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大肠杆菌发酵经验总结

大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结

大肠杆菌发酵经验总结

首先,补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量(主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量,进而影响),所以适当的控制补料速率和比生长速率,对于控制乙酸的量有很好的效果。

其次,必须要保证充足的溶氧,并严格控制pH值,而且补酸碱的速率尽量缓和,不能太快;温度对于蛋白的表达也有很重要的影响,较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的,而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。

第三,选取合理的诱导时间非常重要,一般的诱导时间选在指数生长后期,而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内,选在此时诱导,1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开,使这两个阶段互不影响,有利于蛋白的高表达;2.已经得到了大量的菌体,而且菌体的生物量基本接近稳定,不论是从动力学角度,还是能耗,物料成本方面,都比较合理。

第四,补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高,会使菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累,氮源不足,则菌体繁殖量少从而影响产量;碳源过多,则容易刑场较低的pH,抑制菌体生长,碳源不足,则容易引起菌体的衰老和自溶。另外,碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质,从而直接影响菌体的生长和产物的合成。

根据自己的经验,一般情况下,对于一个稳定的发酵工艺下,如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象,而且能排除噬菌体和染菌的可能性后,那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。

大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响,针对我们论坛所发的帖,我先总结以下几点,并作出相应解决措施。

一、代谢副产物-乙酸

乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物,在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一,一般认为在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时,细胞将会停止生长,当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。

预防乙酸产生的措施:

1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生:

比生长速率越高,乙酸产生越多,当比生长速率超过某个值时,乙酸开始产生。可以通过降低温度,调节酸碱度,控制补料等方法来降低比生长速率。

2、透析培养:

在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质,降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。

3、控制葡萄糖的浓度:

葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一,用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上,以减少乙酸的产生。

常用的控制方法主要有:

恒pH法:大肠杆菌会代谢葡萄等产生乙酸,使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标,该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果,容易造成补料体系出错。

恒溶氧法:菌体代谢时会消耗氧,使溶氧下降,当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降,消耗氧能力下降,溶氧上升。因此,根据溶氧曲线补加葡萄糖,保持溶氧恒定,可以控制葡萄糖在一定的水平。

二、温度

大肠杆菌发酵最适温度是37 C,当温度最适菌体生长时,比增长速率将会增大。随温度上升细菌代谢加快,其产生代谢副产物也会增加。这些副产物会对菌体的生长产生一定的抑制作用。菌体生长过快也会影响质粒的稳定性。降低培养温度,菌体对营养物质的摄取和生长速率都会下降。同时也减少了有毒代谢副产物的产生和代谢热的产生。有时降低温度更有利于目的蛋白的正确折叠及表达。在重组大肠杆菌的发酵中不同发酵阶段其最适温度也不同,为了能获得大量的目的蛋白,首先要保证菌体的量,因此在前期可优先考虑菌体的生长,到诱导阶段应将目的产物的表达放在首位。

三、培养方式

微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批3种。大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养,这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式,能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象,另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。

生物技术研究者追求的两个主要目标,一是新型生物产品的开发,另一就是为传统的或新生生物产品,寻求更经济的生产方式。近十年来,利用遗传工程技术来生产一些重要的生物药物,是生物技术领域中迅速发展的一个重要方向。在这一研究领域里,如何创造更经济、更有效的方法,来提高生产过程的经济性和产品的市场竞争力,已经成为生物技术领域的科学家们所关注的焦点问题。

利用重组DNA技术生产重要的生物药物,在人类文明史上具有划时代的意义。由于生产成本和生产率的高低直接影响公司的生存,重组生物药物生产过程的优化已经成为一个重要问题。它包括以下六个方面∶(1)适宜宿主的选择;(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定;(3)重组基因最大表达的分子策略;(4)细胞生长和生产环境的优化;

(5)发酵条件的优化;后处理过程的优化。只有这六个方面都以实现高生产率为目标,整个

生产过程的最优化才能实现。

(一)细胞生长环境的优化策略

要提高细胞密度和生产率,首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化,包括生长培养基的组成,培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件。优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下,避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。1.培养基组成的优化

培养基中通常含有碳(能)源、氮源,以及微营养物如维生素和微量元素,这些营养物的浓度与比例,对实现生产重组微生物的高密度发酵是很重要的。例如,过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉生产L-苹果酸;链霉菌在60~80 mmol/L CO32-存在下,其丝氨酸蛋白酶生产能力可提高10倍之多;在重组微生物达到高细胞密度后,限制磷酸盐浓度可使抗生素和异源白介素β的产率显著提高。此外还发现,限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的生长,但比起精氨酸充足时细胞生长优良的情况,其重组α-淀粉酶的产量可提高2倍。

培养基中复合氮源的种类对重组大肠杆菌的高密度发酵也非常重要。一般地,当流加培养基中含有酵母膏时,重组蛋白不稳定;而当流加培养基中含有蛋白胨时,大肠杆菌不能再利用其所产生的乙酸。将酵母膏和蛋白胨都加入流加培养基中,不但所生产的重组蛋白非常稳定,细胞还能再利用代谢合成的乙酸,这是一种非常有趣的代谢机制。

恒化技术可用于优化精氨酸营养缺陷型大肠杆菌X90的生长培养基。使该菌株以0.4 h-1的比生长速率在含精氨酸的基本培养基上生长,待培养达到稳定状态后,在恒化器内分别加入氨基酸、维生素和微量元素来考察这些物质对菌体生长和精氨酸合成的影响。结果表明,由于氨基酸生物

合成途径的末端产物抑制作用,加入某些氨基酸后,细胞生长反而受到抑制。加入NH4Cl后细胞量则出现了戏剧性的增长。而添加维生素对菌体生长基本上没有任何影响。通过计算生物量对每种基质的产率,最终可以确定高密度发酵培养基的组成,在此优化培养基上,大肠杆菌X90细胞密度可达到92 g/L,同时形成56 mg/L的胞外重组蛋白酶。

2.特殊营养物的添加

在某些情况下,向培养基中添加一些营养物质能提高生产率。这些营养物的作用有可能是作为产物的前体,也有可能是阻止产物的降解,例如,在培养重组大肠杆菌生产氯霉素乙酰转移酶(一种由许多芳香族氨基酸组成的蛋白)时添加苯丙氨酸,可将酶的比活力提高大约2倍;在培养重组枯草芽孢杆菌生产β-内酰胺酶的培养基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸钾能使重组蛋白的稳定性显著提高。其原因可能是由于宿主细胞产生的多种胞外蛋白酶的活性被抑制,从而防止了重组蛋白的降解。

在生长培养基中添加特殊物质有时还能以一种未知的机制提高生产率。例如,在摇瓶培养Micro monospora cbersina时添加碘化钠可使dynemicin A的产量提高35倍,但在小型反应器中却无法重复这一结果。

3.限制代谢副产物的积累

培养条件的控制对代谢副产物的形成影响甚大。在分批或流加培养中,某些营养物的浓度过高均会导致Crabtree效应的产生。在这种效应下,酿酒酵母会产生乙醇,大肠杆菌则会产生过量乙酸,一旦生成乙酸,细胞生长及重组蛋白的生产均会受到抑制。大肠杆菌形成乙酸的速度依赖于细胞的生长速度和培养基的组成。业已确证,如果在培养基中添加复合营养物(如大豆水解物),则会增加乙酸的积累量。针对如何减轻由于乙酸积累而产生的负面影响,众多研究者进行了大量工作,如利用循环发酵技术来限制乙酸在重组大肠杆菌高密度培养中的积累。近来也有研究表明,添加某些氨基酸能减轻乙酸的抑制作用。如在培养基中添加10 mg/L的甘氨酸能显著促进大肠杆菌合成重组α-淀粉酶和β-内酰胺酶,并能刺激酶从周质向培养基中释放,但此时仍有乙酸伴随生成。

(二)培养模式

由于许多营养物在高浓度下对细胞有抑制作用,而为了达到高细胞密度,又必须供给大量的营养物质,因此,浓缩营养物必须以与其消耗速率成比例的速度加入反应器中。为此产生了多种形式的补料策略,它可以简单到线性补料,也可以复杂到利用数学模型计算得出的策略来控制补料速率。具体来说,培养模式的选择主要依赖于以下三个因素∶(1)所培养细胞的具体代谢行为;(2)利用抑制性底物合成目的产物的潜力;(3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力。

1.大肠杆菌流加发酵策略

大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株,广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生,因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研究发现,即使葡萄糖浓度只有0.25~0.5 g/L,大肠杆菌仍会产生乙酸。因此,高细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定,以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中,这样不仅可以防止底物积累到毒性水平,也不会使细胞处于饥饿状态。

近年来已经报道了多种控制大肠杆菌流加培养中流加速率的方法,其中大多数是将流加速率与一种物理参数间接耦合(如溶氧、pH或CO2释放速率)。有学者将溶氧控制在一个预定值上以保证较低的生长速率,结果乙酸产生很少,最终细胞干重达到110 g/L,并发现较低的比生长速率还有利于重组蛋白的高表达。在另一个控制低比生长速率的高细胞密度培养中,研究者采用先指数流加葡萄糖、铵盐和无机盐,后采用广义线性流加的培养策略,有效地防止了乙酸的积累,重组大肠杆菌的细胞密度达到66 g/L,通过温度诱导可在胞内形成19.2 g/L的活性重组蛋白。

如果将葡萄糖浓度控制在一个不致于产生毒性的足够低的水平上,也可以使细胞在不存在限制性

基质的情况下迅速生长到高细胞密度。这种控制策略对仪器的要求较高。Kleman等采用在线葡萄糖分析仪,以微生物对葡萄糖的需求来决定葡萄糖和其它营养物的流加速率,这一算法能够在产物诱导阶段中根据细胞生长的变化自动调整流加速率。培养携带质粒的大肠杆菌MV1190,其质粒中带有编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因,最终细胞干重达到39 g/L,产生1.7 g/L

可溶的活性蛋白。

2.重组酵母的流加发酵

酵母中广泛用于遗传工程研究的菌株是酿酒酵母。但采用酿酒酵母作为重组宿主也有以下缺点∶(1)重组蛋白生产的水平较低;(2)质粒不稳定;(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出现的,因为这会抑制重组蛋白的形成。近来研究表明,其它酵母,如巴斯德毕赤氏酵母也具有作为重组宿主的潜力。Clare等比较了重组巴斯德毕赤氏酵母和酿酒酵母在高细胞密度状态下表达和分泌鼠表皮生长因子的能力。培养每基因组含有19个拷贝数的巴斯德毕赤氏酵母,最终可获得447 mg/L胞内重组蛋白;而培养酿酒酵母所获得的最高水平仅6~7 mg/L。

通过先指数流加,后采用基于CO2释放和RQ值的线性流加控制方式可使重组巴斯德毕赤氏酵母的细胞干重达到80~90 g/L,并分泌高水平的重组人血清蛋白。而培养酿酒酵母,细胞干重和重组蛋白的产量仅分别为25 g/L和20 mg/L。即使将酿酒酵母的生长速率维持在0.12~0.18 h-1,也将形成10~13 g/L的乙醇,因而导致产率降低。但酿酒酵母产乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一个复杂的流加系统,将酵母的生长速率控制在0.3 h-1,可使谷胱甘肽(G SH)的生产最大而乙醇的生成最小。

3.流加培养的控制

一个好的流加控制系统必须避免两种倾向∶一是流加过量,补料组分在反应器中积累从而对细胞生长和产物形成产生抑制;二是流加不足,这可能会导致细胞必需营养物的缺乏。计算机技术的迅猛发展,为流加培养的控制提供了更有效的手段。近年来,应用计算机技术来监测和控制发酵过程的研究屡见报道。由于现代计算机技术的帮助,人们能够采用多种生长参数和数学模型来控制流加培养中营养物的添加,从而使复杂的控制系统得以实现。在各种人工智能技术中,模糊推理(fuzzy reasoning)是应用最广的一种。模糊逻辑控制(fuzzy logic control)部分依赖于数学生长模型,也采用“语言定义的规则系统”(linguistic ally defined rules system)来帮助系统响应发酵过程的非线性和动态行为。Alfafara等在流加培养酿酒酵母生产谷胱甘肽的研究中,采用一个模糊逻辑控制系统来控制葡萄糖的流加速度,对系统进行优化后谷胱甘肽的比产生速率达到6.2 h-1。目前,在流加培养中应用模糊逻辑控制技术的最大问题在于如何减少底物和产物浓度振荡所需的调整次数。自适应模糊逻辑控制算法的发展可望对此有所帮助。

(三)诱导策略

对于许多带有诱导型启动子的重组微生物,只有将生长期和产物形成期分开才能获得最大生产率。在流加培养中,这两段时期的分离可以通过延迟诱导直至细胞生长已达到高密度来实现。此外,如果质粒稳定并且产物对培养物无毒,那么可以用重复补料分批培养系统来提高生产率。有学者采用重复补料分批培养技术培养酿酒酵母,每24 h更换50%的培养基,持续30 d,其产物(hirudin)的产量可比连续培养系统提高3倍。

如果诱导物和产物对细胞都有毒性,那么应当人为地将诱导期和生长期分开。对于这种情况,两级连续培养是最适宜的培养方式。控制第一罐的条件,使细胞生长处于最适状态之下,而诱导与产物形成则发生在第二罐中。例如,在恒化器中培养一株能产β-内酰胺酶的重组大肠杆菌,将第一罐的发酵液导入第二罐中,构成一个两级培养系统。第二罐中添加营养物以及IPTG作为诱导物。结果获得300 mg活性β-内酰胺酶(相当于总蛋白的25%),其中90%分泌至胞外。这一系统至少可以稳定运行50 d。另一相似的系统被用于培养大肠杆菌生产重组蛋白A-EcoRI蛋白融合体。培养在恒浊器中进行,对第二罐进行热诱导,结果获得了比分批发酵高6倍的比生产率。研究者还尝试将生产重组蛋白的两级连续培养系统与亲和色谱柱相组合,试图实现重组蛋白生产

和纯化的连续化。但由于技术上的一些原因,这种组合还未得到成功。

比生长速率对细胞生长和产物形成均有重要作用。经常会遇到的情况是,最适于细胞生长的比生长速率却并不适于产物的形成或其它特性的实现。我们在培养面包酵母时发现,比生长速率为0.

2 h-1时细胞产率最高,而比生长速率为0.178 h-1时酵母发酵活力最佳。针对这一现象我们提出了一个两阶段控制比生长速率的流加培养策略,结果在一个反应器中实现了高发酵活力与高细胞产率的统一。(四)细胞循环发酵从反应器角度来考虑获得高细胞密度,通常采用的是细胞循环生物反应器。这种反应器利用一种切向流或中空纤维过滤器从醪液中分离细胞,细胞返回容器,无细胞醪液则以给定速率连续转移,同时代之以新鲜培养基。利用细胞循环技术,可使细胞保留在反应器中并达到高细胞密度,而毒性废产物和胞外产物则不断转移,这可以延迟或防止由细胞生长或产物形成引起的反馈抑制。细胞循环生物反应器能够适用于多种机体和生产系统,但它的应用也存在许多限制,主要包括∶(1)作用于进入过滤单元的细胞的剪应力太大;(2)系统的放大存在许多实际困难。

操作细胞循环生物反应器时必须考虑两个因素,一是稀释率(流速/体积);二是循环速率(指通过过滤系统的培养基速率)。稀释率的大小影响细胞的生长速率,不同的实验目的对稀释率的要求也不同;高的循环速率可使组分混合均匀,特别适用于细胞容易凝聚或成团的情况。但循环速率过高会使作用在细胞上的剪切力过高,也会导致过滤单元膜的迅速损坏。因此,很难同时确定合适的稀释率与循环速率,这也是限制细胞循环技术应用的一个重要因素。

细胞循环技术可望获得高的体积生产率,这对产物的提取非常有利。近年来循环发酵技术已广泛用于生产细胞代谢物,如燃料酒精和有机酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用细胞循环发酵技术,重组大肠杆菌细胞干重达到145 g/L,其重组青霉素酰化酶生产率比分批培养提高了近10倍。对于活细胞即为所希望的产物的培养,细胞循环发酵也能发挥作用。如在食品工业中,为生产牛奶,奶酪和酸乳酪需培养不同的乳杆菌,采用细胞循环生物反应器可以很容易地提高这些生物体的的密度。

在多种控制手段的帮助下,目前人们已经能很容易地获得超过100 g/L的细胞密度。但已有的研究结果表明,与最适生物量形成所对应的生长条件通常会导致较低的比生产率。例如,用细胞循环反应器生产2,3-丁二醇,生物量提高了大约6倍,但体积生产率只提高了2~3倍。同样,流加培养可以使链霉菌的细胞干重达到43 g/L,但蛋白酶活为零,而当细胞干重为18 g/L时蛋白酶活却高达3500 U/mL。我们在研究中也经常遇到类似问题。要解决这一问题,一方面应当研究如何促进重组蛋白的高效表达和提高重组菌株的稳定性,另一方面要研究与高细胞密度相关联的高水平产物的形成条件。

引言:高密度培养技术(High—cell—density cultivation,HCDC),也就是高密度发酵技术,提高菌体的发酵密度,最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)不仅可以减少培养体积、强化下游分离提取,还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本,能极大地提高产品在市场上的竞争力。这一目的的实现,除了重组菌本身的表达性质外,还必须赋予重组菌生长和产物表达的最适环境条件,包括适宜的培养基组成、合适的培养温度、pH、稳定的比生长速率、适宜的溶解氧以及营养物的合理流加等。重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键技术是补料策略,也就是根据重组菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养物流加方式。碳源和氮源是两种常用的限制性基质,葡萄糖因细菌利用快且价廉易得,已广泛用作重组菌高密度发酵的限制性基质。大肠杆菌在过量葡萄糖或缺氧的条件下会发生“葡萄糖效应”,积累大量有机酸而影响重组菌的生长和外源蛋白的有效表达。因此大肠杆菌高密度发酵中,合理流加碳源使葡萄糖效应降低,是成功的关键。

首先对重组Escherichia coli的高密度培养一文进行重点推荐https://www.doczj.com/doc/fd1679485.html,/read.php?t id-2728-toread-1.html

该文从高密度培养过程中培养基成份及作用、高密度培养的过程控制参数、底物补料方式的种类及特点对重组Escherichia coli高密度培养进行了概述;并阐述了乙酸的生成机制和控制乙酸生成的策略;最后对重组Escherichia coli高密度培养及外源蛋白高表达进行了研究。知识点全,阐述细致全面,不愧为大肠杆菌培养者和学习者的不错选择,版主在此进行重点推荐

其次有很多会员对培养的相关问题进行了讨论,具体讨论话题及内容总结如下:

问:请问大肠杆菌发酵中C:N怎么来控制啊?

答:如果是在分批补料发酵中C含量控制在0.35-0.5%,N含量控制在0.07-0.15% ,经验之谈

问:请教大肠杆菌摇瓶发酵用的化学合成培养基都有哪些?

答:LB,SOB,SOC等,具体可以查阅分子克隆!

讨论1:大肠杆菌是否能利用乙酸作为碳源的问题讨论

问题:发酵过程中大肠杆菌在葡萄糖等碳源消耗完的情况下,能否利用其代谢产生的代谢副产物乙酸作为碳源?

回答1:不能啊,乙酸又不能进入TCA循环

回答2:大肠杆菌就怕产生乙酸影响代谢。

回答3:能利用其代谢产生的代谢副产物乙酸作为碳源,没有问题的。不知道楼上两位怎么会说不能利用。但是过高的乙酸对菌体生长不利

回答4:乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物,在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一,一般认为在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时,细胞将会停止生长,当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。

看到过以乙酸作碳源进行大肠杆菌发酵的,但不是高密度发酵,且直接以乙酸作碳源(不加入任何其它碳源),而不是以代谢产生的乙酸为碳源。乙酸是不能直接进入TCA循环的,必须是被氧化后才能被利用。3楼的说能够利用其代谢副产物乙酸作为碳源,我也愿听其详,望不吝赐教!

除TCA循环外,还牵涉到乙醛酸途径和磷酸戊糖途径。但一般的大肠杆菌都是进行TCA循环,除了一些特殊菌种如lpdA基因敲除突变E.coli当TCA循环被抑制就会进行乙醛酸途径和磷酸戊糖途径。

回答5:我做的是大肠杆菌的基因工程菌,就是不能利用乙酸,要防止乙酸的产生,对于整个代谢有很大影响。

回答6:这个问题呢大肠杆菌绝对是可以利用乙酸的。因为我做的就是关于大肠杆菌产乙酸的课题。当以葡萄糖为碳源时,大肠杆菌回产生乙酸。而当葡萄糖被消耗光以后,大肠杆菌就可以利用乙酸来提供能量。这一点是肯定的

我在实验过程中还同时补加乙酸和葡萄糖,实验数据表面是可以利用乙酸的。

但是由于乙酸的可以影响大肠杆菌的生长和外源基因的表达,所以在以葡萄糖为碳源时,都采用限制流加方式来补料。

但实际上大肠杆菌是可以利用乙酸的。

回答7:具体的利用途径是乙酸首选被转化成乙酰辅酶A,然后可以进入TCA循环,同时也可以利用糖异生途径来和成其他氨基酸的前体。具体的途径可以查一下NCBI上面的文献。

回答8:可以吧,没有碳源的情况下,适量的乙酸应该还可以有利于生长的,所以发酵中,诱导前可以空耗一段时间。

讨论2:做大肠杆菌的高密度发酵时,以甘油作为碳源进行补料流加存在什么问题?

问题:通常以甘油作为碳源进行大肠杆菌的高密度发酵产生乙酸量少,比较容易获得高密度。除了生长速率较慢、菌体收率低,及甘油成本较之葡萄糖高之外,还有什么缺点吗?希望做过这方面研究或有这方面知识的朋友进来一起讨论。

回答1:做基因工程菌发酵,我们采用的是葡萄糖做为唯一的碳源,进行流加补料,如果采用甘油相对比较好,可以减少高密度发酵时,产生的乙酸。

甘油脱水酶不仅对氧敏感而容易失活,而且在有甘油存在时,它也会发生自杀失活,过高的甘油浓度会增加3.磷酸甘油(G3P)的积聚从而明显抑制菌体的生长,由于甘油浓度过低也不利于基因的转移形成。在采用甘油作为碳源,同时补加适量的葡萄糖作为菌体生长的优先碳源,以提高甘油的转化率。我们现在采用葡萄糖作为碳源,下步计划做加入适量甘油来减少乙酸产生的实验。回答2:高密度发酵当中,补料还得注意搅拌转速的问题。不同浓度底物流加对搅拌转速是不一样,我遇过这样的问题。讨论3:影响重组大肠杆菌发酵的主要因素有哪些?问题:大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响,针对我们论坛所发的帖,我先总结以下几点,并作出相应解决措施。

回答1:一、代谢副产物-乙酸

乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物,在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一,一般认为在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时,细胞将会停止生长,当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。

预防乙酸产生的措施:

1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生:

比生长速率越高,乙酸产生越多,当比生长速率超过某个值时,乙酸开始产生。可以通过降低温度,调节酸碱度,控制补料等方法来降低比生长速率。

2、透析培养:

在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质,降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。

3、控制葡萄糖的浓度:

葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一,用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上,以减少乙酸的产生。

常用的控制方法主要有:

恒pH法:大肠杆菌会代谢葡萄等产生乙酸,使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标,该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果,容易造成补料体系出错。

恒溶氧法:菌体代谢时会消耗氧,使溶氧下降,当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降,消耗氧能力下降,溶氧上升。因此,根据溶氧曲线补加葡萄糖,保持溶氧恒定,可以控制葡萄糖在一定的水平。

二、温度

大肠杆菌发酵最适温度是37 C,当温度最适菌体生长时,比增长速率将会增大。随温度上升细菌代谢加快,其产生代谢副产物也会增加。这些副产物会对菌体的生长产生一定的抑制作用。菌体生长过快也会影响质粒的稳定性。降低培养温度,菌体对营养物质的摄取和生长速率都会下降。同时也减少了有毒代谢副产物的产生和代谢热的产生。有时降低温度更有利于目的蛋白的正确折叠及表达。在重组大肠杆菌的发酵中不同发酵阶段其最适温度也不同,为了能获得大量的目的蛋白,首先要保证菌体的量,因此在前期可优先考虑菌体的生长,到诱导阶段应将目的产物的表达放在首位。

三、培养方式

微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批3种。大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养,这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式,能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象,另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。

回答2:基因工程菌最重要的是

1、前期要里积累到一定的数量;

2、数量达到之后,要快速进行诱导;

3、升温之后,要保持一定的补料速率,控制乙酸的积累量,使DNA表达达到最大。

回答3:抑制本底表达至关重要!!!

因为是重组大肠,外源基因的表达对大肠杆菌的生长是有很大影响的,换句话说是有毒性的,只是毒性大小的问题,超过了承受范围结果可想而知,因此如何在添加诱导物前抑制本地表达非常重要!

解决方法:优化培养基,碳源的利用:葡萄糖>乳糖,故可以调整两者的比例实现本地表达的最小化.等到大肠长到具备抵抗力的成熟期就ok了,注意葡萄糖不要多否则后面的IPTG无法起到诱导的作用了! 讨论4:高密度发酵是不是都能实现?

问题:现在心中存在一个疑问:是不是大部分基因工程菌(大肠杆菌或者酵母),都能实现高密度发酵吗????

或者上发酵罐的产量都能比摇瓶水平高吗?????高多少才算正常呢?我听说一个说法:说一般发酵罐条件优化了,都会比摇瓶高50%以上,是真的吗????

回答1:现阶段手上有一个菌种,真是尝试了各种各样的碳源,不同种类的氮源,它的酶活水平就是很稳定,在发酵罐上也调整了溶氧,控制pH,酶活最多只有20%的提高。真是很是郁闷,没有太好的思路

回答2:一般的讲,只要该微生物能高密度生长,则该基因工程菌就可以高密度发酵(除非构建的产物对细胞生长都毒害作用,这个情况很少,因为不会选择这种宿主菌)

至于大罐优化发酵的结果,一般都能提高产量或效价的,因为一般大罐的生长环境比摇瓶要好控制的多。但是结果区别很大,有的大罐发酵可以比摇瓶提高10倍,几十倍的。

回答3:细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定,以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中,这样不仅可以防止底物积累到毒性水平,也不会使细胞处于饥饿状态。

重组Escherichia coli的高密度培养及其过程控制参数

由于Escherichia coli高密度培养能够提高单位体积的产量,利于下游的分离纯化。因此,Esch erichia coli高密度培养是发酵生产追求的目标。目前,采用透析反应器培养E.coli K-12以及培养重组Escherichia coli生产PHB菌体浓度达到204.3g/L DCW。已发表的Escherichia coli最高菌浓为175.4g (DCW)/L。限制Escherichia coli高密度发酵主要是营养供给限制(包括溶氧供给不足),代谢副产物积累和发酵液流变学特性等因素的限制。

高密度培养过程需要控制参数:

溶氧

在微生物培养时,必须不断地向培养液提供足够的氧,以满足微生物生长代谢的需要。在实验室中,可以通过摇床的往复运动或偏心旋转运动对摇瓶中的微生物供氧,而较大生产规模的培养装置则需采用无菌空气并同时进行搅拌的方式对微生物供氧,通风和搅拌的目的就是提供微生物生长和代谢所需的氧。由于微生物的新陈代谢与氧气呼吸有关,调节通气和搅拌可影响发酵周期时间的长短和代谢产物生成的高低,因而发酵液中的溶氧浓度是发酵过程中的一个需要调节控制的

重要参数,在培养过程中有效而经济的供氧是极为重要的。工艺上主要的控制溶氧手段有以下几种1)改变通气速率(增大通风量);(2)改变搅拌速度;(3)改变气体组成中的氧分压;(4)改变罐

压;(5)改变发酵液的理化性质;加入氧载体。

温度

由于微生物的生长和产物的合成代谢都是在各种酶的催化下进行的,而温度却是保证酶活性的重要条件,因此在发酵过程中必须保证稳定而合适的温度环境。温度对发酵的影响是多方面的,对微生物细胞的生长和产物的生成、代谢的影响是由各种因素综合表现的结果。

pH值

发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标,是发酵过程中重要参数,对微生物的生长和产物的积累有很大的影响。对于同一种微生物,由于pH值的不同,形

成的发酵产物也会不同。发酵过程中pH值的变化情况1)在微生物细胞的生长阶段,由于所用的微生物菌种不同,相对于接种后的起始pH值来说,发酵液的pH值有上升或下降的趋势;(2)在生产阶段,一般发酵液的pH值趋于稳定,维持在最适合产物形成的pH范围;(3)在微生物细胞的自溶阶段,随着培养基中的营养物质的耗尽,微生物细胞内蛋白酶的积累和活跃,微生物趋于自溶,引起培养液中氨基酸等的增加,致使pH值上升。引起发酵液的pH值下降的主要原因有1)培养基中的碳/氮比不合适,碳源过多,特别是葡萄糖过量或者中间补糖过多或溶解氧不足,致使糖等物质的氧化不完全,培养液中有机酸会大量积累;(2)消泡油加得过多;(3)微生物

生理酸性物质的存在。引起发酵液pH值上升的主要原因有1)培养基中的碳/氮比不当,氮源过多,氨基酸释放会使pH值上升;(2)生理碱性物质的存在;(3) 中间补料液中氨水或尿素等碱性物质加入过多。

重组Escherichia coli高密度培养及外源蛋白高表达研究

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重组Escherichia coli的高密度培养的目的在于获得更高的目标蛋白单位体积产量。但是在重组Escherichia coli的高密度培养过程中,常常遇见的是高密度低表达现象,表达效率只有摇瓶的三分之一。实现外源蛋白在菌体高密度培养过程中高效率表达仍是工程重组菌发酵的研究热点。高密度培养下提高外源基因表达的策略

(1)添加复合氮源

菌体生长至高密度时,营养成分逐步耗尽。营养的缺乏也是限制高密度培养下实现高表达的因素。Shimizu等发现在表达阶段,限制蛋白胨和酵母抽提物的浓度,对外源基因表达不利,补料液中加大酵母抽提物比例可以提高外源蛋白的表达量。认为有机氮源提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质,减轻了细胞代谢负担,促进了外源蛋白的表达。

(2)利用代谢工程方法消除乙酸的抑制作用

乙酸对菌体生长和外源蛋白表达抑制的机理通常认为是乙酸破坏了跨膜质子梯度,而跨膜质子梯度是氧化磷酸化和其它需能跨膜运输所必需。pH为中性时乙酸以HAc 和Ac-形式共存,Hac 渗透过细胞膜,在细胞内(pH约为7.5)再分解为H+和Ac-。由于不断渗透使胞外HAc和A c-之间平衡向Hac移动,结果引起一个净电中性H+内流,降低了胞内pH 。由于具有缓冲功能的培养基体积大,乙酸渗透不会导致胞外pH发生剧烈变化,因此胞内pH降低将产生去偶联影响。细胞自身的稳态机制需要能量以改变胞内pH降低趋势,即使质子推动力不发生变化情况下也是如此。因此为了快速生长,E.coli不仅需要一个大的质子电动势,而且需要维持最佳胞内

pH。乙酸大量积累将加剧代谢去偶联的发生。也有报道认为乙酸等短链脂肪酸对DNA、RNA、蛋白质、脂质和肽聚糖等的合成均有抑制,而这些大分子物质是菌体生长和外源蛋白表达所必需的。

目前,一些控制乙酸生成的方法正在被人们所研究,比如培养基优化法,有人以甘油代替葡萄糖作为碳源,实现了高密度培养;葡萄糖流加控制也是一种常用的控制乙酸的方法。为了减少或避免乙酸积累,已经发展了各种葡萄糖流加策略,流加方式主要有恒速流加、线性流加、指数流加等。利用代谢工程的方法改造菌种实现控制乙酸生成的手段也越来越被人们所重视。例如PTA 和ACK代谢突变株的筛选。[/size]

3)增强供氧能力

溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中受很多方面因素的限制,而DO往往是最易成为控制因素。这是氧在水中的溶解度很低所致。在28℃氧在发酵液中的100%的空气饱和浓度只有7mg/L,比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100%空气饱和度,若此时中止供氧,发酵液中的DO可在几分钟之内便耗竭,使DO成为限制因素。在工业生产中产率是否受氧的限制,单凭通气量的大小是难于确定的。因为DO的高低不仅取决于供氧,通气搅拌等,还取决于需氧状况。故了解溶氧是否够的最简便又有效的办法是就地监测发酵液中的溶氧浓度。从DO变化情况可以了解氧的供需规律及其对生长和产物合成的影响。

生长过程中从培养液中的溶氧浓度的变化可以反映菌的生理生长状况。随菌种的活力和接种量以及培养基的不同,DO在培养初期开始明显下降的时间不同。一般在接种后1-5h内,这也取决于供氧状况。通常,在对数生长期DO明显下降,从其下降的速率可估计菌的大致生长情况。D O低谷到来的迟早与低谷时的DO水平随工艺和设备条件而异。二次生长时DO往往会从低谷处上升,到一定高度后又开始下降——这是利用第二种基质的表现。生长衰退或自溶时会出现DO 逐渐上升的规律。值得注意的是,在培养过程中并不是维持DO越高越好。即使是专性好气菌,过高的DO对生长可能不利。氧的有害作用是通过形成O,超氧化物基O2-和过氧化物基O22-,或羟基自由基OH-,破坏许多细胞组分体现的。有些带巯基的酶对高浓度的氧敏感,好气微生物曾发展一些机制,如形成触酶,过氧化物酶和超氧化歧化酶(SOD),使其免遭氧的摧毁。次级代谢产物为目标函数时,控制生长不使过量是必要的。

增加溶氧的方法有:①在通气中掺入纯氧或富氧,使氧分压提高;②提高罐压,这固然能增加溶氧,但同时也会增加溶解CO2的浓度,因为它在水中的溶解度比氧高30倍。这会影响pH和菌的生理代谢,还会增加对设备强度的要求;③改变通气速率,其作用是增加液体中夹持气体体积的平均成分;在通气量较小的情况下增加空气流量,DO提高的效果显著。但在流量较大的情况下再提高空气流速,对氧溶解度的提高不明显,反而会使泡沫大量增加,导致逃液。④提高设备的供氧能力(以氧的体积传质(简称供氧)系数KLa表示),从改善搅拌考虑,更容易收效。改变搅拌器直径或转速可增加功率输出,从而提高a值。另外改变挡板的数目和位置,使剪切发生变化也能影响a值。在考查设备各项工程参数和工艺条件对菌的生长和产物形成的影响时,同时测定改条件下的DO参数对判断氧的供需是大有好处的。

(4)优化诱导条件及诱导方法

在重组Escherichia coli高密度培养过程中,要达到重组产物的最大比生产率,还要考虑合适的诱导时间、诱导剂强度、诱导时的温度、诱导的培养基以及营养物的流加策略。[/size]

实验1 大肠杆菌的培养与分离

实验1:大肠杆菌的培养和分离 一、教学要求 二、基本内容 培养 无菌技配制培养基的原 的培养基的配制计算→称量→溶化→调pH 实配制培养基的方法→分装→加棉塞→灭菌→倒验平板 室平板划线法培分离、纯化大肠杆菌 养稀释涂布法系列稀释平板涂布 1.培养基的种类和化学成份 培养基的种类有很多划分标准,按物理性质分:固体培养基和液体培养基(加入琼脂多少)。液体培养基用于扩大培养和工业生产,固体培养基用于菌种分离,鉴定,计数(菌落数量)。 培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。按照微生物的同化作用类型是自养还是异养,碳源不同,自养微生物为无机碳源,如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐,异养微生物为有机碳源,如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。 2.常见微生物类群 原核生物(如细菌大肠杆菌――二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等)、原生生物(草履虫、变形虫等)、真菌(酵母菌――出芽生殖.异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌)、病毒等。 细菌是单细胞的原核生物,有细胞壁(肽聚糖)、细胞膜、细胞质,无成型的细胞核,只有一环状DNA分子(拟核)。以分裂(二分裂)的方式繁殖,分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌(革兰氏染液染色后,再脱色处理,细菌仍保留染色液的颜色)和革兰氏阴性菌两大类,区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性(细胞壁薄,有荚膜)、兼性厌氧的肠道杆菌。 3.无菌技术 对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒;将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌;为避免周围微生物污染,实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行;避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 灭菌方法: 。灼烧灭菌法①接种环、接种针、试管口等使用

最新大肠杆菌发酵经验总结

大肠杆菌发酵经验总结 首先,补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量(主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量,进而影响),所以适当的控制补料速率和比生长速率,对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次,必须要保证充足的溶氧,并严格控制pH值,而且补酸碱的速率尽量缓和,不能太快;温度对于蛋白的表达也有很重要的影响,较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的,而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三,选取合理的诱导时间非常重要,一般的诱导时间选在指数生长后期,而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内,选在此时诱导,1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开,使这两个阶段互不影响,有利于蛋白的高表达;2.已经得到了大量的菌体,而且菌体的生物量基本接近稳定,不论是从动力学角度,还是能耗,物料成本方面,都比较合理。 第四,补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高,会使菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累,氮源不足,则菌体繁殖量少从而影响产量;碳源过多,则容易刑场较低的pH,抑制菌体生长,碳源不足,则容易引起菌体的衰老和自溶。另外,碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质,从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验,一般情况下,对于一个稳定的发酵工艺下,如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象,而且能排除噬菌体和染菌的可能性后,那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响,针对我们论坛所发的帖,我先总结以下几点,并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物,在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一,一般认为在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时,细胞将会停止生长,当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。 预防乙酸产生的措施: 1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生: 比生长速率越高,乙酸产生越多,当比生长速率超过某个值时,乙酸开始产生。可以通过降低温度,调节酸碱度,控制补料等方法来降低比生长速率。 2、透析培养: 在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质,降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。 3、控制葡萄糖的浓度: 葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一,用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上,以减少乙酸的产生。 常用的控制方法主要有: 恒pH法:大肠杆菌会代谢葡萄等产生乙酸,使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标,该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果,容易造成补料体系出错。恒溶氧法:菌体代谢时会消耗氧,使溶氧下降,当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降,消耗氧能力下降,溶氧上升。因此,根据溶氧曲线补加葡萄糖,保持溶氧恒定,可以控制葡萄糖在一定的水平。 二、温度 大肠杆菌发酵最适温度是37 C,当温度最适菌体生长时,比增长速率将会增大。随温度上升细

生物统计学 实验报告 大肠杆菌

A 题 细胞体内代谢物浓度预测 随着基因组、转录组、蛋白质组等各种“组学”研究计划的蓬勃开展,生命科学进入了“组学”时代。代谢组学作为系统生物学的重要分支,其研究的重点是细胞内代谢物种类与浓度的定性和定量分析以及代谢网络的构建和模拟。 对代谢物的检测及浓度测定主要采用实验方法,包括核磁共振、气相色谱-质谱联用和液相色谱-质谱联用等技术。但由于代谢物种类繁多,且大部分浓度较低(μM 数量级),尤其是胞内代谢物提取难度非常大,精确测定其浓度异常困难,而且实验测定需要消耗大量财力物力和人力,因此通过计算机方法对代谢物浓度预测和分析变得越来越重要。 活细胞的代谢物浓度由什么决定?除了一些特定的代谢和酶的作用以外,有没有那种能全局影响浓度值的性质? 试根据附件中的数据完成如下问题: 1 根据不同类型的数据,分析代谢物浓度与其物理化学性质之间的关系。 2 筛选合适的物理化学性质,建立预测代谢物浓度的预测模型,并对此模型进行评价; 1.线性插补法处理缺失数据 原理:用该列数据缺失值前一个数据和后一个数据建立线性插值,然后用缺失点在线性插值函数的函数值填充该缺失值,即: 在于消除不同变量的量纲的影响,而且标准化转化不会改变变量的相关系数。 代谢物浓度:取对数 代谢物理化性质:标准差标准化法 )1,1( m j n i S x x x j j ij ij ≤≤≤≤-=' 式中:.)(11,1121∑∑==--= =n i j ij j n i ij j x x n S x n x 3.SAS 软件建立多元线性回归方程 回归模型一般形式: u X b X b X b b Y k k +++++= (22110)

大肠杆菌微生物培养实验报告及评价标准

实验1 微生物的分离、培养及计数 实验原理 纯化分离:人为提供适宜的菌落生长的条件(包括营养、温度、Ph等)。用平板划线法,通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞菌落。 筛选:转基因大肠杆菌有抗氨苄青霉素基因,所以在含有氨苄青霉素的LB培养基中可以正常繁殖长成菌落。而普通的大肠杆菌没有抗氨苄青霉素基因,咋含有氨苄青霉素的LB培养基中不能繁殖。由此可进行大肠杆菌的筛选。 梯度稀释并计数:通过浓度梯度稀释把液体培养基培养的大肠杆菌稀释到一定浓度,用稀释涂布平板法,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落。由此可计数计算大肠杆菌的数量。 实验目的 1.通过制备LB固体培养基,对平板进行划线等,学会使用固体LB 平板。 2.通过用液体培养基,学会对微生物进行扩大培养。 3.通过稀释,学会用计数器对微生物进行计数。

实验材料和药品 待分离的大肠杆菌菌液、高压蒸汽灭菌锅、LB 固体培养基、LB 液体培养基、接种环、玻璃涂布器、培养皿、恒温培养箱、摇床、酒精灯、无菌水、移液枪、EP 管 实验步骤(用简单的流程图表示) 实验数据的记录与分析(如照片、表格等)

稀释倍数104105 大肠杆菌单个菌落个 837799111812数 平均数 浓度×107×107 实验结果与讨论 结果:稀释了105计算出来的结果约为×107ml/cm^3

大肠杆菌在发酵乳中生长繁殖浅谈+-+LQ

大肠杆菌在发酵型酸牛奶生长繁殖浅谈 摘要:本文以发酵乳作为基础,其中添加一定浓度的以大肠杆菌为典型菌的大肠菌群,用以研究大肠杆菌在发酵乳中的生长情况。 关键词:大肠杆菌发酵型酸牛奶生长情况 一引言: 发酵型酸牛奶大致可以分为三个品类:第一类是满足营养需求的基础酸奶;第二类是满足美味休闲的大果粒、谷物酸奶;第三类是健康功能酸奶,如通畅、免疫、儿童成长等。其中基础酸奶的市场规模占60%以上,果粒(谷物)酸奶和功能性酸奶的市场规模相对较低。 因大肠杆菌对产品存在着污染隐患,现阶段没有相关文献说明大肠杆菌在发酵型酸牛奶中生长繁殖情况,为此,本文就大肠杆菌在发酵型酸牛奶生长情况进行了评述。 二术语和定义: 1.大肠菌群:在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.发酵乳fermented milk:以生牛(羊)乳或乳粉为原料,经杀菌、发酵后制成的pH 值降低的产品。 3.大肠杆菌:广泛存在于人和温血动物的肠道中,能够在4 4.5℃发酵乳糖产酸产气,IMViC(靛基质、甲基红、VP实验、柠檬酸盐)生化实验为++--或-+--的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况,推断食品中肠道致病菌污染的可能性。 三设备及试剂: 1.温箱:36±1度 2.冰箱:2-5度 3.恒温水浴:46±1℃ 4.天平:感量0.01g 5.均质器 6.振荡器 7.无菌培养皿:直径为90mm 8.无菌吸管:1ml(具0.01ml刻度) 9.无菌锥形瓶:容量为500ml 10.移液器:20-200ul 培养基和试剂: 1.结晶紫中性红胆盐琼脂 2.煌绿乳糖胆盐肉汤 3.无菌生理盐水 4.无菌1mol/lNaOH和1mol/lHCL 四实验方法 1 收集发酵型酸牛奶,以大肠杆菌作为大肠菌群的典型菌落,其中添加10ml的复溶大肠杆菌(菌种编号为CCTCC AB91112)于样品中;

微生物大小与数量的测定实验报告

山东大学实验报告2017年11月27日 _________________________________________________________________ 科目:微生物学实验题目:微生物大小与数量的测定姓名:丁志康 一、目的要求 1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 2.增强微生物细胞大小的感性认识。 3. 明确血细胞计数板计数的原理。 4. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理 一)微生物大小的测定 1.微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征,也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定, 需要在显微镜下,借助于特殊的测量工具——测微尺,包括目镜测微尺和镜台测微尺。 2.镜台测微尺是中央部分可有精确等分线的载玻片,一般是将1mm等分为100格每格长0.01mm(即 10μm)。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小,而是用于矫正目镜测微尺每格的相对长度。 3.目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片,其中央有精确的等分刻度,有等分为50小格 和100小格两种。测量时,需将其放在接目镜中的隔板上,用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同,目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此,用目镜测微尺测量微生物大小时,必须先用镜台测微尺进行校正,以求出该显微镜在一定大放大倍数的目镜和物镜下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数,即可计算出细胞的实际大小。 4.球菌用直径来表示其大小;杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直径约为0.8μm, 枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3μm。 二)微生物数量的测定 1.微生物数量的测定有多种方法,本次试验中使用显微镜直接计数法。显微镜直接计数法是将少 量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器),于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有:血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等,它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数,基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后,总容积为0.02mm3,而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm,因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。(除了用这些计菌器外,还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法,此法一般用于牛乳的细菌学检查。)显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点,如结合活菌染色微室培养(短时间)以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。 2.用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载 玻片,其上由四条槽构成三个平台;中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半,每一边的平台上

生物化学实验报告记录:Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白

生物化学实验报告记录:Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白

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实验三 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白 一、实验目的 利用Western Blotting技术,定性(或定量)检测苦荞黄酮醇合酶基因(Flavon ol synthase gene, FtFLS)在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。 二、实验原理 黄酮醇合酶(FLS,EC 1.14.11.23)属于2-ODD家族,催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应,也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键,从而生成黄酮醇:a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。 本实验采用PCR的方法,在苦荞黄酮醇合酶基因(FtFLS)ORF起始密码子前引入Kpn?酶切位点,去掉终止密码并引入Bam H ?酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中,其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 ×His标签。重组质粒(pET-30b(+)-FtFLS)经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物,经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。 Western blotting的标准流程如下:蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离,通过电泳转移到固相支持物上(硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜);将膜上未反应的位点封闭起来,以抑制抗体的非特异性吸附,固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。 本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体(Anti-His tag IgG,一抗)与重组FtF LS蛋白的N-末端和C-末端6 ×His发生抗原-抗体特异反应,再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG,二抗)与一抗发生特异结合,最后使用DAB进行显色。DAB即:二氨基联苯胺(3, 3'-diaminobenzidine),是过氧化物酶(Peroxidase)的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累,形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性,它灵敏度高,特异性好,在免疫组化,原位杂交,Western blotting等膜显色中

大肠杆菌发酵经验总结

大肠杆菌发酵经验总结-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1

大肠杆菌发酵经验总结 大肠杆菌发酵经验总结 首先,补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量(主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量,进而影响),所以适当的控制补料速率和比生长速率,对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次,必须要保证充足的溶氧,并严格控制pH值,而且补酸碱的速率尽量缓和,不能太快;温度对于蛋白的表达也有很重要的影响,较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的,而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三,选取合理的诱导时间非常重要,一般的诱导时间选在指数生长后期,而且诱导时的比生长速率最好能控制在之内,选在此时诱导,1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开,使这两个阶段互不影响,有利于蛋白的高表达;2.已经得到了大量的菌体,而且菌体的生物量基本接近稳定,不论是从动力学角度,还是能耗,物料成本方面,都比较合理。 第四,补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高,会使菌体生长过于旺盛,p H偏高,不利于代谢产物的积累,氮源不足,则菌体繁殖量少从而影响产量;碳源过多,则容易刑场较低的pH,抑制菌体生长,碳源不足,则容易引起菌体的衰老和自溶。另外,碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质,从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验,一般情况下,对于一个稳定的发酵工艺下,如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象,而且能排除噬菌体和染菌的可能性后,那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响,现总结以下几点,并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物,在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一,一般认为在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当

大肠杆菌实验

大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化 一、实验目的 1)掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2)学习和掌握质粒DNA的转化和筛选方法及操作步骤。 二、实验原理 本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温实现转化。由于所用pBS质粒带有长那霉素抗性基因。因此可以通过长那霉素抗性来筛选转化子。如果受体细胞没有转入pBS,则在含长那霉素的培养基上不能生长。能在长那霉素培养基上生长的受体细胞肯定已经导入了pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳酶切等进一步鉴定。 三、仪器及试剂 仪器:恒温摇床、CO2细胞培养箱、台式高速冷冻离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、移液枪、Eppendrof管。 试剂:LB培养基(在950mL水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl、用1mol/L NaOH调制pH=7.2.加入至1L,121℃高压灭菌20min) 长那霉素储存液:100mg/mL 含长那霉素的LB固体培养基:(1L LB液体培养基中加入20g琼脂粉,将配好的LB固体培养基高压灭菌后,冷却至60℃左右,加入长那霉素储存液,使其终浓度为50μg/mL。摇匀后铺板,每皿倒15mL,室温放置过夜至冷凝水挥发干净) 1mol/L CaCl2储存液质粒DNA10ng/Μl 四、实验步骤 1 感受态细胞的制备 1)从LB平板上挑选新活化的E.coli DH 5α单菌株,接种于3~5mL LB液体培养基中,37℃下震荡过夜培养,12h左右,直至对数生长后期。

2)将该菌悬浮液以1:50的比例接种于5mL LB液体培养基中,37℃振荡培养2~3h至OD600为0.5左右。 3)将5mL培养液转入4个1.5mL离心管中,冰上放置10min,然后于4℃下,5000rpm离心5min。 4)弃去上清液,用预冷的1mL 0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15~20min后,40℃下5000rpm离心5min。 2 铺平板 将配好灭菌的LB固体培养基加热融化,待冷却至60℃左右后,加入长那霉素储存液,使其终温度为50μg/mL,摇匀后铺板,每皿倒约15mL。室温放置过夜至冷凝水挥发干净。 3 感受态细胞的转化 1)取100μl感受态细胞悬浮液,加入5μLpBS质粒DNA溶液,轻轻摇匀,冰上放置30min。 2)42℃水浴热激70s,热激后迅速置于冰上冷却3~5min。 3)向管中加入400μl LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃震荡培养1h。使细菌恢复到正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 4)将上述菌液摇匀,取200μl涂布于含长那霉素的筛选平板上,正面放置0.5h。待菌液完全被吸收后倒置培养皿,37℃培养16~24h, 5)对照实验: 对照组1:以同体积的无菌二次水代替DNA溶液,其他操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2:以同体积的无菌二次水代替DNA溶液,取5μl菌液,稀释100万倍,涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。 五、实验数据记录处理 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,各培养皿中的菌落数如下表所示:

大肠杆菌生化实验

细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 1葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌,有气泡并变为黄色;右边为大肠杆菌, 2V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP,图为右边为大肠杆菌,溶液变红,为阳性菌。 3吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.

左边为大肠杆菌,出现红色阳性菌;右边为产气杆菌,颜色不变,阴 性菌。 4硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液,如过溶液变红说明有亚硝酸盐,为硝酸盐还原阳性菌,如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂,如果变蓝,说明此菌为阴性菌;如果不变色,说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌. 右下方恶臭假单胞菌,加入革里斯试剂A、B后不变色,再加入二苯 胺试剂后变蓝,为阴性菌;左上方大肠杆菌为红色。 5柠檬酸盐实验 直接观察斜面,斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌,不变者为阴性菌.

左边产生蓝色,产气杆菌阳性;右边为大肠杆菌,阴性。 6明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液,并铺满平板,菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌,没有透明圈的菌为阴性菌. 左边为大肠杆菌,出现透明圈,阳性;右边为枯草杆菌,阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液,并铺满平板,菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌,没有透明圈的菌为阴性菌.

大肠杆菌的检测(MPN计数法)

大肠杆菌的检测(MPN计数法)

食品微生物检验技术课程综述大肠杆菌的检测(MPN计数法) 院系:食品科学与药学学院 班级:食科114 姓名:张花 学号:114031431 组长:张军玲 成员:张花 赵晶郁 朱娟娟

大肠杆菌Petrifilm测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段,而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统,并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读,而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可,并在国内很多实验室开展运用。 关键词大肠杆菌Petrifilm测试法

1设备和材料 1.1恒温培养箱:36±1℃。 1.2冰箱2~5℃。 1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。 1.4天平:感量0.1g。 1.5均质器 1.6振荡器。 1.7无菌吸管:lmL(具0.01 mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶:容量500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。 1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸 1.11试管架。 2. 培养基和试剂

2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨( LST )肉汤。 2.2EC肉汤。 2.3蛋白胨水。 2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水(MP-VP实验用)。 2.5磷酸盐缓冲液。 2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中,121℃高 压灭菌15min。 2.71mol/L氢氧化钠(NaOH ) :称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。 2.81mol/L 盐酸(HCI ) :移取浓盐酸90ml,用蒸馏水稀释至1000ml。3检验程序 4.样品稀释

大肠杆菌发酵经验总结

大肠杆菌发酵经验总结 大肠杆菌发酵经验总结 首先,补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量(主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量,进而影响),所以适当的控制补料速率和比生长速率,对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次,必须要保证充足的溶氧,并严格控制pH值,而且补酸碱的速率尽量缓和,不能太快;温度对于蛋白的表达也有很重要的影响,较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的,而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三,选取合理的诱导时间非常重要,一般的诱导时间选在指数生长后期,而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之,选在此时诱导,1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开,使这两个阶段互不影响,有利于蛋白的高表达;2.已经得到了大量的菌体,而且菌体的生物量基本接近稳定,不论是从动力学角度,还是能耗,物料成本方面,都比较合理。 第四,补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高,会使菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代产物的积累,氮源不足,则菌体繁殖量少从而影响产量;碳源过多,则容易刑场较低的pH,抑制菌体生长,碳源不足,则容易引起菌体的衰老和自溶。另外,碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质,从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验,一般情况下,对于一个稳定的发酵工艺下,如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象,而且能排除噬菌体和染菌的可能性后,那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响,现总结以下几点,并作出相应解决措施。 一、代副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代副产物,在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一,一般认为在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时,细胞将会停止生长,当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。 预防乙酸产生的措施:

大肠杆菌高密度发酵

课程设计说明书 课程名称:发酵工程 设计题目:大肠杆菌的高密度发酵 院系:生物与食品工程学院 学生姓名:****** 学号:201006030051 专业班级:10生物工程(2)班 指导教师:*****

课程设计任务书设计题目大肠杆菌的高密度发酵 学生姓名所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班10生物工程 设计要求: 1、树立正确的设计指导思想,严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。 2、根据所给资料,按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成,不得延误,不得抄袭他人成果。 3、说明书应字迹清楚文字通顺,并附有各项设计成果表,摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、设计标准要求规范、实用、切合实际。 5、设计应严格按有关设计规范进行。 6、设计结束后,以个人为单位提交设计说明书一份(后附流程图)。 学生应完成的工作: 1、明确设计标准适用的范围,给出产品以清晰明确的定义。 2、确定引用标准和技术要求,确定特定的理化指标及标准。 3、确定理化指标所采用的测定方法,一般首选国标或公认经典方法。新方法需经多试验或单一实 验法验证。 4、给出检验规则。 5、对产品的外观、流通保藏过程中操作给出规范。 参考文献阅读:[1] Fuchs C, Koste D, Wiebusch S, et al. Scale-up of dialysis fermentation for high cell densityCultivation of Escherichian coji[J]。Biotechnol, 2002, 93: B. 2002, 93: 243~251 [2] 刘子宇,李平兰,郑海涛等.微生物高密度培养的研究进展[J].中国乳业,2005,12:47~51 [3] Riesenberg D. High cell-density cultivation of Escherichian coli. Curr. Opin. Biotechnol.1991,2: 380~384 工作计划: 2013.5.27----2013.5.30 接受设计任务,查阅相关文献。 2013.5.30----2013.6.3 整理文献资料,进行产品标准的应用设计。 2013.6.3— 2013.6.9 整理设计内容,完成课程设计报告。 任务下达日期:2013年5月27日 任务完成日期:2013年6月9日 指导教师(签名):学生(签名):

大肠杆菌实验报告

大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选 0740063 阿噟兰 1.前言 抗生素能破坏细菌细胞壁的结构,使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性,原因是其基因发生了改变,产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下,细菌的基因突变率很低,而且突变是不定向的,因此在自然条件下,想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时,其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时,能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线(UV)有强烈的吸收作用,尤其是碱基中的嘧啶,它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此,紫外线通常作为诱变剂,用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛,诱变剂量越大,突变率高,诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键,过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。 在紫外线诱变下,菌株发生不定向的突变,想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株,因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变,则该菌株不能在抗性培养基上正常生长,只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。 紫外线对于菌株有诱变作用外,对菌株还有较强的致死作用,因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。 因此,通过本实验的操作,在合适的照射剂量的设置下,比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率,并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上,能了解诱变育种的机理和方法,为做进一步的诱变实验做准备。 2.材料和方法 实验材料、仪器和试剂 菌种:大肠杆菌 仪器:超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器 试剂:牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液(50mg/ml)、生理盐水 实验方法 2.2.1制备培养基 普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基(400ml): 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min,倒平板,4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml 筛选培养基(200ml):含抗生素50mg/L。(卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素,能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA,阻断细菌蛋白质的合成。) 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 硫酸卡那霉素水溶液(50mg/ml),按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌,取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素加入培养基中,充分震荡混匀,倒平板,2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml 2.2.2制备菌悬液(106 ~ 108个/mL) ①固体培养:大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基,37℃培养24-48h。 ②菌悬液:用适量生理盐水刮洗菌落,倒入一个无菌小三角瓶(或试管)中,充分振荡使菌

大肠杆菌总结

大肠杆菌发酵经验总结 首先, 补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量(主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量,进而影响)所以适当的控制补料速率和比生长速率,对于控制乙酸的量有很好的效果 。 其次,必须要保证充足的溶氧,并严格控制p H值,而且补酸碱的速率尽量缓和,不能太快;温度对于蛋白的表达也有很重要的影响,较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的,而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三,选取合理的诱导时间非常重要,一般的诱导时间选在指数生长后期,而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内,选在此时诱导, 1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开,使这两个阶段互不影响,有利于蛋白的高表达; 2.已经得到了大量的菌体,而且菌体的生物量基本接近稳定,不论是从动力学角度,还是能耗,物料成本方面,都比较合理。 第四,补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高,会使菌体生长过于旺盛,p H偏高,不利于代谢产物的积累,氮源不足,则菌体繁殖量少从而影响产量;碳源过多,则容易形成较低的p H,抑制菌体生长,碳源不足,则容易引起菌体的衰老和自溶。另外,碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质,从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验,一般情况下,对于一个稳定的发酵工艺下,如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象,而且能排除噬菌体和染菌的可能性后,那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比. 温度对大肠杆菌的影响:大肠杆菌发酵最适温度是37 C,当温度最适菌体生长时,比增长速率将会增大。随温度上升细菌代谢加快,其产生代谢副产物也会增加。这些副产物会对菌体的生长产生一定的抑制作用。菌体生长过快也会影响质粒的稳定性。降低培养温度,菌体对营养物质的摄取和生长速率都会下降。同时也减少了有毒代谢

大肠杆菌微生物培养实验报告及评价标准

实验原理 纯化分离:人为提供适宜的菌落生长的条件(包括营养、温度、Ph 等)。用平板划线法,通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞菌落。 筛选:转基因大肠杆菌有抗氨苄青霉素基因,所以在含有氨苄青霉素的LB 培养基中可以正常繁殖长成菌落。而普通的大肠杆菌没有抗氨苄青霉素基因,咋含有氨苄青霉素的LB 培养基中不能繁殖。由此可进行大肠杆菌的筛选。 梯度稀释并计数:通过浓度梯度稀释把液体培养基培养的大肠杆菌稀释到一定浓度,用稀释涂布平板法,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落。由此可计数计算大肠杆菌的数量。 实验目的 1. 通过制备LB 固体培养基,对平板进行划线等,学会使用固体LB 平板。 2. 通过用液体培养基,学会对微生物进行扩大培养。 3. 通过稀释,学会用计数器对微生物进行计数。 实验材料和药品 待分离的大肠杆菌菌液、高压蒸汽灭菌锅、LB 固体培养基、LB 液体培养基、接种环、玻璃涂布器、培养皿、恒温培养箱、摇床、酒精灯、无菌水、移液枪、EP 管 实验步骤(用简单的流程图表示) 实验数据的记录与分析(如照片、表格等)

实验结果与讨论 结果:稀释了105计算出来的结果约为×107ml/cm^3 稀释了104计算出来的结果约为×107ml/cm^3 全组数据计算出来结果为×107ml/cm^3 讨论: 在稀释倍数为104的试验中大肠杆菌菌落较少,原因可能是在稀释过程操作中,震荡不够,而且由于不小心洒了半管104稀释液,所以取液接种的时候底层的大肠杆菌数量偏少了。也有可能是靠近酒精灯附近使得温度升高杀死了一部分细菌或者降低了活性。 从实验图片中可以看出,涂布过程中由于操作失误导致固体培养基上不平滑,有多处破损,细菌在破损处的生长大多是不规则的连续紧挨在一起的,所以不便于菌落的计数,也会影响最终实验数据。 课后提问 使用稀释涂布平板计数法,计算出来的细菌数量与实际相比是偏大还是偏小呢?误差有多大?有没有误差更小的更准确的方法来计数?

大肠杆菌培养实验报告

大肠杆菌培养实验报告 篇一:大肠杆菌检测实验报告 国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数 实验目的 实验原理:国标法操作的原理 实验器材: 培养箱,10只移液管,1只250ml锥形瓶,5只大试管,试管架,4个平皿,500ml大烧杯1个,电子天平,纱布,脱脂棉,灭菌锅,PH计或PH试纸,100ml量筒,橡皮手套,超净台 实验药品: 磷酸盐缓冲液,蒸馏水,LB培养基,琼脂,5%NaOH,5%HCl 实验步骤: 一: 10只移液管,1只250ml锥形瓶,5只大试管,4个平皿,500ml大烧杯1个,100ml量筒进行洗涤,然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。灭完菌后烘干,完成后放入超净台中。 用酒精擦拭超净台,紫外消毒30min 二: 1:用电子天平称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。 2:用量筒量取125ml的蒸馏水

加入该锥形瓶中,制成培养基。 3:用棉花堵住该锥形瓶的瓶口,用牛皮纸包住瓶口,用橡皮筋扎牢,再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。 4:灭完菌后放入超净台中备用。 三: 1:取1只无菌250ml锥形瓶,用量筒向其中加入49ml PBS 2:将1ml样品加入到该锥形瓶中,摇匀制成1:50的细菌溶液。 3:取4只试管,编号1—4 4:用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS 5:用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1中.震荡试管使菌液均匀。 6:用1ml无菌移液管从1号试管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中,摇匀 7:用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取1ml细菌溶液,加入3中,摇匀......以此类推直至4只试管中均加入了细菌溶液。 9:取4只平皿,编号1—4 10:分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取1ml的菌液置于4只平皿中,加入45—50摄氏度温度下的培养基,约15mm厚度。缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合均匀;待培养基冷凝后倒置。

细菌的生理生化反应实验报告

细菌的生理生化反应实验报告 【实验目的】 了解细菌生理生化反应原理,掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。了解生理生化反应在鉴别细菌中的意义。 【实验原理】 通过测定微生物校内某些酶类的有无、对某些第五的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物带血的多样性。某些细菌产生色氨酸酶,能分解培养基蛋白胨中的色氨酸,产生吲哚, 吲哚与对二甲基氨基苯甲醛发生反应,形成红色的玫瑰吲哚,为吲哚反应阳性。微生物发酵葡萄糖成丙酮酸,2分子丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下与 肌酸类物质反应,生成红色化合物为.反应阳性。有些细菌发酵糖类产生有机酸较多,使发 酵液的pH下降到以下,当加入甲基红试剂后,时发酵液变红色,为甲基红反应阳性。某种 微生物能以某种糖类为碳源,产酸产气,则判断为发酵这种糖。 【实验材料和用具】 1.菌种:大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌。 2.培养基:葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基(葡萄糖、乳糖或蔗 糖)、V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂 3.仪器:酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液枪、滴管、 杜氏小管。 【实验方法】 (一)V-P反应 1.试管标记取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管,分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、 普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。

2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录去除以上培养物,分别取出2ml培养液加入另外5支相应编号的空试管中,加入与培养液等量的V-P试剂,充分震荡2min。放置37度恒温培养箱中培养30min观察记录结果。 (二)甲基红实验 于V-P实验留下的培养液中,分别加入2-3滴甲基红指示剂,立即观察培养液的颜色变化(三)吲哚实验 1.试管标记取5只装有蛋白胨水培养基的试管,分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变 形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录在培养基中加入乙醚1-2ml,经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中,静置片刻后乙 醚层浮于培养液的上面,此时沿试管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂。观察记录结果 (四)糖发酵试验 1.试管标记取分别装有葡萄糖、蔗糖、乳糖发酵培养液试管各4支,分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。 2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录 【实验结果与分析】 (一)V-P 大肠产气枯草变形对照 结果—+———

大肠杆菌生长曲线实验报告-xiang

E.coli growth curve measurement 一、目的 1、瞭解細菌生長曲線特徵,測定細菌繁殖的代時; 2、學習液體培養基的配製以及接種方法; 3、反復練習無菌操作技術; 4、瞭解不同細菌,不同接種方法在同一培養基上生長速度的不同; 5、掌握利用細菌懸液混濁度間接測定細菌生長的方法 6、複習光電比濁法測量細菌數量的方法 7、學習平板塗布技術 二、原理 1、大腸桿菌生長: 將一定量的細菌接種在液體培養基內,在一定條件下培養,可觀察到細菌的生長繁殖有一定的規律性,如以細菌的活菌數的對數作縱坐標,以培養時間作橫坐標,可繪成一條曲線,成為生長曲線(如圖一)。 圖一微生物生長曲線示意圖 單細胞微生物的發酵具有四個階段,即Ⅰ調整期(延滯期)、Ⅱ對數期(生長旺盛期)、Ⅲ平衡期(穩定期)、Ⅳ死亡期(衰亡期)。 生長曲線可表示細菌從開始生長到死亡的全過程的動態。不同的微生物有不同的生長曲線,同一種微生物在不同的培養條件下,其生長曲線也不一樣。因此,測定微生物的生長曲線對於瞭解和掌握微生物的生長規律是很有幫助的。 測定微生物生長曲線的方法很多,有血球計數板法、平板菌落計數法、稱重法和比濁法等。本實驗採用比濁法測定,由於細菌懸液的濃度與混濁度成正比,因此,可利用分光光度計測定細菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。將所測得的光密度值(OD600)與其對應的培養時間作圖,即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。注意,由於光密度表示的是培養液中的總菌數,包括活菌與死菌,因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯。

2、平板塗布技術: 塗布法接種是一種常用的接種方法,不僅可以用於計算活菌數,還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點用於檢測化學因素對微生物的抑殺效應。 原理:將一定濃度,一定量的待分離菌懸液加到已凝固的培養基平板上,再用塗布棒快速地將其均勻塗布,使長出單菌落或菌苔而達到分離或計數的目的。 其目的:用於目的微生物的分離;用於藥物的抑菌試驗;觀察菌苔的形狀和特點。 優點:可以計數,可以觀察菌落特徵,還可以進行菌種的分離。 缺點:接種前需梯度稀釋,吸收量較少,較麻煩,平板不乾燥效果不好,容易蔓延。 三、材料、藥品 1、實驗材料:細菌(E.coli) 2、培養基:LB medium; 3、實驗儀器:光電比色計、L型玻棒、接種環、超淨工作臺、恒溫培養箱; 四、步驟 1、取100μLE.coli放入含有200mL LB liquid medium的錐形瓶中,並搖晃均勻。 2、取mixed的菌液1mL到cuvette內,拿去測量吸光值,並記錄測得的數值。 3、取500μL的菌液放入LB solid medium內,並用玻璃棒塗抹均勻,放入37℃,150rpm的incubator內培養。 4、整個實驗共進行24個小時又50分鐘,第三個小時開始用n=600nm測定細菌培養液吸光度,以後每隔一小時測一次,知道實驗結束。(若吸光值大於0.7,則代表菌液的濃度太濃,需要加以稀釋。) 5、除第二盤plate相距第一盤plate1小時和第三盤plate相距第二盤plate3小時之外,之後每相隔5小時就要再新畫一盤新的plate。(第一、二盤plate沒有稀釋,第三盤plate稀釋1000X,第四、五、六盤稀釋106 X) 五、實驗結果

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