INTRODUCTION
Glutathione-S-transferase (GST) fusion proteins have had a wide range of applications（应用）since their introduction as tools for synthesis of recombinant proteins in bacteria. One of these applications is their use as probes for the identification of protein-protein interactions. The pull-down method described in this protocol is fundamentally similar to immunoprecipitation. Immunoprecipitation(免疫沉淀) is based on the ability of an antibody to bind to its antigen(抗原) in solution, and the subsequent purification of the immunocomplex by collection on protein A- or G-coupled(耦合的) beads(磁珠). Similarly, the GST pull-down is an affinity(亲和) capture(捕获) of one or more proteins (either defined or unknown) in solution by its interaction with the GST fusion probe protein and subsequent isolation of the complex by collection of the interacting proteins through the binding of GST to glutathione-coupled beads.
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RELATED INFORMATION
An introduction to the use of GST fusion proteins for studying protein-protein interactions can be found in Identification of Protein-Protein Interactions with Glutathione-S-Transferase (GST) Fusion Proteins.
This protocol is designed to use a 35S-labeled cell lysate(细胞裂解液) as the source for interacting proteins. For 35S-labeling procedures, see Orlinick and Chao (1996) and Spector et al. (1998). Additionally, if the interacting protein of interest is known to be confined to a specific cellular compartment (特定的细胞区域)(e.g., the nucleus), a fraction of the cell lysate corresponding to that compartment (e.g., a nuclear extract [to prepare, see Dignam et al. 1982]) can be used in place of a total cell lysate.
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MATERIALS
This procedure may require equipment or reagents(试剂) for Western analysis, Coomassie blue staining, and/or silver staining (see Step 13).
Reagents
Cell lysate (unlabeled or labeled with 35S, depending on experimental goal)
This experiment compares GST versus GST fusion protein, so it is necessary to prepare enough lysate to provide equal amounts of lysate in each reaction. The
amount of lysate needed to detect an interaction is highly variable. Start with lysate equivalent to 1 × 106 to 1 × 107 tissue culture cells.
GST fusion protein (see Preparation of GST Fusion Proteins)
GST protein
GST pull-down lysis buffer, ice cold
Reagents for SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins (see Step 12)
2X SDS gel-loading buffer
Tris-Cl (50 mM, pH 8.0) containing 20 mM reduced glutathione (optional; for Step 11 only)
Equipment
Equipment for SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins (see Step 12) Gel dryer (optional; see Step 13)
Glutathione-Sepharose beads (store at 4°C; do not freeze)
Beads are often supplied by commercial vendors in solutions containing alcohols. It is important to wash the beads thoroughly in GST pull-down lysis buffer and to generate a 50/50 slurry of beads in GST pull-down lysis buffer prior to use. Microcentrifuge, precooled to 4°C
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL (optional; for Steps 11.vi-11.ix only) and 1.5 mL Needle, small bore, sterile (optional; for Steps 11.vi-11.ix only)
Rotator for end-over-end mixing
Water bath, boiling (optional; see Step 10)
X-ray film (optional; see Step 13)
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METHOD
1. Incubate the cell lysate with 50 μL of glutathione-Sepharose beads (50/50
slurry in lysis buffer) and 25 μg of GST (NOT the GST fusion probe protein)
for 2 h at 4°C with end-over-end mixing. Allow enough volume in the tube to
permit liberal mixing; 500 μl to 1 mL is a good starting point.
This step is designed to preclear from the lysate proteins that interact
nonspecifically with the GST moiety or with the beads alone. If the interaction will be detected primarily with antibodies directed to a candidate interacting
protein, it is not absolutely necessary to preclear the lysates with GST or
glutathione-Sepharose beads. However, when35S-labeled cell lysates are used
to identify novel protein-protein interactions, these steps can help to reduce background.
When detecting the interacting protein with antibodies to that protein, it is important to include “GST+ beads” and “beads alone” controls.
2. Centrifuge at 13,000 rpm for 10 sec at 4°C in a microcentrifuge.
3. Transfer the supernatant (precleared cell lysate) to a fresh tube.
4. Set up two tubes containing equal amounts of the precleared cell lysate.
i. Add 50 μl of glutathione-Sepharose beads (50/50 slurry in lysis
buffer) to each tube.
ii. Then add GST protein to one tube and the GST fusion probe to the other (~5-10 μg each).
The amount of protein added should be equimolar in the two reactions
(i.e., the final molar concentration of GST should be the same as that of
the GST probe protein).
5. Incubate the tubes for 2 h at 4°C with end-over-end mixing.
6. Centrifuge the samples at 13,000 rpm for 10 sec at 4°C in a microcentrifuge.
7. Transfer the supernatants to fresh microcentrifuge tubes and reserve them for SDS-PAGE (see Troubleshooting).
8. Wash the beads four times with 1 mL of ice-cold lysis buffer. Discard the washes.
9. At this point, proteins bound to the probe protein must be dissociated for analysis. Use either the boiling method (the more popular choice; see Step 10) or one of the elution methods described in Step 11.
The disadvantage of elution (Step 11) is that if multiple elutions are necessary, the final sample volume may be large. In these cases, it may be impossible to load more than a small percentage of the sample on an SDS-polyacrylamide gel for analysis. This is the reason most researchers choose instead to boil complexes off the beads in SDS sample buffer (Step 10).
10. If the samples are to be boiled off the beads, do as follows:
i. Add an equal volume of 2X SDS gel-loading buffer to the beads.
It is important to include a “glutathione-Sepharose beads only” control.
Proteins bound nonspecifically to the beads can appear as bound to the
fusion protein, even in comparison to GST alone.
ii. Boil for 5 min in a water bath.
Samples are now ready for SDS-PAGE (Step 12).
11. If the samples are to be eluted from the beads, perform one of the
following options:
i. Add 50 μl of 20 mM reduced glutathione in 50 mM Tris-Cl (pH 8.0).
ii. Flick the tube to mix the contents, and incubate the samples at room
temperature for 5 min.
iii. Centrifuge the samples at 13,000 rpm for 10 sec at room
temperature in a microcentrifuge.
iv. Transfer the supernatant containing the eluted protein to a new
microcentrifuge tube.
v. If elution is incomplete, repeat Steps 11.i-11.iv.
vi. Add 50 μl of 20 mM reduced glutathione in 50 mM Tris-Cl (pH
8.0).
vii. Flick the tube to mix the contents, and incubate the samples at
room temperature for 5 min.
viii. Transfer the mixture to a fresh 0.5-mL tube. Carefully, using a
sterile, small-bore needle, poke a hole in the bottom of the 0.5-mL tube.
Place it inside a 1.5-mL microcentrifuge tube.
ix. Centrifuge the tubes together at 1000g in a microcentrifuge for 2
min at room temperature.
The eluted proteins will be deposited in the 1.5-mL tube.
12. Analyze as much of the sample as possible by SDS-PAGE (see
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins).
13. Detect the proteins. The method of detection will depend on the
experimental goal:
i. If the goal is to detect the 35S-labeled proteins associated with the
fusion protein after SDS-PAGE, dry the gel on a gel dryer and expose it
to X-ray film.
ii. If the goal is to detect specific partners after SDS-PAGE, transfer
the proteins to a membrane and subject them to Western analysis.
iii. If the goal is to determine the size and abundance of proteins
associated with the fusion protein from a nonradioactive lysate,
subsequent to SDS-PAGE, stain the gel with Coomassie blue or silver
stain.
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TROUBLESHOOTING
Problem: Conditions for pull-down are not optimal
[Step 13]
Solution: Analyze aliquots of equal percentage volumes (e.g., 1%) from each of the following fractions generated during the protocol:
Total cell lysate (Step 1)
Beads prior to elution (Step 9)
Eluate (Steps 10 or 11)
Beads post-elution (Steps 10 or 11)
Supernatant saved at Step 7
“Beads + GST” eluate (if applicable; Steps 10 or 11)
“Beads alone” eluate (if applicable; Steps 10 or 11)
After these samples are collected at the indicated steps, add an appropriate volume of SDS-PAGE sample buffer. Snap-freeze the samples in a dry-ice ethanol bath for analysis by SDS-PAGE (during Step 12), and perform autoradiography, Western analysis, or Coomassie staining as appropriate (Step 13).
Results from this gel will show:
The prevalence of the novel interactor in the total cell lysate (aliquot from
Step 1).
How much of the interactor is bound to the GST fusion protein (aliquot from Step 9).
How much GST fusion protein + associated proteins were eluted from the
beads (aliquot of eluate from Steps 10 or 11).
What fraction of the interactors remained bound (beads remaining from Steps
10 or 11).
How much of the interacting protein was depleted from the total cell lysate
(aliquot from supernatant at Step 7).
Problem: Low signal
[Step 13]
Solution: If an interaction yields a low signal even though the interactor is abundant in the total cell lysate, this may indicate that the binding conditions are not optimal. A change in salt and detergent concentrations, in addition to increasing the time allowed for association, may improve the binding. A poor signal can also be caused by inefficient elution; i.e., the complex being retained on the glutathione-Sepharose
beads. This can be determined by SDS-PAGE comparison of the eluate versus the “beads post-elution” fraction (Steps 10 or 11). If this proves to be the problem, it may be remedied by pooling multiple elutions or increasing the time for elution. Releasing the interactors by boiling in sample buffer (Step 10), if appropriate, would be applicable in this case.
Problem: Nonspecific background
[Step 13]
Solution: Preclearing a lysate with GST, or beads alone, can help to minimize nonspecific interactions (see Step 1). Titrating the amount of lysate added and increasing the stringency of the binding and wash conditions can also reduce background.
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DISCUSSION
When analyzing an interaction by Western blot (e.g., analyzing a predicted interaction for which there are available antibodies), it is important to reprobe the membrane with anti-GST antibodies after probing for the candidate interactor. This will determine whether all samples were incubated with the same amount of GST fusion protein, and it will help to determine whether the fusion protein is undergoing degradation while incubated with the cell lysate. If the interactors are radio- or biotin-labeled, one should also confirm equal amounts of GST fusion and GST proteins by Western blot or Coomassie blue staining.
大学生出国交流心得体会范文两篇大学生出国交流心得体会范文两篇 曼哈顿、华尔街、时代广场、纽约是世界上最繁华的都市之一。从曼哈顿驱车近一个小时的路程,在纽约长岛纳苏郡和苏福克郡的交界处,风景秀丽的海岸边,散落着十几栋小楼,路口不起眼的牌子,告诉人们这里便是世界著名的冷泉港实验室(coldspringharborlaboratory)。 正是这样一个至今仍称自己为实验室的研究机构,却被人们誉为世界生命科学的圣地和分子生物学的摇篮,曾名列世界上影响最大的十大研究学院榜首,先后有几十位诺贝尔奖获得者在这里学习和工作过,有多项荣获诺贝尔奖的研究工作是在冷泉港实验室完成的, 其中最为著名的是发现转座子元件的巴巴拉·麦克林托克。詹姆斯?沃森曾是实验室的主任。 始建于1890年,具有百年悠久历史的冷泉港实验室为何能 够始终站在浪尖上引领世界生命科学的潮流?作为世界一流的研究机构,冷泉港实验室拥有充裕的科研基金,同时具有独特的科研策略和 领先的研究思路。他山之石,可以攻玉。在此,将我在冷泉港实验室工作的一些体会和理解与大家进行交流,籍此抛砖引玉。 开放精神下的学术交流冷泉港实验室是国际生命科学的会 议中心,平均每两周就举办一次国际会议。每次学术会议往往2-3天,大型的学术会议可能持续5-6天。邀请到这些学术会议上做报告的都是当今最活跃的一流科学家,我在冷泉港实验室工作的半年期间,就 先后听到PhilipSharp,DavidBaltimore,CraigMello等诺贝尔奖获 得者的学术报告,其中CraigMello因RNAi研究成果获2006诺贝尔生
理与医学奖。 在瑞典卡罗林斯卡医学院宣布获奖消息一周后,Mello博士便应邀在冷泉港实验室做学术报告。会议期间,上午为学术报告,下午为学术展板(poster),中间往往有促进交流的酒会。学术报告通常网络直播,研究人员可以在做实验的同时,关注学术报告的内容。而在学术展板和酒会期间,可以和感兴趣的同行进行正式或非正式的交流。 正是依托于频繁的、涉及生命科学各个领域的国际学术会议,冷泉港实验室的研究人员与外界建立了密切的联系,了解和关注生命科学研究领域内的最新动态,真正做到“足不出户而知天下事”。有意思的是,我在冷泉港工作时需要用到法国GiacomoCavalli博士研 究小组的实验方案,在几次Email邮件交流后,我在冷泉港召开的学 术会议上见到了Cavalli博士本人,得以当面讨论和交流一些具体的细节。 冷泉港实验室也非常重视实验室内部的学术交流。为了促进实验室内不同研究小组之间的相互了解和交流,冷泉港实验室推行 In-houseseminar的机制,每个研究小组除了自身组内的讨论会外,还必须定期面向整个实验室公开举办讨论会,实验室内所有感兴趣的研究人员均可参加。https://www.doczj.com/doc/f84438640.html, 通过国际会议、in-houseseminar、研究小组内的讨论会, 冷泉港实验室的研究人员成功地实现与外界同行、实验室内同行以及研究小组内多层次的学术交流。在这些交流的过程中,我感受到绝大多数研究人员开放的学术精神,他们非常艺术地处理了同行之间学术竞争和学术交流的矛盾,让不同层次的学术交流和思想碰撞发挥到了极致。 实质性的学科交叉不同学科的交叉与融合会催生大量的源
重结晶和过滤实验 一、实验目的 １、学习重结晶法提纯固态有机化合物的原理和方法； ２、掌握抽滤和热过滤操作的方法。 二、基本原理 固体有机物在溶剂中的溶解度一般是随温度的升高而增大。若把固体溶解在热的溶剂中达到饱和,冷却时由于溶解度降低,溶液变成过饱和而析出结晶.利用溶剂对被提纯物质及杂质的溶解度不同，可以使被提纯物质从饱和溶液中析出，而让杂质全部或大部分仍留在溶液中(或被过滤除去），从而达到提纯目的。 重结晶的一般过程:使待重结晶物质在较高的温度(接近溶剂沸点）下溶于合适的溶剂里；趁热过滤以除去不溶物质和有色杂质（可加活性炭煮沸脱色)；将滤液冷却，使晶体从过饱和溶液里析出，而可溶性杂质仍留在溶液里,然后进行减压过滤，把晶体从母液中分离出来;洗涤晶体以除去附着的母液；干燥结晶. 三、实验装置 热过滤装置减压过滤装置干燥装置 回流装置 四、实验仪器、器材及药品 １、仪器、器材: 250ml三角烧瓶球形冷凝管保温漏斗短颈玻璃漏斗 200mｌ烧杯表面皿玻璃棒布氏漏斗 吸滤瓶酒精灯电热套乳胶管 滤纸剪刀台秤药勺 2、药品: 乙酰苯胺水活性炭 五、实验步骤 称取 3。0ｇ粗乙酰苯胺加到２50ｍL三角烧瓶中,加入100mＬ水,安装回流冷凝管，加热至沸,保持沸腾2—3min,取下稍冷,加入０．2g活性炭，再加热５-１０ｍｉn，用热漏斗趁热过滤,
滤液用干净的200mＬ烧杯接收，静止自然冷却,乙酰苯胺充分结晶后进行冷的减压过滤(抽滤），压实滤饼。彻底抽干水分,干燥,称重。 六、注意事项 1．可在补加2０％的水时，一同加入活性炭。 2。热过滤时保温漏斗中的水一定要尽可能热,动作要快。 3。减压过滤滤纸事先要润湿，铺好滤纸后不能减压太大。在倒入滤液之前滤纸要紧贴漏斗底部,防止滤纸被压穿. ４。如果滤液已经冷却到室温，长时间静止仍然没有结晶出现,可以用玻璃棒搅拌之。 七、思考题 1。重结晶包括哪几个步骤？每一步的目的是什么? 答:（１）溶剂的选择 目的：以保证在高温时被提纯的物质在溶剂中的溶解度较大,而在低温时则很小。 (２）样品的溶解 目的:将粗产物用所选溶剂加热溶解制成饱和或近饱和溶液。【为了避免趁热过滤的困难,一般可比需要量多加1５～20%的溶剂】 (3）活性炭脱色 目的：活性炭脱色,趁热过滤除去不溶性杂质及活性炭。【活性炭的用量应视有色杂质的多少而定，一般为干燥粗品的１～5%】 （4)滤液的冷却 目的：冷却过滤液使结晶慢慢析出，而杂质留在母液中.【将热滤液静置使其慢慢冷却至析出晶体，然后可再用冷水冷至室温，这样所得的晶体纯度高。】 （5）抽滤晶体 目的：使晶体与母液分离,过滤时尽量抽干。 （6）洗涤晶体 目的:以除去晶体表面的母液。【母液中含有可溶性杂质】 (7）晶体的干燥 目的：以除去晶体表面的溶剂。【晶体干燥时,可根据晶体的性质选择合适的方法进行干燥。】 (8）熔点的测定 目的：确定重结晶所得产品是否合乎要求.若不合格，应进行第二次重结晶。 2。怎样选择重结晶的溶剂？ 答：(１)需查阅文献、化学手册;（2)需要采用实验的方法。 若杂质溶解度很大，可以留在溶液中，若杂质溶解度很小,可以留在残渣中。要求被提纯的物质在选择的溶剂中的溶解度随温度变化大,溶剂沸点不宜太高或太低，如果没有适合的单一溶剂时，可以选用混合溶剂。混合溶剂一般由两种能以任何比例互溶的溶剂组成，其中一种易溶解被提纯物质，另一种则难溶解。 3。重结晶的溶剂应符合什么条件? 答:在重结晶时选择合适的溶剂是非常重要的。否则,达不到纯化的目的,作为适宜的溶剂,要符合以下条件: (1）与被提纯的有机化合物不起化学反应; (2）在高温时被提纯的物质在溶剂中的溶解度较大,而在低温时则很小;
12.GST蛋白的表达和纯化 12.1 GST蛋白的表达 （1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。 （2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。 （5) 加入50μl 100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。 （6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。 （7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。 （8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。转移至5ml离心管。 （9) 超声破壁 破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。 破壁参数：Frequency:100～200w 60s， pause 20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。 加100μl 20% TritonX－100，冰上放置30min。 （10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。 12.2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry （1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。 （2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。 （3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。反复5次。 （4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。 12.3 GST融合蛋白的纯化 （1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。 （2) 3krpm离心5min，弃上清。该Sepahrose上即结合了GST融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做） （3) 在管中加入离心后的 1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应
生命科学实验指南系列 生命科学实验设计指南Experimental Design for Biologists 〔美〕D畅J畅格拉斯 著 丛羽生等 译 北 京
图字：01唱2007唱4869号 内 容 简 介 随着人类和其他物种基因组的破译，生物信息科学的发展，生命科学已成为２１世纪最为活跃、发展最为迅速的先导性学科之一。国内各高校十分重视生命科学的发展，相继设立了本科生创新科研项目以及研究策略和实验设计方面的课程。研究生培养也以科学研究水平为标准。本书作者基于多年教学科研经验以及与著名专家学者交流的基础，对生物学研究策略和实验设计进行深入细致的解析。 本书可作为生命科学专业高年级本科生和研究生的教材和参考资料。 Experimental Design for Biologists，by David J畅Glass畅 Copyright眖２００７．Translation rights arranged with the permission of Cold Spring Harbor Laboratory Press畅 图书在版编目（CIP）数据 生命科学实验设计指南／（美）格拉斯（Glass，D畅J畅）著．丛羽生等译．—北京：科学出版社，２００８ （生命科学实验指南系列） ISBN９７８唱７唱０３唱０２１３４１唱９ Ⅰ畅生… Ⅱ畅①格…②丛… Ⅲ畅生命科学实验指南 Ⅳ畅Q１唱０ 中国版本图书馆CIP数据核字（２００８）第０３１８６６号 责任编辑：夏 梁 席 慧／责任校对：包志虹 责任印制：钱玉芬／封面设计：耕者设计工作室 出版 北京东黄城根北街１６号 邮政编码：１００７１７ ht tp：／／w w w．sciencep．co m 印刷 科学出版社发行 各地新华书店经销 倡 ２００８年５月第 一 版 ２００８年５月第一次印刷印数：１—４０００ 开本：B５（７２０×１０００） 印张：１１１／４ 字数：２１３０００ 定价：35畅00元 （如有印装质量问题，我社负责调换枙环伟枛）
粗盐提纯实验操作步骤文档编制序号：[KK8UY-LL9IO69-TTO6M3-MTOL89-FTT688]
实验：除去硫酸铜粉末中的沙子 一、实验目的 1.掌握、过滤、蒸发等实验的操作技能． 2.理解过滤法分离混合物的化学原理． 3.体会过滤的原理在生活生产等社会实际中的应用． 二、实验仪器和药品 药品：CuSO 4，蒸馏水 器材：托盘天平(含砝码)，量筒，烧杯，玻璃棒，药匙，漏斗，滤纸，铁架台（带铁圈），蒸发皿，酒精灯，坩埚钳，胶头滴管，若干一样的小纸片，滤纸 三、实验原理 四、粗盐中含有泥沙等不溶性杂质，以及可溶性杂质如：CuSO4等．不溶性杂质可以用溶解、过滤的方法除去，然后蒸发水分得到较纯净的精盐． 五、实验操作步骤 1.溶解 2.用托盘天平称取2克CuSO 4 混合物（精确到0.1克）．用量筒量取5毫升水倒入烧杯里．用药匙取一匙粗盐加入水中，观察发生的现象．用玻璃棒搅拌，并观察发生的现象（玻璃棒的搅拌对粗盐的溶解起什么作用）．接着再加入粗盐，边加边用玻璃棒搅拌，一直加到粗盐不再溶解时为止．观察溶液是否浑浊． 3.2.过滤 4.按照化学实验基本操作所述方法进行过滤．仔细观察滤纸上的剩余物及滤液的颜色．滤液仍浑浊时，应该再过滤一次．如果经两次过滤滤液仍浑浊，则应检查实验装置并分析原因，例如，滤纸破损，过滤时漏斗里的液面高于滤纸边缘，仪器不干净等．找出原因后，要重新操作．
注意：一贴二低三靠 ①“一贴”是指滤纸折叠角度要与漏斗内壁口径吻合，使湿润的滤纸紧贴漏斗内壁而无气泡，因为如果有气泡会影响过滤速度． ②“二低”是指滤纸的边缘要稍低于漏斗的边缘，二是在整个过滤过程中还要始终注意到滤液的液面要低于滤纸的边缘。这样可以防止杂质未经过滤而直接流到烧杯中，这样未经过滤的液体与滤液混在一起，而使滤液浑浊，没有达到过滤的目的。 ③“三靠”一是指待过滤的液体倒入漏斗中时，盛有待过滤液体的烧杯的烧杯嘴要靠在倾斜的玻璃棒上（玻璃棒引流），防止液体飞溅和带过滤液体冲破滤纸；二是指玻璃棒下端要轻靠在三层滤纸处以防碰破滤纸（三层滤纸一边比一层滤纸那边厚，三层滤纸那边不易被弄破）；三是指漏斗的颈部要紧靠接收滤液的接受器的内壁，以防液体溅出。 3.蒸发 把得到的澄清滤液倒入蒸发皿．把蒸发皿放在铁架台的铁圈上，用酒精灯加热（图16）．同时用玻璃棒不断搅拌滤液．等到蒸发皿中出现较多量固体时，停止加热．利用蒸发皿的余热使滤液蒸干．
P u l l D o w n实验流程 1. 混合两种预测相互作用的蛋白。（Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用GST 树脂 IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down。） 2. 加入1 mL Binding Buffer。 Binding Buffer：50 mM （.） 100 mM NaCl % Triton-X 100 35 mM β-Me（巯基乙醇） 3. 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4 h。 4. 加入20-30 μL GST-Bind TM Resin结合2-4 h。 5. 4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。 6. 加入1 mL Binding Buffer，4 ℃条件下旋转混匀5-10 min，4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清。 7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。 8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的 Loading Buffer，95℃金属浴5-10 min，150-200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。 电泳样品顺序： Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B 此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。 用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下： （input，蛋白量为后两者的1/10） Marker，Protein-B-HIS ， GST+ Protein-B-HIS， Protein-A-GST+ Protein-B-HIS Marker，Protein-A-GST ， HIS+ Protein-A-GST， Protein-B-HIS+ Protein-B-GST 9. 转PVDF膜，350 mA 恒流，2 h 左右。（PVDF膜用之前，用甲醇泡2 min） 10. 做Western Blot 过程： 预杂交1 h 以上；杂交一抗1 h 以上；洗膜三次，每次10 min ；杂交二抗1 h 以上；洗膜三次，每次10 min。 11. 显影： 用1 mL 发光液A + 1 mL发光液B浸润PVDF膜，然后固定，显影液显影1 min（时间可以适当调整），水洗，定影1 min。 12. 扫描杂交胶片结果。
用孕妇外周血诊断胎儿性别 及其在单基因遗传病诊断中的应用 北京市陈经纶中学翟晶
用孕妇外周血诊断胎儿性别 及其在单基因遗传病诊断中的应用 北京市陈经纶中学翟晶 摘要 通过该课题的研究目的建立一种非创伤性的取材和快速胎儿性别诊断方法, 并应用于单基因遗传病的产前诊断。研究方法采用聚合酶链反应( PCR) 技术, 从2例孕妇和3名正常男性，3名非怀孕正常女性外周血中扩增Y 染色体上SRY基因，X染色体上ZFX基因。结果2例孕妇经PCR 检测, 1例有一条446bpY染色体特异荧光带, 提示胎儿为男性; 1例无此荧光带, 提示胎儿为女性。检测结果与随访新生儿出生性别或引产后外生殖器检查结果完全一致。结论：本方法快速、灵敏而准确, 推广应用对单基因遗传病的产前诊断具有重要意义。 关键词孕妇血; 胎儿性别诊断; 单基因遗传病; 聚合酶链反应
一、选题背景 单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，有6600多种，并且每年在以10-50种的速度递增，单基因遗传病已经对人类健康构成了较大的威胁。 按照遗传方式又可将单基因病分为四类： 1、常染色体显性遗传病。人类的23对染色体中，一对与性别有关，称为性染色体，其余22对均称常染色体。同源常染色体上某一对等位基因彼此相同的，称为纯合子，一对基因彼此不同的称杂合子。如果在杂合状态下，异常基因也能完全表现出遗传病的，称为常染色体显性遗传病，如多指并指、先天性肌强直，这类遗传病的发生与性别无关，男女患病率相同。父母中有一位患此疾病，其子女中就可能出现患者。据估计，约7‰新生儿患有常显体显性遗传病。 2、常染色体隐性遗传病。常染色体上一对等位基因必须均是异常基因纯合子才能表现出来的遗传病。大多数先天代谢异常均属此类。父母双方虽然外表正常，但如果均为某一常显体隐性遗传基因的携带者，其子女仍有可能患该种遗传病。近亲婚配时容易产生纯合状态，所以其子女隐性遗传病的发病率也高。 3、常染色体不完全显性遗传病。这是当异常基因处于杂合状态时，能且仅能在一定程度上表现出症状的遗传病。如地中海贫血，引起该病的异常基因为，纯合子表现为重症贫血，杂合子则表现为中等程度的贫血。 4、伴性遗传病。分为X连锁遗传病和Y连锁遗传病两种。有些遗传病的基因位于X染色体上，Y染色体过于短小，无相应的等位基因，因此，这些异常基因将随X染色体传递，所以称为X连锁遗传病。也分为显性和隐性两种，前者是指有一个X染色体的异常基因就可表现出来的遗传病，由于女性拥有两条X染色体而男性只有一条，所以女性获得该显性基因的机会较多，发病率高于男性，但这类遗传病为数很少，至今仅知10余种。如Xg血型，又如抗维生素D佝偻病是 X 连锁不完全显性遗传病。X连锁隐性遗传病是指X染色体上等位基因在纯合状态下才发病者，在女性，只有当两条X染色体上的一对等位基因都属异常时才患病，如果其中有一条 X染色体的等位基因正常就不会患有此病。但是男性只有一条X
pull-down试验方法(自己总结) 12、GST蛋白的表达和纯化 12、1 GST蛋白的表达（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得 种子液。（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600为0、1。（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。（5) 加入50μl100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液， 4℃5krpmx5min离心，弃上清。（7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。转移至5ml离心管。（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl10mg/ml PMSF,80μl 蛋白酶抑制剂(100x)。破壁参数：Frequency:100～200w 60s，pause 20s run40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。加 100μl20%TritonX－100，冰上放置30min。（10) 将裂解液分入 1、5ml离心管中，4℃离心12krpm10min，取上清。（11)
吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮 3min。离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表 达情况。 12、2 准备50%GST Sepharose4Bslurry（1) 将原75%Glutathione Sepharose4B的slurry弹至混匀。（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。（3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。反复 5次。（4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose4B备用。 12、3 GST融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl50%Glutathione Sepharose4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。（2) 3krpm离心5min，弃上清。该Sepahrose上即结合了GST融 合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可 以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）（3) 在管中加入离心后的 1、5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应30min～ 60min。3krpm离心5min，弃上清。重复该步骤多次，就可以使Sepahrose上结合6～10ml 裂解液中的GST融合蛋白。（4)
安国市小营中学导学案 九年级学科化学设计人使用人使用日期 过滤浑浊天然水 实验目标： 1．了解过滤是使不溶性固体和液体分离的一种常用方法,了解过滤的适用范围和主要操作。 2.学习过滤操作步骤,分析过滤操作过程中应注意的问题,培养学生动手实验的能力。 重点：用过滤分离混合物的一般原理。 难点：过滤分离的操作方法及步骤。 实验过程： 引言：在生产生活中，人们所接触到的物质很多都是混合物，为了适应各种不同的需要，常常要把混合物里的几种物质分开，得到较纯净的物质，这叫做混合物的分离，过滤是最常用的混合物分离的方法。 讲授新课: 一、过滤 1.定义：过滤是把溶于液体的固态物质跟液体分离的一种方法。 2.原理：过滤时，液体穿过滤纸上的小孔，而固态物质留在滤纸上， 从而使固体和液体分离。 3.实验仪器:铁架台(带铁圈),烧杯,漏斗,玻璃棒. 演示实验:浑浊天然水的过滤.
4.实验装置图： 5.注意事项: 一贴：滤纸紧贴漏斗内壁; 二低：滤纸低于漏斗边缘(0.5cm)滤液低于滤纸边缘; 三靠：漏斗下端紧靠烧杯内壁;玻璃棒靠在三层滤纸处; 烧杯紧靠在玻棒上倾倒液体. 讨论: 滤液浑浊的原因?
安国市小营中学学案 达标测评 1.过滤操作的要点：“一贴”“二低”；“三靠；； 2.活学活用：如图所示。 （1）该图进行的是操作。 （2）在此操作中玻璃棒的作用是, 滤纸的边缘要液面（填“高于”或“低于”），这主要是因为。 （3）该操作用于净水，可除水中杂质，如需要进一步使水净化，则可继续进行(填“吸附”或“蒸馏”)。 （4）操作过程中，他发现过滤速度太慢，产生的原因可能是 （5）过滤后，滤液仍然浑浊，其原因有哪些？ （6）改进后过滤，得到了澄清透明的水，他兴奋地宣布：我终于制得了纯水！对此，你有无不同看法？，理由是。若要制取纯水，还需采用的净化方法是3.某化学科技小组在实验室中对一烧杯浑浊的河水进行了简单净化。请完成操作中的有关问题： （1）先向烧杯中加入适量明矾粉末，这是利用明矾溶于水后生成的胶状物对杂质的________，使杂质________来达到净水的目的。 （2）再进行过滤液体： ①过滤操作所必需的仪器：________。 A.烧杯 B.酒精灯 C.铁架台（带铁圈） D.试管 E.玻璃棒 F.漏斗 G.托盘天平 H.蒸发皿 ②玻璃棒的作用是________________________________，玻璃棒下端接触的部分是________层滤纸处。 ③若滤液仍然浑浊，你认为其原因可能是_____________ _____________。 （3）再用活性炭除去水中的异味，这是利用了活性炭的________作用。 （4）最后进行蒸馏： ①蒸馏时加入沸石的目的是________________________；加热烧瓶，注意不要使液体沸腾得太剧烈，以防________________________________________。 ②所得蒸馏水是_____（填“硬水”或“软水”），检验的简单方法是_________
A stock of 100% avertin is prepared by mixing 10 g of 2,2,2-tribromoethyl alcohol (Aldrich T4,840-2) with 10 ml of tert-amyl alcohol (Aldrich 24,048-6). Make sure it is fully dissolved (heat to 50°C; use a microwave oven or magnetic stirrer overnight). (Note: If 2,2,2-tribromoethanol is dark in color, it should be recrystallized before use; see below). To use, dilute 100% stock to 1.2-2.5%, v/v, in water or isotonic saline, stirring vigorously until it is dissolved. Filter-sterilize through 0.2-micron filter (filtering also removes remaining undissolved crystals). Both the 100% stock and working solutions are stored in the dark at 4°C to prevent decomposition to the irritant by-products, dibromoacetic aldehyde and hydrobromic acid (Papaioannou and Fox 1993). The working solution is stable for a couple of months, but some labs prefer to prepare it fresh from stock aliquots immediately prior to the experiment.
分子克隆第三版有详细介绍，结合其中的示意图很容易理解 GST融合蛋白沉降技术利用了GST对谷胧甘肤偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。GST融合的探针蛋白从细菌中表达和纯化，并平行制备细胞裂解液(可被35S标记或非标记)，再将GST融合蛋白探针和细胞裂解液在谷胧甘肤琼脂糖球珠存在下混合并孵育，以使蛋白结合。GST融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集，获得的混合物经洗涤后，用过量游离的谷胧甘肤洗脱或直接在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。蛋白质经SDS-PAGE分离后进行下一步的western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析。GST沉降技术对探测蛋白在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。 GST沉降实验通常有两种应用:确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间 新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用(例子请见Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。这两种实验的设计和实施都有所不同。
GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法，基本原理是这样的：假定A蛋白和B 蛋白可能有相互作用，我们就将其中一个蛋白比如A蛋白融合GST标签，然后将GST-A和B以及能特异结合GST的Sephrose 4B beads 孵育一定时间，然后充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，然后进行放射自显影（如果两个蛋白通过体外翻译并且S35标记的话），就可以看见GST-A和B分别对应的条带，表明GST-A和B因相互作用而被GST-A pull down，如果没有相互作用，就只有GST-A相对应的一条带。我们实验室就是这么做的，当然也有细菌表达GST-A蛋白，而B蛋白通过细胞裂解液中得到，电泳后直接western blot检测。 1、首先你的目的是“要检测这两种蛋白是否与寄主细胞之间存在相互作用”，也即是说要寻找这两种蛋白的相互作用蛋白---在寄主细胞表面，也就是说你要寻找的相互作用蛋白是膜蛋白，对吗？pulldown似乎不是达到你目的的最佳办法，因为你首先要提膜蛋白。而膜蛋白一般都疏水，量少，好像难以pulldown----缓冲液系统不适合。我想，你真正的目的是检测寄主细胞表面是否有你这两个蛋白的受体或配体，细胞ELISA应该可以胜任这个目的。其他方法你可以在查查看？ 2、如何保证你融合蛋白（细胞提取物）的尽可能大的活性，只有一条：快速、低温纯化。即，要保证你纯化过程尽量低温，时间尽量短，得到蛋白后立刻冻纯-70。当然，你还是有必要做下你蛋白活性到底丧失有多快。 3、如果你还是执意要做pulldown，最好还是直接买珠子，试剂盒太贵了，不划算。
教学设计方案1 教学重点：用过滤和结晶分离混合物的一般原理。 教学难点：利用结晶方法，分离几种可溶固体物质的混合物的原理。 教学过程： 引言：在生产生活中，人们所接触到的物质很多都是混合物，为了适应各种不同的需要，常常要把混合物里的几种物质分开，得到较纯净的物质，这叫做混合物的分离，过滤和结晶是最常用的混合物分离的方法。 （板书）第四节过滤和结晶 一、过滤 1．定义：过滤是把溶于液体的固态物质跟液体分离的一种方法。 2．原理：过滤时，液体穿过滤纸上的小孔，而固态物质留在滤纸上，从而使固体和液体分离。 3．操作方法： 例如：粗盐提纯（请学生设计实验步骤）展示粗盐，让学生看到粗盐上的沙子等不溶性固体物质，以利于学生思考。 （演示实验）粗盐提纯 归纳出： （1）步骤： ①在烧杯中溶解粗盐 ②过滤 （2）注意事项： 一贴：滤纸紧贴漏斗内壁 二低：滤纸低于漏斗边缘0.5cm 滤液低于滤纸边缘 三靠：漏斗下端紧靠烧杯内壁 玻璃棒靠在三层滤纸处
烧杯靠在玻棒上倾倒液体 （3）玻璃棒的作用 溶解——加速溶解 过滤——引流 让学生总结过滤作为分离物质的一种方法的适用范围。 过滤是用于分离不容性固体和可溶性固体的一种方法。 设问过渡：如果要分离硝酸钾和氯化钠固体能用过滤的方法吗？如果不能，想一想能用什么方法来分离它们？ 二结晶 1.定义：溶质以一定几何形状的晶体从溶液中析出的过程叫做结晶。 2.原理：几种可溶性固态物质的混合物，根据它们在同一种溶剂里的溶解度不同，用结晶的方法加以分离。 （讲述）常用的结晶方法主要有两种，对于溶解度受温度影响不大的固态溶质，一般用蒸发溶剂的方法得到晶体；对于溶解度受温度影响较大的固态溶质，一般可以用冷却的热饱和溶液的方法，使溶质结晶析出。 例如：硝酸钾中混有少量氯化钠，应怎样分离？ （演示实验）在烧杯中加入10g和NaCl混合物，注入15mL水，加热使混合物完全溶解，然后冷却，观察的析出，再进行过渡，晶体留在滤纸上，NaCl溶解在滤液中。 （讲述）我们已经知道，的溶解度受温度变化的影响较大（80℃时，的溶解度是169g，20℃时为31.6 g），因此较高温度下的饱和溶液降温时，部分从溶液里结晶析出。而NaCl的溶解度受温度变化的影响较小（80℃时，NaCl的溶解度是38.4g，20℃时为36g），降温时大部分NaCl仍溶解在溶液里。过滤时，晶体留在滤纸上，大部分NaCl仍留在滤液里（这种滤液叫做母液）。 小结： 作业：课本142页习题1、2、3 教学设计方案2 [教学方法] 实验讨论法。 [教学用具] 仪器：烧杯、漏斗、玻璃棒、试管、试管夹、铁架台、铁环、滤纸、酒精灯、药匙。
CSH-ChIP-Material Reagents .Agarose gel .Antibodies to native protein of interest (or a post-translationally modified form) .Antibody (control) Cell lysis buffer for ChIP (cold) 5 mM PIPES (pH 8.0) 85 mM KCl 0.5% Nonidet P-40 (NP-40) Store at 4°C. Cells (5x107-1x108 per experiment) Nuclei lysis buffer for ChIP 50 mM Tris-Cl (pH 8.0) O. Adjust the pH to the desired value by To prepare a 1 M solution, dissolve 121.1 g of Tris base in 800 mL of H 2 adding concentrated HCl. 7.4 70 mL 7.6 60 mL 8.0 42 mL Allow the solution to cool to room temperature before making final adjustments to the pH. Adjust the volume of the O. Dispense into aliquots and sterilize by autoclaving. solution to 1 L with H 2
GST pull-down实验介绍 本帖引用网址：https://www.doczj.com/doc/f84438640.html,/thread-30095-1-1.html GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋 白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过 SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。 GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase) GST pull down 和 Coimmunoprecipitation关系问题 啥叫GST pull down , Coimmunoprecipitation呢? 学过生物的地球人都知道. 这是研究蛋白质相互作用的两种方法. 简单通俗的打个比方, GST pull down 就像把一男一女放在孤岛上, 除非蜂马牛不相及, 同类男女之间该发生的一般都会发生. 这种关系是直接的, 西方的. Coimmunoprecipitation, (Co-IP) 则是, 众里寻他千百度, 那人却在灯火阑珊处. 研究一群男女间的自由恋爱问题. 一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白, 但是最终还是会有个最喜欢的, 而在Co-ip中就能发现他的喜好. 这种关系可能是直接的, 也可能是间接的, 是更接近于东方的. 两个蛋白可能在生物体内素昧平生, 一个在头上, 一个在脚上. 也许两者之间或许很合辙, 生来却天各一方. 在GST pull down 的环境中, 他们可能相遇, 吸引在一起. 但在现实生活中, 这样的浪漫关系可能是不现实的. 脚上的蛋白若是跑到头上与情人幽会, 人就要出大问题. 还有的情况是, 两个蛋白即使独处在一起, 也可能不会互相吸引, 但是到了生物系统的大环境中, 在其他蛋白, 各种因素适当的辅助下, 却有可能形成稳定的搭档关系. 所以, 随缘, 就是像蛋白一样单纯, 却不简单. 有关Control和多方取证. 我们做试验, 都要有实验组, 阴性对照, 阳性对照. 即使体外生化实验都达成了, 还要通过多方取证来确定两个蛋白之间确定的生理关系. 这也是我们生理学家所关心的, 若是没有生理意义, 那还空谈什么关系. 尤其在蛋白实验里, 假阴性, 假阳性泛滥. 以为是真的东西, 实际是假的; 以为是假的东西, 实际上却是真的. 如何披沙捡金, 去伪存真? 就得靠缜密的阴性, 阳性对照组来帮助我们辨别. 要把蛋白和已知不相干的蛋白放在一起, 和已知相干的放在一起, 以此来检验实验手段是
实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离. 试剂：NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF（Amersco），Cocktaier（Merck 539134），Immobilized Glutathione（PIERCE 15160） 实验操作程序： 材料及试剂 探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物 细胞蛋白裂解液，洗脱液： PBS及PBS+1%Triton-100 PBS (1L) NaCl：8g KCl：0.2g Na2HPO4： 1.44g KH2PO4：0.24g 加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！ PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃ （以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用） 1：原核融合蛋白A的获得 1.1：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株 1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜 1.3：将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整）.6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N 1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混匀 1.5：冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。至裂解液充分清凉 1.6：11000rpm，15分钟，4℃离心分离上清，-80℃保存备用 2：真核融合蛋白B的获得 2.1：将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如HA,或者myc）的真核表达载体上，进行细胞转染xq 3：48小时后，取适量融合蛋白GST-A冰上冻融 4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4℃层析柜旋转结合1小时。 5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul（PBS+Beads）作Offer。 6：同时，裂解真核融合蛋白B，去尽培养基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well为例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分钟。
实验三 过滤综合实验 —— 恒压（板框）过滤实验 本实验设备由过滤板、过滤框、旋涡泵等组成，是一种小型的工业用板框过滤机。本套装置可进行设计型、研究型、综合型实验。由于设备接近工业生产状况，通过实验可培养学生的工程观念、实验研究能力、设计能力以及解决生产实际问题的能力。 一、实验任务 根据教学大纲要求和各实验小组的准备情况，从下列实验任务中选择其中1-2项实验。 1.测定恒压过滤参数K 和过滤介质参数qe 、θe ； 2．改变压力，测定滤饼压缩性指数S 和滤饼物料特性常数k ； 3.研究不同过滤压力对过滤机生产能力的影响； 4．研究在相同压力下，不同滤浆浓度对过滤机生产能力的影响。 二、实验基本原理 滤饼过滤是液体通过滤渣层（过滤介质与滤饼）的流动。无论是生产工艺还是工艺设计，过滤速率的计算都要有“过滤常数”作依据。由于滤渣厚度随着时间而增加，所以，恒压过滤速度随着时间而降低。不同物料形成的悬浮液，其过滤常数差别很大，即使是同一种物料，由于浓度不同，滤浆温度不同，其过滤常数也不尽相同，故要有可靠的实验数据作参考。 根据恒压过滤方程: ()()e e K q q θθ+=+2 (1) 式中: q ─ 单位过滤面积获得的滤液体积 [ m 3/m 2 ] e q ─ 单位过滤面积的虚拟滤液体积 [ m 3 /m 2 ] θ ─ 实际过滤时间 [ s ] e θ ─ 虚拟过滤时间 [ s ] K ─ 过滤常数 [ m 2 /s ] 将(1)式微分可得: e q K q K dq d 2 2+=θ （2） 当各数据点的时间间隔不大时， dq d θ 可以用增量之比 q ??θ 来代替，即： e q K q K q 22+=??θ （3） 上式为一直线方程。试验时，在恒压下过滤要测定的悬浮液，测出过滤时间θ及滤液累计量q 的数据，在直角坐标纸上标绘 q ??θ 对 q 的关系，所得直线斜率为 K 2，截距为 e q K 2 ，从而求出 K 和 e q 。