也不宜采用rａmp。?5. 什么是rａmp？有什么作用? 答：与步阶（step)不同，ｒamp在pCｌamp软件中表示施加给细胞的一种逐渐变化的电压或电流,称为“斜坡电压或电流”,可用于作通道I－Ｖ曲线。