通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解, 染色体分离并打碎为一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与 DNA交联的复合物, 对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联, DNA与蛋白质之间的 Schiff键水解, 释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测,获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。
图2 ChIP实验流程
RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列通过microarray （RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。
图3 RIP实验流程
3 RNA pull-down实验
使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。
图4 RNA pull-down实验流程
4 EMSA实验
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
图5 EMSA实验原理
5 Luciferase实验
荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应。
萤光生成反应通常分为以下两步：
萤光素+ ATP→ 萤光素化腺苷酸（luciferyl adenylate）+ PPi
萤光素化腺苷酸+ O2→ 氧萤光素+ AMP +光
荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中，将不同类型的细胞（骨髓干细胞、T细胞等）标记上（即表达）荧光素酶，就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光，而发出的光子可以被光敏感元件，如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。
图6 Luciferase研究增强子原理
图7 Luciferase常用载体
图8 Luciferase片段缺失分析实验流程
图9 Luciferase定点突变分析实验流程
荧光素酶分析可应用于启动子研究中分析顺式作用元件和反式作用因子、药物筛选、siRNA和miRNA筛选、分泌途径及蛋白定位报告基因检测、活细胞的实时动态研究、信号转导通路分析、难转染的细胞（包括干细胞和原代细胞）的研究、RNA剪接研究。
双荧光素酶报告基因测试，是结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术。在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时，通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统，表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试，快速、灵敏、简便。其应用广泛，可同时分析多个调控元件、同时分析多个信号转导通路、单次筛选一个以上的靶点（包括脱靶效应、分析两个或多个通路之间的相互作用）。
染色质免疫沉淀分析ChIP技术介绍 染色质免疫沉淀分析ChIP 技术介绍 (Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChiP) (Abcam 公司与Upstate 公司都提供ChIP 抗体产品) 染色质免疫沉淀法(Chromatin immunoprecitation,ChIP)就是研究体内DNA 与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况,还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等,这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。根据“组蛋白密码”假说,组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能,因此,ChIP 也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用,全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。 真核生物细胞状态就是由内源与外源因素共同影响的,所有信号传递途径的终点都就是DNA。DNA 通过核蛋白复合物组成染色质,染色质就是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子与辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制--“组蛋白密码”,其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域与羧端修饰的确定,组蛋白密码在控制与调节基因功能过程中的作用越来越明确。参与修饰的酶根据其作用的不同而分类:如组氨酸乙酰转移酶(HATs)可以将乙酰基团转到组蛋白上;组蛋白去乙酰酶(HDACs)可以去除氨基酸上的乙酰基团;组蛋白甲基转移酶(HMTs)可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程,它可以作为调节因子的作用位点,也可以用来改变染色质结构。 染色质免疫沉淀分析(ChiP)就是基于体内分析发展起来的方法,它的基本原理就是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA 复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA 序列上的调控蛋白,就是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP 不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP 与其她方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP 与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP 与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP 用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP 的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)就是目前研究转录调控蛋白与相应核苷酸序列
ChIP实验操作指南 国家瓜果改良中心荔枝分中心 采用Bowler等（2005）的方法，具体如下： 1收获2.0g花生根、茎、也、种子于一个50ml离心管中。 2加40 ml超纯水于离心管中，轻柔颠倒离心管洗材料2次。 3去掉尽可能多的水，再加入37ml 1% 甲醛，与15-25 ℃，真空放置15 min。 4 加入2. 5 ml 2 M甘氨酸是离心管中的甘氨酸的终浓度为0.125 M，再真空放置5 min。 5 加40ml超纯水与离心管中，轻柔颠倒离心管洗材料2-3次。 6去掉尽可能多的水，液氮速冻后-80℃保存或直接利用。 第一天 1 准备核酸提取液Extraction buffer 1、2、3，并4 ℃预冷。 2 液氮淹没样品，样品尽量磨碎，注意不用潮解样品。 3 预冷的50 ml离心管中加入预冷的30 ml核酸提取液1 ，再将样品粉末加入离心管中，轻柔颠倒混匀后放在冰上5 min. 4 再拿一个50 ml离心管于冰上预冷，用两层滤膜将样品过滤入该离心管，如果滤液中仍有残渣，重复步骤4。 5 4 ℃， 3000g 离心10min。 6 小心弃上清，加入1 ml 4 ℃预冷核酸提取液2重悬浮沉淀，移入进口（或严格灭菌）的1.5ml 离心管，4 ℃，12000g离心溶液10Min. 7 小心弃上清，加入300μl 4 ℃预冷核酸提取液3重悬浮沉淀,可以轻柔颠倒助匀，但要避免起泡。（核酸提取液3很粘稠，但还是要尽量重悬浮好沉淀）。 8 在一新4 ℃预冷离心管中加300μl 4 ℃预冷核酸提取液3，再将步骤7的溶液小心加入上层，4 ℃，16000g离心溶液1h（准备步骤9，制一块1%琼脂糖凝胶，用80μl CHIP 洗液洗磁珠）。 9 准备核酸裂解液 Nuclei lysis Buffer。 10 小心弃上清，加入300μl预冷核酸裂解液，于冰上用（剪过尖端）枪头吹打溶液混匀或轻柔颠倒助匀，但要注意避免起泡。并取出1-2μl混匀也来作为对照看超声波破碎后的对照。 11 超声波破损染色质5次，每次15s，中间间隔1 min 避免溶液过热，避免损失过多及起泡。跑电泳（1%琼脂糖凝胶）检测超生效果（应该在200-1000bp之间）。可以把破碎后的染色质-80 ℃保存或直接进入下一步。 12 超声波破碎后溶液4 ℃，12000g离心5 min，上清液移至1个5ml离心管中，并移出10μl来，于-20℃保存作为“Input DNA对照”。 13 先验证这时候的超声波破碎后溶液体积少于300μl，再补加CHIP洗液至总体积3 ml。
七个基本原理和方法论 ?1、矛盾对立统一原理 ?2、矛盾的普遍性原理 ?3、矛盾的特殊性原理 ?4、矛盾的普遍性与特殊性辩证关系原理 ?5、主要矛盾与次要矛盾关系原理 ?6、矛盾的主要方面与次要方面关系原理 ?7、两点论与重点论相统一的原理 一、矛盾对立统一原理 ?原理：矛盾就是对立统一 ?方法论：要求我们必须用一分为二的观点、全面的观点看问题 ?“既……又……、虽然……但是、双赢、双刃剑、成就……困难……、机遇…挑战、相反相成”此类语言哲理是：矛盾是对立统一，要一分为二看问题，坚持两分法、两点论。 ?该原理经常应用于: ?用对立统一原理分析A和B的关系------(通常是一对反义词) ?答题模式： ?（1）矛盾就是对立统一，A与B是对立统一关系 ?（2）一方面，A与B存在一定的对立性，------ ?另一方面，A与B也具有统一性----- ?（3）---既要---又要---（或把---有机结合或兼顾-----） ? ?某些地方政府管理理念错位，为提升城市形象，忽视民生问题，要建“无摊贩城市”。 目前，上海的无证摊贩约5万个，上海市政府经调查研究，一改往日对马路摊点一律封杀的做法，出台《城市设摊导则》，规定：部分市区路段经市民同意，便可设置部分便民摊点，政府颁发临时许可证，这既可扩大就业，方便居民生活，又可规范城市摊点管理。 ?运用矛盾对立统一的观点分析塑造城市形象与解决民生问题的关系。（10分）?①矛盾就是对立统一，要求我们用全面的观点看问题。摊点问题既涉及城市形象又涉及民生问题，二者是对立统一的关系。 ?②一方面，塑造城市形象与解决民生问题存在一定的对立，有时塑造城市形象与民生问题会有冲突；另一方面，塑造城市形象与解决民生问题具有统一性。塑造城市形象必须以人为本，关注民生；民生问题的解决也要有利于维护和塑造城市形象。 ?③在二者关系问题上，应坚持两分法，防止片面性，应将塑造城市形象与解决民生问题有机结合起来。 ? ?2010年3月14日上午，国务院总理温家宝在回答台湾记者关于两岸关系的提问时指出，两岸同胞是兄弟，“虽有小忿，不废懿亲”，这句话是强调，尽管兄弟之间存在分歧，但仍应以血缘关系为重，同心共御外侮。这体现( B ) ?A、联系是普遍的、无条件的 ?B、矛盾是既对立又统一的关系 ?C、事物发展是前进行与曲折性的统一 ?D、集中主要力量，解决主要矛盾 ?解析：“虽有小忿，不废懿亲”，“兄弟之间存在分歧”，说明事物双方存在斗争性，“但应以血缘关系为重，同心共御外侮”，说明事物双方相互联结的趋势，共同体现了矛盾是既对立又统一的关系，所以B项符合题意。A项本身错误，联系时有条件的；C、D材料没有体现。 ?
染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验方法 实验原理 染色质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少了体外实验的误差。在活体细胞中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一定的方法（例如：超声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过一定手段把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用PCR等方法检测鉴定共沉淀的DNA片段的特性。 仪器和试剂
真空设备、涡旋器、液氮、冷冻离心管、离心机、超声波粉碎仪、miracloth 37%甲醛，2M甘氨酸，ddH O，剪切的鲑精DNA/protein A琼脂糖珠(Sant cruz)， 2 蛋白酶K（14mg/ml）,RNaseA,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,氯仿,无水乙醇, 提取缓冲液1（EB1）:0.4M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；5mM β-ME； 0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（aprotinin、pepstain A、Leupeptin、 Antipain、TPCK、Benzamidine） 提取缓冲液2（EB2）:0.25M 蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；10mM MgCl2； 1%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) ；5mM β-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上） 提取缓冲液3（EB3）：1.7M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；0.15%Triton X-100；2mM MgCl ；5mMβ-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上） 2 核裂解缓冲液（NLB）：50mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA；1%SDS；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上） ChIP稀释缓冲液（ChIP DB）：1.1%Triton X-100；1.2mM EDTA；16.7 mM Tris-HCl，pH8.0；167mM NaCl；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上） 洗脱缓冲液（EB）：1%SDS；0.1M NaHCO3（现配） 低盐洗脱液：150mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0
一、物质与意识的辩证关系原理及方法论 1、物质决定意识，意识是对物质的反映。要求坚持一切从实际出发，实事求是。 2、意识对物质具有能动性，意识对改造客观世界具有指导作用。人们在意识的指导下能动地改造客观世界，即通过实践把观念的东西变成现实的东西，创造出没有人的参与永远也不可能出现的东西。正确（错误）的意识促进（阻碍）事物的发展。意识对于人体生理活动具有调节和控制作用。要求重视意识的作用，重视精神的力量，树立正确的思想意识，克服错误的思想意识。 二、尊重客观规律与发挥主观能动性的辩证关系原理及方法论 1、规律是客观的。要求我们尊重规律，按客观规律办事。 2、发挥主观能动性是认识和利用客观规律的必要条件。要求我们充分发挥主观能动性，认识和利用规律。 3、要把发挥主观能动性和尊重客观规律结合起来。 三、实践与认识的辩证关系原理及方法论 1、实践是认识的基础，实践是认识的来源，实践是认识发展的目的，实践是检验认识的真理性的唯一标准。实践是认识的目的。要求树立实践第一的观点，自觉参与实践活动。 2、认识对实践具有反作用。正确的认识，科学的理论对实践有巨大的指导作用；错误的认识，不科学的理论则会把实践引向歧途。要求重视认识的反作用，重视科学理论对实践的指导作用。 四、真理是有条件的具体的的辩证关系原理及方法论 1、真理都是有条件的。任何真理都有自己适用的条件和范围。 2、整理是具体的。任何真理都是相对于特定的过程来说的，都是主观与客观、理论与实践的历史的具体的统一。 3、要求坚持真理的条件性，坚持主观与客观、理论与实践的历史的具体的统一。 五、认识具有反复性无限性的辩证关系原理及方法论 1、认识具有反复性，人类追求真理的过程并不是一帆风顺的。 2、认识具有无限性，追求真理是一个永无止境的过程。 3、认识具有上升性，从实践到认识、从认识到实践的循环是一种波浪式前进或螺旋式上升的程。 4、与时俱进，开拓发展，在实践中认识和发现真理，在实践中检验和发展真理，是我们不懈的追求和永恒的使命。
一、原理 转录从基因的启动子区开始，由一系列的转录因子结合到基因的启动子区，通用转录因子结合在 基本启动子区起始转录，而这个过程对基因的转录是必需的，但不是充分的，通常需要一些特异的转 录因子结合在上游调节序列，使基因特异表达并维持的合适水平，ChIP主要用于研究转录因子（个人 认为主要是特异转录因子的作用，因为这些因子的表达才有时空特异性）与下游基因的结合，如果 ChIP发现转录因子能与目的基因结合，那么这说明该基因可能是其下游基因，要想进一步证明，还要 做高低表达和荧光素酶等实验。 二、目的基因的筛选 1，如果做ChIP-seq那就不需要在实验前筛选目的基因了，理论上芯片会分析出样本中该转录因 子所有的下游基因，我们根据这个分析结果进行筛选就可以了。 2、如果是做普通的ChIP，那么在实验前要进行初步的筛选，选择自己感兴趣的目的基因，设计 PCR引物，进行验证，所以，这样考虑的话，ChIP实验是对你的早期数据的验证。个人认为，筛选目 的基因的方法有一下几种：a，查文献，看转录因子和哪些基因在表达时间，空间，及功能
相关。b， 你的课题设计中涉及到的基因，比如说你课题中设计到c-myb基因，你就想看一下转录因子和c-myb的 关系（这个纯属碰运气）。c，根据自己早期的实验结果，比如，你做高、低表达后，发现你的转录 因子表大变化后，一些基因的表达也发生了变化，那么这些基因可以作为候选基因。 3、另外筛选完自己感兴趣的基因后，可以用一些分析工具进行初步的预测，这个网上也可以搜 到，就不罗嗦了，如果有战友需要，可以再讨论。 三、实验设计 这里只说说实验各组的作用 1.input：样本经过超声，但是没有进行ChIP，包含样本超声后总DNA，可以进行电泳，检测超声 效果，同时，可以与最后ChIP样本进行比较，看ChIP的效率（如果用同一引物进行PCR，ChIP组和 input组亮度差不多，说明ChIP效率高，基本上，样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了，反之 ，说明效率低，实验条件有待改进） 2、阳性对照：一般用anti-RNA Polymerase II抗体，因为RNA Polymerase II是通用转录
一、ChIP实验步骤 第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min 收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul 含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl 终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。 9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。 10、1h后，在4度静置10min 沉淀，700rpm离心1min。 11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。 （三）、检验超声破碎的效果。 取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。 第二天：（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。 12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。 4度颠转2h。 13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。 14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。洗涤溶液：a. low salt wash buffer----one wash b. high salt wash buffer-----one wash c. LiCl wash buffer------one wash d. TE buffer------two wash 15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10％SDS， 100ul 1M NaHCO3， 800ul ddH2O，共1ml。 每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。 16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65度解交联过夜。第三天：（一）、DNA样品的回收 17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。 18、每管加入10ul 0.5M EDTA， 20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。 45度处理2h。 19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。（二）、PCR分析二、技术总结（一）、关于细胞细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状
项目管理的基本原理和方法 项目管理是一种科学的管理方式, 项目管理贯穿于项目实施的全过程, 项目管理的关键内容是进度、费用和质量的相互协调、相互制约、相互适应, 同时项目管理的组织与领导又是项目成败的关键。目前越来越多的企业逐步认识到项目管理的重要性, 相信在公路工程的各个领域都将会采用项目管理, 这样产生的高效率和高效益是可观的。 1 项目管理的基本概念 目前国际上对于项目管理还没有一个统一的定义。主要因为: 项目管理是一整套科学的管理体系和方法, 很难用几句话对其进行全面而精确的概括, 为此只能从不同的角度对其进行描述 描述1: 项目管理是在项目运作过程中, 综合应用各种知识、技能、手段和技术以完成项目预期的目标和满足项目有关方面的需求。 描述2: 项目管理是以项目为对象的一种科学的管理方式, 它以系统论的思想为指导, 以现代先进的管理理论和方法为基础, 通过项目管理特色的组织形式, 实现项目全过程的综合动态管理, 以有效地完成项目目标。 另外项目管理还有其它含义: 项目管理既是一种科学的管理活动, 也是一门新兴的管理学科。 2 项目管理的工作内容 项目管理认为, 各种项目的生命周期均可分为C、D、E、F 四个阶段。各个阶段具有各自的工作方法和工作内容。 (1)C 阶段。即概念阶段, 该阶段的主要内容有: ①调查研究、收集数据; ②明确需求、策划项目; ③确立目标; ④进行可行性研究; ⑤明确合作关系; ⑥确定风险等级; ⑦拟订战略方案; ⑧进行资源测算; ⑨提出组建项目组方案; bk提出项目建议书; bl获准进入下一阶段。 (2)D 阶段。即开发阶段, 该阶段的主要内容有: ①确定项目组主要成员; ②项目最终产品的范围界定; ③项目实施方案研究;
关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结 ChIP实验原理 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。 一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。 ChIP实验步骤 第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。 假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。 将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。 留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul 加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，
《生活与哲学》原理与方法论归纳整理 〖辩证唯物主义（唯物论、认识论、辩证法、）〗 第一部分：唯物论（物质、意识、运动、规律） 一．物质和意识辩证关系原理、方法论【重点掌握】 〖原理内容〗：，物质决定意识，意识是物质的反映；〖方法论〗：我们要坚持一切从实际出发，实事求是，使主观符合客观；意识对物质具有能动作用。〖方法论〗我们要重视意识的作用，重视精神的力量，自觉地树立正确的思想意识，克服错误的思想意识。正确意识对事物发展促进作用,错误意识对事物发展起着阻碍作用。 【应用举例】“根据…实际情况….制定….方案”；“针对…当前形势…作出…决策”；“主观符合客观”；企业生产要根据市场的实际需要进行（以市场为导向）。 二、意识能动作用原理【重点掌握】 〖原理内容〗：（1）人能够能动地认识世界。（因为意识活动具有目的性、计划性，主动创造性和自己选择性）（2）人能够能动地改造世界。（①意识对改造客观世界具有指导作用。正确意识促进事物发展,错误意识对事物发展起着阻碍作用。②意识对于人体生理活动具有调节和控制作用。） 〖方法论〗：要求我们要意识的作用，重视精神的力量，自觉地树立正确的思想意识克服错误的思想意识。 三．物质和运动辩证关系原理 〖原理内容〗：物质和运动是不可分割的。①物质是运动的物质，运动是物质的根本属性和存在方式，②运动是物质的运动，物质是运动的承担者。③总之，世界上一切事物都是运动、变化的。 〖方法论〗：我们要用运动、变化、发展的眼光看问题,反对割裂物质和运动二者联系的两种错误观点. 【错误倾向】离开物质谈运动或离开运动谈物质都是错误的。既要反对离开物质谈运动的唯心主义观点，又要反对离开运动谈物质的形而上学观点。 四．运动和静止辩证关系原理 〖原理内容〗：①世界上的一切事物都处于运动变化中，没有不运动的物质，因而运动是无条件的、绝对的、永恒的；②静止是有条件的、相对的和暂时的，静止是运动的一种特殊状态；动中有静、静中有动。③物质世界是绝对运动和相对静止的统一。 〖方法论〗：既肯定绝对运动，也承认相对静止的存在。要求我们用运动、变化、发展的观点看问题,还要看到事物相对静止的存在,反对割裂运动和静止的辩证关系. 【错误倾向】只承认静止而否认运动是形而上学的不变论，只承认绝对运动而否认相对静止则导致相对主义和诡辩论 五．规律的客观性和普遍性原理【重点掌握】 〖原理内容〗：所谓规律，就是事物运动过程中固有的本质的、必然的、稳定的联系。规律是客观的，是不以人的意志为转移的，它既不能被改变、创造，也不能被消灭。规律是普遍的，自然界、人类社会和人的思维，在其运动变化和发展的过程中，都遵循其固有的规律，一切事物的运动变化都是有规律的。 〖方法论〗：①我们必须遵循规律，按客观规律办事，而不能违背规律。②在客观规律面前，人并不是无能为力的，人可以发挥主观能动性认识和利用规律，改造客观世界，造福于人类。（想问题、办事情，既要尊重客观规律，按规律办事，又要充分发挥主观能动性，
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤 在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。 目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天） 1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。 2. 37℃孵育10 min。 3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5 min即可。 4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。 6. 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。这样每100 ul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为 4x106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800 ul。 7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。共14次。 二、除杂及抗体哺育（第一天） 1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。 2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。 3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
《生活与哲学》基本原理、方法论 一、唯物论（辩证唯物论）5个 1、物质决定意识原理 【原理内容】物质决定意识，意识是对物质的反映。 【方法论】要求我们想问题、办事情要一切从实际出发，实事求是(主观符合客观，做到主观与客观具体的历史的统一)。 2、意识反作用原理 【原理内容】意识反作用于物质，人能够能动地认识世界,人能够能动地改造世界,正确的意识对事物的发展起促进作用，错误的意识对事物发展起阻碍作用。 【方法论】重视意识的作用，重视精神的力量，自觉树立正确的意识，克服错误的意识。 3、物质和意识辩证关系原理 【原理内容】物质决定意识，意识是对物质的反映。意识反作用于物质，人能够能动地认识世界,人能够能动地改造世界,正确的意识对事物的发展起促进作用，错误的意识对事物发展起阻碍作用。 【方法论】要求我们想问题、办事情要一切从实际出发，实事求是(主观符合客观，做到主观与客观具体的历史的统一)。重视意识的作用，重视精神的力量，自觉树立正确的意识，克服错误的意识。 4、规律的客观性原理 【原理内容】规律是事物运动过程中固有的、本质的、必然的、稳定的联系。规律是客观的，不以人的意志为转移,人不能创造、消灭和违背规律。 【方法论】规律的客观性要求我们，必须遵循规律，按客观规律办事。 5、规律客观性和人的主观能动性辩证关系原理 【原理内容】规律是客观的，但人可以发挥主观能动性，认识和利用规律，改造客观世界，造福于人类。（认识和利用规律必须发挥主观能动性，发挥主观能动性必须以尊重客观规律为基础。） 【方法论】我们在想问题、办事情的时候，要把尊重客观规律和发挥主观能动性有机地结合起来，做到解放思想实事求是，与时俱进，求真务实。 二、认识论（辩证唯物主义认识论） 1、实践和认识的辩证关系原理 【原理内容】1实践决定认识：实践是认识的基础；实践是认识的来源；实践是认识发展的动力；实践是检验认识的真理性的唯一标准；实践是认识的目的和归宿。2认识对实践具有反作用：正确的认识（真理）对实践起指导作用，科学理论对实践有巨大的促进作用，谬误对实践起阻碍作用。 【方法论】把认识和实践相结合，做到理论和实践的具体的历史的统一。树立实践第一的观点，重视认识的作用。 2、真理的条件性和具体性原理 【原理内容】真理是人们对客观事物及其规律的正确反映。真理是具体的，任何真理都有自己适用的条件和范围；真理是有条件的，何真理都是相对于特定的过程来说的，都是主观与客观、理论与实践的具体的历史的统一。 【方法论】真理的条件性和具体性表明，真理和谬误往往是相伴而行的。 3、认识是发展的原理（认识过程的反复性和无限性原理） 【原理内容】认识具有反复性、无限性，人类的认识是无限发展的，要经过从实践到认识，再从认识到实践的多次反复才能完成；循环是一种波浪式前进和螺旋式上升，真理是永远不会停止前进的步伐，它在发展中不断超越自身。 【方法论】要求我们与时俱进，开拓创新在实践中认识和发现真理，在实践中检验和发展真理。 三、辩证法（唯物辩证法） （一）联系观点 3个 1、联系普遍性原理 【原理内容】事物是普遍联系的，联系具有普遍性、客观性和多样性 【方法论】要求我们用联系的观点看问题。要从事物固有的联系中把握事物，切忌主观随意性，注意分析、把握事物存在和发展的各种条件，一切以时间、地点、条件为转移。2、整体和部分相互关系原理 1)强调整体： 【原理内容】整体居于主导地位，整体统率着部分，具有部分不具有的功能。部分是整体中的部分，部分离不开整体，整体的功能状态及其变化会影响部分。 【方法论】树立全局观念，立足整体，统筹全局，选择最佳方案，实现整体的最优目标，从而达到整体功能大于部分功能之和的理想效果。 2）强调部分： 【原理内容】部分构成整体，整体离不开部分，部分的功能及其变化会影响整体的功能，关键部分的功能及其变化甚至对整体的功能起决定作用。 【方法论】重视部分的作用，搞好局部，用局部的发展推动整体的发展。 3）既强调整体又强调部分： 【原理内容】整体和部分相互联系，密不可分，辨证统一的。 【方法论】树立全局观念，立足整体，重视部分的作用，搞好局部。 3、系统优化的方法原理及方法论 【原理内容】系统是由相互联系和相互作用的诸要素构成的统一整体。系统的基本特征是整体性、有序性和内部结构的优化趋向。 【方法论】系统优化的方法要求我们用综合的思维方式来认识事物。既要着眼于事物的整体，从整体出发认识事物和系统，又要把事物和系统的各个部分、各个要素联系起来进行考察，统筹考察。优化组合，最终形成关于这一事物的完整、准确认识。 （二）发展观点 1、发展原理（发展的普遍性原理） 【原理内容】事物是变化发展的，发展具有普遍性，发展的实质是事物的前进、上升，是新事物的产生和旧事物的灭亡。 【方法论】我们必须坚持用发展的观点看问题。（与时俱进，培养创新精神，促进新事物的成长。） 2、事物发展是前进性和曲折性的统一原理（发展的道路、趋势）
chip基本实验步骤 基本实验步骤 (1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4?裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清; (2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4?C缓慢摇晃孵育过夜; (3)免疫沉淀反应后，在4?C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟; (4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。 一、样品处理: 免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4?完成外，最为关键的是裂解液的成份。 用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。 a. 缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。
课题：教学基本原理与方法 一、教学目标：通过本次课使学员学习和掌握教学的最基本的原理和方法，特别是教学的一些基本程序与要求，并能够结合自己的实际情况，吸取经验，树立信心，投身于自己的教学实践中去，提升教学能力，完成教学任务。 二、教学重点：教学的基本程序与要求 三、教学难点：教学的基本理论，特别是牵涉到哲学、心理学、逻辑学的部分 四、教学方法与手段：讲授法、讨论法、案例教学法相结合，教学录像与ppt相结合。 五、教学课时：3学时 六、教学步骤：先讲授教学的基本原理与方法部分，然后就教学的实际操作和技能技巧介绍一些经验之谈并与学员共同进行探讨。 讲稿提要 一、教学基本原理和方法 （一）教学的概念和任务 1、教学的定义。教学是教师的教和学生的学所组成的一种人类特有的人才培养活动。通过这种活动，教师有目的、有计划、有组织地引导学生学习和掌握文化科学知识和技能，促进学生素质提高，以适应社会、组织或个人的需要。 2、教学的任务。掌握知识与技能；学会学习与形成能力；确立情感态度价值观等。 （二）教学基本要素 教师、学生、教学内容、教学形式和手段等。 （三）教学能力结构 1、基本素养； 2、学科知识背景； 3、对所教知识结构的认知； 4、对学生认知发展的认知； 5、学科教学能力。 （四）遵循教学规律 1、间接经验与直接经验相结合。学生学习间接经验为主；学生学习间接经验要以直接经验为基础。 2、掌握知识与发展智力相统一。掌握知识是发展智力（观察力、记忆力、思维力和想象力）的基础；智力发展是掌握知识的重要条件；掌握知识与智力相互转化的内在机制（传授科学的规律性知识；科学组织教学过程；重视操作与活动） 3、教师的主导作用与学生的主体能动性结合。两种师生观：教师中心论与学生中心论。教师在教学过程中处于组织者的地位，充分发挥教师主导作用；学生在教学过程中作为学习主体的地位，充分发挥学生参与教学的主体能动性；建立合作、友爱、民主、平等的师生关系。 4、教学过程中知、情、意的统一。处理好知识学习与思想、情感、意志和个性培养的关系问题。 （五）贯彻教学原则 1、直观性原则是指在教学中要通过学员观察所学事物，形成所学事物的清晰表象，丰富感性认识，从而能够正确理解书本知识和发展认识能力。直观分为三类：一是实物直观；二是模象直观；三是言语直观。 2、启发性原则是指教师要重视学生是学习的主体，注意调动他们的学习积极性，引导他们独立思考，积极探索，生动活泼地学习，自觉掌握科学知识和提高分析问题和解决问题的能力。营造问题情境是启发的首要因素；独立思考是启发的关键；发扬教学民主是启发的条件。
管理学原理与方法(周三多第五版) 总论 人类活动的特点：目的性，依存性，知识性 管理的概念：管理是管理者为了有效地实现组织目标（目的性有效性协调性过程性） １：管理是人类有意识有目的的活动。２：管理应当是有效的。 ３：管理的本质是协调。４：协调是运用各种管理职能的过程。 管理的职能：决策、组织、领导、控制、创新，是一切管理活动最基本的职能。 1：决策：所有管理者必须制定符合并支持组织的总体战略目标。（制定目标、行动） 2：组织：设计岗位，授权分工，使整个组织协调地运转。（设计、授权） 3：领导：指导人们的行为，通过沟通增强互相理解，统一思想和行动，激励成员自觉地为实现组织目标共同努力。（指导、沟通、激励） 4：控制：使实践活动符合于计划，计划是控制的标准。（衡量、纠偏） 5：创新：与其他职能结合中表现。 管理二重性：1、管理的自然属性 --反映人与自然的关系不以人的意志为转移，也不因社会制度形态的不同而有所改变，这完全是一种客观存在。 2、管理的社会属性 --反映社会关系 管理者的角色：明茨伯格这十种角色可归入三类。 人际角色：代表人角色、领导人角色、联络者角色 信息角色：监督者、发言人、传播人 决策角色：企业家、干扰对付者、资源分配者、谈判者 管理者三种技能：卡次 1：技术技能，运用管理者所监督的专业领域中的过程、惯例、技术和工具的能力。 2：人际技能，成功地与人打交道并与人沟通的能力。 3：概念技能，把观点设想出来并加以处理以及将关系抽象化的精神能力。 管理学的研究方法：归纳法、试验法、演绎法 中国传统管理思想的要点： 1：宏观管理的治国学--（财政赋税、人口管理、货币管理、等） 2：微观管理的治生学--（农副业、手工业、运输、建筑工程等） 顺道、重人、人和、守信、利器、求实、对策、节俭、法治 西方早期思想产生的三个人物：亚当斯密巴贝奇罗伯特欧文 泰罗创立的科学管理理论 主要观点：1：科学管理的根本目的--谋求最高工作效率 2：达到最高效率的重要手段--用科学的管理方法代替旧的经验方法 3：实施科学管理的核心问题-要求管理人员和工人双方在精神上和思想上来一个彻底的改变 提出的以下管理制度：1：对工人提出科学的操作方法，以便合理利用工时，提高效率 2：在工资制度上实行差别计件制 3：对工人进行科学的选择，培训和提高 4：制定科学的工艺规程 5：使管理和劳动分离 评价：1：它冲破了传统地落后地经验管理办法，将科学引进了管理领域，创立了一套具体地科学管理方法2：科学地管理方法和科学地操作程序使生产效率提高了二三倍，推动了生产地发展，适应了资本主义地发展。 3：由于管理职能于执行职能地分离，企业中开始有一些人专门从事管理工作 4：泰罗把人看成会说话的机器，只能按照管理人员的决定、指示、命令执行劳动，在体力技能上受很大的压榨 缺陷：适应历史发展的需要而产生的，同时也受到历史条件和个人经历的限制，他的科学管理所涉及的问
第十二章数量性状的选择原理与方法动物育种中所重视的大多数重要经济性状都是数量性状，例如产奶量、乳脂率、产蛋数、蛋重、瘦肉率、增重速度、饲料转化率等。数量性状是由微效多基因控制的，每个基因作用微小， 效应各异，可以累加和倍加，只有通过群体对其进行研究，选择是在一个群体中通过外界的作用， 将其遗传物质重新组合，以便在世代的更替中，使群体内的个体更好地适应于特定的目标，优良 性状只有通过不断的选择才能得到巩固和提高。因此选择就成为进一步改良和提高家畜生产性能 的重要手段。阈性状是一类特殊类型的性状，与数量性状的遗传基础是一致的，对它的选择方法 有所不同。 第一节选择差与选择反应 家畜的繁殖率一般都是很高的，特别是应用人工授精技术以后，不需要将育种群中同一世代 出生的所有家畜全部留作种用，而是将各方面优秀的个体选留下来，用于繁衍下一代，因此选种 是改进群体遗传的重要手段。选择差和选择反应是进行数量性状选择的基础。 一选择差 选择差(S)是由被选择个体组成的留种群数量性状的平均数( P)与群体均数（P）之差： S P－P（公式 12-1） S= S 选择差表示的是被选留种畜所具有的表型优势。选择差的大小，主要受两个因素的影响，一是畜群的留种率（P），留种率是指留种个体数占原始畜群总数的百分比。一般来说，群体的留种率愈小，所选留个体的平均质量愈好，选择差也就越大。在实际的育种工作中，在一个每年都要扩大的畜群里，需要选留的种母畜多，留种率加大，选择差减小。在一个母畜头数年年保持不变的群体中，种母畜的留种率较小，选择差会增大。多胎家畜的选择差要比单胎家畜大，因为可能供选择的后代数目较多。断乳成活率较高的畜群，要比成活率较低的选择差大。公畜的选择差通常都大于母畜，这是因为公畜的留种比例小。对于限性性状的公畜，在选择时，留种的少数公畜，如果选择不那么准确，其实际选择差就会比预期的减小。二是性状的表型标准差，即性状在群体中的变异程度。同样留种率，标准差大的性状，选择差也大。由于数量性状的表型值呈正态分布，群体的标准差的大小基本稳定，因此留种率的大小就决定了选择强度的高低。 度量不准确会影响选择差。即使记录准确，但未加利用也会造成选择差减小。如要选用肉用牛的增重速度，有的牛增重率大但外形中等；有的牛增重率中等但外形优异，如选后者，就会造成增重率的选择差减小。 有时也会因育种措施不当而人为地加大留种率。例如，有的羊场在羔羊断奶前后，选择一批当时看来较好的羔羊组成特培群，给予特殊的饲养管理条件，到选种时，由于培育群的条件比其他群优越，以致种羊全部选自特培群。这样就加大了留种率。影响了选择效果。 由于不同性状的度量单位不同，选择差的单位也不同，它们之间的选择差不能进行相互比较，为了便于分析规律，通常将选择差标准化，变成标准化的选择差，即选择强度，选择强度通常用小