分子生物学实验
从小麦基因组中克隆谷胱甘肽硫转移酶基因
一、实验思路与设计：
目的基因的获取是基因工程的重要步骤，也是研究基因的进化、功能等的必要手段。本实验设计从基因组DNA提取开始，通过DNA的提取及质量检测、常用生物信息库的查询、电子延伸、DNAstar软件的使用、PCR仪的编程与使用、载体构建、感受态细胞的制备、重组子的筛选和扩培、质粒的提取与检测等实验，使学生掌握基因克隆的基本思路和方法。
谷胱甘肽硫转移酶（GSTs，EC 2.5.1.18）是分子量为25-29kD的同源或异源二聚体酶类。其作用是将将谷胱甘肽转移到各种有毒物质的亲电分子上去。GSTs 在机体有毒化合物的代谢、保护细胞免受急性毒性化学物质攻击中起重要作用。此外，亲电子致癌物可被GSTs分解，所以GSTs有抑制细胞癌变的功能（Seidegard J，et al.，1997）。谷胱甘肽硫转移酶作为一种具有广谱抗氧化活性的物质已用于癌症等疾病的治疗。
编码GSTs的基因是一类古老而且广泛存在的基因家族。植物GSTs家族各成员之间的差异很大，它们只有一个长15个氨基酸的保守域（Marrs，1996）。Droog 等人（1995）建议根据序列保守性，免疫交叉反应活性和基因内含子和外显子的结构将植物的GSTs分为三个亚类，I型GSTs有两个内含子，其翻译和转录受诸如脱水（Kiyosue et al.，1993），损伤（Kim et al.，1994），活性氧（Bartling et al.，1993），病原菌攻击或激素（生长素和乙烯）（Zhou and Goldsbrough，1993；Akahashi et al.，1995）的影响。II型GST的序列有9个内含子，此类型的GST序列只在荷兰石竹中发现（Meyer et al.，1991；Itzhaki and Woodson，1993）。III型GSTs只有一个内含子，其转录和翻译受各种植物激素（Takahashi et al.，1989，Droog et al.，1993）、病原菌侵袭（Taylor et al.，1990）及重金属（Czarnecka et al.，1988；Hagen et al.，1988，Marrs and Walbot,1997）的诱导。
研究植物GST最初目标在于确定不同作物对除草剂的抗性，但是对其在细胞正常代谢过程中所起的作用知道的较少（John and Kathryn，1998；Mars,1996）。
对麦类作物GST的研究主要集中在其抗除草剂的作用上，由抗除草剂诱导的在小麦中表达得到的GST主要是I型的GST，它们只含有一个内含子并将其定位在小麦的第六部分同源群上（Riechers et al.，1994，1996 a，1996 b，1998）。
本实验采用同源序列克隆的方法从小麦基因组克隆小麦GST的基因组序列。
二、具体实验安排
实验一小麦基因组DNA提取
小麦种子表面消毒后浸泡在蒸馏水中浸泡12小时，露白后转入培养皿中，室温条件下生长至两叶一心时采集叶片，立即用液氮处理后，置于-70℃冰箱中保存备用。
总DNA采用Sharp等（1989）提出并经Devos等（1992）改进的酚—氯仿法提取。具体步骤如下：
1）将适量新鲜叶片液氮低温下磨碎，取适量置于1.5ml离心管中，加500μl “S”beffer（100mM Tris.HCl pH8.0，100mM NaCl，50mM EDTA pH 8.0，2% SDS，(现配现用) 65℃预热），65℃水浴约1h。
2）加入500μl酚—氯仿（1∶1），混匀后10000rpm离心10min；取上清液加入0.6 倍体积异丙醇，混匀并静置一会儿后，10000rpm离心10min，倒掉液相，用200ul 70%乙醇将DNA洗1-2次后干燥。
3）将DNA溶于500μl1×TE（pH 7.0），加5μlRNA酶（10mg/ml），37℃保温1h；加500μl氯仿，轻轻混匀后10000rpm离心10min。
取上清液加入2倍体积冷无水乙醇（或95%乙醇），轻轻混匀并静置一会儿后10000rpm离心10min，轻轻倒掉液相，待DNA干燥后溶于25ul 1×TE（pH 7.0）。
实验二从小麦基因组中克隆谷胱甘肽硫转移酶基因
根据GeneBank上公布的具有基因组序列的两个小麦GST序列GSTA1（X56012）和GSTA2（X56004）及其它小麦GST的mRNA的保守序列设计如下引物：
引物名称碱基
长度
碱基序列产物长度
gDNA cDNA
Gcds
Foward
28 5’ATGTCTCCGGTGAAGGTGTTCGG GCAC3’ 1.1kb 900bp
Gcds
Reverse
30 5’TTAAAGCAAGGAATCCGGGCTCG CACGAGC3’
引物Gcds开始于起始密码子结束于终止密码子，其cDNA的扩增产物应该包含完整的开放阅读框。
基因组PCR反应体系
以基因组DNA进行基因组PCR。PCR反应总体积为20μl，反应液组成：10×Buffer 2.0μl
MgCl2 （25 mmol/L） 1.50μl
dNTP （10 mmol/L）0.5μl
Taq （2.5 U /μl）0.4μl
Primer F（5μmol/L）1μl
Primer R（5μmol/L）1μl
模板（gDNA）50-80ng
ddH2O
Total 20μl
基因组PCR反应程序
扩增条件为95℃5min，94℃1min，67℃1min，72℃1min，30个循环，72℃10min，然后4℃保温。
扩增产物的检测
大于300bp的片段用1.2%的加EB的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下检测。
实验 3 PCR产物的纯化及连接
选用PCR凝胶回收纯化试剂盒进行（按照实际说明书操作，下面仅是参考）1）100ul的PCR产物在1.0%的琼脂糖胶上电泳，在紫外灯下用洁净消毒的刀片将目标片段挖出，放入1.5ml离心管中。
2）向1.5ml离心管中加3倍体积的溶胶液，50o C水浴10分钟，待凝胶完全溶解后，倒入回收离心柱中。
3）向回收柱中加入700ul漂洗液，13000rpm离心1分钟。
4）倒出离心管中漂洗液，再向回收柱中加入500ul漂洗液，13000rpm离心1分钟。
5）将离心管中的漂洗液倒掉， 13000rpm离心2.5分钟。
6）将回收柱转移至一个新1.5ml离心管上，加入适量ddH2O，静置30分钟。
7）13000rpm离心1min，弃纯化柱，离心管内即为高纯度的PCR纯化产物。
PCR产物的连接
选用天为时代公司的连接试剂盒，载体为pGEM-T easy；感受态细胞为TOP10,连接体系为：
T4 DNA ligase 1 μl
10×T4 DNA ligase Buffer 1 μl
pGEM-T easy 1 μl
PCR products 7 μl
Total 10 μl
25℃下连接12-16h。
实验 4 大肠杆菌感受态制备
[实验目的]
通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备。所用菌株是DH5a
[实验原理]
细菌处于易于吸收外源DNA的状态叫感受态。细菌处于0℃的CaCl
低渗溶
2
液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃段时间短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。
[实验步骤]
1.挑取大肠杆菌单菌落接种于10 mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2.按1%接种量接种10 mL LB培养基中，37℃快速振荡培养3 h。
3.取1ml培养物，冰浴30 min ，12,000 r/min离心1 min，去上清。
4.加二分之一体积的冰冷的0.1 mol/L CaCl
溶液，重新悬浮细菌沉淀，
2
12,000 r/min离心1 min，去上清。
5.加十分之一体积的冰冷的0.1 mol/L CaCl
溶液，重新悬浮细菌沉淀，
2
12,000 r/min离心1 min，去上清。
6.加二分之一体积的冰冷的0.1 mol/L CaCl
溶液，重新悬浮细菌沉淀，冰
2
浴3 h-24 h，即为大肠杆菌感受态细胞。
实验5 PCR连接产物的转化
[基本原理]
将质粒DNA导入细菌的过程称为转化（Transformation）。此感受态细菌细
胞在CaCl
2低渗溶液中膨胀为球状（感受态细菌的制备，见前）。质粒DNA与CaCl
2
形成抗DNase羟基-磷酸钙复合物黏附于细菌表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，外源基因得到表达。在选择性培养平板上，可选出所需的转化子（即含有质粒DNA的细菌）。钙处理的感受态细胞，一般每微克DNA能获得105～106个转化子。除化学方法转化细菌外，还有电穿孔法（Electroporation），其转化率可高达109～1010个转化子/μg质粒DNA。
[实验步骤]
1）LB固体选择培养基的配制
Bacto trytone 2g
Bacto yeast extract 1g
NaCl 1g
H2O 100ml
IPTG （200mg/ml）28μl
X-gal （20mg/ml）120μl
Ampicillin （50mg/ml）100μl
2）转化连接液的配制
E. coli TOP10 100 μl
PCR连接液5 μl
3）应用热激法进行转化
冰浴30 min后，42℃热激90 s，马上放回冰上，冰浴2 min；加400 μL LB培养基，37℃水浴静置15 min；再于37℃摇床慢摇振荡培养45-60 min；
取50-100 μL涂在含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB固体培养基上，37℃
倒置培养过夜。
4）将适量复苏后的转化液涂于LB选择培养基上，于37℃倒置培养16-18 h。白色菌落即重组质粒。
实验6 重组质粒的提取与检测
质粒提取
1.挑取单菌落接种于2 mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB培养基中培养，37℃培养过夜。
2.取1.5 mL细菌培养物，加入微量离心管中，8,000 r/min离心1 min。
3.除净上清，加100μL溶液I，剧烈振荡混匀。
4.加200 μL溶液II（先加400ul水+50ul 2M NaOH+50ul 10%SDS,按此顺序加样，现用现配，够2人份使用），盖紧管盖，迅速颠倒混匀。
5.加150 μL冰冷的溶液III（冰上预冷），盖紧管盖，颠倒混匀，冰浴10 min。
6.12,000 r/min离心10 min，将上清转移到一个新的干净指管中。
7.向上清中加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温作用15 min ，12,000 r/min
离心10 min 。
8.弃上清，70 %乙醇洗沉淀一次，倒扣在纸巾上凉干。
9.用适量含100 μg/ml RNA酶的TE溶解沉淀，65℃作用30 min。
10.加等体积酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），反复颠倒混合，进行抽提, 12,000
r/min离心10 min 。
11.反复抽提至两相界面无蛋白出现，再用氯仿-异戊醇（24：1）抽提一次。
12.取水相，加2倍体积无水乙醇及十分之一倍体积的3 mol/L NaAc(pH5.2)，
混匀，-20℃放置半小时以上，12,000 r/min离心10 min；弃上清，用预冷的70 %乙醇洗沉淀一次，倒扣在纸巾上凉干，用适量TE溶解沉淀，-20℃存放备用。
实验7 质粒检测(见扩增产物的检测)
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
分子生物学综合试验报告
综合实验Ⅰ.Southern杂交 （质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、 地高辛标记的Southern杂交） 一.实验目的 1.学习Southern杂交的原理及操作方法。 2.学习碱裂解法提取质粒的原理。 3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。 4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 二.实验原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。 PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。 地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 三．实验准备 1.实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基 2.实验试剂： Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
实验一.质粒提取与琼脂糖电泳 一、目的 掌握质粒的提取方法及原理；琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。 二、原理 1.质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。在pH 12.0- 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的 质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。 2.带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 三、实验材料、仪器、试剂 （1）菌种：大肠杆菌DH5α （2）分子生物学试剂 10mg/ml溴化乙锭（EB）:按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。 50×TAE电泳缓冲液: 24.2g Tris 5.71g 冰乙酸 10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。
实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用
事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。
分子生物学复习题 实验一DNA的制备 （1）为什么分子生物学实施时要担心EB？ 溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？ 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？ 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。 （6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁 实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？ 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？ 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。 一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感分子生物学实验的"试炼"。 分子生物学实验心得体会 东强（生科01级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA的制备、PCR技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值。
分子生物学实验课程教学大纲 课程名称：分子生物学（Molecular Biology） 课程编号：1313072215 课程类别：专业课 总学时数：68实验时数：18 学分：3.5 开课单位：生命科学学院生物综合教研室 适用专业：生物技术 适用对象：本科（四年） 一、课程的性质、类型、目的和任务 分子生物学实验是生物技术专业一门必修的专业课，涵盖了分子与细胞生物学的许多内容，并与结构基因组学、功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学、生物医学、分子病毒学、 分子免疫学等学科有着重要的联系。分子生物学实验课程教学以理论课教学为基础，理论与 实践相结合，加深对所学知识的理解，对实验仪器要求较高，因此开设本课程的目的是使学 生掌握分子生物学实验设备的操作方法，使学生更加牢固地掌握基础知识，更重要的是培养 学生的动手能力和科学研究能力，为学生学习生命科学中的其他相关课程作好基础准备。同 时也使学生具备分子生物学基本的实验技能，学会发现问题和解决问题的能力，为毕业后从 事生物学相关的科研和教学工作奠定基础。 本课程的任务是通过实验教学，使学生了解和初步掌握分子生物学实验技术的基本原理 和方法，教学内容包括植物基因组DNA的提取、琼脂糖凝胶电泳检测、PCR扩增目的基因 及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。在实验内容和方法、技术上进行合理安排，力争让学生在有限的 课时中尽可能多地了解和掌握现代分子生物学基本理论和有关实验的基本方法和技术原理，并尽可能多地引进、介绍新的、先进的实验方法和技术，以开阔学生视野，提高学生的动手 能力和创造性思维能力，培养高素质的生命科学人才。 二、本课程与其它课程的联系与分工 学习和研究分子生物学的目的在于阐明生命活动的化学物质基础，并与其它学科配合，来揭示生命活动的本质和规律。《生物化学》、《细胞生物学》和《遗传学》是先修课程。 三、课程内容及教学基本要求 [1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”； 实验一植物基因组DNA的提取 植物基因组DNA的提取的目的及原理[1]；植物基因组DNA的提取的实验步骤及操作方 法[3]； 作业：提取的DNA呈褐色的原因及解决办法？ 实验二琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤[1]，琼脂糖电泳的实验方法[3]； 作业：琼脂糖凝胶电泳中电压如何设置？ 实验三聚合式酶联反应（PCR）扩增目的基因
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
第0章绪论 一、名词解释 1.分子生物学 2.单克隆抗体 二、填空 1．分子生物学的研究内容主要包含（）、（）、（）三部分。 三、是非题 1、20世纪60年代，Nirenberg建立了大肠杆菌无细胞蛋白合成体系。研究结果发现poly(U)指导了多聚苯丙氨酸的合成，poly(G)指导甘氨酸的合成。（×） 四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么？ 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？ 3. 分子生物学研究内容有哪些方面？ 4. 分子生物学发展前景如何？ 5. 人类基因组计划完成的社会意义和科学意义是什么？ 6．简述分子生物学发展史中的三大理论发现和三大技术发明。 7. 简述分子生物学的发展历程。 8. 二十一世纪生物学的新热点及领域是什么？ 9. 21世纪是生命科学的世纪。20世纪后叶分子生物学的突破性成就，使生命科学在自然科学中的位置起了革命性的变化。试阐述分子生物学研究领域的三大基本原则，三大支撑学科和研究的三大主要领域？ 答案： 一、名词解释 1.分子生物学：分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类；分子生物学以遗传学、生物化学、细胞生物学等学科为基础，从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究。
2.单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。 二、填空 1.结构分子生物学，基因表达与调控，DNA重组技术 三、是非题 四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么？ 答案： 有人把它定义得很广：从分子的形式来研究生物现象的学科。但是这个定义使分子生物学难以和生物化学区分开来。另一个定义要严格一些，因此更加有用：从分子水平来研究基因结构和功能。从分子角度来解释基因的结构和活性是本书的主要内容。 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？ 分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。狭义：偏重于核酸的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程，其中也涉及与这些过程有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。 3. 分子生物学主要包含以下三部分研究内容：A.核酸的分子生物学，核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（moleculargenetics）是其主要组成部分。由于50年代以来
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
分子生物学实验教学大纲 一、说明 1、课程类别 专业课 2、教学目的 通过实验教学使学生了解、验证、巩固和加深所学理论知识，掌握分子生物学研究的基本实验技能，如：质粒（植物/动物）DNA的分离及纯化、植物总RNA的提取，琼脂糖凝胶电泳等技术。培养科学、严谨、实事求是的学风，提高动手能力、分析问题解决问题的能力以及创新性思维。 3、教学内容 本门课教学主要以某一基因为主线，从基因的分离、纯化、克隆、及鉴定等方面入手，帮助学生掌握分子生物学基本的实验方法和技能，在此基础上对分子生物学方法的应用和意义有一个整体的把握，在可能的情况下同时提供多种实验材料让学生自行设计和准备实验，培养其独立科研能力。 4、教学方式 以实验操作为主，配合原理教授、实践性教学、多媒体教学和学生实验报告、撰写论文、自学等方法进行学习。 5、考核内容及方式 实验操作 30％，实验结果 30％，实验报告 30％，考勤 10％。参照以下几个方面评定成绩。 （一）认真预习实验并书写实验预习报告； （二）实验态度认真，操作规范，遵守实验室管理规定； （三）按规定步骤进行实验，实验结果准确； （四）认真撰写实验报告。 6、本课程授课时间（学期），总学时数。 本课程在三年级开设，总计36学时，学时分配见下表: 教学时数分配表
二、教学内容 1、教学目标（课程） 通过本课程的教学使学生了解和掌握现代分子生物学研究的基本原理、方法、技术和技能，包括DNA 提取、PCR 扩增等。通过学生的独立实验设计和实践，训练学生分析问题和解决问题的能力及实际动手能力，同时培养学生的创新思维以及对生命科学探索的兴趣和爱好。 2、教学内容（分章节描述） 实验一质粒DNA的提取 1．主要内容碱裂解法提取载体质粒。 2．教学要求学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术。 实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA 1．主要内容（1）电泳基本知识介绍（2）琼脂糖凝胶的制备（3）质粒的定量。 2．教学要求掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 实验三植物总RNA的提取及检测 1．主要内容（1）RNA的提取（2）核酸的琼脂糖凝胶电泳（3）紫外分光光度法测定核酸的含量和纯度。 2．教学要求掌握植物组织中提取RNA的基本原理和实验技术方法。 实验四动物总DNA的提取 1．主要内容（1）总DNA的提取（2）核酸的琼脂糖凝胶电泳（3）紫外分光光度法测定核酸的含量和纯度。 2．教学要求掌握动物组织中提取总DNA的基本原理和实验技术方法。 实验五 PCR基因扩增 1．主要内容（1）PCR基本原理（2）PCR溶液体系的制备（3）PCR仪使用 2．教学要求掌握聚合酶链式反应的基本原理和实验技术方法。 （二）重点和难点
分子生物学实验文档
分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。 4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。 5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。 7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。 8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。 9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 （一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
《分子生物学》课程教学大纲 课程编号：233201 课程名称：《分子生物学》 总学时数：64 实验学时：0 先修课及后续课：先修课为《生物化学》，《遗传学》；后续课为《基因工程》 一、说明部分 1. 课程性质：生物技术专业课，必修 2. 教学目标及意义 本课程是高等院校生物专业的专业课。旨在使学生掌握分子生物学的基本知识、基本概念，并了解分子生物学的发展趋势及应用前景。 3. 教学内容和要求 本课程安排在学生完成《生物化学》、《遗传学》等有关基础和专业基础课程之后的第六学期。内容上注意与以上课程的衔接，并避免不必要的重复。同时注意与后续课程《基因工程》等课程的衔接。课堂教学应力求使学生掌握基本概念，了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、DNA的复制、RNA的转录、蛋白质的合成、RNA在蛋白质合成中的功能、遗传密码、基因表达与调控的本质、基因组与比较基因组学；由于该课程内容繁多，发展迅速，故授课教师在吃透教材基础上，应广泛阅读相关参考资料，紧跟本学科发展，随时补充新内容，使学生及时了解本学科的重要进展及发展动态。分子生物学的发展依赖于现代分析和研究技术，因此，配合分子生物学实验课程，讲解一些分子生物学的重要研究方法。 4. 教学重点，难点 重点：DNA的结构与功能；DNA的转座；基因的表达与调控 难点：基因表达的调控 5. 教学方法与手段 在教学方法上采取课堂讲授为主，辅以多媒体课件、提问、综述、实验、作业、教学辅助材料等，以加强学生对理论知识的消化和理解，在教学过程应注意积极启发学生的思维，培养学生发现问题和解决问题的能力。 6. 教材及主要参考书 教材：朱玉贤，李毅.《现代分子生物学》，第三版；北京：高等教育出版社.2007. 主要参考书： （1）杨岐生.《分子生物学基础》，杭州：浙江大学出版社.1998. （2）郜金荣等.《分子生物学》，武汉：武汉大学出版社.1999. （3）阎隆飞，张玉麟.《分子生物学》，北京：中国农业大学出版社.1997. （4）魏群，分子生物学实验指导.北京：高等教育出版社，2003. （5）李振刚.《分子遗传学》，北京：科学出版社，2000. （6）Weaver R. Molecular Biology. 2nd Edition.北京：科学出版社，2001.