实验26 植物细胞膜脂过氧化产物MDA含量的测定
一、目的
植物器官衰老或在逆境下遭受伤害时，往往发生膜脂过氧化作用。膜脂过氧化作用的产物比较复杂，包括一些醛类、烃类等。其产物之一丙二醛(MDA) 从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，改变这些大分子的构型，或使之产生交联反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，研究中常以MDA含量来反映植物膜脂过氧化的水平和对细胞膜的伤害程度。
通过本实验，使学生加深对细胞膜脂过氧化作用的认识，掌握丙二醛测定的原理与技术。
二、原理
丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA－TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的消光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克干重100～300μg·g－1，根据植物样品量和提取液
的体积，加入Fe3＋的终浓度为0．5μmol·L-1。
1．直线回归法
MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的消光度值为零。不同浓度的蔗糖(0～25mmol·L －1)与TBA显色反应产物在450nm的消光度值与532nm和600nm处的消光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的消光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的消光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：Y532＝—0.00198＋0.088D450（8.3－1）
2．双组分分光光度计法
据朗伯一比尔定律：D＝k CL，当液层厚度为1cm时，k＝D／C，k称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等于此混合液在该波长下各显色物质的消光度值之和。
已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40和
7.40。MDA在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0，532nm波长下的比吸收系数为155，根据双组分分光度计法建立方程组，求解方程得计算公式：
C1＝11.71D450 （8.3－2）
C2＝6.45（D532－D600）－0.56D450 （8.3－3）
式中
C1：可溶性糖的浓度(mmol·L－1)；
C2：MDA的浓度(μmol·L－1)；
D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的消光度值。
三、主要仪器设备
紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：l0ml 1支，2m11支；剪刀1把。
四、实验步骤
（一）试剂准备
10％三氯乙酸(TCA)；
0.6％硫代巴比妥酸：先加少量的氢氧化钠(1mol·L－1)溶解，再用10％的三氯乙酸定容；
石英砂。
（二）实验材料
受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。
（三）MDA的提取称取剪碎的试材1g，加入2m110％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆在4000r·min-1离心10min，上清液为样品提取液。
(四)显色反应和测定吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml 0.6％TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下的消光度。
五、结果计算
（一）直线方程法
按公式8.3－1求出样品中糖分在532nm处的消光度值Y532，用实测532nm的消光度值减去600nm非特异吸收的消光度值再减去Y532，其差值为测定样品中MDA-TBA反应产物在532nm 的消光度值。按MDA在532mn处的毫摩尔消光系数为155换算求出提取液中MDA浓度。
（二）双组分分光光度法
按公式8.3－3可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。
用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量：MDA含量(μmol·g-1)=MDA浓度(μmol·L-1)×提取液体积(ml)／植物组织鲜重(g)
六、注意事项
TBA试剂最好现配现用。