实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养
一、实验目的
了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类
BHK-21：仓鼠肾传代细胞
PK-15：猪肾传代细胞
IBRS-2：猪肾传代细胞
Hela：人的子宫瘤细胞
Vero：非洲绿猴肾细胞
Marc-145：来源于Vero细胞
TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞
Sf9：昆虫细胞
三、材料
1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头
2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞
3、0.25%胰酶
4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
5、伪狂犬病病毒液（PRV）
四、传代细胞培养的条件要求
1）细胞密度：2-3×105个/ml
2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
哺乳动物细胞一般为37℃
昆虫细胞28-30℃
五、常用细胞分散剂与作用原理
1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，
导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽
酶的混合物。
六、营养液
1、人工综合营养液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清
1）血清的种类
胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理
无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。
3）血清的作用
A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
D、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。
E、给培养液提供良好的缓冲系统。
F、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。
4）应用血清存在的问题
A、血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。
B、血清的成分不明确，影响对结果的分析。
C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。
七、传代细胞系培养
1、优点：1) 可以无限的传代。
2) 不少细胞系对病毒很敏感。
3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
3、培养方法
1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。
2）加入2ml 胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。
3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。再在每个小瓶中补充生长液至10ml，然后置37℃培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。
八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养
1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。
2、加入适量的病毒悬液
3、置温箱中感作（吸附）45min-1h。
4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%以上的细胞病变。
5、收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。
实验三、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）
一、实验目的
了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。
二、材料
1、9-11日龄鸡胚
2、照蛋灯与蛋座
3、碘酊棉球与酒精棉球
4、大剪子、眼科剪、小镊子
5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、
6、胰酶、生长液、维持液
三、细胞培养的条件要求
1）细胞密度
原代细胞：4-6×105个/ml
传代细胞：2-3×105个/ml
2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
哺乳动物细胞一般为37℃
昆虫细胞28-30℃
四、操作步骤
1、取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。
2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚
颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。
3、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。
4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。
5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗，并静
置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加DMEM。如此反复冲洗2-3遍。
6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8，振荡混匀
后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。
7、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长
液5ml，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。
8、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。
9、细胞计数
取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。
每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。
活细胞数应在90%以上。
10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6×106个/ml，分层于
细胞培养瓶中，每瓶1ml，再补加DMEM生长液至10ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。
○表示可计数
●表示不计数
五、结果的观察
于培养后每天观察结果，至长层单层。细胞量较大时，一天即可长成单层，细胞呈纤维状。
实验四病毒感染力的滴定（TCID50的测定）
一、实验目的
了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID
50
的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法
( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测
半数致死量LD
50
(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测
半数鸡胚感染量EID
50
半数细胞培养物感染量TCID
（50% tissue culture infective dose)：用细胞
50
来检测
蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测
三、材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
四、TCID50的操作步骤
1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，
每孔接种100μl。
3、在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100μl生长液+100μl细胞悬液）
5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法
五、TCID50的计算方法
1、Reed-Muench两氏法
CPE：Cytopathic effect
距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）
＝（91.6-50）/（91.6-40）
＝ 0.8
=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数lgTCID
50
=0.8×(-1)+(-3)
=-3.8
=10-3.8/0.1ml
TCID
50
含义：将该病毒稀释103.8接种100μl可使50%的细胞发生病变。
2、Karber法
=L-d(s-0.5)
lgTCID
50
L：最高稀释度的对数
D：稀释度对数之间的差
S：阳性孔比率总和
=-1-1×(3.375-0.5)
lgTCID
50
=-3.875
=10-3.875/0.1ml
TCID
50
含义：将该病毒稀释103.875接种100μl可使50%的细胞发生病变。
实验五血清中和试验
一、实验目的
了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒—稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。
二、原理
抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使病毒的感染力丧失。
三、用途
1、疾病诊断
2、病毒分离株的鉴定
3、不同病毒株的抗原关系研究
4、疫苗免疫原性的评价
5、免疫血清的质量评价
6、测定实验动物血清中是否存在抗体
四、分类
(一) 蚀斑（痘斑）减数试验
将病毒—正常血清混合物以及病毒—待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒—正常血清组和病毒—待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。
以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
(二) 交叉保护试验
先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。这一方法的缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。可用于以下几方面：应用已知V鉴定未知V ；应用已知免疫血清鉴定未知V；应用已知V鉴定未知血清。
（三）终点法中和试验
1、固定病毒—稀释血清法
将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般为100或200个TCID
50、EID
50
或LD
50
）混合，置适当的条件下感作一定时间，再将血清-病毒混合物接种于敏
感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。
以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血
清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价（PD
50
）。
2、固定血清——稀释病毒法
在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照
组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCID
50、EID
50
或LD
50
，然后计算中
和指数。
五、材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
6、待检血清、PRV阳性对照血清、PRV阴性对照血清
六、操作步骤
1、固定病毒—稀释血清法
1）测定病毒液的TCID
50
2）将测好TCID
50的病毒液稀释成200个TCID
50
的病毒悬液。
3）在96孔微量培养板中将血清（预先56℃灭活30min）作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50μl生长液，再加50μl待检血清，混匀后，吸50μl至下一孔，如此下去。一直到1∶256），每个稀释度作4孔。
4）在上述各孔内加入50μl稀释好的病毒液，混匀后放入37℃ 5%CO
2
培养箱中作用45min-60min。
5）同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，
其中病毒对照要作 200个TCID
50、20个TCID
50
、2个TCID
50
、0.2个TCID
50
4
个不同浓度的对照。
6）感作完成后每孔加入100μl细胞悬液，放37℃ 5%CO
2
培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要观察5-7天。
7）结果计算，按Reed-Muench 两氏法或Karber 法进行。
血清稀释度 CPE 孔数
无CPE 孔数
累计
保护率% CPE 孔数 无CPE 孔数
1∶2（10-0.3） 0 4 0 15 100（15/15） 1∶4（10-0.6） 0 4 0 11 100（11/11） 1∶8（10-0.9） 1 3 1 7 87.5（7/8） 1∶16（10-1.2） 1 3 2 4 66.7（4/6） 1∶32（10-1.5） 3 1 5 1 16.7（1/6） 1∶64（10-1.8） 4 0 9 0 0（0/9） 1∶128（10-2.1） 4 0 13 0 0（0/13） 1∶256（10-2.4） 4
17
0（0/17）
即1∶20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE 。 2、固定血清——稀释病毒法 1）将病毒作连续10倍稀释
2）将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50μl ，做两块板子。在其中一块板子的每孔加入50μl 待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入50μl 正常血清（对照组），混合后置37℃ 5%CO 2培养箱作用1h 。
3）然后在每孔中加入100μl 细胞悬液。
距离比例=（高于50%的保护率-50% ）/（高于50%的保护率—低于50%的保护率）
=（66.7-50）/（66.7-16.7）
lgPD50=高于50%的保护率的血清稀释度的对数+距离比例×稀释度对数的差
=-1.2+0.33×(-0.3) =-1.299
=0.33
PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20
4）设两纵排正常细胞对照。
5）置37℃ 5%CO
2
培养箱培养，逐日观察并记录结果。
6）分别计算每组病毒的TCID
50
，然后计算血清的中和指数。
中和指数=试验组TCID
50 /对照组TCID
50
如：中和指数=10-4.0/10-7.0 =103.0=1000
判定标准：以待检血精的中和指数大于50者，判为阳性；10-49为可疑；小于10为阴性。
首先要纠正一下错误的问题描述。正确的换算公式是1 TCID50 = 0.7 PFU
你的病毒滴度为：10^12.3 TCID50/0.1ml = 10^13.3 TCID50/ml （你好像没有理解TCID50的概念，请参考这里：https://www.doczj.com/doc/f31651695.html,/bbs/topic/14324310）10^13.3 TCID50/ml = 10^13.3 TCID50/ml × 1又因为1 ＝0.7 PFU/TCID50, 所以10^13.3 TCID50/ml = 10^13.3 TCID50/ml * 0.7 PFU/TCID50 = 10^13.15 PFU/ml
https://www.doczj.com/doc/f31651695.html,/bbs/topic/22833577
空斑分析(plaque assay)是检测病毒感染颗粒滴度的一种常用方法。感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml，其中PFU(plaqueforming unit)表示空斑形成单位。它的优势在于可以直接用肉眼看到一个一个空斑（一些相信肉眼观察胜于可重复性的科学家非常乐意使用这个方法），但是它的重复性比较差（有时候是非常差），因此笔者强烈推荐采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。
由于PFU又使用非常广泛，所以就涉及到PFU和TCID50 换算的问题。简单地说他们的关系是：1个TCID50 约等于0.7个PFU，即：
1 TCID50 ≈ 0.7 PFU
例如某病毒的滴度为105TCID50/ml，那么它换算成PFU为：
105TCID50/ml = 105TCID50/ml * 1 =105TCID50/ml * (0.7PFU/TCID50) = 7*104PFU/ml
如果你是只求知其然那种科学家，知道这一点就够了，没有必要往下看了，但是千万别记反了。如果你还想知其所以然，请继续看我的推演。我尽量做到深入浅出。
我们知道1个PFU在理想的情况下代表一个病毒颗粒，但是实验过程中会出现两个（或多个）病毒
颗粒粘在一起了，或者是它们感染了同一个细胞或两个非常相近的细胞，在形态上，只表现出一个空斑，所以在严谨意义上又不好说一个空斑就是一个病毒，只好换了个说法：将形成一个空斑的病毒颗
粒的数量定义成空斑形成单位即PFU。事实上，1个PFU近似等于一个病毒颗粒。为了说明方便，在下文中我有时候也把一个PFU就说成一个病毒（当然是有感染性的病毒颗粒）。根据TCID50的定义我们知道：用含有一个TCID50的病毒液体去感染细胞，有50%的感染可能性。有的战友会说，那不就是：一个TCID50的病毒液体就是含有0.5个病毒了吗？又因为一个PFU约等于1个病毒，所以1个TCID50约等于0.5 PFU了吗？如果你理解到这一步，那恭喜你，你肯定不会把TCID50/PFU的换算公式记反了，但是这个理解和实际情况是有偏差的。回想一下，在TCID50试验结果中，我们只考察又多少个孔感染病毒，至于感染病毒的孔到底感染了多少个病毒形成了多少个空斑，并没有在计算结果中反应出来。换句话说一个感染了病毒的孔，它可能形成一个空斑，也可能形成两个、三个等多个空斑。所以说一个TCID50含有的病毒的数量要比0.5个病毒多一点点，所以就有1个TCID50要略大于0.5PFU。那么到底大多少呢？别急，先恭喜你一下，你的理解有进了一大步！
在进一步讲解这个0.7的近似值是如何计算出来之前，让我们来先回顾一下相关的数学概念。现在我设想有一个摇奖机：机器里面有20个大小完全相同的球，每次摇奖它可以掉出一定数量的球，那么它掉出1个，2个，3个，……，20个球的概率分别是多少？学过高中数学我们就可以知道掉出n个球的概率符合二项分布。如果忘记了，你可以复习一下，如果不想复习，也不妨碍继续看我的帖子。我简单说明一下，掉出1个和20个概率最小，渐渐地到掉出10个和11个的概率最大。二项分布的概率函数图如下：
现在我们设想另外一种情况：如果是一个装有20个球的捞奖桶，然后用一个一定大小的勺子去捞出一定数量的球，那么它捞出1个，2个，3个，……，20个球的概率分别是多少？如果我让你猜一猜捞出几个球的概率最大，聪明的你肯定可以想到那取决与我给你的勺子有多大，如果勺子适合捞出2.7个球，那么捞到3个球的概率最大。可以想象的是捞到20个球的概率几乎为0。同时我们知道捞出的最大概率的球数实际上还取决于勺子的大小这个参数。关于这个数学模型，现在我们来学习一
下泊松分布：
在二项分布的随机试验中，如果试验次数k很大，二项分布的概率p很小，且乘积λ= k*p比较适
中，则事件出现的次数的概率可以用泊松分布来逼近。具体的数学证明请看相关专业参考书。泊松分布的概率函数图如下：
（cited from:维基百科：泊松分布）
泊松分布的函数为：
P(X=k)=e-λ*λk/k!
其中λ表示一个正的实数，是一个数学期望值，表示是单位时间(或单位面积)内随机事件的平均发生频率。
在温故了二项分布并知新了泊松分布之后，我们再回过头来看看我们要解决的生物问题。在TCID50试验中，一个孔形成非常非常多的空斑（即k很大）的情况的概率非常非常小（即接近0), 这种情况
可以用泊松分布来逼近。解决生物问题的第一步是要把生物问题转化为数学问题。这一步是相当困难的！以下是TCID50实验结果转化为数学的描述：根据TCID50的实验我们知道用一个TCID50的病毒液体去感染细胞，有一半会感染，而另一半不会感染，换个说法就是：有一半的孔会出现至少一个空斑，而另一半的孔则出现0个空斑（即不感染），那么出现0个空斑的概率为0.5即：
P(X=0)=e-λ*λ0/0! = 0.5
我们知道0!=1, λ0＝1 所以：
e-λ*1/1 = 0.5
求得
λ=-ln(0.5) ≈ 0.69
终于看到了这个近似值是怎么来的了，可是这个λ又表示什么意思呢？泊松分布的函数为：
P(X=k)=e-λ*λk/k!
其中λ表示一个正的实数，是一个数学期望值，表示是单位时间(或单位面积)内随机事件的平均发生
频率。这个描述比较抽象，我在网上找到了另外一个比较好的解释（请参考这里：
https://www.doczj.com/doc/f31651695.html,/Poisson_Exp.php）
The Poisson parameter Lambda (λ) is the total number of events (k) divided by the
number of units (n) in the data (λ = k/n). The unit forms the basis or denominator
for calculation of the average, and need not be individual cases or research
subjects.
For examples, if we have 100 people, and only 90 of them go shopping in a week
then the binomial risk of shopping is 90/100 = 0.9. However, some of the people
will go shopping more than once in the week, and the total number of shopping
trips between the 100 people may be 160, and the Poisson Lambda is 160/100 =
1.6 per 100 person week.
关于λ的解释还是很抽象，但是他给了一个很好的例子。把例子翻译过来就是：
在100个人中，只有90人每周去购物，那么单个人每星期去购物的机会为90/100=0.9。然
而一些人一个星期内不止去购物一次，而所有人的购物次数总和为160次。那么泊松分布的
λ是160/100 = 1.6次/人/星期。
如果再要求解一个人一周去购物两次的概率，就可以把λ＝1.6套入公式计算得到了。好！现在我们来类比一下：现有100孔细胞，每孔接入0.1ml病毒液，只有50孔会感染病毒并产生空斑，所以每孔细胞感染病毒的机会为0.5 （这是根据TCID50的定义来的）。然而一些感染病毒的孔可能不止形成一个空斑，所以这100个孔总共形成的空斑数目肯定>50, 假设它的数值为k, 那么λ＝k/100 个空斑/每孔。已经求得λ = - ln(0.5), 所以
-ln(0.5) = k /100
k= -ln(0.5) * 100 ≈ 70
即100个TCID50 在理想状态下共可以形成-ln(0.5) * 100) (≈70) 个空斑。所以1个TCID50 可以在理想状态下可以形成-ln(0.5)个空斑，即：
1 TCID50 ＝-ln(0.5) PFU ≈ 0.7 PFU
更多讨论请参考我在丁香园发表的相关帖子:
https://www.doczj.com/doc/f31651695.html,/bbs/topic/14324310
https://www.doczj.com/doc/f31651695.html,/bbs/topic/22833577
MOI不是病毒的滴度，以下来自链接所给网站：MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。A ,能产生细胞裂解效应的病毒例如腺病毒、单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。B ,对于某些病毒如AAV病毒，无法用pfu 表示病毒的数量，而是采用TU、IU、病毒颗粒（viral particles, v.p）或基因组数量（vector genome,v.g.）来表示病毒数量。采用TU或IU，MOI的含义便是TU number/cell 或IU number/cell。采用v.p.，MOI的含义便是v.p. number/cell 。采用v.g，MOI的含义便是v.g. number/cell。可以将上述不同的MOI 表示方式分为2种：1）以活性单位表示病毒数量，如pfu, TU, IU。这时MOI的含义是指平均每个细胞感染病毒的活性单位数。2）以病毒颗粒或基因组数表示病毒数量，如v.p. 或v.g. 。这时MOI的含义是指平均每个细胞感染病毒的病毒颗粒或基因组数。值得一提的是，上述2种不同的MOI 表示方式
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
……………………………………⊙……装…………………………⊙……订………………………⊙……线……………………………………17.4含水率试验 17.4.1试验目的和方法 土的含水率是土在105~110℃温度下烘干至恒量时所失去水的质量与干土质量的比值。以百分数表示。 含水率是土的基本物理指标之一。它反映了土的干、湿状态。土的含水率是计算干密度、孔隙比、饱和度、液性指数等指标的基本数据和评价土的工程性质的重要依据，是研究土的物理力学性质的重要指标。 含水率的试验方法较多，由于烘干法试验简便，结果稳定，故以此法作为测定含水率的标准方法。如果测试条件不能满足采用烘干法或需快速测定含水率时，可分别用如下方法： ● 酒精燃烧法：适用于不含有机质的砂类土、粉土和粘性土。 ● 碳化钙减量法：本方法的原理是用过量碳化钙与土中游离水混合接触产 生化学反应，生成乙炔气体。根据乙炔气体逸出失去的质量，计算求得土的含水率。此方法适用于各类土。 ● 核子射线法：适用现场原位测定填料为细粒土和砂类土的含水率。 以下仅介绍烘干法，核子射线法在土的密度试验中介绍。 17.4.2烘干法 17.4.2.1试验用仪器设备 ● 电热干燥箱：温度能保持在105~110℃。 ● 天平：称量200g ，分度值0.01g ；称量1000g ，分度值0.02g 。 ● 其它：干烘器、称量盒等。 17.4.2.2主要试验步骤： 1）选取有代表性试样（粘性土15~30g ，砂类土30~50g ，砾石类土不少于250g ，碎石类土不少于500g ），放于称量盒内称量湿土质量。 2）打开盒盖，将装有试样的盒放入烘箱内，在105~110℃温度下烘干。 各类土的烘干时间见表17.28。
教学设计原理与方法 一、教学设计概述 1、教学设计的定义是什么？谈谈你是如何理解的。 对教学结果作出评价的一种计划过程与操作程序。 确定并解决教学问题，实现教学最优化的现代教学技术。 （教学设计不再是简单的设计之后加以实施的问题，而是一个在学—教的具体境脉中、在互动中发展演化的过程。） 教学设计属于教育科学领域的方法论学科，是教学论的重要组成部分。 教学设计的基本原理与方法适用于不同类型和层次的教学系统的设计，具有很强的实践性、操作性。 2、教学设计的理论基础是什么？ a)系统科学理论 b)学习理论 c)教学理论 d)教育传播理论 3、教学设计的内容包括哪些？ 1、分析教学目标 2、确定教学策略 3、进行教学评价 4、教学设计应用在哪些领域？试举例说明。 （一）教学类型（过程）的设计 1、多媒体组合课堂教学 2、基于局域网的网络教学 3、广播电视远程教学 4、基于Internet的远程教学 （二）教学资源的设计 1、电视教材 2、多媒体（网络）课件 3、专题学习网站 4、网络课程 5、专业资源库 二、学习者特征与教学目标分析 1、学习者特征分析的内涵是什么？教学中通常需要分析学习者的哪些特征？（学生的认知结构和认知发展水平、学习者的起点能力分析、学习风格、自我效能感、学习动机） 教学中通常需要分析学习者的： 一、认知发展特征分析 二、起点能力分析 三、学习风格分析 四、学习动机分析 五、学习自我效能感分析 2、教学目标分类的代表性理论有哪些？
（一）布卢姆等的教学目标分类理论 1、认知领域 2、动作技能领域 3、情感领域 （二）加涅的学习结果分类理论 （三）国内对教学目标的研究 3、教学目标分析方法有哪些？举例说明如何表述教学目标？ 依据知识点的内容属性确定具体的教学目标，采用教学内容与教学目标二维层次模型 行为目标的ABCD表述方法 A即Audience，意指“学习者”，要求有明确的学习者，他们是目标表述句中的主语。 B即Behavior，意为“行为”，要求说明通过学习后，学习者应能做什么，是目标表述句中的谓语和宾语。 C即Conditions，意为“条件”，要求说明上述行为在什么条件下产生，是目标表述句中的状语。 D即Degree，意为“程度”，要求明确上述行为的标准。 三、学习环境设计 1、学习环境的内涵是什么? 谈谈你是如何理解的 /场所说 /工具说 /条件说 广义的学习环境，是指一切影响学习的环境条件和各种因素。 狭义的学习环境，是指在正规课程中影响课堂学习的各种情况和条件。（专指课堂学习环境） 全面认识学习环境概念，需要结合学习环境的空间和时间两个存在形式来考察，学习环境既是一种静态的系统结构，也是一种动态的发展过程。 2、建构主义学习环境的基本构成要素是什么？举例说明。 3、试述学习环境的设计方法。 ——真实情境 ——问题情境 ——模拟真实情境 四、学习资源设计 1、学习资源的主要类型有哪些？
1 总则 《公路土工试验规程》(JTG E40—2007)(简称本规程)包括87个测定土的基本工程性质的试验项目和一个土的工程分类方法标准。修订本规程的目的是使公路系统的试验室在进行土工试验时有一个统一的试验准则，使所有的试验及试验结果具有一致性和可比性。 共性技术要求系指土的物理、水理、力学和化学性质试验中带共性的要求或标准，内容涉及土性指标的选择、成果整理、指标换算和试验报告等，系参考其他部门经验并结合公路工程特点制定。 1．O．1 为测定土的基本工程性质，统一试验方法，开为公路工程设计和施工提供可靠的计算指标和参数，制定本规程。 《公路土工试验规程》(JTJ 051—93)(简称《93规程》)自1993年实施以来，已有14年的时间。在此期间，公路建设所涉及的岩土工程问题发生了巨大的变化，在低等级公路建设中可以避让的岩土工程问题，在高等级公路建设中山于线形、坡度等技术要求变得无法回避。随着公路建设穿越山区以及黄土、冻土等特殊土地区，要求《公路土工试验规程》提供更多、更可靠的计算参数和判定指标，同时测试技术也有了进一步的发展，因此有必要对原规程进行重新修订，使《公路土工试验规程》能够满足现时和未来一段时期的公路建设发展需要，规范公路土工测试标准，并使土工试验及试验结果具有一致性和可比性。 1．O．2 本规程适用于各类公路I程的地基土、路基土及其他路用土的基本I程性质试验。 我国建筑、水利、铁路、冶金等系统均有相应的土工试验规程或标准，基本内容与本规程基本相同。本规程在修订的过程中，特别注意到与国家标准的统一和合理衔接。但是由于公路建设的特点，有些试验方法的条件和评判指标不同，在某些具体的参数和规定上有一定的特殊要求，因此与其他行业的规定略有不同。在实际使用中应予以注意。 1.0．3 各项工程应编制合理的试验方案，采集代表性的试样，测算准确的数据和进行正确的资料分析整理，为设计和施工提供反映实际情况的各种土性指标。 土的工程分类是土工试验规程对土进行粒组和土的工程性质划分、试验规模和仪器划分的重要依据。本规程中土的工程分类系以国家标准《土的分类标准》 第1页 (GBJ 145—90)最新修订报批稿为基础井依照公路建设特性要求进行编制。各项基本试验遵照《土工试验方法标准》(GB／T50123—1999)，对《公路土工试验规程》(JTJ 051 93)进行了修订。 1．0．4 土工试验资料的分析整理按附录A进行，通过对样本(试验测得的数据)的研究，来估计总体(土体单元)的特征及其变化的规律性。 土工试验资料的分析整理，是提供真实有效、准确可靠的土性指标的重要环节。内容涉及数据记录的准确和客观性、成果整理、土性指标的选择、计算统计方法、误差分析、精度评价等。根据误差分析，对不合理的数据进行研究，分析其原因；在有条件的情况下，应进行一定的补充试验，以便决定对有疑问数据的取舍和更正。为便于使用，本 规程仍保留了《93规程》的附录A部分。 1．0．5 土I试验检测报告，对不同类型和级配特征的土，应提供土的基本颗粒级配、液限和塑限指标；对于特殊土，还应提供描述特殊土基本特征的试验测试指标。 土工试验检测报告，均应包含土的最基本特性参数的描述。对于粗粒土和巨粒土必须进行颗粒分析试验，提供土样的颗粒级配粒组数据和级配特征曲线。对于细粒土除应进行颗粒分析试验，提供土样的颗粒级配粒组数据和级配特征曲线外，还应进行界限含水率试验，提供土样的液限、塑限和塑性指数等。这是可重复再现土工试验结果的基本条 件，也是科学实验的基本要求。对于特殊土还应提供描述特殊土基本特征的试验测试指标。 1．0．6 公路土I试验除应符合本规程要求外，尚应符合国家和行业现行相关标准的规定。 在进行土工试验检测前，应对土工试验检测设备进行检查，仪器设备应符合《土工仪器的基本参数及通用技术条件》(GB／T 15406)的规定。根据国家计量法的要求，土工试验所用的仪器、设备应定期检定和校验。对通用仪器设备应按有关检定规程进行检定，对一些专用仪器设备应按相应的校验方法进行校验。 在执行本规程的过程中，对有些内容要求其符合现行国家标准《建筑地基基础设计规范》(GB 50007)、《湿陷性黄土地区建筑规范》(GnJ 25)、《膨胀土地区建筑技术规范》(GBJ 112)、《土的分类标准》(GBj 145)、《岩土工程基本术语标准》(GB／T 50279)等，以及交通行业指南《盐渍土地区公路设计与施工指南》、《公路工程抗冻设计
土工试验方法标准GBJ123－88 目录 主要符号 第一章总则 第二章土样和试样制备 第三章含水量试验 第四章密度试验 第一节环刀法 第二节蜡封法 第三节灌水法 第四节灌砂法 第五章比重试验 第一节一般规定 第二节比重瓶法 第三节浮称法 第四节虹吸筒法 第六章颗粒分析试验 第一节筛析法 第二节密度计法 第三节移液管法 第七章界限含水量试验 第一节液、塑限联合测定法 第二节碟式仪法 第三节滚搓法 第四节土的缩限试验 第八章砂的相对密实度试验 第一节砂的最小干密度试验 第二节砂的最大干密度试验 第九章击实试验 第十章承载比试验 第十一章渗透试验 第一节常水头渗透试验 第二节变水头渗透试验 第十二章固结试验 第十三章黄土湿陷试验 第十四章三轴压缩试验 第一节不固结不排水试验 第二节固结不排水试验 第三节固结排水试验 第四节一个试样多级加荷试验 第十五章无侧限抗压强度试验
第十六章直接剪切试验 第一节粘性土的慢剪试验 第二节粘性土的固结快剪试验 第三节粘性土的快剪试验 第四节砂性土的直剪试验 第十七章反复直剪强度试验 第十八章自由膨胀率试验 第十九章膨胀率试验 第一节有荷载膨胀率试验 第二节无荷载膨胀率试验 第二十章膨胀力试验 第二十一章收缩试验 第二十二章酸碱度试验 第二十三章易溶盐试验 第一节浸出液制取 第二节易溶盐总量测定 第三节碳酸根及重碳酸根的测定 第四节氯根的测定 第五节硫酸根的测定 第六节钙离子的测定 第七节镁离子的测定 第八节钙离子和镁离子的原子吸收分光光度法测定 第九节钠离子和钾离子的测定 第二十四章中溶盐石膏试验 第二十五章难溶盐碳酸钙试验 第二十六章有机质试验 第二十七章土的离心含水当量试验 附录一习用的非法定计量单位与法定计量单位的换算关系表附录二名词解释 附录三本标准用词说明 附加说明
《教学设计原理与方法》复习提纲 （20XX年6月） | 一、教学设计概述 1、教学设计的定义是什么 教学设计是应用系统方法分析研究教学的问题和需求，确定解决它们的教学策略、教学方法和教学步骤，并对教学结果作出评价的一种计划过程与操作程序。 2、教学设计的理论基础是什么 系统科学理论、学习理论、教学理论、教育传播理论 3、教学设计的内容包括哪些 1、分析教学目标 2、确定教学策略 3、进行教学评价 4、教学设计应用在哪些领域试举例说明。 ? 教学类型（过程）的设计教学资源的设计 1、多媒体组合课堂教学 1、多媒体（网络）课件 2、基于局域网的网络教学 2、专题学习网站 3、广播电视远程教学3、网络课程 4、基于Internet的远程教学 4、专业资源库 二、教学目标与教学内容分析 1、教学目标的定义是什么 教学目标是对学习者通过教学后应该表现出来的可见行为的具体明确的表述，是教学设计和课程设计的基础，是学习者在教学活动实施中应达到的学习结果。 | 2、教学目标分类的代表性理论有哪些
3、教学目标分析方法有哪些教学目标的表述方法有哪些试举例说明。 教学目标的分析方法： （1）分析教学内容 （2）分解目标层次 （3）表述教学目标教学目标的表述方法： ` （一）行为目标的ABCD表述法 对象（audition）、行为（behavior）、条件（conditions）、标准（degree） Ex：（“给予20个要填写形容词的未完成的句子，学生能在15分钟内分别写出形容词以完成句子”） （二）内部过程与外显行为相结合的表述法（三）表现性目标的表述法 4、教学内容可以分为哪几类 事实、概念、技能、原理、问题解决 5、教学内容分析方法有哪些教学内容分析的关键在什么地方 归类分析法图解分析法层级分析法信息加工分析法 教学内容分析的关键： "
土工直剪试验原理与实践探析 摘要：本文从原理与实践两个方面对土工直剪试验进行了深入分析与讲解，对 如何做好该试验提出了一些见解与主张，并对试验的局限性也进行了剖析，方便 土工试验人员以及勘察设计人员去更好地理解该试验，更加科学地分析、运用本 试验指标。 关键词：土工直剪试验原理实践粘聚力内摩擦角最小二乘法 1 前言 土工直剪试验是发展较早的一种测定土的抗剪强度的方法，由于设备简单， 易于操作，在工程实践中得到了广泛应用。笔者进行过大量的土工直剪试验操作，认真学习了相关理论知识，积累了丰富实践经验，现就土工直剪试验的原理与实 践与读者进行一下探讨与分析。 2 土工直剪试验的原理 2.1土工直剪试验单块土抗剪强度的确定 土的抗剪强度是指土体抵抗剪切破坏时的能力，是土的重要力学性质之一。 在外荷作用下，建筑物地基或土工建筑物内部将产生剪应力和剪切变形，而土体 具有抵抗剪应力的潜在能力，它随着剪应力的增加而逐渐发挥，当剪阻力完全发 挥时，土就处于剪切破坏的极限状态，此时剪阻力也达到极限。这个极限值就是 土的抗剪强度。 室内直剪试验中测定土的抗剪强度时，一组土样至少制备4个试件，按土样 实际荷载分别施加多级垂直压力后，沿固定的剪切面直接施加水平剪力依次进行 剪切，依次剪切，分别测试出土样在相应荷载下破坏时的抗剪强度，这个抗剪强 度是以剪切位移为横坐标，剪应力为纵坐标，绘制剪应力与剪切位移关系曲线 （见图1），取曲线上剪应力的峰值为抗剪强度，无峰值时，取剪切位移4mm处所对应的剪应力为抗剪强度，同时要求试验的剪切位移达6mm。如图1中的小箭头分别为4块土样进行剪切试验时的剪应力峰值取值，这4个峰值即分别为试验 土样的抗剪强度。 图1 剪应力与剪切位移关系曲线 上图中剪应力的计算公式如下： =CR/A0×10 式中剪应力，kPa； C 测力计率定系数，N/0.01mm； R 测力计读数，0.01mm，直剪试验中的测力计一般采用量力环； A0 试样面积，常量，取30 cm2； 10 单位换算系数。 算例：设某剪切仪的测力环系数为4.79（N/0.01mm），测力环中的百分表某 一时刻读数为0.6mm，即60个0.01mm，那么该时刻的剪应力为： =4.79×60÷30×10=95.8（kPa） 因为试样的剪切面积是固定不变的，所以在对量力环进行率定的时候也可把 试样的剪切面积放在量力环率定系数里进行计算，而这样计算出的量力环系数的 单位是kPa/mm，因此剪应力公式也可以写成：=CR，其中R是以mm为单位的测力计读数，这在土工生产中常用的四联剪切仪里一般采用后者计算方式。 2.2 土的抗剪强度参数内摩擦角φ和粘聚力c的确定
单元7 土工试验 土工试验的项目较多，每个试验项目都有几个不同的试验方法，本章选择的五项试验均参照国家现行标准《土工试验方法标准》GB/T 50123-1999和《土的工程分类标准》GB/50145-2007（以下简称《标准》）编制。 7.1 土的基本物理指标测定 一、试验目的 在实验室内直接测定土的密度、土粒比重、含水率三个实测指标，这三个指标称为土的三相基本试验指标。土的其它指标可以计算求得，称为换算指标。 二、试验方法 1. 测定土的密度试验方法有环刀法、蜡封法、灌水法、灌砂法等。对于细粒土，采用环刀法；对于易破裂土和形状不规则的坚硬土，可用蜡封法；对于现场粗粒土，一般用灌水法或灌砂法。 2. 根据土粒径的不同，土粒比重试验可分别采用比重瓶法、浮称法和虹吸筒法。对于粒径小于5mm的各类土，采用比重瓶法；对于粒径等于大于5mm的各类土，且其中粒径大于20mm的土质量小于总土质量的10％时，采用浮称法；对于粒径等于大于5mm的各类土，其中粒径大于20mm的土质量等于大于总土质量的10％时，采用虹吸筒法试验。 3. 含水率试验可分别采用烘干法、酒精燃烧法、炒干法、比重法等。 三、密度试验——环刀法 1.仪器设备 环刀；天平，感量0.1g；切土刀；推土器；游标卡尺；凡士林等。 2.试验步骤 (1) 用卡尺测出环刀的高和内径，并计算出环刀的容积V(cm3)。 (2) 称环刀的质量m1，准确至0.1g。
(3) 在环刀内壁涂一层薄薄的凡士林油，刃口向下放在试样上。 (4) 用切土刀沿环刀外缘将土样削成略大于环刀直径的土柱，然后慢慢将环刀垂直下压，边压边削，到土样伸出环刀上部为止，削去环刀两端余土，使与环刀口面齐平。把削下的土样做含水率试验。 (5) 擦净环刀外壁，称量环刀加土的质量m 2，准确至0.1g 。 (6) 用推土器将试样从环刀中推出。 (7) 本试验应进行二次平行测定，两次测定的差值不得大于0.03g/ cm 3,取两次测定的算术平均值。 3.成果整理 (1) 按式（7—1）计算土的湿密度： ()021m m V ρ=- （7—1） 式中：ρ0 —— 土的湿密度（g/ cm 3），准确到0.01 g/ cm 3； m 1 —— 环刀的质量（g ）； m 2 —— 环刀加土的质量（g ）； V —— 环刀容积V (cm 3)。 (2) 按式（7—2）计算土的干密度： ()0010.01d w ρρ=+ （7—2） 式中：ρd —— 土的干密度（g/ cm 3）； w 0 —— 土的含水率（%）。 (3) 填写试验记录。格式见表7-1。 表7-1 密度试验记录（环刀法） 试验日期 试验者 计算者 校核者 4.注意事项 (1) 操作要快，动作细心，以避免土样被扰动、破坏结构及水分蒸发。 (2) 环刀方向要正、要垂直，加力适当。 (3) 边压边削的时候，切土刀要向外倾斜，以免把环刀下面的土样削空。
一、Transwell小室制备 1. 无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
施工现场回填土试验取样方法 一、依据标准 《建筑地基基础施工质量验收规范》 《建筑地面工程施工质量验收规范》 《土工试验方法标准》 二、检验项目 检验项目一般依据施工图纸要求，包括密度和含水率两个指标。 在建筑工程的施工图纸上如果规定有密度指标，则回填后委托密度试验；施工现场的实测干密度ρd应不小于工程图纸要求的最小干密度ρdmin的控制指标。如果规定有压实系数指标，则先委托击实试验（击实试验提供给施工单位该土最佳含水率ωop状态下的最大干密度ρdmax及控制干密度）；然后现场按击实试验报告中的最佳含水率和控制干密度回填后再委托密度试验，实测干密度应不小于击实试验报告中的控制干密度。 三、取样要求 1.取样方法 密度试验常用取样方法有：环刀法、灌砂法、灌水法、蜡封法。其中环刀法与灌砂法应用较为广泛。 用环刀法取样，取样部位应在每层压实后的下半部。取样时应事先在环刀内壁涂一薄层凡士林，刃口向下放在土样上，将环刀垂直下压，直至土样高出环刀。将环刀整个挖出，用切土刀将环刀外侧土样削掉，用钢丝锯整平环刀两端土样。取出环刀内土，编号，装入密封袋内。 2.取样数量 2.1压实回填土的过程中，应分层取样检验土的干密度和含水率。 2.1.1基坑每50～100m2应不少于1个检验点； 2.1.2基槽每10～20m应不少于1个检验点； 2.1.3每一独立基础下至少有1个检验点； 2.1.4对灰土、砂和砂石、土工合成材料、粉煤灰等地基，检验数量每单位工程不应少于3点，1000m2以上的工程每100m2至少有1点，3000m2以上的工程，每300m2至少有1点。
2.2场地平整 2.2.1每100～400m2取1点,但不应少于10点； 2.2.2长度、宽度、边坡为每20m取1点，每边不应少于1点。 2.3击实试验取样时，用四分法取代表性土样20kg（重型为50kg）。若为灰土，白灰的取样数量按比例而定。
二密度试验 2.1基本原理： 土(体)的密度是指土的单位体积的质量，单位是g/cm3或kg/m3，土的密度可分为天然密度（湿密度）和干密度两种。 2.2试验方法及适用范围 ?环刀法：一般适用于原状样中的细粒土，未受扰动的砂土，以及形状规则的土体。 ?蜡封法：适用于具有不规则形状的易碎裂的难以切割的土体。 ?灌砂法，灌水法：用于对粗粒土密度的测试，主要用于施工现场的测试。 2.3 仪器设备 ?环刀法：环刀，天平，切土刀，钢丝锯，凡士林等 ?蜡封法：架盘天平（最大称量500克，感量0.01克），蜡，烧杯，细线，针，切土刀等 ?灌水法：台称（最大称量20千克，感量1克，最大称量50千克，感量5克），水平尺，铁铲，塑料薄膜，盛水桶， 装土器具等 2.4试验步骤 (环刀法) ?称量所使用环刀的质量和体积。 ?取待测试的土样，整平其两端，在环刀内壁均匀地涂上一薄层凡士林，然后将环刀刀口向下放在土样上。 ?将土样削成略大于环刀直径的土柱，然后将环刀向下压，边
压边削，至土样露出环刀为止，将两端余土削平修平，并取 剩余代表土样测定含水率。 ?擦干环刀外壁，称量环刀和土的总质量。 ?计算ρ0 = m /v ρd = ρ0/(1+0.01w) ?本试验需进行两次平行测定，其平行差值应不大于0.03g/cm3，否则应重新测定，取两次的平均值作为该土样的密度值。 实验数据的计算过程 环刀号：315 环刀质量：42.92g 环刀＋土重：160.98g 环刀体积 60cm3 密度：（160.98g－42.92g）／60cm＝1.97g／cm3 环刀号：280 环刀质量：42.91g 环刀＋土重：164.19g 环刀体积60cm3密度：（164.19g－42.91g）／60cm＝2.02g／cm3 平均密度：（1.97+2.02）／2=1.995g/cm3 指标应用： （1）密度是土的基本物理指标之一，可用来计算土的干密度，孔隙比指标等。 (2) 用来计算土的自重应力。 (3) 用来计算地基稳定性和地基承载力。
1 试样制备 1.1试样制备 1.1.1本试验方法适用于颗粒粒径小于60mm的原状土和扰动土。 1.1.2根据力学性质试验项目要求，原状土样同一组试样间密度的允许差值为0.03g/cm3；扰动土样同一组试样的密度与要求的密度之差不得大于± 0.01g/cm3，一组试样的含水率与要求的含水率之差不得大于±1%。 1.1.3试样制备所需的主要仪器设备，应符合下列规定： 1细筛：孔径0.5mm、2mm。 2洗筛：孔径0.075mm。 3台秤和天平：称量10kg，最小分度值5g；称量5000g，最小分度值1g；称量1000g，最小分度值0.5g；称量500g，最小分度值0.1g；称量200g，最小分度值0.01g。 4环刀：不锈钢材料制成，内径61.8mm和79.8mm，高20mm。 5击样器。 6压样器。 7其他：包括切土刀、钢丝锯、碎土工具、烘箱、保湿缸、喷水设备等。 1.1.4原状上试样制备，应按下列步骤进行： 1将土样筒按标明的上下方向放置，剥去蜡封和胶带，开启土样筒取出土样。检查土样结构，当确定土样已受扰动或取土质量不符合规定时，
不应制备力学性质试验的试样。 2根据试验要求用环刀切取试样时，应在环刀内壁涂一薄层凡上林，刃口向下放在土样上，将环刀垂直下压，并用切主刀沿环刀外侧切削土样，边压边削至土样高出环刀，根据试样的软硬采用钢丝据或切土刀整平环刀两端土样，擦净环刀外壁，称环刀和土的总质量。 3从余土中取代表性试样测定含水率、界限含水率等项试验的取样。 4切削试样时，应对土样的层次、气味、颜色、夹杂物、裂缝和均匀性进行描述，对低塑性和高灵敏度的软土，制样时不得扰动。 1.1.5扰动土试样的备样，应按下列步骤进行： 1将土样从土样筒或包装袋中取出，对土样的颜色、气味、夹杂物和土类及均匀程度进行描述，并将土样切成碎块，拌和均匀，取代表性土样测定含水率。 2对均质和含有机质的土样，宜采用天然含水率状态下代表性土样，供颗粒分析、界限含水率试验。对非均质土应根据试验项目取足够数量的土样，置于通风处凉干至可碾散为止。对砂土和进行比重试验的土样宜在105～110°C温度下烘干，对有机质含量超过5%的土、含石膏和硫酸盐的土，应在65～70°C温度下烘干。 3将风干或烘干的土样放在橡皮板上用木碾碾散，对不含砂和砾的土样，可用碎土器碾散（碎土器不得将土粒破碎）。 4对分散后的粗粒土和细粒土，应按要求过筛。对含细粒土的砾质土，
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 腺病毒包装简要流程 1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用 PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 、慢病毒和腺病毒的比较 2、构建目的基因到载体
教学设计原理 R.M.加涅
相关书籍： 《学习的条件和教学论》R.M.加涅 《学习心理学：一种面向教学的观点》P.M.德里斯科尔 《学习与教学》R.E.梅耶 《教学设计原理》R.M.加涅 《学习、教学与评估的分类学：布卢姆教育目标分类的修订》布卢姆《系统化教学设计》W.迪克 《教学设计》P.L.史密斯
一教学系统导论 1 教学设计导论 教学设计的主体内容：教师用来使学生参与到学习活动中去的完整的活动范围，如： ?如何将学生进行分组，以有助于学生学习和交流 ?什么时候练习与反馈最有效 ?技能知识学习的前置知识有哪些 掌握教学设计原理的目的： 按照一定的理论，对教学设计过程进行设计，促进学生参与到学习事件和活动中去，使教学更有效。 1.1 教学设计的基本假设 没有哪一种教学设计模型是最佳的，基本假设： ?教学设计是帮助学习过程，而不是教学过程（目的是达到教学效果） ?学习效果受多种因素的影响（毅力、时间、教学质量、学生能力、原有知识、学习能力等） ?教学设计模型可运用到多种教学场景下（学生个体、小组、大组），原理保持不变 ?利用学习者对教学设计进行检验，反复设计与验证，使教学趋于完善 ?教学设计本身是一个过程，包含相关子过程（原子过程是：将学生置于学习过程中的预习、评价、 反馈等） ?不同的学习目标需要不同的教学形式 1.2 学习原理 学习情境 人在清醒的时刻，都在观察和处理信息，一些信息被记忆，一些被摒弃。 是什么让人记忆： ?学习者内部（来源于学习者，想获知） ?学习者外部（提供一个事件，包括学习内容、目的、方法等环境）
?学习者、学习发生的情境、学习的内容、学习过程等存在着相互作用 教学原则 从学习原理中，指导教学设计的一些原则： ?接近：教学环境与学习目的相接近 教学情境的设计接近学习的目的，或学习预期。教学设计以达到教学目标为纲，而不应以方便学习或教学为目的。如，学习目的是“在没有帮助的情况下，装配一支枪”，教学中要尽量避免给学生图纸。 ?重复：教学环境与学习者的反应需要重复，以使学习得到进步 重复的教学环境和学习者反应，只是一种练习形式，而非基本条件，也不是必须的。 ?强化：使学习变得有期望，以便学习者能“自我激励” 学习过程中，如果能让学习者看到预期的结果，并相信能达到，将使学习得到强化。预期的结果可以分为两种 ?短期，如学习习得了，就有奖励等 ?长期，如社会期望、人生追求、家庭厚望等 ?合作协商：学生与其他学生或知识丰富的人一起学习，以确认信息的意义，即合作学习环境可以 促进学习 ?广泛认知：学生广泛的获取相关惰性知识（初步接触，并不注重应用，在需要时能回忆起来，并 通过进一步学习掌握的知识），是教学环境设计的一部分 ?组织活动：通过参加活动来促进学习发生 要明确学习是活动的结果和目的。
目录 1．总则--------------------------------------------------------- 3 2．术语、符号-------------------------------------------------3 3. 试样制备----------------------------------------------------5 4. 含水率试验-------------------------------------------------7 5. 密度试验----------------------------------------------------8 6. 颗粒分析试验----------------------------------------------8 6.2 粘粒分析移液管法试验----------------------------------10 7. 液塑限含水率试验----------------------------------------12 8 固结/黄土湿陷试验---------------------------------------13 9. 直接剪切试验---------------------------------------------17
土工试验方法 1．总则 1.0.1 为了测定土的基本工程性质,统一试验方法,为本工程设计和施工提供了可靠的参数,特制定本标准。 1.0.2 本标准适用于工业与民用建筑、水利、交通等各类工程的地基与填筑土料的基本工程性质试验。 1.0.3 土工试验资料的整理，应通过对样本（试验测得的数据）的研究来估计土体单元特征及其变化的规律，使土工试验的成果为工程设计和施工提供准确可靠的土性指标，试验结果的分析整理应附录A进行。 1.0.4 土工试验所用的仪器、设备应按现行国家标准《土工仪器的基本参数及通用技术条件》GB/T15406采用，并定期按现行有关规程进行检定和校准。 1.0.5土工试验方法除应遵守本标准外，商应符合有关现行强制性国家标准。 2．术语、符号 2.1 术语 2.1.1 校准 在规定条件下，为确定计量仪器和测量系统的示值或实物量具有所代表的值与相对应的被测量的已知值之间关系的一组操作。 2.1.2 测力计 强度试验时所用的钢环或负荷传感器。 2.1.3 平行测定 在相同条件下，采用两个以上的试样同时进行试验。 2.1.4 抗剪强度参数 表征土体抗剪切性能的指标，包括粘聚力和内摩擦角。 2.1.5 土试样 用于试验的具有代表性的土样。 2.2 符号 2.2.1 尺寸和时间
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
《教学设计原理与方法》考评方式与标准 一、考核的形式 本课程考核的形式主要有三种，分别是日常考查、项目实践评定与期末考试评定。 日常考查是一种伴随日常教学而进行的经常性检查和了解学生学习情况的方法。本课程采用的日常考查形式主要是习题作业。 项目实践评定是一种针对项目或任务的实践成果而进行考核评价的方法。本课程综合采用电子作品（e-work）和评价量规（rubric）对每一项目实践的成果加以评定。 ?电子作品是学习者根据所学的知识，针对某一主题独立完成任务并以成果的 形式如电子作品、解决方案、研究报告、网页等方式展示自己的学习所得。 ?评价量规是一个评分工具，它为一个作品或其他成果表现列出标准，并且从 优到差明确描述每个标准的水平。 期末考试是依据课程目标和内容，选择一系列有代表性的问题，按照一定的程序与方式，对学生所学知识的掌握程度及综合运用知识的能力进行测量与评价的方法。 二、考核的内容 针对不同的考核形式，相应地，有不同的考核内容。 日常考查的内容主要是各教学专题的习题作业，请参见习题作业。 项目实践评定的内容主要是三个电子作品，并依据三个评价量规进行评价（如表1所示）。 项目实践内容电子作品评价量规 项目实践1：网络教学资源 的设计选择某一个学科的某一个内容，基 于一定的教学策略与设计方法，参 照资源技术规范，设计与开发一个 网络教学资源。 参见“附录1：网络教学资源 评价量规” 项目实践2：教学过程（模 式）的设计依据已开发的学习资源，选择合适 的教学模式（策略）进行教学过程 设计，撰写一份教学设计方案。 参见“附录2：教学设计方案 评价量规” 项目实践3：教学（培训）绩效改进方案的设计结合具体的问题，运用以绩效为导 向的教学设计方法，设计一份教学 （培训）绩效改进方案。 参见“附录3：教学（培训） 绩效改进方案评价量规”