微生物实验
微生物实验
细菌形态观察
细菌分布
消毒灭菌
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细菌形态观察
一、实验目的
1.掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护
掌握细菌的三种形态 2.
掌握临床常见细菌的形态及染色 3.
掌握细菌的特殊结构 4.了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点5.二、实验原理
普通光学显微镜（油镜）的使用1.
1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头
2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰
3. 根据需要调节显微镜亮度
2. 普通光学显微镜的维护
1.移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前
2.油镜用毕后，要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头
3.镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内
4.做好使用记录
3．微生物知识
1．细菌按形态分类：
球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等）
杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等）
螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等）
2．细菌的基本结构
细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体
3．细菌的特殊结构
荚膜：如肺炎双球菌
鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。如：变形杆菌为周毛菌
菌毛
芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌
4．微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。
原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体
真核类：真菌、原生动物、显微藻类
非细胞类：病毒、亚病毒
5．真菌
单细胞：圆形、芽生孢子。如：酵母菌
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多细胞：菌丝及孢子、孢子出芽。如：霉菌
6．白假私酵母菌（白念）
生物学性状：G+单细胞真菌、芽生孢子、类酵母型菌落
厚膜孢子、假菌丝有助于鉴定
致病性：皮肤粘膜——鹅口疮、内脏感染、CNS感染
微生物学检查：直接涂片、染色后镜检——菌体、芽生孢子、假菌丝
7．新型隐球菌
生物学性状：圆形酵母型菌、外周有厚荚膜（比菌体大1-3倍）
致病性：吸入后侵犯皮肤、粘膜等——慢性炎症和脓肿；侵袭CNS——亚急性或慢性脑膜炎
微生物学检查：脑脊液离心后取沉淀、痰和脓标本直接检查；墨汁负染见出芽菌体外围有宽厚荚膜为阳性
三、实验材料
记号笔：1支；大镊子：1支；火柴：1盒；蜡笔：1支；试管架：1个；酒精灯：1个；接种环：1支；Olympus显微镜：1台；显微镜使用记录本：1个
四、实验内容
1. 观察细菌三种形态
1）球菌
链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌（子弹形）、脑膜炎双球菌（蚕豆形）、四联菌
2）杆菌
破伤风杆菌、白喉杆菌（异染颗粒）、绿脓杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌
3）螺形菌
弧菌——霍乱弧菌；螺菌；螺杆菌——幽门螺杆菌；弯曲菌
2. 观察细菌的特殊结构
芽胞、鞭毛、荚膜、异染颗粒、钩端螺旋体、幽门螺杆菌
3. 绘图
葡萄球菌(staphyloccocus)；肺炎双球菌(pneumo coccus)；脑膜炎球菌(meningococcus)；破伤风杆菌（Clostridium Tantenus）；霍乱弧菌（vibrio cholera)；芽胞(spore)；鞭毛（flagellum)；荚膜(capsule)；钩端螺旋体(leptospira)
五、实验结果
绘8幅细菌镜下图，已交。
六、思考与讨论
1．显微镜高倍镜使用时看不清楚的常见原因
（1）未滴加镜油
（2）镜头不干净
（3）标本放置反了，所以达不到对焦平面
制片问题：标本太厚、染色误差等）4（．
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细菌分布
一、实验目的
1. 掌握固体培养基的制备
2. 掌握机体常见部位及环境中的细菌采样、培养、及初步鉴定
3. 掌握革兰氏染色方法及结果判定
二、实验原理
1. 培养基：
1．细菌生长所需营养物质：水、碳源、氮源、无机物和生长因子
2．培养基分类：
（1）根据营养物质：营养培养基、选择培养基、鉴别培养基
（2）根据物理性质：液体培养基、固体培养基和半固体培养基
3．细菌在培养基中的生长状况：表面生长、均匀浑浊生长、沉淀生长
2. 革兰氏染色：
革兰阳性细菌细胞壁的肽聚糖(peptidoglycan)层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，通道弯曲，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后孔径仍可使结晶紫与碘的复合物通过，因而将染料洗去而被脱色。
三、实验材料
咽拭子、羊血培养皿：1套/人；大号普通培养皿：1块/2人；载玻片：1片/人；A、B菌：6套
/桌；NS：1份/人；滤纸：1张/人；消毒液：4套/桌；三角瓶、电天平、营养琼脂、称药纸、称药勺、量筒：1套/桌
四、实验内容
1. 培养基制备
1）按产品要求称取营养琼脂
2）每实验桌制备200ml
3）高压蒸汽灭菌后，在洁净工作台内倒平皿
4）所制备的普通平皿用于空气培养
2. 机体不同部位的细菌采样、培养
1）咽部正常菌群的采样、培养
咽拭子擦拭咽部，平行划线法接种于羊血平皿。
2）手指消毒前后细菌的采样培养
未消毒手指平行划线法接种于普通平皿；同一手指碘酒、酒精消毒后平行划线法接种于普通平皿。
3. 环境中细菌采样培养
1）空气培养
将培养皿打开暴露于空气中，20分钟后盖好平皿盖儿
）流通纸币（或硬币）的细菌采样培养2．
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将硬币正反面分别在培养基上充分接触
3）采样结束后，将培养皿底部朝上放入铁丝筐，统一置培养箱：37℃18-24小时
4. A、B、C菌鉴定（革兰氏染色法）
1）. 细菌涂片制备程序：
（1）取一干净玻片，火焰上方缓缓通过三次去油
（2）蜡笔画线将玻片分割为A、B、C三区域
（3）接种环取生理盐水分别滴入A、B两区域各一滴
（4）分别取少许A、B 、C菌，与生理盐水充分混匀成菌液，风干后形成菌膜
（5）固定（火焰上方缓缓通过三次）
（6）革兰氏染色
（7）滤纸吸干水分，油镜观察
2）. 革兰氏染色：
（1）细菌涂片、火焰固定
（2）结晶紫初染1min
（3）卢戈氏碘液媒染1min
（4）95%乙醇脱色30-40s
（5）沙黄复染1min
五、实验结果
A：G+，球菌，推测为金黄色葡萄球菌；
B：G-，短杆菌，推测为大肠杆菌；
六、思考与讨论
1．影响革兰氏染色的因素：
（1）细菌本身因素：
菌龄：如果菌龄太大，可能出现假阴性
（2）操作因素
涂片：取菌应适量，涂片要均匀，如果某个部分菌层太厚，可能在脱色时达不到，会导致局部假阳性
固定：固定温度太高或时间太长都会导致细菌结构破坏而出现假阴性；但是固定不够，细菌会在水洗时被冲掉
初染：初染时间虽然说是1分钟，但是可以适当延长，时间太短会出现假阴性；染色滴加不均匀可能出现半阴半阳
媒染：和初染一样
脱色：脱色时间不能过长，基本上用酒精滴过之后马上水冲就可以了，否则容易出现假阴性
复染：复染时间需足够长，否则可能会染不上
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消毒灭菌
一、实验目的
1. 了解实验室常用消毒灭菌方法及其原理
2. 掌握实验中所用仪器的使用方法
3. 掌握机体常见部位及环境中的细菌培养物的初步鉴定
4. 强化革兰氏染色技能
二、实验原理
1．口咽部及皮肤正常菌群
鼻咽部及扁桃体：葡萄球菌、类白喉杆菌、肺链、溶血及非溶血性链球菌、奈瑟菌等
口腔：链球菌多见、放线菌、螺旋体、G-杆菌等
皮肤：表皮葡萄球菌、丙酸杆菌、类白喉杆菌、铜绿假单胞菌
2．溶血类型
α溶血：现象：草绿色溶血环
常见菌种：机会致病菌（甲链、肺链）
原理：细菌产生过氧化氢将血红蛋白氧化成深绿色的高铁血红蛋白
β溶血：现象：透明溶血环
常见菌种：致病菌（乙链)
原理：细菌释放溶血素使红细胞破裂，血红蛋白释放
三、实验材料
咽拭子培养物：1套/人；空气、纸币、手指消毒前后培养物：1套/2；载玻片：1片/人；NS：1支/人；滤纸：1张/人
四、实验内容
1. 常用消毒灭菌方法：（示教讲解）
1）．热力灭菌：
（1）干热灭菌法：焚化、烧灼、干烤（160 ℃，2小时）
（2）湿热灭菌法：煮沸（2%NaCO，105 ℃）；高压蒸汽灭菌（103.4kPa，20分钟，32121℃，临床运用最广的灭菌方法）
2）. 紫外线（Ultraviolet radiation)：
波长265nm-266nm(DNA吸收光谱）杀菌能力最强。紫外光穿透力差，一般只用于不耐热物品表面的消毒。
3）. 过滤(filtration)
用物理阻流的方法除去液体或空气中的细菌，用于不耐热物质的灭菌（血清、毒素、抗生素等）滤菌器：薄膜滤菌器、玻璃滤菌器、石棉滤菌器、素陶瓷滤菌器
4）. 低温
保存菌种（冷冻真空干燥法）．
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）．实验室常用化学消毒剂：6 乙醇70-75% 洁净台消毒：来苏水擦拭防腐剂：三氯甲烷、硫柳汞、叠氮钠细菌分布结果鉴定2．）观察菌落1 ）取部分菌落的细菌进行革兰氏染色并观
察2五、实验结果
1. 咽部正常菌群的采样、培养结果：
在羊血培养皿上出现四种菌落：
（1）数目多，划线沿线都有；针尖大小；无色、光滑、湿润、透明、圆形。周围出现草绿色溶血环，发生了不完全溶血即α溶血。
（2）数目较多，划线沿线都有；较小；乳白色、光滑、湿润、半透明、圆形。
（3）少，只出现在四个点；中型；乳黄色、光滑、半湿润、不透明、形状不规则。在此种菌落
下方的培养基出现了透明溶血环，发生了完全溶血即β溶血。
（4）1个菌落；较大；乳白色、光滑、湿润、半透明、圆形。粘稠。
取（1）、（2）、（3）进行革兰氏染色，结果如下;
（1）G+，链球菌，根据不完全溶血推断，为甲型链球菌。
（2）G-，球菌，细胞个体小，形状像金黄色葡萄球菌，但是染色为阴性。
（3）G-，球菌。
2. 手指消毒前后细菌的采样培养结果：
1）消毒前：
仅出现2个菌落，较小；乳白色、光滑、湿润、有光泽、圆形。
革兰氏染色结果：G-，杆菌
2）消毒后：无菌落出现。
3. 硬币正反面的细菌采样培养结果：
1）正面
三种菌落：
（1）13个菌落；较小；乳白色、光滑、湿润、有光泽、圆形。和手指消毒前的菌落一样。（2）1个菌落；较大；白色、光滑、湿润、近似圆形。
（3）5个菌落；较大；中央乳黄色边缘颜色变浅、光滑、湿润、中间凸、不规则、边缘光滑）进行革兰氏染色，结果如下：3（、）2取其中（．
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（2）G-，杆菌。和手指消毒前的细菌一样
（3）G-，链杆菌。形态较大，形状像炭疽芽胞杆菌，但是没有芽孢且染色为阴性。
2）反面
两种菌落：
（1）2个；较大，乳白色、光滑、湿润、有光泽、圆形。
（2）多个，沿硬币边缘线连成一片；针尖大小、无色、光滑、湿润、透明。
4. 空气培养结果
平皿敞开在实验室的窗台上放置了约20分钟，当时阳光照在上面：
平皿出现了五种菌落：
（1）11个；中等大小；白色、光滑、湿润、半透明、圆形
（2）2个；较大；周围白色，中间有一个透明圈，光滑、湿润、中间凹的圆饼状
（3）1个；较大；周围黄色，中间有一个透明的圆形区域，半湿润、没有光泽
（4）1个；较大；边缘橘黄色，中央偏白、明显凸起、干燥、形状不规则
（5）1个；较大；边缘透明，中央乳黄色，光滑、湿润、半透明、圆形
取其中（3）、（4）进行革兰氏染色，结果如下：
（3）G-，杆菌。和手指消毒前、硬币正面菌落（2）的细菌一样
（4）出现三种细菌：
G-，双球菌
G+，双球菌
G-，梭菌