PCR方法在蕲蛇中的鉴别实践论文
2020-01-14
近年来，由于大量的捕捉和利用蕲蛇，使蕲蛇药材资源不断减少，造成了药材资源短缺，价格不断上升，市场上随之出现了大量的伪品。因此，对蕲蛇的鉴定已成为保证药材质量的关键。蕲蛇传统的鉴别方法以形态学为主，但从形态学技术方面鉴别需要丰富的经验积累和对蕲蛇的完整性要求较高，并且对不同品系的蕲蛇鉴别存在一定的困难。随着生物学的发展，许多生物学方法也应用于蕲蛇的鉴别，为蕲蛇的鉴别开拓了新的领域。本文就PCR方法对蕲蛇的鉴别应用作一介绍如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验药材
蕲蛇对照品来源于中国食品药品检定研究院(批号：121592-201201)，蕲蛇1(苏州雷允上药业有限公司赠送)，蕲蛇2、赤练蛇、中国水蛇(本所保存，蛇的种类经本所两位专家从形态学确认)。
1.1.2 仪器与试剂
高速低温离心机(Thermo scientificBiofuge primo R)，凝胶成像系统(GEL DocTM XR+BioRAD)，电泳仪(Bio-RAD Power Pac TM Basic)，PCR仪(ABApplied Biosystems)。DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit，吸附柱批号：M1104)，DREAM Taq Green PcrMaster Mix(2×)(Thermo Scientific 公司产品，批号：00108596)，引物合成于上海生工(批号：9301839997 和9301839996)，GelRed (购自BIOTIUM 公司，批号：11G0127)，100bp DNA Ladder(TIANGEN公司产品)。
1.2 方法
1.2.1 模板DNA提取
(1)供试品DNA制备：取剪碎的蛇肉0.5g，置乳钵中，加液氮适量，充分研磨成粉末，取20mg置1.5ml离心管中，按DNA提取试剂使用说明书步骤提取DNA，提取得到的供试品DNA置-20℃保存备用。
(2)对照品DNA制备：取蕲蛇对照品20mg置1.5ml离心管中，按上述方法提取蕲蛇对照品DNA。
1.2.2 PCR反应
鉴别引物：5'GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT'3 和
5'CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC'3。PCR反应体系：在200μl离心管中进行，反应总体积为25μl，DREAM Taq Green Pcr Master Mix12.5μl，20μM的引物各0.75μl，DNA模板1.25μl，去离子水9.75μl。PCR反应参数95℃预变性5min，循环反应30次(95℃30s，63℃45s)，72℃延伸5min。
1.2.3 电泳检测
电泳缓冲液为TAE，胶浓度为1.2%，在融化的琼脂糖中加入核酸胶染色剂GelRed;供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为8μl，DNA分子量标记上样量为6μl，5V/cm，电泳时间约50min。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上检视。
1.3 结果判断
凝胶电泳图谱中，蕲蛇正品在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上(291bp)有单一DNA条带。
2 结果
蕲蛇对照品及蕲蛇正品出现相应的扩增条带，而蕲蛇混淆品(伪品)未出现扩增条带。
3 讨论
目前，蕲蛇鉴别的经典方法为形态学，但需要有丰富的经验，而且市售的蕲蛇药材部分是经过醋炙的蕲蛇段，失去个体的完整性，更利于不法商贩进行制假、掺假，以大量的混淆品来充当正品蕲蛇。由于药材在醋炙过程中外观形态、皮和骨骼等均可发生不同程度的改变，因此给蕲蛇药材性状鉴别带来了较大的困难。本文按《中国药典》的方法，选用了2条不同来源的正品蕲蛇及蕲蛇常见混淆品(中国水蛇、赤练蛇)和蕲蛇对照药材进行了PCR鉴定，结果该方法能够准确鉴别蕲蛇正品和混淆品。本研究显示，用PCR的方法鉴别能够更好地克服传统方法的弊端，对蕲蛇类药材的炮制品在DNA水平上进行准确鉴定。PCR方法鉴别不依赖经验和蛇的完整性，判断结果更加直观、客观、可靠，该法对药材分子鉴别具有快速、准确、易于操作的优点。