甾体生物转化羟化反应的机理及条件研究
某某
（成都理工大学化学工程与技术）
摘要：甾体化合物普遍应用于医学等领域，具有不可替代的作用。对于甾体化合物的生物转化又是其合成主要方式。文中讲述了甾体化合物生物转化中的羟化反应及其相应条件影响等。关键词：甾体化合物; 生物转化; 羟化反应。
甾体化合物(Steroids)又称类固醇，是环戊烷多氢菲类化合物的总称。甾体化合物具有各种生物活性，由于甾体母核上取代基位置种类不同、双键位置或者立体构型等不同，形成了一系列具有独特生理功能的甾体化合物衍生物[1]。
甾体化合物种类繁多，普遍存在于自然界中，成千种甾体化合物已经被报道存在于一些生物体中。比较常见的有：植物组织中的薯芋皂素类、大豆甾醇和油甾醇；昆虫中的蜕皮甾体；动物组织中的糖皮质激素、盐皮质激素类、雌二醇，孕酮和雄酮等性激素、胆固醇、胆酸等；还存在于酵母和霉菌等低等生物中，如麦角固醇等[2]。
甾体化合物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。近年来，甾体化合物在医疗领域的应用范围不断扩大，被广泛用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等[3]。
而生物转化是利用生物体系将加入到反应系统中的外源有机底物某一特定部位或功能基团进行特异性的结构修饰以获得有价值的不同化学产物的工艺[4]。
生物转化涉及的反应类型很多,如加氢、脱氢、氨化、脱氨、酞化、轻化、脱梭、水解、缩合、环氧化、酞胺化;卤化、酷化、脱水、甲基化、磷酸化、糖基转移反应以及底物分子的歧化、异构化、消旋化等[5]。生物转化已经成功地应用于甾体化合物的研究与生产中，特别是甾体的羟化反应。最早应用于工业生产的羟化反应就是利用黑根霉转化黄体酮生成Ⅱα羟基衍生物。本文概述在生物转化甾体化合物中羟化反应的研究进展。
1 羟化反应机理
同位素示踪试验的研究表明，转化到甾体化合物上的羟基是直接取代甾体碳架上的氢位置，并且取代过程中没有发生立体构型的变化，也不是通过形成烯的中间体来完成的，即羟基取代的立体构型(α或β构型)是由氢原子原来所处的空间位置决定。从图1可以看出，羟化作用的氧不来自于水中的氢氧基(-OH)而是来自于空气中的氧。这一点从理论上说明工业上用黑根霉转化甾体时需要充分供氧的原因。Hoyam曾将C11和C12位上的氢被H3取代的孕甾-3,20-二酮作为底物用黑根霉转化来进行研究，结果说明甾体的酶促羟化反应是羟基化位置上的氢被直接取代[6]。
2底物溶解率的影响
在甾体化合物的生物转化过程中，由于甾体底物溶解性差、培养基传质效率低、底物产物的反馈抑制和全细胞生物催化副产物多等原因，菌株的转化能力和甾体的转化效率仍然偏低，是甾体生物转化技术实现工业化的主要瓶颈。
中国是甾体化合物原料及其制剂的主要生产国，原料药年产值近100亿元，其中70%出口，且皮质激素类原料的生产规模已居世界之首。薯蓣皂素的日渐枯竭造成原料成本价格上升，同时合成的低端产品又缺乏国际竞争力，这给我国甾体药物产业带来了严重的危机。因此，需要积极努力开发新型甾体原料资源，研究收率高、成本低、环境污染小的绿色工艺 [7]。
甾体化合物的原料包括植物甾醇，包括β-谷甾醇、豆甾醇、油菜甾醇等，它们主要来自于豆类植物或炼油下脚料。它们具有甾体化合物的母核结构，因而将其“变废为宝”能有效解决水解黄姜所带来的环境污染问题。
其他甾醇原料，如存在于酵母及真菌中的麦角甾醇，又称麦角固醇，是一种重要的医药化工原料，可用于氢化可的松、黄体酮等药物的生产[8]。
因为原料的溶解性问题对甾体化合物的生产占据较大影响，所以寻找新型、有效的甾体药物前体原料仍是未来甾体生物转化方向的主要研究方向。
徐诗伟等[9]在研究地塞米松中间体的1,4脱氢和11α羟基化时，采用N ，N-二甲基甲酰胺溶解底物后进行投料，使产物转化率提高了约40％，且底物转化完全。万金营等[10]在研究黑根霉催化16α，17α-环氧黄体酮的11α-羟基化时，底物经吐温-80处理后最终转化率比对照提高了18％。通过添加溶剂提高底物在转化体系中的溶解度是目前甾体微生物转化过程中最为常见和简单的方法，并且在很多的产业化项目上得以应用。
3甾体羟化酶的研究
早在1981年，Ghosh 等[11]首次研究了Aspergillusochraceus
的无细胞抽提液
图1甾体羟化反应机理（RH 表示底物，ROH 表示相应的产物）
对孕酮的Ⅱα羟化，并对Ⅱα羟化酶进行了初步研究。研究表明该酶是一种诱导酶，主要存在于无细胞抽提液经离心的线粒体后的上清液中，进一步对该上清液离心分离得到微粒体和微粒体后上清液，两者单独存在都不能进行羟化反应，而微粒体部分在添加NaIO4后显示有羟化酶活性，推测羟化酶可能是一种多酶体系，其血红蛋白部分在微粒体中，而微粒体后上清液中可能含有羟化酶系统的非血红蛋白部分。酶的体外羟化活性被氰化物刺激、美替拉酮(metyrapone，细胞色素P450依赖的羟化酶抑制剂)抑制进一步证实微生物羟化反应是由细胞色素P450介导。
4环糊精及其衍生物的影响
如何提高甾体化合物底物在发酵培养基中的溶解度一直是甾体微生物转化的研究热点。一种方法是采用水不溶性的有机溶剂如甲醇、乙醇、DMF和DMSO 等溶解甾体底物，但这类有机溶剂对微生物具有强的毒性作用，因此使用量不能太大；另外也有采用超声粉碎和表面活性剂等方法来提高甾体与菌体细胞的接触，但这些方法都有一定的局限性。
环糊精及其衍生物（如甲基β-环糊精，羟丙基β-环糊精）能形成疏水性空腔，通过氢键、分子间作用力、范德华力等可以与甾体类疏水性强的客体分子相互作用而形成包合物。β环糊精（β-cyclodextrin，CD）是一种外部亲水内部疏水的笼形分子，能与疏水性分子形成包合物，在制药工业中被用来增加药物的水溶性、化学稳定性和生物利用度[12]，更重要的是β环糊精对微生物没有毒性。考虑到这些特点，我们以微生物对雄甾-4-烯-3，17-二酮（androst-4-erie-3，17-dione，AD）Ⅱα羟化反应为例，研究了β环糊精对甾体底物在水中的溶解度及菌种羟化反应的影响，以期通过添加β环糊精增加底物投料浓度，提高羟化反应效率。结果表明β环糊精能显著提高底物AD在发酵培养基中的溶解度，增溶效果优于有机溶剂。
因此，根据甾体化合物的结构特性，合成新型的环糊精衍生物，同时全面分析甾体底物与环糊精的分子识别机制，将有利于进一步挖掘环糊精在微生物转化甾体领域的潜能。单一使用某种有机试剂、表面活性剂或环糊精的效果有限，在实验过程中，可以根据各自的优缺点设计“复合配方”，在不影响菌体生长的前体下，到达高底物投料浓度、高转化率、高产物得率的目的。
5生物转化菌种选育及改良
生物催化剂的种类不够多、适用的反应类型有限是当前限制甾体生物催化发展的因素之一，因此需要大规模从自然界筛选特定功能的催化剂，或对原有的催化剂进行改造。目前在高产菌株的选育中，诱变育种仍然是普遍应用并十分有效的方法，但由于甾体类微生物的转化菌株大多数为放线菌、霉菌等，相对细菌来
讲，这类菌株细胞结构的复杂性和特殊性导致采用菌丝体的诱变方法很难达到预定的诱变效果。因此，在了解菌株细胞结构特征的基础上，采用单孢子或原生质体诱变并结合特定的筛选方法和适当的压力条件进行多轮多次突变选择效果较好。此外，随着基因工程技术的日益完备，采用分子生物学手段对菌种的分子改造也成为比较有效且常用的方法之一。
6新技术和新工艺的研究
由于甾体化合物的非水溶性，底物的传质是影响转化反应的关键因素，为此进行了超声波、表面活性剂、磁场、及原生质体等手段增强底物溶解和细胞膜透性的研究。
固定化技术在生物催化反应中的应用，具有有利于生物催化剂与产物的分离、细胞的重复使用、避免含酶细胞的频繁制备、提高生产效率等许多优点，一直是生物催化领域研究的内容。对甾体药物固定化细胞转化技术研究的最多和最有成效的是固定化活细胞包埋技术。常用的固定化载体有聚丙烯酰胺(NA)、聚氨基甲酸乙酯(PU)、海藻酸盐凝胶、二氧基硅氧烷、葡聚糖凝胶、聚乙烯醇(PV A)等，也有采用生物吸附法的报道。采用疏水性固定化介质将更有利于水不溶性甾体底物与产物的扩散和传质[13]。
7结论
近年来，生物转化显示出化学合成技术所无法取代的优势，吸引了大批国内外研究者对甾体生物转化进行研究和改进。通过一些手段改进底物的溶解性，菌种筛选以及新技术新工艺的应用等提高甾体化合物生物转化羟化反应等的提升，虽然距工业化还有距离，但已展现出良好的前景。
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分子生物学常见名词解释完全版(中英文对照) A Abundance (mRNA 丰度)：指每个细胞中mRNA 分子的数目。 Abundant mRNA(高丰度mRNA)：由少量不同种类mRNA组成，每一种在细胞中出现大量 拷贝。 Acceptor splicing site (受体剪切位点)：内含子右末端和相邻外显子左末端的边界。Acentric fragment(无着丝粒片段)：(由打断产生的)染色体无着丝粒片段缺少中心粒，从而 在细胞分化中被丢失。 Active site(活性位点)：蛋白质上一个底物结合的有限区域。 Allele(等位基因)：在染色体上占据给定位点基因的不同形式。 Allelic exclusion(等位基因排斥)：形容在特殊淋巴细胞中只有一个等位基因来表达编码的 免疫球蛋白质。 Allosteric control(别构调控)：指蛋白质一个位点上的反应能够影响另一个位点活性的能力。Alu-equivalent family(Alu 相当序列基因)：哺乳动物基因组上一组序列，它们与人类Alu 家族相关。 Alu family (Alu家族)：人类基因组中一系列分散的相关序列，每个约300bp长。每个成员 其两端有Alu 切割位点(名字的由来)。 α-Amanitin(鹅膏覃碱)：是来自毒蘑菇Amanita phalloides 二环八肽，能抑制真核RNA聚 合酶，特别是聚合酶II 转录。 Amber codon (琥珀密码子)：核苷酸三联体UAG，引起蛋白质合成终止的三个密码子之一。Amber mutation (琥珀突变)：指代表蛋白质中氨基酸密码子占据的位点上突变成琥珀密码 子的任何DNA 改变。 Amber suppressors (琥珀抑制子)：编码tRNA的基因突变使其反密码子被改变，从而能识 别UAG 密码子和之前的密码子。 Aminoacyl-tRNA (氨酰-tRNA)：是携带氨基酸的转运RNA，共价连接位在氨基酸的NH2 基团和tRNA 终止碱基的3￠或者2￠－OH 基团上。 Aminoacyl-tRNA synthetases (氨酰-tRNA 合成酶)：催化氨基酸与tRNA 3￠或者2￠－OH基团共价连接的酶。 Amphipathic structure(两亲结构)：具有两个表面，一个亲水，一个疏水。脂类是两亲结构，一个蛋白质结构域能够形成两亲螺旋，拥有一个带电的表面和中性表面。 Amplification (扩增)：指产生一个染色体序列额外拷贝，以染色体内或者染色体外DNA形 式簇存在。 Anchorage dependence (贴壁依赖)：指正常的真核细胞需要吸附表面才能在培养基上生长。Aneuploid (非整倍体)：组成与通常的多倍体结构不同，染色体或者染色体片段或成倍丢失。Annealing (退火)：两条互补单链配对形成双螺旋结构。 Anterograde (顺式转运)：蛋白质质从内质网沿着高尔基体向质膜转运。 Antibody (抗体)：由B 淋巴细胞产生的蛋白质(免疫球蛋白质)，它能识别特殊的外源“抗 2 原”，从而引起免疫应答。 Anticoding strand (反编码链)：DNA 双链中作为膜板指导与之互补的RNA 合成的链。Antigen (抗原)：进入基体后能引起抗体(免疫球蛋白质)合成的分子。 Antiparallel (反式平行)：DNA双螺旋以相反的方向组织，因此一条链的5￠端与另一条链的3￠端相连。
高中生物实验涉及的显色反应 实验名称鉴定(或提取) 对象 试剂颜色备注生物材料 糖类的鉴 定 淀粉碘液蓝色脱色的叶片 还原糖(葡萄糖、 果糖、麦芽糖) 斐林试剂砖红色 现配现用,甲 乙液等量混 匀后加入,水 浴加热 含还原糖量高的白色 或近白色的植物组织、尿液等 蛋白质的鉴定蛋白质双缩脲试剂紫色 先加A液后加 B液,摇匀使 用 豆浆、牛奶、鸡蛋清 脂肪的鉴 定脂肪苏丹Ⅲ/Ⅳ橘黄色/红色 需用高倍镜 观察 花生种子等含脂肪较多的种子 DNA、RNA 的鉴定DNA 二苯胺蓝色 需要水浴加 热 鸡血细胞甲基绿绿色口腔上皮细胞RNA 吡罗红红色口腔上皮细胞 有丝分裂 (减数分裂) 染色体(染色质) 醋酸洋红/龙胆紫/ 改良苯酚品红染液 等碱性染料 红色/紫色/红色 洋葱根尖分生区(有丝分裂) 蝗虫的精母细胞(减数分裂) 观察线粒 体 线粒体健那绿染剂蓝绿色活细胞(常用口腔上皮细胞) 叶绿体中 色素的提取与分离叶绿体色素 无水乙醇(提取)、 层析液(分离) 色素带从上到下: 橙黄色的胡萝卜素、 黄色的叶黄素、 蓝绿色的叶绿素a、 黄绿色的叶绿素b 加入二氧化 硅就是为了 研磨得更充 分;碳酸钙可 防止在研磨 中色素被破 坏 新鲜的绿叶 酵母菌呼吸方式探 究酒精 酸性条件(浓硫酸 95%-97%)下的重铬 酸钾溶液 灰绿色酵母菌(无氧条件) CO2澄清的石灰水浑浊酵母菌(无氧、有氧) 溴麝香草酚蓝由蓝变绿变黄 高中生物实验中酒精与盐酸的用法 其她试剂及用法 (1)班氏糖定性试剂:为蓝色溶液。与葡萄糖溶液混合后沸水浴会出现砖红色沉淀。用于尿糖的测定。 (2)20%的肝脏研磨液、3%的过氧化氢、3、5%的氯化铁:用于比较过氧化氢酶与Fe3+的催化效率。 (新鲜的肝脏中含有过氧化氢酶) (3)3%的可溶性淀粉溶液、3%的蔗糖溶液、2%的新鲜淀粉酶溶液:用于探索淀粉酶对淀粉与蔗糖的 作用实验。 (4)层析液:(成分:20份石油醚、2份丙酮、与1份苯混合而成,也可用93号汽油)可用于色素的层析, 即将色素在滤纸上分离开。 (5)二氧化硅:在色素的提取的分离实验中研磨绿色叶片时加入,可使研磨充分。 (6)碳酸钙:研磨绿色叶片时加入,可中与有机酸,防止在研磨时叶绿体中的色素受破坏。 (7)0.3 g/mL的蔗糖溶液:相当于30%的蔗糖溶液,比植物细胞液的浓度大,可用于质壁分离实验。 (8)0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液:与鸡血混合,防凝血 实验试剂目的 鉴定脂肪体积分数为50%酒精洗去浮色(洗去染液) 观察ＤＮＡ与ＲＮＡ 在细胞中分布 ８％的盐酸１、改变细胞膜通透性,使染色剂迅速进入细胞 ２、使染色体中ＤＮＡ与蛋白质分离利于甲基绿 与ＤＮＡ结合 叶绿体色素提取无水乙醇溶解色素,提取色素 观察细胞有丝分裂解离液(１５％盐酸:体 积分数９５％的酒精＝ １:１) 使组织细胞相互分离开 低温诱导植物染色体 数目变化 卡诺氏液固定细胞形态 体积分数为９５％酒精冲洗残留液 解离液(１５％盐酸,９ ５％酒精) 解离 土壤小动物类群丰富 度 体积分数７０％酒精杀死保存小动物,防止腐烂,成为标本 DNA粗提取与鉴定体积分数为95%酒精溶解杂质析出DNA
蛋白质的二级结构是指多肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠，并以氢键为次级键而形成有规则的构象，如α螺旋β折叠β转角等。 肽单位：肽键是构成在分子的基本化学键，肽键与相邻的原子所组成的基团，成为肽 单位或肽平面。 结构域是位于超二级结构和三级结构间的一个层次。结构域是在蛋白质的三级结构内 的独立折叠单元，其通常都是几个超二级结构单元的组合。在较大的蛋白质分子中， 由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的致 密的三维实体，即结构域。 超二级结构又称模块或膜序是指在多肽内顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体。 三级结构具有二级结构、超二级结构或结构域的一条多肽链，由于其序列上相隔较远 的氨基酸残基侧链的相互作用，而进行范围更广泛的盘曲与折叠，形成包括主、测链 在内的空间排列，这种在一条多肽链中所有原子和基团在三维空间的整体排布称为三 级结构。 一级结构蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，以及二硫键的位置。 四级结构多亚基蛋白质分子中各个具有三级结构的多肽链，以适当的方式聚合所形成 的蛋白质的三维结构。 增色效应增色效应或高色效应。由于DNA变性引起的光吸收增加称增色效应,也就是 变性后 DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。 固定化酶不溶于水的酶。是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或 把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。 脂肪酸的β氧化饱和脂肪酸在一系列酶的作用下，羧基端的β位C原子发生氧化，C链在α位C原子与β位C原子间发生断裂，每次生成一个乙酰CoA和较原来少两个C单位的脂肪酸，这个不断重复进行的脂肪酸氧化过程称为脂肪酸的β氧化。 脂肪酸的β-氧化基本过程：丁酰CoA经最后一次β氧化：生成2分子乙酰CoA 。故 每次β氧化1分子脂酰CoA生成1分子FADH２，1分子NADH+H+，1分子乙酰CoA，通过呼吸链氧化前者生成2分子ATP，后者生成3分子ATP。 尿素循环肝脏是动物生成尿素的主要器官，由于精氨酸酶的作用使精氨酸水解为鸟氨 酸及尿素。精氨酸在释放了尿素后产生的鸟氨酸，和氨甲酰磷酸反应产生瓜氨酸，瓜 氨酸又和天冬氨酸反应生成精氨基琥珀酸，精氨基琥珀酸为酶裂解，产物为精氨酸及 延胡索酸。由于精氨酸水解在尿素生成后又重新反复生成，故称尿素循环。 操纵子指启动基因、终止基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称。原核生物大多数 基因表达调控是通过操纵子机制实现的。操纵子通常由 2个以上的编码序列与启动序列、操纵序列以及其他调节序列在基因组中成簇串联组成。启动序列是RNA聚合酶结合并起动转录的特异DNA序列。多种原核基因启动序列特定区域内，通常在转录起始点上游-10及-35区域存在一些相似序列，称为共有序列。大肠杆菌及一些细菌启动序 列的共有序列在-10区域是TATAAT，又称Pribnow盒，在-35区域为 TTGACA。这些 共有序列中的任一碱基突变或变异都会影响RNA聚合酶与启动序列的结合及转录起始。因此，共有序列决定启动序列的转录活性大小。操纵序列是原核阻遏蛋白的结合位点。当操纵序列结合阻遏蛋白时会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或使RNA聚合酶
高中生物实验涉及的显色反应
高中生物实验中酒精和盐酸的用法 其他试剂及用法 （1）班氏糖定性试剂：为蓝色溶液。和葡萄糖溶液混合后沸水浴会出现砖红色沉淀。用于尿糖的测定。 （2）20%的肝脏研磨液、3%的过氧化氢、3.5%的氯化铁：用于比较过氧化氢酶和Fe3+的催化效率。（新鲜的肝脏中含有过氧化氢酶）（3）3%的可溶性淀粉溶液、3%的蔗糖溶液、2%的新鲜淀粉酶溶液：用于探索淀粉酶对淀粉和蔗糖的作用实验。 （4）二氧化硅：在色素的提取的分离实验中研磨绿色叶片时加入，可使研磨充分。 （5）碳酸钙：研磨绿色叶片时加入，可中和有机酸，防止在研磨时叶绿体中的色素受破坏。 （6）0.3 g/mL的蔗糖溶液：相当于30%的蔗糖溶液，比植物细胞液的浓度大，可用于质壁分离实验。 （7）0.1 g/mL 的柠檬酸钠溶液：与鸡血混合，防凝血
（8）氯化钠溶液：①可用于溶解DNA。当氯化钠浓度为2 mol/L、 0.015 mol/L时DNA的溶解度最高，在氯化钠浓度为0.14 mol/L时， DNA溶解度最低。②浓度为0.9%时可作为生理盐水。 （9）胰蛋白酶：①可用来分解蛋白质。②可用于动物细胞培养时分解组织使组织细胞分散开。 （10）秋水仙素：人工诱导多倍体试剂。用于萌发的种子或幼苗，可使染色体组加倍，原理是可抑制正在分裂的细胞纺锤体的形成。（11）层析液：(成分：20份石油醚、2份丙酮、和1份苯混合而成，也可用93号汽油)可用于色素的层析，即将色素在滤纸上分离开。 (12)果胶酶：分解果胶，将植物细胞分散开；提高果汁的出汁率和澄清度 （13）果胶酶和纤维素酶：除去植物细胞的细胞壁，制备原生质体 （14）0.1%的氯化汞溶液和70%的酒精溶液：植物组织培养和花药离体培养时外植体的消毒 （15）卡诺氏固定液：将无水酒精和冰醋酸按体积比为3:1的比例混匀。用于植物组织和细胞的固定。 方案评价试题解题的一般思路 一看对照 有无对照实验 如果有，看对照设计 是否合理 实验变量设置 是否有标记 是否遵循了单一变量原则 是否遵循了等量原则 是否排除了干扰因素 二看步骤 步骤的顺序是否合理 步骤是否完整 具体操作有无违反生物学基本原理 三看验证 实验结果的验证目标是否准确 实验结果的验证方法是否得当 四看材料生物学材料选择是否得当 实验器材选择是否合理 药剂选择，使用，用量是否准确 五看条件 是否需要搅拌加热等 实验所需的温度，光照等条件是否合理
1.DMSO： DMSO是二甲基亚砜，用途广泛。用作乙炔、芳烃、二氧化硫及其他气体的溶剂以及腈纶纤维纺丝溶剂。是一种即溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。对皮肤有极强的渗透性，有助于药物向人体渗透。也可作为农药的添加剂。也是一种十分重要的化学试剂。 DMSO也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。 但是研究表明，DMSO存在严重的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性,具有血管毒性和肝肾毒性。 DMSO是毒性比较强的东西，用的时候要避免其挥发，要准备1%-5%的氨水备用，皮肤沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗涤. 最为常见的为恶心、呕吐、皮疹及在皮肤、和呼出的气体中发出大蒜、洋葱、牡蛎味。 吸入：高挥发浓度可能导致头痛，晕眩和镇静。 皮肤：能够灼伤皮肤并使皮肤有刺痛感，如同所见的皮疹及水泡一样。若二甲基亚砜与含水的皮肤接触会产生热反应。要避免接触含有毒性原料或物质的二甲基亚砜溶液，因其毒性不为人所知，而二甲基亚砜却可能会渗入肌肤，在一定条件下会将有毒物质代入肌肤。 吸收：吸收危险性很低。 2.EB：EB（Ethidium bromide，溴化乙锭） 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭用标准302nm紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的NDA条带。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性！会在60－70度是蒸发（所以最好不要在胶太热的时候加，或者应该加到液体里，0.5ug/ml，染色半小时）（当EB加得过多时，也可以在室温用水将已染色的凝胶浸泡20min以降低未结合的EB引起的背景荧光）。 溴化乙锭溶液的净化处理：由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。 （1）对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： ①将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml； ②加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； ③加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 （2）EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理： ①按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时； ②用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910152033.0 (22)申请日 2019.02.28 (71)申请人 武汉大学 地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山 武汉大学 (72)发明人 瞿旭东 周强辉 张亚楠 王军林 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 42222 代理人 彭劲松 (51)Int.Cl. C12P 33/12(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称一种用于系列甾类化合物19位羟化的生物转化方法(57)摘要本发明公开了一种用于系列甾类化合物19位羟化的生物转化方法，属于化学及生物学领域。本发明方法步骤为：将甾类化合物和铁盐加入到含生物转化菌株的液体培养基中进行培养，所述的生物转化菌株包含具有甾类化合物C -19位羟化功能的菌株以及含有甾类化合物C -19羟化基因的异源表达菌株；所述的甾类化合物包含可托多松，17位和/或21位羟基保护的可托多松，以及在前述限定化合物基础上对甾醇骨架的其他修饰。本发明可用于甾醇19位高效羟化，获得系列甾醇羟化产物。本发明解决了甾体类化合物在19位羟化产物产率低、选择性差等问题，所用原料廉价易得，反应条件温和，底物普适性好，产率高，制备过程简单， 具有很高的工业应用价值。权利要求书1页 说明书6页CN 109852659 A 2019.06.07 C N 109852659 A
1.一种用于系列甾类化合物19位羟化的生物转化方法，其特征在于：包括如下步骤：将甾类化合物和铁盐加入到含生物转化菌株的液体培养基中进行培养；所述的生物转化菌株包含具有甾类化合物C -19位羟化功能的菌株以及含有甾类化合物C -19羟化基因的异源表达菌株。 2.根据权利要求1所述的用于系列甾类化合物19位羟化的生物转化方法，其特征在于：所述的生物转化菌株为Thanatephorus cucumeris NBRC 6298或Aspergillus oryzae NSAR1。 3.根据权利要求1所述的用于系列甾类化合物19位羟化的生物转化方法，其特征在于： 所述的甾类化合物的结构式如通式I所示： 通式I中，R 1和/或R 2为烷基、取代烷基、硅基、酰基。 4.根据权利要求3所述的用于系列甾类化合物19位羟化的生物转化方法，其特征在于：所述的甾类化合物为对通式I所示化合物的甾醇骨架做了修饰的化合物。 5.根据权利要求1所述的用于系列甾类化合物19位羟化的生物转化方法，其特征在于：所述的甾类化合物为17-乙酰基-可托多松。 6.根据权利要求1-5任一项所述的用于系列甾类化合物19位羟化的生物转化方法，其特征在于：包括如下步骤：将生物转化菌株接种到固体培养基上活化，活化后的菌株接种于液体培养基中培养2-3天，按照5-10％的接种量再转接到新鲜的液体培养基中培养2-3天后加入甾类化合物和铁盐，继续培养直至转化率达到最高。 7.根据权利要求6所述的用于系列甾类化合物19位羟化的生物转化方法，其特征在于：所述的培养的条件为30℃、200rpm。 8.根据权利要求6所述的用于系列甾类化合物19位羟化的生物转化方法，其特征在于：所述的铁盐包括硫酸亚铁铵、硫酸亚铁、氯化亚铁、硝酸亚铁、硫酸铁铵、硫酸铁、氯化铁、硝酸铁等。 9.根据权利要求6所述的用于系列甾类化合物19位羟化的生物转化方法，其特征在于：加入铁盐后铁离子的终浓度为1-1.5mmol/L。 权 利 要 求 书1/1页2CN 109852659 A
分子生物学常见名词解释完全版(中英文对照） A Abuｎdancｅ（mRNA丰度）：指每个细胞中mRNＡ分子得数目。?AbｕndanｔmＲNA（高丰度mRNA):由少量不同种类mＲNＡ组成,每一种在细胞中出现大量 拷贝。?Acceptor ｓｐliｃing sｉte (受体剪切位点）:内含子右末端与相邻外显子左末端得边界。?A ｃｅｎｔrｉc fragment（无着丝粒片段）：（由打断产生得)染色体无着丝粒片段缺少中心粒，从而?在细胞分化中被丢失. ?Activｅｓitｅ（活性位点)：蛋白质上一个底物结合得有限区域。 Alｌｅle(等位基因）：在染色体上占据给定位点基因得不同形式. ?Aｌｌelｉc excluｓioｎ（等位基因排斥）：形容在特殊淋巴细胞中只有一个等位基因来表达编码得 免疫球蛋白质。?Allｏｓteｒic coｎtｒol(别构调控）:指蛋白质一个位点上得反应能够影响另一个位点活性得能力。 Alu—ｅqｕiｖalｅｎｔｆamily（Ａlu 相当序列基因）：哺乳动物基因组上一组序列,它们与人类Aｌｕ家族相关. Ａｌuｆamｉly (Ａlu家族）：人类基因组中一系列分散得相关序列，每个约3０0bｐ长。每个成员?其两端有Aｌu切割位点（名字得由来）. ?α-Amanitｉn(鹅膏覃碱)：就是来自毒蘑菇Aｍaｎitａphal ｌｏｉdes二环八肽,能抑制真核ＲNA聚 合酶，特别就是聚合酶II 转录. Ａmber codon （琥珀密码子)：核苷酸三联体ＵAＧ，引起蛋白质合成终止得三个密码子之一.?Ａm ｂer mutatioｎ(琥珀突变）:指代表蛋白质中氨基酸密码子占据得位点上突变成琥珀密码 子得任何DNA 改变。?Aｍber supｐｒessors (琥珀抑制子）:编码tRNA得基因突变使其反密码子被改变，从而能识 别UAＧ密码子与之前得密码子。 Aｍinoａcyl—tRNA (氨酰—tRＮA)：就是携带氨基酸得转运ＲＮA，共价连接位在氨基酸得NH2 基团与tRNA终止碱基得３￠或者2￠—OH 基团上。?Aｍinoａcyl-tRNA syntｈetaｓeｓ（氨酰－tRNA 合成酶）：催化氨基酸与tRＮA 3￠或者2￠-ＯＨ基团?共价连接得酶。?Amｐｈｉｐａthic strｕｃtuｒｅ(两亲结构）：具有两个表面，一个亲水,一个疏水。脂类就是两亲结构, ?一个蛋白质结构域能够形成两亲螺旋,拥有一个带电得表面与中性表面。 Ampliｆicaｔion (扩增）：指产生一个染色体序列额外拷贝,以染色体内或者染色体外DNＡ形?式簇存在。?Ａnchoraｇe deｐeｎｄenｃｅ（贴壁依赖)：指正常得真核细胞需要吸附表面才能在培养基上生长。?Anｅuplｏid （非整倍体)：组成与通常得多倍体结构不同,染色体或者染色体片段或成倍丢失。?Annealｉnｇ（退火)：两条互补单链配对形成双螺旋结构。 Ａntｅrｏｇｒadｅ(顺式转运):蛋白质质从内质网沿着高尔基体向质膜转运。 2 ? Antiboｄy（抗体):由Ｂ淋巴细胞产生得蛋白质（免疫球蛋白质），它能识别特殊得外源“抗??原"，从而引起免疫应答。 Antｉｃoｄｉng ｓtrand (反编码链）：ＤNA 双链中作为膜板指导与之互补得RNA 合成得链。?Ａntigeｎ（抗原)：进入基体后能引起抗体(免疫球蛋白质）合成得分子。?Ａntipaｒaｌleｌ(反式平行)：DNA双螺旋以相反得方向组织,因此一条链得5￠端与另一条链得 ３￠端相连。 Anｔｉteｒmiｎatｉｏn pｒotｅｉn (抗终止蛋白质）：能够使RNＡ聚合酶通过一定得终止位点得蛋白质?质. ?AP endonuclｅaｓes （AP核酸内切酶）：剪切掉DNA 5￠端脱嘌呤与脱嘧啶位点得酶?Apoptｏsis （细胞凋亡)：细胞进行程序性死亡得能力;对刺激应答使通过一系列特定反应摧?毁细胞得途径发生. Aｒchｅae（古细菌）：进化中与原核与真核不同得一个分支. ?Asｃuｅ(子囊)：真菌得子囊包含四个或八个（单一得)孢子，表示一次减数分裂得产物。
高中生物学实验中相关的颜色反应归纳 1、斐林试剂检测可溶性还原糖 原理：还原糖+斐林试剂→砖红色沉淀 注意：①斐林试剂的甲液和乙液要等量混合均匀后方可使用，而且是现用现配，条件需要水浴加热，当然化学上是直接将试管在火焰上加热，只不过考虑安全问题，水浴加热更安全，还能受热均匀。②注意与双缩脲试剂的浓度区别与使用区别。 应用：检验和检测某糖是否为还原糖；不同生物组织中含糖量高低的测定；在医学上进行疾病的诊断，如糖尿病、肾炎。 2、苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ检测脂肪 原理：苏丹Ⅲ+脂肪→橘黄色；苏丹Ⅳ+脂肪→红色 注意：脂肪的鉴定需要用显微镜观察。 应用：检测食品中营养成分是否含有脂肪。 3、双缩脲试剂检测蛋白质 原理：蛋白质+双缩脲试剂→紫色 注意：①双缩脲试剂在使用时，先加A液再加B液，反应条件为常温（不需要加热）。②注意检测试剂为“双缩脲试剂”③双缩脲试剂之所以能检测蛋白质，是因为蛋白质有肽键（实际上是含有与双缩脲类似的结构），双缩脲试剂能检测含有两个肽键及以上的物质，不能检测二肽和尿素。 应用：鉴定某些消化液中含有蛋白质；用于劣质奶粉的鉴定。 4、碘液检测淀粉 原理：淀粉+碘液→蓝色 注意：①这里的碘是单质碘，而不是离子碘。 应用：检测食品中营养成分是否含有淀粉 5、DNA的染色与鉴定 染色原理：DNA+甲基绿→绿色 应用：可以显示DNA在细胞中的分布。 鉴定原理：DNA+二苯胺→蓝色 应用：用于DNA粗提取实验的鉴定试剂。 6、吡罗红使RNA呈现红色 原理：RNA+吡罗红→红色 应用：可以显示RNA在细胞中的分布。 注意：在观察DNA和RNA在细胞中的分布时用的是甲基绿和吡罗红混合染色剂，而不是单独染色。 7、台盼蓝使死细胞染成蓝色（质壁分离实验时用来鉴定细胞的死活） 原理：正常的活细胞，细胞膜结构完整具有选择透过性能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；死细胞或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。 应用：区分活细胞和死细胞；检测细胞膜的完整性。
甾体药物 体激素是一类稠合四环脂烃化合物，具有环戊烷并多氢菲母核。甾体激素类药物的化学结构由A、B、C和D四个环稠合的而成，A、B、C环为六元环，而D为五元环。理论上这四个环有多种稠合方式，但主要以两种方式存在，即5-α系和5-β系，5β-系为A/B环顺式稠合，而5α-系为A/B环反式稠合，这主要是有5-H的取向不同所成。 C H 3C H 3 C H 3 C H 3 5α-系的构象式5β-系的构象式但天然存在的甾体激素均为5-α系。其四个环都是反式稠合。C5、C8、C9、C10、C13、C14为手性碳原子。当环上取代基在环平面的上方时，用β-表示。在环平面的下方时，用α表示。当甾体母核平面平放在纸平面上时，虚线表示取代基在环的下方，为α取代；实线表示取代基在环的上方，为β取代。甾体A、B、C环一般以椅式构象存在，D环以半椅式构象存在。甾体药物按化学结构可将它们分为雌甾烷类、雄甾烷类及孕甾烷类化合物。若按其药理作用分类，可分为性激素及皮质激素； C H 3 C H 3C H 3 C H 3 C H 3C H 3 孕甾烷雄甾烷雌甾烷 他们之间的相互关系为： 雌性激素雌甾烷 雄性激素 性激素雄性激素雄甾烷 蛋白同化激素 甾体激素孕激素 糖代谢皮质激素孕甾烷 肾上腺皮质激素 盐代谢皮质激素 第一节雄性激素及同化激素 雄性激素是维持雄性生殖器的发育及促进第二性征发育的物质。雄性激素还具有蛋白同化活性，能促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的代谢，使肌肉生长发达，骨骼粗壮。临床上雄性激素用于内源性激素分泌不足的补充疗法。而蛋白同化激素用以治疗病后虚弱和营养不良的病人。 1、雄性激素及同化激素 雄酮为从动物尿中提取得到，为第一个被发现具有雄性激素作用的物质，但效力太弱，
1 分子生物学常见名词解释完全版(中英文对照) 2 A 3 Abundance (mRNA 丰度)：指每个细胞中mRNA 分子的数目。 4 Abundant mRNA(高丰度mRNA)：由少量不同种类mRNA组成，每一种在细胞中5 出现大量 6 拷贝。 7 Acceptor splicing site (受体剪切位点)：内含子右末端和相邻外显子左末8 端的边界。 9 Acentric fragment(无着丝粒片段)：(由打断产生的)染色体无着丝粒片段缺10 少中心粒，从而 11 在细胞分化中被丢失。 12 Active site(活性位点)：蛋白质上一个底物结合的有限区域。 13 Allele(等位基因)：在染色体上占据给定位点基因的不同形式。 14 Allelic exclusion(等位基因排斥)：形容在特殊淋巴细胞中只有一个等位基15 因来表达编码的 16 免疫球蛋白质。 17 Allosteric control(别构调控)：指蛋白质一个位点上的反应能够影响另一18 个位点活性的能力。 19 Alu-equivalent family(Alu 相当序列基因)：哺乳动物基因组上一组序列，20 它们与人类Alu
21 家族相关。 22 Alu family (Alu家族)：人类基因组中一系列分散的相关序列，每个约300bp 23 长。每个成员 24 其两端有Alu 切割位点(名字的由来)。 25 α-Amanitin(鹅膏覃碱)：是来自毒蘑菇Amanita phalloides 二环八肽，能26 抑制真核RNA聚 27 合酶，特别是聚合酶II 转录。 28 Amber codon (琥珀密码子)：核苷酸三联体UAG，引起蛋白质合成终止的三个29 密码子之一。 30 Amber mutation (琥珀突变)：指代表蛋白质中氨基酸密码子占据的位点上突31 变成琥珀密码 32 子的任何DNA 改变。 33 Amber suppressors (琥珀抑制子)：编码tRNA的基因突变使其反密码子被改34 变，从而能识 35 别UAG 密码子和之前的密码子。 36 Aminoacyl-tRNA (氨酰-tRNA)：是携带氨基酸的转运RNA，共价连接位在氨基37 酸的NH2 38 基团和tRNA 终止碱基的3￠或者2￠－OH 基团上。 39 Aminoacyl-tRNA synthetases (氨酰-tRNA 合成酶)：催化氨基酸与tRNA 3￠40 或者2￠－OH基团
高中生物颜色反应小结 1染色 1.1定义：利用物理或化学方式使被染物质与染色剂结合从而使被染物质显示染色剂颜色的过程。 1.2应用价值：根据细胞中某结构的成分特点，恰当选择与该成分具有较强亲和力的染色剂对细胞进行染色从而显示细胞不同结构的形态与位置。 1.3染色剂的分类 作为染色剂必须具备两个性质：一要具有颜色；二要与被染组织之间有亲和力。这两个性质分别是由染色剂中产生颜色的发色基团，和与被染组织之间有亲和力的助色基团来决定的，发色基团能产生颜色，但由于它对被染组织没有亲和力，只能使被染组织暂时染色，但经物理作用后又会被除去，所以发色基团必须与被染组织之间能产生亲和力的助色基团结合才能成为染料（染色剂）。助色基团的存在使染料物质离子化，极性增强，促进染料与组织间发生作用，产生染色效果，而助色基团的性质决定了染料是酸性或碱性染色剂。一般根据染色剂的官能基团（助色基团），把染色剂分为酸性染色剂、碱性染色剂和中性染色剂。酸性染色剂是指酸性助色基团，在水中电离后其本身（含发色基团）成为带负电荷阴离子的染色剂，这类染色剂一般用于染细胞质，如伊红、橘黄G、甲基蓝等。碱性染色剂是指碱性助色基团，在水中电离后其本身（含发色基团）成为带正电荷阳离子的染色剂，这类染色剂一般用于染细胞核，如苏木精、龙胆紫、醋酸洋红、甲基绿和美蓝等。中性染色剂是酸性染色剂和碱性染色剂的复合物，又可称为复合染料。是由碱性染料（色碱的盐）和酸性染料（色酸的盐）配制而成。其中染色剂的分子很大，所以往往水中溶解度较低，需用酒精做溶剂。血液学中的血液涂片经常使用的瑞氏染色剂及姬姆萨染色剂就是这种混合染色剂。其中的各种不同成分可分剔使核、胞浆和颗粒着色。 活体染色是指利用某些无毒或毒性很小的染色剂来显示出细胞内某些结构，而不影响细胞的生命活动的染色方法，因此活体染色技术通常可以用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。它包括体内活体染色和体外活体染色，体内活体染色和体外活体染色的主要区别是体内活体染色是在有机体内部，因此不是在空气中而是在还原的环境中进行的，体外活体染色则是在空气中，在氧化的环境中进行的。 活体染色剂是一种能被生物活细胞的某种构造吸收或吸附，但对于细胞、组织和生物体不发生有害作用的染料。一般染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后，细胞膜被破坏，染料才能进入细胞内部，但是有一些染料（即活体染色剂）却能进入活细胞，它们是一些无毒或毒性很小的染色剂，能使细胞内某些特定结构着色。活体染色剂多为碱性染料，如中性红、健那绿（詹纳撕绿）亚甲基蓝、甲苯胺蓝和亮焦油紫等，它们解离后带正电，其中有的染料能与细胞内的某种特定结构专一性的结合，因此能达到对细胞内的某种特定结构进行染色的目的，例如，可用中性红染液泡系，用健那绿染线粒体。 2颜色反应 2.1定义：化学物质在一定的条件下和特定的试剂混合后发生的特定颜色变化。 2.2应用：用于检测生物样品中是否有某种物质或某物质量的多少，有该物质时会发生颜色反应，该物质含量多时回发生较重的颜色反应。 3染色和颜色反应的比较 原理研究对象的颜色应用价值实例 染色利用染色剂对被 染物质的亲和性和染色剂一致显示某结构的形 态和位置 龙胆紫、醋酸洋红、甲 基绿对DNA的染色等 颜色反应利用化学反应生 成新的物质和显色剂不同检测样品中某物 质是否存在及含 量多少 斐林试剂与还原糖、双 缩脲试剂与蛋白质的反 应等
第11卷第2期2013年3月生物加工过程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol．11No．2Mar．2013 doi ：10．3969/j．issn．1672－3678．2013．02．005 收稿日期：2013－01－04 基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）重大项目（2011AA02A211）；国家自然科学基金（21206055）；江苏省自然科学基金 （BK2012127） 作者简介：许正宏（1971—），男，江苏泰州人，教授，博士生导师，研究方向：生物催化及传统发酵， E-mail ：zhenghxu@jiangnan．edu．cn 甾体生物转化技术研究的现状与进展 许正宏，吴 燕，李 会，李 恒，史劲松 （江南大学医药学院，无锡214122） 摘要：从半合成原料、菌种选育及改良和生物转化新技术与新工艺（包括底物的物理/化学助溶法，新型转化体系 和细胞通透性改良法）等方面对近几年来甾体生物转化进展进行综述。可以预测，在甾体药物的工业化生产过程中，生物转化技术所占比例将大幅度提高。关键词：甾体；生物转化；药物中间体中图分类号：TQ46 文献标志码：A 文章编号：1672－3678（2013）02－0030－07 Current state and progress of biotransformation technology of steroid compounds XU Zhenghong ，WU Yan ，LI Hui ，LI Heng ，SHI Jingsong （School of Pharmaceutical Science ，Jiangnan University ，Wuxi 214122，China ） Abstract ：Progress of biotransformation technology of steroid compounds was reviewed．The selection of steroid raw materials ，selection and improvement of microbial strain and new technologies of biotransformation were discussed ，including physical /chemical solubilizing of substrates ，new transformation system and improvement of cell permeability．It is forecasted that the proportion of biotransformation technologies increased in the industrial production process of steroid hormone drugs．Key words ：steroids ；biotransformation ；pharmaceutical intermediates 甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物，具 有很强的抗过敏、抗感染、抗病毒等药理活性，已被广泛应用于治疗内分泌失调、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、风湿病、老年性疾病等 ［1－2］ 。甾体生物转化 即利用微生物酶对甾体底物的某一部位进行特定 的化学反应来获得一定的产物。与传统的化学合成法相比，甾体生物转化具有反应条件温和、环境友好、高效性和高选择性等优势，还能合成化学合成法所不能合成的一些甾体中间体。近些年来，微生物转化工艺在甾体药物合成路线中的比例迅速 增加，形成了一条生物化学法耦联的甾体药物合成 新工艺。最为成功的案例是利用黑根霉Rhizopus nigricans 在孕甾酮的C11α引入羟基，解决了皮质激素合成中的关键问题，产品收率大幅度提高，专一性增强，效果远超化学合成法的合成效果，开创了 微生物转化甾体化合物的先例［3］。 目前，甾体药物的合成主要集中在以具有甾体 母核结构的天然产物为原料、采用化学法和微生物 转化法相结合的方式来合成甾体类药物。综合国内外研究， 生物转化技术在甾体药物生产中的应用主要分为两大类：①将天然原料转化为生产甾体化
生物药靶和药物分子的主要作用力形式 1、共价键共价键是生物药靶和药物分子的最强作用力，药物分子的主要共价结合方式有烷基化作用、酰基化作用和磷酰化作用。药物分子的共价基团往往具有较高的化学活性而缺乏特异选择性。有些药物分子结构并没有反应基团，而是在人体内转化生成活性基团。药物分子与生物药靶的化学反应与生物分子表面的基团和性质有关。 2、非共价键生物体系中分子识别的过程不仅涉及到化学键的形成，而且具有选择性的识别。共价键存在于一个分子或多个分子的原子之间，决定分子的基本结构，是分子识别的一种方式。而非共价键（又称为次级键或分子间力）决定生物大分子和分子复合物的高级结构，在分子识别中起着关键的作用。 1)、静电作用酶、核酸、生物膜、蛋白质等生物药靶的表面都具有可电离的基团和偶极基团存在，很容易与含有极性基团的药物分子生成离子键和其它静电作用。 (1).离子键生物药靶表面的带电基团可以与药物分子的带电基团形成离子键。这种键可以解离。 (2).离子－偶极作用药物分子和生物药靶中O、S、N和C原子的电负性均不相等，这些原子形成的键由于电负性差值可以产生偶极现象。这种偶极部分与永久电荷可以形成静电作用。(3).偶极-偶极相互作用这种作用对药物分子—生物药靶相互作用的特异性和立体选择性非常重要。 2)、氢键氢键是由两个负电性原子对氢原子的静电引力所形成，是一种特殊形式的偶极—偶极键。它是质子给予体X-H和质子接受体Y之间的一种特殊类型的相互作用。 3). 范德华力这是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力。它是一种比较弱的、非特异性的作用力。 (1).静电力静电力是极性药物分子的永久偶极之间的静电吸引作用。 (2).诱导力永久偶极矩诱导邻近分子，并使其发生电荷转移，出现诱导偶极矩。 (3).色散力非极性药物分子有瞬间偶极矩。瞬间偶极矩将在邻近分子中诱导出新的偶极矩。瞬间偶极矩与诱导偶极矩间的相互作用力就叫做色散力。 (4).排斥力当分子间相距较远时，表现为范德华引力，当分子靠得很近时，则会出现排斥力。4)、疏水作用就药物分子来说，它们的非极性部分在生物体内的环境中均为水合状态，即被水分子所包围，当它们与受体接近到某种程度时，非极性部分周围的水分子便被挤出去，两个非极性区域的接触稳定化，从而缔合在一起。 5)、电荷转移作用在生物系统中，生物分子可以通过电子给予分子与电子接受分子的相互作用形成电荷转移复合物。电荷转移是生物体系的重要作用方式和传能方式之一。
1.斐林试剂检测可溶性还原糖 原理：还原糖+菲林试剂→砖红色沉淀 注意：菲林试剂的甲液和乙液要混合均匀后方可使用，而且是现用现配，条件是需要加热。 应用：检验和检测某糖是否还原糖;不同生物组织中含糖量高低的测定;在医学上进行疾病的诊断，如糖尿病、肾炎。 2.苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ检测脂肪 原理：苏丹Ⅲ+脂肪→橘黄色;苏丹Ⅳ+脂肪→红色 注意：脂肪的鉴定需要用显微镜观察。 应用：检测食品中营养成分是否含有脂肪。 3.双缩脲试剂检测蛋白质 原理：蛋白质+双缩脲试剂→紫色 注意：双缩脲试剂在使用时，先加A液再加B液，反应条件不需要加热。 应用：鉴定某些消化液中含有蛋白质;用于劣质奶粉的鉴定。 4.碘液检测淀粉和观察动植物细胞的基本结构的染色剂 原理：淀粉+碘液→蓝色;碘液能使动植物细胞着色。 注意：这里的碘是单质碘，而不是离子碘。 应用：检测食品中营养成分是否含有淀粉;验证光合作用产生淀粉;在观察动植物细胞基本结构——细胞膜、细胞质、细胞核时用碘液做染色剂，使细胞核染上颜色便于观察。 5.DNA的染色与鉴定 染色原理：DNA+甲基绿→绿色 应用：可以显示DNA在细胞中的分布 鉴定原理：DNA+二苯胺→蓝色 应用：用于DNA粗提实验的鉴定试剂
6.吡罗红使RNA呈现红色 原理：RNA+吡罗红→红色 应用：可以显示RNA在细胞中的分布。 7. 台盼蓝使死细胞染成蓝色 原理：正常的活细胞，细胞膜结构完整具有选择透过性能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内;死细胞或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。 应用：区分活细胞和死细胞;检测细胞膜的完整性。 8.线粒体的染色 原理：健那绿染液是专一性染线粒体的活细胞染料，可以使活细胞中的线粒体呈现蓝绿色，而细胞质接近无色。 应用：可以用高倍镜观察细胞中线粒体的存在。 9.酒精的检测 原理：橙色的重铬酸钾溶液在酸性条件下与酒精发生化学反应，变成灰绿色。 应用：探究酵母菌细胞呼吸的方式;制作果酒时检验是否产生了酒精;检查司机是否酒后驾驶。 10.CO2的检测 原理：CO2可以使澄清的石灰水变混浊，也可使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿在变黄。 应用：根据石灰水混浊程度或溴麝香草酚蓝水溶液变黄的时间长短，可以检测酵母菌培养液中CO2的产生情况。 11.染色体(或染色质)的染色 原理：染色体容易被碱性染料(如龙胆紫溶液、醋酸洋红溶液、改良苯酚品红染液)染成深色。 应用：用高倍镜观察细胞的有丝分裂;观察低温诱导植物细胞染色体数目变化;植物花药离体培养时，可以通过染色镜检来确定其中的花粉是否处于适宜离体培养的发育期。 12.吲哚酚试剂与维C溶液呈褪色反应
第一章绪论 1.简述孟德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。 答：孟德尔的对分子生物学的发展的主要贡献在于他通过豌豆实验，发现了遗传规律、分离规律及自由组合规律；摩尔根的主要贡献在于发现染色体的遗传机制，创立染色体遗传理论，成为现代实验生物学奠基人；沃森和克里克在1953年提出DAN反向双平行双螺旋模型。 2.写出DNA和RNA的英文全称。 答：脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid），核糖核酸（RNA, Ribonucleic acid） 3.试述“有其父必有其子”的生物学本质。 答：其生物学本质是基因遗传。子代的性质由遗传所得的基因决定，而基因由于遗传的作用，其基因的一半来自于父方，一般来自于母方。 4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。 答：一，肺炎双球菌感染实验，1，R型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。2，S型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。3，用加热的方法杀死S 型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡； 二，噬菌体侵染细菌的实验：1，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。2，DNA中P的含量多，蛋白质中P的含量少；蛋白质中有S而DNA中没有S，所以用放射性同位素35S标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P标记另一部分噬菌体的DNA。用35P标记蛋白质的噬菌体侵染后，细菌体内无放射性，即表明噬菌体的蛋白质没有进入细菌内部；而用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌后，细菌体内有放射性，即表明噬菌体的DNA进入了细菌体内。 三，烟草TMV的重建实验：1957年，Fraenkel-Conrat等人，将两个不同的TMV株系（S株系和HR株系）的蛋白质和RNA分别提取出来，然后相互对换，将S株系的蛋白质和HR株系的RNA，或反过来将HR 株系的蛋白质和S株系的RNA放在一起，重建形成两种杂种病毒，去感染烟草叶片。 5.请定义DNA重组技术和基因工程技术。 答：DNA重组技术：目的是将不同的DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，然后在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。 基因工程技术：是除了包含DNA重组技术外还包括其他可能是生物细胞基因结构得到改造的体系，基因工程是指技术重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 6.写出分子生物学的主要研究内容。 答：1，DNA重组技术；2，基因表达调控研究；3，生物大分子的结构功能研究----结构分子生物学；4，基因组、功能基因组与生物信息学研究。 第二章染色体与DNA 1.染色体具有哪些作为遗传物质的特征？