HPLC法测定不同产地粉萆薢中原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷含量
邵岩岩1，肖潇1，吴玲芳1，朱丹1，杨光辉1，张晓雪1，张兰珍1
（北京中医药大学中药学院，北京100102）
摘要:目的：建立HPLC 法测定不同产地粉萆薢中原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷含量。方法：采用Agilent C18 色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm），以乙腈 - 水为流动相，梯度洗脱，体积流量为0.8 mL·min-1，检测波长为208 nm，柱温30 ℃，进样体积20 μL。结果：原薯蓣皂苷在1.73～8.64μg（r = 0. 9996）范围内线性关系良好，平均回收率为101.98 %（RSD = 1.53 %）；薯蓣皂苷在1.03～8.20 μg（r = 0.9991）范围内线性关系良好，平均回收率为101.60 %（RSD = 2.41 %）。10个不同产地粉萆薢中原薯蓣皂苷的含量在0.89 ～2.24 %之间, 薯蓣皂苷的含量在0.75 ～3.22 %之间。结论：该方法操作简便，定量准确，重现性好，可为粉萆薢药材质量控制提供方法。
关键词: 粉萆薢；原薯蓣皂苷；薯蓣皂苷；不同产地；含量测定；高效液相色谱
基金资助: 北京中医药大学科研创新团队项目（No.2011-CXTRD-12）
Determination of protodioscin and diosgenin in
Dioscoreahypoglauca from differenthabitats by HPLC
SHAO Yan-yan1, XIAO Xiao1,WU Ling-fang1,ZHU Dan1,YANG Guang-hui1,
ZHANG Xiao-xue1, ZHANG Lan-zhen1
(1School of Chinese MatericaMedica, Beiing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)
Abstract: Objective:To establishan HPLC method for the content determination
通讯作者：张兰珍，北京市朝阳区望京中环南路6号北京中医药大学，邮编：100102，电话：010-********，邮箱：zhanglanzhen01@https://www.doczj.com/doc/ff5002334.html,
ofprotodioscin and diosgenin in Dioscoreahypoglauca and compare the contents from differenthabitats.Methods: The chromatographic separation was performed onan Agilent C18 column (4.6 mm × 150 mm, 5 μm);with mobile phase of acetonitrile –water solution with gradient elution at the flow rate of 0.8mL·min-1; the detection wavelength was 208 nm, thecolumn temperature was 30℃, and the injection volume was 20μL. Results: Protodioscinshowed a goodlinear relationship with the range of 1.73～8.64 μg(r= 0.9996), with the average recovery of101.98 % (RSD= 1.53 %);Diosgeninshowed a goodlinear relationship with the rangeof1.03～8.20μg(r= 0. 9991),withthe averagerecoveryof 101.60 % (RSD=2.41 %).The contents of protodioscin anddiosgeninin D. hypoglauca from 10different habitats werein the range of 0.89～2.24 % and 0.75～3.22 %. Conclusion: The method is fast，simple，accurate and reliable，and can be used to determine the content of protodioscinanddiosgenin in D. hypoglauac.
Key words: Dioscoreahypoglauca; protodioscin; diosgenin;different habitats;content determination; HPLC
Fund assistance: Scientific Research Innovation Team Project of Beijing University of Chinese Medicine (No.2011-CXTRD-12)
粉萆薢为薯蓣科植物粉背薯蓣(Dioscoreahypoglauca Palibin)的干燥根茎，具有利湿去浊、祛风通痹功效，用于淋病白浊、白带过多，湿热疮毒、腰膝疼痛及风湿顽痹和小便不利等症状[1,2]。粉萆薢主要分布于浙江临安、淳安、龙泉，湖南沪溪、沅陵、安化及四川、安徽、江西等地。现代药理实验表明，粉萆薢具有降压、抗炎、抗菌、提高免疫、抗肿瘤、杀软体动物等功效[3]。粉萆薢主要含有皂苷、甾体、二芳基庚烷、木脂素、有机酸及脂类等化学成分，其中甾体皂苷类化合物是其主要药效成分。薯蓣皂苷具有抗肿瘤，改善心血管，调节免疫，抗血小板聚集，抗炎，降血糖，预防和治疗骨质疏松等作用;原薯蓣皂苷有较好的抗肿
瘤作用[4-11]，为粉萆薢的主要药效物质。
2015年版《中国药典》尚无粉萆薢的含量测定方法，目前文献报道的粉萆薢含量测定有药材中总皂苷的含量测定[3]和薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元的含量测定[12,13]。为了进一步完善粉萆薢的质量控制方法，本实验建立了粉萆薢中原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷的HPLC含量测定方法, 并测定和比较了不同产地粉萆薢药材中原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷的含量，为粉萆薢的质量控制提供依据。
材料
1.仪器Waters 1525高效液相色谱仪（美国Waters公司），Agilent C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm，美国Agilent公司），Sartorious BT 25 S电子天平（德国Sartorious 公司），KQ – 500 DE超声清洗仪（昆山超声仪器有限公司）。
2. 试药原薯蓣皂苷对照品（购于南京春秋生物有限公司，批号: 200015，纯度＞98%)。薯蓣皂苷自制，经1H NMR、13C NMR、MS鉴定结构，HPLC归一化法检测，纯度＞98 %。实验所用10个产地药材购于祁州香草堂、毫州中药堂、安国中药材市场，经北京中医药大学中药鉴定系张贵君老师鉴定为薯蓣科植物粉背薯蓣的干燥根茎;样品保存于北京中医药大学中药化学系。乙腈（Fisher公司，色谱纯），哇哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。
方法与结果
1. 溶液的制备
1.1 对照品溶液的制备
原薯蓣皂苷对照品溶液: 精密称取原薯蓣皂苷对照品4.32 mg，置于10 mL的棕色容量瓶中用水溶解并稀释到刻度，摇匀，备用。
薯蓣皂苷对照品溶液: 精密称取薯蓣皂苷对照品4.10 mg，置于10 mL的棕色容量瓶中用甲醇溶解并稀释到刻度，摇勾，备用。
1.2供试品溶液的制备
称取粉萆薢粉末（过60目筛）约300 mg，精密称定，置于具塞的100 mL锥形瓶中，精密加入70 %乙醇30 mL, 称重，超声提取60 min。滤过，减压回收溶剂，残渣用70%乙醇定容至25 mL的棕色容量瓶中。用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试液，备用。
2.色谱条件色谱柱: Agilent C18色谱柱（150×4.6 mm，5 μm）; 流动相: 乙腈（A）–水（B）；洗脱梯度程序：0～5 min，5 % ～25 %（A）；5～20 min，25 % ～30 %（A）；20 ～35 min，30 % ～50 %（A）；35 ～36 min，50 % ～60 %（A）；36 ～50 min，60 % ～65 %（A）；体积流量为0.8 mL·min-1，检测波长为208 nm，柱温30 ℃，进样体积20 μL。样品中原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷与其他成分分离度大于1.5，按原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷计算理论塔板数均大于5000。HPLC色谱图见图1。
A：原薯蓣皂苷、B：薯蓣皂苷、C：广西玉林样品溶液
1. 原薯蓣皂苷；
2. 薯蓣皂苷
图1 HPLC色谱图
3. 方法学考察
3.1 线性关系考察分别精密吸取原薯蓣皂苷对照品溶液（浓度为0.432 mg/mL）4，8，12，16，20 μL; 薯蓣皂苷对照品溶液（浓度为0.410 mg/mL）2.5，5.0，10，15，20 μL注入高效液相色谱仪，按“2.”项下色谱条件进行分析，测定其峰面积。以对照品量（μg）为横坐标（X），色谱峰峰面积为纵坐标（Y），进行回归计算。得原薯蓣皂苷与薯蓣皂苷回归方程分别为：Y= 111214X – 23782，r = 0.9991；Y = 143558X + 1721.9，r = 0.9996。原薯蓣皂苷与薯蓣皂苷量分别在1.728～8.640 μg和1.025～8.200 μg范围内，呈良好的线性关系。
3.2 精密度试验精密吸取同一供试品溶液20 μL，按“2.”项下色谱条件连续进样6次，测定原薯蓣皂苷，薯蓣皂苷的色谱峰峰面积，分别计算原薯蓣皂苷与薯蓣皂苷的峰面积RSD 分别为2.35 %，1.61 %，表明方法精密度良好。
3.3 稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液20 μL，分别于制备后0、2、4、6、8、24h 进样测定，计算原薯蓣皂苷与薯蓣皂苷峰面积的RSD（n=6）分别为1.08 %和1.14 %，结果表明供试品溶液中原薯蓣皂苷与薯蓣皂苷在室温条件下24h内基本稳定。
3.4 重复性试验取粉萆薢药材（广西玉林，过60目筛）粉末6份，按“1.2”项下方法操作，制得6份供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定含量。结果样品中原薯蓣皂苷与薯蓣皂苷的含量平均值分别为1.98 %和2.01 %，RSD分别为2.04 %和1.57 %，表明该方法重复性良好。
3.5加样回收率试验取已知含量的粉萆薢（原薯蓣皂苷与薯蓣皂苷的含量分别为1.98 %和2.01 %）粉末6份，每份约150 mg，分别精密加入原薯蓣皂苷对照品溶液（含原薯蓣皂苷1.8 mg/mL）、薯蓣皂苷对照品溶液（含薯蓣皂苷2.0 mg/mL）各1.5 mL, 按“1.2”项下方法操作，制得6份供试品溶液，按“2.”项下色谱条件连续进样6次，测定含量，计算
回收率。结果见表1。
表1 原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷加样回收率试验
成分
取样量
（mg）样品含量
（μg）
加入量
（μg）
测得量
（μg）
回收率
（%）
平均回收
率（%）
RSD
（%）
原薯蓣皂苷151.0 2990 2700 5862 103.02
101.98 1.53 150.7 2984 2700 5868 103.24
150.2 2974 2700 5750 101.34
151.3 2995 2700 5851 102.72
150.0 2970 2700 5619 99.10
150.8 2986 2700 5827 102.48
薯蓣皂苷151.03035 3000 6250 103.51
101.60 2.41 150.73029 3000 6151 102.02
150.23019 3000 5957 98.97
151.33041 3000 6254 103.53
150.03015 3000 5902 98.12
150.83031 3000 6239 103.45
4.含量测定取10个不同产地的粉萆薢药材粉末300 mg各3份，精密称定。按“1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.”项下色谱条件，测定峰面积，并用外标法计算样品中原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷的含量，结果见表2、图2。
表2不同产地粉萆薢中原薯蓣皂苷与薯蓣皂苷含量测定（n = 3）
编号厂家产地
原薯蓣皂苷薯蓣皂苷
含量（%）RSD（%）含量（%）RSD（%）
1 亳州中药堂湖南沅陵 1.93 1.81 3.2
2 0.48
2 亳州中药堂浙江龙泉 1.77 2.52 2.48 1.37
3 祁州香草堂浙江临安 1.03 2.70 0.75 2.65
4 亳州中药堂安徽亳州 1.78 1.97 2.41 2.78
5 亳州中药堂湖北荆州 2.24 1.70 2.4
6 0.57
6 祁州香草堂广西玉林 1.96 1.8
7 2.02 1.69
7 安国中药材市场湖北宜昌0.92 2.24 0.83 2.57
8 安国中药材市场广西南宁 1.06 0.48 1.13 2.61
9 亳州百草堂广东 1.01 2.43 0.84 0.84
10 亳州百草堂江西0.89 1.46 0.81 2.65
图2 不同产地粉萆薢原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷含量之和
由表2可知，10个不同产地粉萆薢药材中原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷的含量相差较大，其中湖南沅陵产地粉萆薢中薯蓣皂苷含量最高，为3.22 %，其次为浙江龙泉，薯蓣皂苷含量由高到低产地依次为：湖南沅陵>浙江龙泉>湖北荆州>安徽亳州 >广西玉林 >广西南宁 >广东 >湖北宜昌 >江西 >浙江临安。湖北荆州产地粉萆薢中原薯蓣皂苷含量最高，为2.24 %，其次为广西玉林，原薯蓣皂苷含量由高到产地低依次为：原薯蓣皂苷含量从高到低依次为：湖北荆州>广西玉林>湖南沅陵>安徽亳州>浙江龙泉>广西南宁>浙江临安>广东>湖北宜昌>江西。二者含量之和由高到低产地依次为：湖南沅陵>湖北荆州 >浙江龙泉 >安徽亳州 >广西玉林 >广西南宁 >广东 >浙江临安 >湖北宜昌 >江西。
讨论
1.检测波长的选择实验考察了203 nm、208 nm和210 nm波长下的色谱图，发现在203 nm下，噪音干扰较大，210nm下灵敏度较低，在208 nm波长下原薯蓣皂苷与薯蓣皂苷均有吸收且达到良好分离，并在此波长下同时测定2个成分杂质干扰少，灵敏度高，因此本实验选择208 nm 作为检测波长。
2. 流动相选择本实验考察了乙腈-水、乙腈-0.2 % 冰醋酸水、乙腈-0. 1% 磷酸水等不同比例的流动相进行梯度洗脱，结果表明乙腈-水梯度洗脱的色谱峰峰形好，保留时间适中，灵明度高，可达到较好的分离效果。
3. 提取溶剂的选择由于原薯蓣皂苷在甲醇中不稳定，其C-22-OH容易被甲基化，转变成甲基原薯蓣皂苷，故不选用甲醇做溶剂和流动相。本实验提取溶剂考察了30 %、50 %、70 %、95 %乙醇溶剂的提取效率，结果显示70 %的乙醇提取效率较高。
4. 提取方式的选择因原薯蓣皂苷为原皂苷类，在受热的情况下容易水解，失去26-位的葡萄糖基，F-环环合得到相应的次级皂苷类，避免加热，所以选择超声提取法。提取溶剂用量考察了10、30、50 mL，提取时间考察了20 min、40 min、60 min、80 min，结果表明30 mL的70 %乙醇超声提取60 min可提取完全。
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作者简介：邵岩岩，北京市朝阳区望京中环南路6号北京中医药大学，邮编：100102，电话：010-********，邮箱：sunshine4003@https://www.doczj.com/doc/ff5002334.html,