微生物的接种、分离纯化与培养方法
一、接种
将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法
在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３）
图３－３接种和分离工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
常用的接种方法有以下几种：
１）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。
８）活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。
２、无菌操作
培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料
（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。
实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。
空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。（图３－４）然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。
图３－４斜面接种时的无菌操作
(1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
二、分离纯化
含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。１、倾注平板法
首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40~50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。（图３－５，a）
图３－５倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解
1.菌悬液
2.熔化的培养基
3.培养物
4.无菌水
２、涂布平板法
首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。（图３－５，b）
３、平板划线法
最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图３－６）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。（图３－７）
４、富集培养法
富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
图３－６平板划线分离法
1.斜线法
2.曲线法
3.方格法
4.放射法
5.四格法
５、厌氧法
在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。
三、培养
微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、ＰＨ等。微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。
１、影响微生物生长的因素
微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到外界许多因素的影响。影响微生物生长的因素很多，简要介绍如下。
1)营养物浓度
细菌的生长率与营养物的浓度有关:μ=μmax*C/(K+C)
营养物浓度与生长率的关系曲线是典型的双曲线。
K值是细菌生长的很基本的特性常数。它的数值很小，表明细菌所需要的营养浓度非常之低，所以在自然界中，它们到处生长。然而营养太低时，细菌生长就会遇到困难，甚至还会死亡。这是因为除了生长需要能量以外，细菌还需要能量来维持它的生存。这种能量称为维持能。另一方面，随着营养物浓度的增加，生长率愈接近最大值。
２）温度
在一定的温度范围内，每种微生物都有自已的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。微生物只有处于最适生长温度时，生长速度才最快，代时最短。超过最低生长温度，微生物不会生长，温度太低，甚至会死亡。超过最高生长温度，微生物也要停止生长，温度过高。也会死亡。一般情况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的。但也常受其它环境条件的影响而发生变化。
根据微生物最适生长温度的不同，可将它们分为三个类型：
a.嗜冷微生物：其是适生长温度多数在-10℃－20℃之间
b.中温微生物：其最适生长温度一般在20℃－45℃之间
c.嗜热微生物：生长温度在45℃以上。
３）水分
水分是微生物进行生长的必要条件。芽孢、孢子萌发，首先需要水分。微生物是不能脱离水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生长，而不能生活在纯水中。各种微生物在不能生长发育的水分活性范围内，均具有狭小的适当的水分活性区域。
４）氧气
按照微生物对氧气的需要情况，可将它们分为以下五个类型。
a.需氧微生物
这类微生物需要氧气供呼吸之用。没有氧气，便不能生长，但是高浓度的氧气对需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧气浓度大于大气中氧气浓度的条件下生长。绝大多数微生物都属于这个类型。
b.兼性需氧微生物
这类微生物在有氧气存在或无氧气存在情况下，都能生长，只不过所进行的代谢途径不同罢了。在无氧气存在的条件下，它进行发酵作用，例如酵母菌的无氧乙醇发酵。
c.微量需氧微生物
这类菌是需要氧气的，但只在0.2大气压下生长最好。这可能是由一它们含有在强氧化条件下失活的酶，因而只有在低压下作用。
d.耐氧微生物
这类微生物在生长过程中，不需要氧气，但也不怕氧气存在，不会被氧气所杀死。
c.厌氧微生物
这类微生物在生长过程中，不需要分子氧。分子氧存在对它们生长产生毒害，不是被抑制，就是被杀死。
２、培养方法
1）根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。
好氧培养：也称“好气培养”。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。
厌氧培养：也称“厌气培养”。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。一般可采用下列几种方法：
a.降低培养基中的氧化还原电位：常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养基中，便可达到目的。有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。
b.化合去氧：这也有很多方法，主要有：用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。
c.隔绝阻氧：深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。
d.替代驱氧用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混和气体驱代氧气。
２）根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类。
固质培养：是将菌种接至疏松而富有营养的固体培养基中，在合适的条件下进行微生物培养的方法。
液体培养：在实验中，通过液体培养可以使微生物迅速繁殖，获得大量的培养物，在一定条件下，还是微生物选择增菌的有效方法。
实验六微生物的接种、分离和培养 一、目的要求 1．理解和掌握微生物接种、分离基本技术的原理及操作要领。 2．熟悉微生物接种、分离的无菌操作过程。 3．了解微生物需氧培养的方法。 4．学会观察和描述微生物的各种培养性状。 二、实验原理 1. 微生物接种 指将微生物纯种或含菌材料转移到另一营养基质上的过程。根据不同的目的可采用的不同的接种方法，如平板划线法、斜面划线法、浸洗法、涂布法、倾注法、穿刺法、点植法和影印法。 2. 微生物分离 指依据微生物的特征，采用各种方法从含菌样品中获得由单一个体（如单一菌体或孢子）或一段菌丝生长繁殖形成的微生物群体的过程。常用的分离方法有：平板划线法、稀释涂布平板分离法、稀释倾注平板分离法和单细胞分离法。 平板分离法的基本原理包括两个方面： （1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入 某 种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 （2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。 因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。 值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。 3. 微生物培养 指微生物被接种到营养基质后，在一定条件下生长繁殖的过程，分需氧培养法和厌氧培养法。本实验所做的需氧培养法，是采用生化培养箱和恒温摇床进行的。 4. 微生物的培养形状 培养性状是微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。平板菌落特征、斜面和液体培养特征、半固体穿刺培养特征等培养性状，是鉴定微生物的重要形态学依据。 菌落是由单个或少数细胞在固体培养基表面或里面生长繁殖所形成的眼可见的子细胞群体。菌落形态会因菌种不同或菌种相同但所用培养基、培养温度和时间等条件不同而存在
重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书 实验课程名称： 实验指导教师： 学院： 专业及类别： 学号： 姓名： 实验日期： 成绩： 重庆大学研究生院制
一、实验目的 1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法； 2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术；； 3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能； 4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。 二、实验原理 1、培养基的种类 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基；根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。 已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。 培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。 2、接种方法与无菌接种 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。 划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
病原物的分离与培养 病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤: 1.有关器皿的灭菌和消毒； 2.制作培养基； 3.病原菌的分离 4.病原菌的培养。 －、灭菌与消毒 灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。 (一) 热力灭菌 热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。 1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。 干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。 进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；
实验三微生物分离纯化技术 一、目的要求 掌握浇注平板法、平板涂抹法和平板划线法分离微生物的基本原理和具体操作 二、实验材料 1、菌种 2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 3、试剂和仪器：无菌水、无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、水浴锅 2人一组，每人分别用三种方法操作三个培养皿 三、实验原理 平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 浇注平板法和涂布平板法是两种最常用的菌种分离纯化方法，它们不仅可用于分离纯化，还可用于计数等。浇注平板法是将待分离的试样用生理盐水等稀释液作梯度系列稀释后，取其中一合适稀释度的少量菌悬液加至无菌培养皿中，立即倒入融化的固体培养基，经充分混匀后，置室温下培养。最后可从其表面和内层出现的许多单菌落中选取典型代表，将其转移至斜面培养后保存，此即为初步分离的纯种。 涂布平板法是指取少量梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌的涂布棒把菌液均匀地徒步在装个平板表面，经培养后，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移接至斜面，经培养后保存。 四、实验过程 （1）稀释平板法 A 每组取培养皿2只，即每个同学做1只。先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 B 另取一吸管，以无菌操作法吸取10-3或10-4稀释液0.2mL，加在无菌培养皿的一边； C 取已熔化的在水浴锅中保温45－50 ℃左右的培养基，分别倒入上述培养皿中（见图－2），轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于37 ℃恒温培养。 （2）平板涂抹法 A 每组取无菌培养皿2只（每个同学做1只）。在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释
微生物的分离和纯培养技术 一、培养基 1、培养基的概念：人们按照______________对营养物质不同的_______，配制出供其生长繁殖的________________叫培养基。根据其物理状态，一般分为_______________________和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂_____________后，就能制成__________________ 2、培养基的营养成分：各种培养基的配方不同，但一般都含有__ 、、、和______等最基本的生命物质。在此基础上还要满足微生物生长对_________、特殊营养物质以及_________的要求。 二、无菌技术 1、消毒方法：___________________、__________________、化学药剂消毒法 2、灭菌方法：___________灭菌、_______________灭菌、___________________灭菌 【思考】无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 【思考】请选用合适的方法为下列材料或用具进行消毒或灭菌 （1）培养细菌用的培养基与培养皿。___________（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管。__________ （3）实验操作者的双手。___________ 三、分离和纯培养大肠杆菌的实验操作 1、制备培养大肠杆菌的培养基：即牛肉膏蛋白胨固体培养基，一般步聚：计算、_______、_______、_______、倒平板。 2、接种和纯化大肠杆菌 ①平板划线法：是通过______________在琼脂固体培养基表面划线的操作，将聚集的菌种___________________到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由_____个大肠杆菌繁殖而来的肉眼可见的菌落 ②稀释涂布平板法：是将菌液进行_______________________稀释，再将不同稀释度的菌液_____________涂布到琼脂________培养基的表面进行培养。在涂布稀释度_____________的培养基表面上可获得单个菌落。 课题延伸：对于频繁使用的菌种我们可以采用_______________的方法，但这种方法保存的时间不长，菌种易被污染或产生变异，需长期保存的菌种可采用___________________的方法放在___________℃的冷冻箱中保存。 【讨论】1、平板划线时，为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物； 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的未端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环
微生物的培养方法 实验目的：学习掌握无菌操作技术；学习接种方法；学习常用的分离、纯化菌种的方法。 一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 在实验室用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图1） 图1 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。 ７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。 ８）活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。 ２、无菌操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。 实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。 空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。（图2）然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。
实验微生物的分离、接种和培养技术 一、目的要求 1、了解微生物分离和纯化的原理，掌握常用的分离纯化微生物的方法 2、学习掌握微生物的接种技术，建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节。 二、实验原理 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。 三、实验器材 培养基：营养琼脂培养基，伊红美蓝培养基 器皿：培养皿，接种环，酒精灯，玻璃涂棒，显微镜 四、操作方法 1、倒平板：将已经制备好的营养琼脂培养基加热溶化待冷至55～60℃时倒入灭过菌的培养皿中。 2、涂布：在上述培养基中用无菌吸管吸取湖水的稀释液0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置，用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。 3、培养：上述培养基平板倒置于37℃温室中培养24h。 4、伊红美蓝培养基准备：在已经制备好的伊红美蓝培养基中加入乳糖，加热溶化琼脂，冷却至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板； 5、分离：将培养后长出的单个菌落挑取少许细胞，用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌
微生物的实验室培养——自酿葡萄酒中酵母菌的分离与纯化 一、实验目的：掌握无菌技术的操作，尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤 （1）制备培养基（马铃薯琼脂培养基）：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（已完成） （2）分离纯化 实验 步骤 操作流程流程叙述操作目的、作用 接种方法一：点燃酒精灯 ↓ 1.灼烧接种 环并冷却 ↓ 2.沾取菌液 ↓ 3.平板划线 ↓ 4.转动培养 皿约70°角 ↓ 5.灼烧并冷 却接种环 ↓ 6.平板划线 ↓ 7．倒置培养 用火柴点燃酒精灯，保证实验操作在酒精 灯火焰进行 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红， 让接种环自然冷却 打开装有菌液的试管，塞子要拿在手上， 将试管口通过火焰灭菌，将冷却的接种环 伸入菌液中，沾取菌液。将试管口通过火 焰灭菌，用塞子塞住试管 左手将皿盖打开一条缝隙；右手把沾有菌 种的接种环迅速伸入平板内，划3到5条 平行线（不要划破培养基），盖上培养皿盖 逆时针旋转培养皿约70°角 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红让接 种环自然冷却 从第一区域划线的末端开始往第二区域划 线，重复以上操作，在三、四、五区域划 线，注意不要将最后一区的划线与 相连。（也可以用连续划“Z”字形线的方 法 倒置培养皿，放入培养箱中培养 避免周围环境中微生物的 污染 清除； 防止杀死菌种 防止塞子被污染； 清除的杂菌 接种到培养基表面 调整角度，准备第二区域 的划线 在琼脂固体培养基表面连 续划线的操作，将聚集的 菌种逐步稀释分散到培养 基的表面 减少培养基内的水分蒸 发，使培养基保持湿润； 防止水珠回流打散菌落 在右图所示 的培养皿内 用笔模拟接 种环画出两 种平板划线 法的划线轨 迹 接种 方法 二： 1.系列稀 释操作 准备六只试管 ↓ 分别加入4.5mL蒸馏水并灭菌，编号 ↓ 取 mL菌液放入第1支试管并混匀 ↓ 从第1支试管取0.5ml菌液放入第2只试管并 混匀 ↓ 重复步骤，直至最后一支试管 2.涂布平 板操作 滴加100μL菌液到培养基表面 ↓ 引燃涂布器，待酒精燃尽后，冷却8～10s ↓ 把培养皿打开一条缝 ↓ 在培养皿盖内侧进一步冷却涂布器，均匀涂布 菌液，转动培养皿，涂匀 ↓ 盖上皿盖,放置10min ↓ 倒置培养皿，放入培养箱中培养 清除涂布器上的杂菌 使菌液均匀分布在培 养基表面 使液体被充分吸收 结果 观察 观察划线平板和涂布平板上的菌落形态、颜 色、大小，可挑取少量菌落制成临时装片，显 微镜下观察。 对菌落进行初步鉴定 1
微生物的分离与培养知识小结与专题训练 一、微生物的培养和分离技术 1.微生物生长需要的营养物质一般都含有水、碳源、氮源、无机盐 牛肉膏又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。 蛋白胨，是有机化合物。蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。在胃内蛋白质的初步消化产物之一就是蛋白胨。蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。能为微生物提供C源、N源、生长因子等营养物质。 对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。 2.培养基的制作合格与否通过未接种的培养基表面是否有菌落生长来验证 3.常用的无菌技术有 ⑴对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 ⑵将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 ⑶为避免周围环境中的微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 ⑷实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 考点细化： ①灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。消毒是指用较为温和的理化方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物，不包括芽孢、孢子。 ②灭菌的方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌，灼烧灭菌用于接种用的金属工具；干热灭菌用于能耐高温的，需要保持干燥的玻璃器皿等；高压蒸汽灭菌用于培养基等 ③消毒的方法有煮沸消毒法，用于液体消毒；巴氏消毒法，用于不耐高温的液体；化学药剂（如用体积分数70%-75%的酒精）或紫外线消毒，用于物体表面的消毒。 4.微生物的纯培养指的是防止外来杂菌入侵。 5.配制固体培养基的步骤：计算、称量、溶化、（调节pH、分装、包扎）灭菌、倒平板 6.微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是纯化的菌落。 ★平板划线法中的注意事项 ①操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：
微生物的接种、分离纯化与培养方法 实验目的：学习掌握无菌操作技术；学习接种方法；学习常用的分离、纯化菌种的方法。实验内容： 一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。１、接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３） 图３－３接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45° C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
一、实验目的：掌握无菌技术的操作，尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤 （1）制备培养基（马铃薯琼脂培养基）：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（已完成） （
三.巩固检测 1．获得纯净培养物的关键是( ) A．在无菌环境中培养B．接种纯种细菌 C．接种环灼烧灭菌D．防止外来杂菌的污染 2．巴氏消毒法常用于酒、奶等食品的消毒，该消毒法就是加热到70～75 ℃、保持30 min，或加热到80 ℃、保持15 min，能杀死一般杂菌和病原菌。这与灭菌的要求相比，巴氏消毒法( ) A．不能杀灭芽孢和孢子B．只能杀灭芽孢等休眠状态的细菌 C．能杀灭各种细菌，包括芽孢D．能杀灭各种真菌，包括孢子 3．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部分的微生物（） A．接种环、手、培养基 B. 高压锅、手、接种针 C. 培养基、手、接种环 D. 接种环、手、高压锅 4.下列操作与消毒或灭菌无关的是（） A. 接种前用酒精灯火焰灼烧接种环 B. 接种前用酒精擦试双手 C. 接种在酒精灯水焰旁完成 D. 培养基在冷却到50℃ 时倒平板 5．制备固体培养基的步骤是( ) A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌 B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板 D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板 6.平板冷却凝固后要将平板倒置，其意义是（） A. 防止菌种死亡B．利于培养基的冷却 C．利于大肠杆菌的接种D．防止皿盖上的冷却水倒流入培养基 7．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱培养的目的是（）A．为了检测温度是否最适宜B．检查培养基是否灭菌彻底 C．为了下次接种时再使用D．没必要放入未接种的培养基 8. 下列关于平板划线操作的叙述正确的是（） A．使用已灭菌的接种针、培养皿，在操作过程中不再灭菌 B．打开含菌种的试管，需通过火焰灭菌，取出菌种后，需马上塞上棉塞10. 稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是（） A．操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释 B．需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面 C．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落 D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理 11. 下列关于平板划线法和稀释涂布平板法纯化大肠杆菌的叙述，正确的是（） ①可以获得单个的菌落②都需要使用接种环进行接种 ③都需要在火焰旁进行接种④都可以用来计数活菌． A．①② B. ③④ C.①③ D. ②④ 12. 下列有关实验室中微生物培养和分离的叙述，错误的是（） A. 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵 B. 高温灭菌的目的是杀死所有微生物 C. 划线分离可在培养基上获得均匀分布的单菌落 D. 稀释涂布平板法可用于计数活菌数目 13. 平板划线法：通过在琼脂固体培养基表面的操作，将聚集的菌种逐步 到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是。 14. 稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的，然后将不同稀释度的菌液分别 在琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成。 15．大肠杆菌是生存在人体肠道中的正常菌群，每克粪便中含有109 个，且能够与致病菌混杂生长。如果食品和饮用水中出现大肠杆菌，就意味着食物可能被粪便污染而带上致病菌，因而常将大肠杆菌的数量作为食品卫生的检测指标之一。请据此回答下列问题： （1）测定街边出售的奶茶中大肠杆菌的数目，常用稀释涂布平板法进行测定。 该方法首先配置LB 培养基，进行高压蒸汽灭菌后冷却至60℃，在 旁倒在培养皿中形成平板；对奶茶样品进行一定倍数的稀释，取0.1mL 奶茶稀释液，加在培养皿的固体培养基上，用涂布在培养基平面上，然后进行培养；观察统计培养皿中的数目；该数据比实际数值要(高、低)，原因是 C．将培养皿盖全部打开后，用沾有菌液的接种环进行划线接种 D. 接种时，接种环在培养基上迅速划线后盖上皿盖 9. 在农业生产研究上，常需要进行微生物的培养和计数，下图是利用平板划线法进行微生物接种过程中的部分操作，有关叙述不正确的是（） A．每次划线前都需要灼烧接种环 B．接种环冷却后从上一区划线的末端开始划线 C．最后一区和第一区要保证不重叠 D．只有在图中的5 区域才可以得到所需菌落 。实验完成后需要对培养基进行处理，然后才能倒掉。（2）若要对上述培养基中的菌种进行扩大培养，则需配置LB 培养基，灭菌后，将在酒精灯火焰上烧红后冷却，然后蘸取单菌落中的菌体接种到新的培养基中，在适宜环境中培养。
微生物的接种、分离纯化与培养方法 一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３） 图３－３接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。 ７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。 ８）活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。 ２、无菌操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料
课题1 微生物的分离和纯培养 教材内容解读 要点1 培养基 （1）培养基按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。 （2）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种营养物质。满足微生物生长还需要适宜的pH、氧气的要求（根据微生物的需求提供有氧或无氧环境）、特殊营养物质等。 碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、蛋白质、脂肪等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。 氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+、蛋白质、氨基酸等。只有固氮微生物才能利用N2。 要点2 无菌技术 （1）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面： ①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。 ③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 ④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 （2）消毒与灭菌的区别 消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、红外线消毒。 灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。 要点3 制作牛肉膏蛋白胨固体培养基 （1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。 （2）倒平板操作的步骤： ①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。 ②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。 ③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。 ④等待平板冷却凝固，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。 要点4 纯化大肠杆菌 （1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。 （2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。 （3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。 （4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。 （5）平板划线法操作步骤： ①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。 ②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。
(一)常用的微生物分离纯化方法 菌种分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备,分离纯化效果好,现分别简述如下 1.稀释混合倒平板法 平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中,冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。该法是先将待分离的含菌样品,用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法,稀释倍数要适当),然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中,倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基,迅速旋摇,充分混匀。待琼脂凝固后,即成为可能含菌的琼脂平板。 于恒温箱中倒置培养一定时间后,在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。
挑取单一个菌落,一般再重复该法1-2次,结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。 图4混合倒平板操作法示意图图5涂布平板操作法示意图 2.稀释涂布平板法 采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固,不能充分混匀。
在微生物学研究中,更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基,先倒入无菌培养皿中,制成无菌平板。待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面,再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面,倒置温箱培养后挑取单个菌落。 另一种简单快速有效的涂布平板法,可省去含菌样品悬液的稀释,直接吸取经振荡分散的样品悬浮液l滴加入1号琼脂平板上,用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布,用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平板数视样品浓度而定),翻转此涂棒再涂布5号、6号平板,经适温倒置培养后挑取单个菌落。该法可称之为玻璃涂棒连续涂布分离法。 3.平板划线分离法 先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来。经培养后,可在平板表面形成分散的单
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A. B. C. D.甲、乙、丙都是异养微生物 甲、乙都是自养微生物，丙是异养微生物 甲是固氮微生物、乙是自养微生物、丙是异养微生物甲是异养微生物，乙是固氮微生物、丙是自养微生物Ⅰ Ⅱ Ⅲ （1分）A. B. C. D.下列有关平板划线接种法的操作不正确的是（） 将接种环放在火焰上灼烧 将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环液 蘸取菌液和划线要在火焰旁进行 划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连5 （1分）A. B. C. D.稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是（） 操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释 需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面 不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落 操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理6 （1分） A. B. C. D.分离纯化大肠杆菌最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。下列有关这两种方法 的叙述错误的是（） 均将大肠杆菌接种在固体培养基的表面 获得的每个菌落均是由一个细菌繁殖而来的子细胞群 都应在火焰附近进行操作，以防止杂菌污染 稀释分散的菌种的原理不同，均能达到分离纯化大肠杆菌的目的7
（1分）A.液体培养基、菌落由一个细菌形成 B.液体培养基、菌落由多个细菌形成 C.固体培养基、菌落由一个细菌形成 D.固体培养基、菌落由多个细菌形成利用稀释平板法进行菌落计数时，使用的培养基种类应该是什么？该方法能够计数培养 液中细菌总数的原因是（ ） 8（1分）A.杀死所有微生物的细胞、芽孢和孢子 B.杀死所有的微生物细胞 C.杀死所有的病原微生物 D.使病原菌不生长 灭菌的标准是（ ） 9（1分）A.B.C.D.在接种细菌的过程中，不正确的操作是（ ） 操作台及手要消毒 取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌 将灼烧灭菌后的接种环立即伸入试管内挑取菌种，避免污染 接种后还要将管口灭菌加塞 10（1分）A.B.C.D.关于高压蒸气灭菌的表述，不正确的是（ ） 可用于培养基和培养器械的灭菌 只能杀死微生物的营养体，而不能杀死芽孢等休眠体 高压导致高温使微生物蛋白质凝固变性，达到灭菌目的 髙压蒸气灭菌后，加入了琼脂的固体培养基为液态，可用于制备平板 11（1分）A.①②③④ B.①③②④ C.①②④③ D.①④②③若要通过稀释涂布平板法分离纯化土壤中的微生物，其正确操作步骤是（ ） ①土壤取样 ②称取 土壤加入盛有无菌水的锥形瓶中，制备土壤稀释液③吸取土壤稀释液进行平板涂布 ④依次将土壤稀释液稀释至浓度为、、、、的溶液 12
南昌大学实验报告 学生姓名：学号：专业班级： 实验类型：√验证□综合□设计□创新实验日期：实验成绩： 实验八细菌纯种分离、培养和接种技术 一、实验目的： 1、学习从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离、培养微生物，掌握一些常用的分离和纯化微生物的方法； 2、学会几种接种技术。 二、实验基本原理： 自然界中的微生物总是杂居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物。要研究其中的某一种微生物，首先必须将它分离出来。 受污染的土壤或水体中，微生物的数量和污染物的降解之间存在着显著的关系.为了提高污染物降解速率,常需接种一些能降解目标污染物的高效菌。从经过富集、驯化培养的样品中筛选目标菌株，往往是获得高效降解菌的有效方法。 根据目标微生物特定的营养要求，设计相应的选择培养基。是快速高效获得目标菌的关键步骤。 土壤是微生物生活的大本营，有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化的到许多有价值的菌株，事实上，生产、工程上很多有益菌株都是从土壤中分离得到的。 从复杂的微生物群体中获得只含有一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。微生物纯种分类的方法有很多，常用的方法有两类一类是单细胞挑取法，采用这种方法能获得微生物的克隆纯种，但对仪器条件要求较高，一般实验室不能进行。另一类是单菌落分离（平板分离法），该方法简便是微生物学实验中常采用的的方法。通过形成单菌落获得纯种的方法有平板划线法、平板浇注（稀释混合平板法）、平板表面涂布法。 此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。其原理包括两方面：