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2×CTAB法植物总DNA提取

2×CTAB法植物总DNA提取
2×CTAB法植物总DNA提取

2×CT AB法植物总DNA提取

1. 液氮研磨1g左右的植物组织,转移到离心管中。改用研磨枪在冰上研磨,不加β-巯基乙醇

研磨时可加入适量的PVP、β-巯基乙醇。若CTAB准备2-3天内用完,则可将PVP、β-巯基乙醇直接加入其中。

2. 加入500μl的2*CTAB (60℃或65℃预热) ,颠倒混合均匀后在60℃或65℃水浴30m-1h 小时,其间要上下颠倒混匀数次。

3.取出离心管,加入等体积的24:1(三氯甲烷:异戊醇),上下颠倒充分混合。

若量多,则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。

4.12000转速离心5-10min。将离心管动作轻缓的取出转子,放置于离心管架上。

a.离心后溶液分三层:上层为水相;中层为碎片和蛋白相;底层为氯仿

b.迅速进入下一步,以免各相混合

5.用移液枪吸取管中上层水相,动作一定要轻缓,不可搅动其它两层。

a.此步骤要宁舍不贪多,尽量避免吸取到下层液体。

b.若上步骤中中间层较厚,则继续加入等体积24:1,再次抽提一次,直至中间层较薄。

6.在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇(4℃预冷),轻轻晃动混合均匀后在-20℃沉淀。沉淀至少15分钟至过夜。

6-1 在抽提出的水相中加入1/10体积醋酸钠(pH5.2, 3M),混匀后,加入2倍体积预冷的无水乙醇,-20℃沉淀15min至过夜。

6-3. 在抽提出的水相中加入加入2倍体积预冷的无水乙醇,-20℃沉淀15分钟至过夜。

a.时间越长,DNA的产量越多,污染也越多

7. 12000转速离心5-10min,去上清,倒置于吸水纸上数分钟,加入700μl 70%的酒精,上下颠倒数次,洗涤沉淀。12000转离心5-10m,去上清,倒置于吸水纸上数分钟。重复一遍。

8. 12000转速离心5-10min,去上清,倒置于吸水纸上数分钟,最后置于超净工作台中吹干。

9. 在离心管中加入30-50μl的灭菌去离子水或者TE溶液,4℃放置数小时,使其充分溶解。

10.用琼脂糖凝胶检测结果。

11. -20℃—— -70℃低温保存。

去除总DNA中的 RNA污染先做预扩增实验,若RNE污染无严重影响则舍去该步骤

A

1. 在总DNA溶液中加入灭菌去离子水或者TE溶液调整总体积至200μl, 加入10μRNase-A (10mg/ml)4℃过夜,或者37℃ 1h .

2. 用等体积的24:1抽提。

3. 沉淀DNA——洗涤DNA——干燥DNA——溶解DNA—— -20℃—— -70℃低温保存。

B 直接加入10μRNase-A(10mg/ml)后冷冻保存。

试剂配方

注意:应该在溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1℃,溶液的pH大约降低0.03个单位

5×TBE缓冲液

室温保存

2×CTAB

注:只有pH值接近8.0时,EDTA才能完全溶解。溶解过程可在磁力搅拌器上剧烈搅拌。

耗材准备:

需要灭菌者: 1.5ml离心管、研磨枪头、蓝色枪头、黄色枪头、

其他:卫生纸(吸水用)、镊子、封口膜、挑菌针、酒精灯、70%酒精、离心管架子、离心管盒子、移液枪。

CTAB法提取植物基因组

药品:

2*CTAB

终浓度组分药品用量

0.1M/L 1M Tris-HCl(pH8.0) 100ml

20nM/L 0.5M EDTA(pH8.0) 40 ml

NaCl 82g

CTAB 20g

PVP40 20g

加去离子水800ml 充分溶解定容到1L。120℃ 1.5个大气压,灭菌20分钟

用之前加0.2-1%的

0.5M EDTA(pH8.0)

配制量:1L

配制方法:

1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O,置于1L烧杯中。

2. 加入约800mL的去离子水,充分搅拌。

3. 用NaOH调节pH值值8.0(约20g NaOH)。

注意:pH值至8.0时,EDTA才能完全溶解。

4. 加去离子水将溶液定容至1L。

5. 适量分成小份后,高温高压灭菌。

6. 室温保存

1M Tris-HCl(pH8.0)

氯仿:异戊醇24:1 异丙醇

流程

1、研钵预冷,叶片放入研钵,加液氮,研磨成粉末,用小勺放入2.0mlEP管。

2、加入65℃预热的2*CTAB 600ul,摇匀;

3、65℃水浴1小时,10min摇动一次

4、12000rpm离心10min, 取上清到一新的EP管中。(次步骤视情况可省略)

5、加入200ul 氯仿:异戊醇( 24:1)。

6、12000rpm离心10min, 取上层水相到一新的EP管中。

7、加入等体积的异丙醇,轻轻上下摇动10次,静置10min。

8、12000rpm离心10min,弃上清

9、加入75%乙醇1.0ml,摇动

10、12000rpm离心2min,弃上清

11、吸取多余乙醇,室温吹干

12、加入50ul的ddH2O,或TE溶解。

-20℃保存

CTAB法提取植物基因组DNA

CTAB法原理

CTAB(Cetyl trimethyl ammonium bromide),十六烷基三甲基溴化铵,是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,能与核酸形成复合物,具有从低离子强度溶

液中沉淀核酸的特性。

当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀,通过离心就可将其与蛋白,多糖类物质分开,在经过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB 溶于乙醇或异丙醇而除去

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,不能沉淀核酸。CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此,在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。另外,它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。

主要试剂与溶液的配制:

PVP(聚乙烯吡咯烷酮K30)

巯基乙醇

氯仿︰异戊醇(24︰1)

异丙醇

70%乙醇

Tris-苯酚

RNaseA

无水乙醇

CTAB 溶液:CTAB——20g/L

NaCl(58.44)——1.4 mol/L(81.816g)

EDTA(292.25)——10 mmol/L(2.9225g)

Tris(121.14)——100 mmol/L(12.114g)

pH 8.0

1×TE 缓冲液:EDTA(292.25)——1 mmol/L(0.29225g)

Tris(121.14)——10 mmol/L(1.2114g)

pH 8.0

NaAC溶液:NaAC(82.03)——3mol/L(246.09g)

pH 4.0

植物总DNA的提取

1、取适量甘薯新鲜叶片,用液氮迅速研磨,中间加PVP(聚乙烯吡咯烷酮K30)少许,成粉末后转入10mL的离心管中,放入液氮或-80℃冰箱储存(在研磨样品时,研的细和研的粗,提出的DNA量可以相差几倍,所以,在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次)。

2、将(200ml)CTAB溶液放于65℃水浴锅中预热。

3、加4ml巯基乙醇到预热的200mlCTAB中。

4、速加3ml预热的CTAB到装有粉末的10mL离心管中,之后放入65℃水浴

锅中,保温30~60min,期间轻摇数次(一般20min左右一次,刚投入水浴时可以稍快速的晃动,之后的晃动一定要轻柔)。

5、加入3~4ml氯仿︰异戊醇(24︰1)(在通风橱中操作),轻摇混匀至乳白色(100~200次,剧烈晃动会使DNA机械切割)。

6、15~20℃,11000 rpm离心15min(CTAB配平,相对应的离心管,质量相差<0.03g)。

7、取上清(用剪过的枪头进行操作,过尖的枪头会把DNA链弄断。),加0.6倍体积的异丙醇,摇均(有絮状物析出,可放入4℃冰箱过夜)。

8、用毛细玻璃管将DNA絮状物挑出(DNA絮状物尽量要挑出,不要离心,因为离心后虽然产量会增大,但是不完整的DNA也增多)(或4℃,10000 rpm 离心5min,弃上清),放入新的离心管中,用70%乙醇漂洗2次,放置超净台中吹干。

9、加入2ml 1×TE缓冲液溶解,可放入4℃冰箱保存(酶活性在4℃或65℃水浴中最低,防止酶降解DNA)。

10、未溶解的,可放入65℃水浴中促其溶解,10min后拿出冷却至室温,可重复,直至溶解。

11、加入2.5ul RNaseA(RNaseA提前拿出融化),10℃离心,升至4000 rpm 即停,使RNaseA和溶液充分混合。

12、37℃水浴,保温1h。

13、加入1ml Tris-苯酚、1ml氯仿︰异戊醇(24︰1),摇均配平,4℃,11000 rpm离心10min。

14、取上清,加1×TE补至2ml,加2ml氯仿︰异戊醇(24︰1)摇均配平,4℃,11000 rpm离心10min。

15、如仍有白色蛋白质沉淀,则重复步骤14。

16、取上清,加0.1倍上清液体积的NaAC,2.5倍上清液体积的无水乙醇(提前放入-20℃冰箱),摇均,放入-20℃冰箱沉淀30min。

17、用毛细玻璃管将DNA挑出(或用无水乙醇配平,4℃,10000 rpm离心4min,弃上清),放入新的离心管中,用70%乙醇漂洗2次,转入1.5ml离心管,放置超净台中吹干。

18、将DNA 溶于适量的1×TE缓冲液中,短期4℃保存,长期-80℃冰箱中储存。

19、取少量DNA溶液进行琼脂糖电泳,胶浓度为0.8%,检测其完整性。并用紫外分光光度计测其浓度。

注解:

1、PVP(聚乙烯吡咯烷酮):是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。

2、CTAB:溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;

3、NaCl:提供一个高盐环境,使DNA充分溶解,在于液相中;

4、EDTA:螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;

5、Tris (pH8.0):提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;

6、β-巯基乙醇:是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除。

7、苯酚:使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶,蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。使用酚的优点:(1)有效变性蛋白质;(2)抑制了DNase的降解作用。缺点:(1)能溶解10-15%的水,从而溶解一部分poly(A)RNA。(2)不能完全抑制RNase的活性。

8、氯仿:克服酚的缺点,加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚(酚易溶于氯仿中)。

9、异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

基因组DNA提取常见问题:

1、DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质:重新纯化DNA,去除蛋白、多糖、多酚等杂质,重新沉淀DNA。

2、DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应:让酒精充分挥发,增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)

3、DNA中有RNA的存留:加入RNase降解RNA。

4、材料不新鲜或反复冻融:尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融,液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液。

5、未很好抑制内源核酸酶的活性:在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量。

6、提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断:细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

7、外源核酸酶污染:所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌。

8、反复冻融。将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。

冰冻材料提出高质量的基因组DNA,应确保以下几点:

1、确保采样后立即投入液氮中保存。

2、在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。

研磨前先将液氮倒入研钵,研钵彻底冷却后,再放入材料,研磨过程中,一定不要让液氮挥发净使材料回温,否则会DNA降解得很厉害。

装管的时候,先将几个离心管放入一个装有液氮的容器内,将其冷冻一下,

使之处于低温状态,将液氮还为挥发干净的材料放入管内,不要急着盖盖子,因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。将离心管放入盛有液氮的容器,等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。

另外,如果是在离心管上编号,最好在冷冻前写好,否则离心管冷冻后材料会受影响不说,也很难写上。

Geini 关于CTAB法提取基因组DNA,原理

CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;

NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,在于液相中;CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;

β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。

用酚抽提细胞DNA时,有什么作用?

使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA 溶于水相。

使用酚的优点:1.有效变性蛋白质;2抑制了DNase的降解作用。缺点:1.能溶解10-15%的水,从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。

氯仿的作用?

氯仿:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚。(酚易溶于氯仿中)

用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?

异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时,为什么加入单价的阳离子?

用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或NaAc,Na+中和DNA 分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀。

简言之,无论哪种抽提方法,药品的作用基本都是一样的。

CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)

发布: 2010-06-02 08:20| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 634 次

原理:CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注:CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此,在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。

一、CTAB提取缓冲液的经典配方:

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;

NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;

CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;

β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除。

二、CTAB提取缓冲液的改进配方:

(1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA 中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖;

(2) 蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离,纯

化;

(3)多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl,高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl),冰浴20min.核酸分离,纯化;

(4) 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合;

(5) 盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸,其它的杂质均被洗掉,达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M),用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNasepH值为8.0,可防止DNA发生酸解。

三、基因组DNA提取常见问题

DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应,DNA中残留有金属离子,有RNA的存留。对策:重新纯化DNA,去除蛋白、多糖、多酚等杂质,重新沉淀DNA,让酒精充分挥发,增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次),加入RNase降解RNA。

(1)DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应。DNA提取常见问题:材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断,外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融,液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液。在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌。将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。

(2)DNA降解,DNA提取常见问题。实验材料不佳或量少,破壁或裂解不充分,吸附或沉淀不完全,洗

涤时DNA丢失。尽量选用新鲜(幼嫩)的材料,动植物要匀浆研磨充分;G+菌,酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量)。增加吸附的时间、或

低温沉淀小心操作。

要用冰冻材料提出高质量的基因组DNA,应确保以下几点:

1.确保采样后立即投入液氮中保存.

2.在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。研磨前先将液氮倒入研钵,研钵彻底冷却后,再放入材料,研磨过程中,一定不要让液氮挥发净使材料回温!否则会DNA降解得很厉害。装管的时候,材料一定要有液氮的保护才行!否则研磨时的液氮保护DNA不都前功尽弃了?可以这样做:将几个离心管放入一个容器,向容器中加液氮,将其冷冻一下,使之处于低温状态,将液氮还为挥发干净的材料放入管内,不要急着盖盖子,因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。将离心管放入盛有液氮的容器,等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。

另外,如果是在离心管上编号,最好在冷冻前写好,否则离心管冷冻后材料会受影响不说,也很难写上。

提取DNA时加液氮的目的主要是防止DNA的降解,所以必须一直提醒自己,减少材料回温的机会,液氮保护必须自始至终。

3.在用CTAB法提取时,刚投入水浴时可以稍快速的晃动,之后的晃动一定要轻柔!

4.加酚/氯仿/异戊醇静置30min后,离心温度不可过低。尽量保持在15度以上。

5.将DNA加入异丙醇析出时用的枪头一定要剪过的。这点很重要。过尖的枪头会把DNA 链弄断。

6.加入异丙醇后出现的DNA絮状物尽量要挑出,尽量不要离心,因为离心后虽然产量会增大,但是不完整的DNA也增多了。

另外,看楼主的电泳图条带比较弱,看来不只是降解,提取量也比较少。这里对于增加提取量想说明一点,在研磨样品时,研得细和研得很细,提出的DNA量可以相差几倍!所以,在液氮保护的很好的情况下多研磨几次,要比在后面的过程中离心以增加产量要划得来!主要试剂的配制

参考(美)萨姆布鲁克(Sambrook,J.)等.分子克隆实验指南(下册)配置如下[94]:

(1)0.5 mo1/L EDTA(pH 8.0):称取EDTA-Na2 18.61 g,加80 mL双蒸水,磁力搅拌器上剧烈搅拌。加入7 mL 10 mo1/L NaOH调至pH 8.0再用双蒸水定容到100 mL,在1.03×105Pa下高压灭菌20 min。

(2)5 mol/L NaCl溶液:称取NaCl 29.22 g,溶解于90 mL的双蒸水,加热到80℃溶解,冷却,再用双蒸水定容100 mL,在高压灭菌20 min。

(3)10 mol/L NaOH溶液:称取40.00 g NaOH溶于80 mL的双蒸水,搅拌,定容到100 mL。

(4)1 mol/L Tris-HC1溶液(pH 8.0):称取12.114 gTris碱,溶于80 mL的双蒸水,加入浓HC1 4.2 mL,调整PH值到8.0,加水定容到100 mL,高压灭菌20min。(5)10%CTAB(m/v):称取CTAB 10.00 g,溶解于80 mL的双蒸水,加热促进溶解,加双蒸水定容到100 mL,室温保存。

(6)5 mo1/L KAc溶液(pH 4.8和6.5):分别称取KAc晶体49.07 g,溶于80 mL的双蒸水,再用冰乙酸调至pH 4.8和6.5,加双蒸水定容到100 mL,在1.03×

105Pa下灭菌20 min。4℃保存。

(7)3 mo1/L NaAc·3H2O溶液(pH 5.2):称取NaAc晶体20.412 g溶解于约30 mL 的双蒸水,用冰乙酸调至pH 5.2,加双蒸水定容到50 mL,高压灭菌20 min。4℃保存。

(8)提取缓冲液(0.4 mol/L葡萄糖,3%PVP,2%β-巯基乙醇)250 mL:称取葡萄糖19.817 g、PVP 7.50 g,加水溶解并定容到250 mL,在1.03×105Pa下灭菌20 min,β-巯基乙醇现用现加。4℃保存。

(9)裂解缓冲液(3%CTAB;100 mmo1/L Tris-HC1,pH 8.0;20 mmo1/LEDTA,pH 8.0;1.4 mol/L NaCl;2%β-巯基乙醇)100 mL:取10%CTAB 30 mL,加1mol/LTris~HC1(pH 8.0)10 mL,加0.5 mo1/L EDTA(pH8.0)4 mL,加5 mol/LNaCl 28 mL并定容到100 mL,高压灭菌20 min,β-巯基乙醇现用现加。

(11)TE缓冲液(10 mmo1/LTris-HC1,pH 8.0;1 mmo1/L EDTA,pH 8.0):取Tris-HCl溶液(pH 8.0)1 mL,EDTA(pH 8.0)0.2 mL,用双蒸水定容到100 mL,高压灭菌20 min。4℃保存。

(12)电泳缓冲液TAE(Tris-乙酸)的配制

50×TAE母液的配制:242.0 g Tris-Bace、57.1 mL冰乙酸、100 ml 0.5mo1/L EDTA(pH 8.0),用双蒸水空容至1000 mL。

1×TAE电泳缓冲液的配制:取50×TAE 10 mL,再加入490 mL双蒸水,定容至500mL

主要溶液如下:

1)1M Tris-HC1(pH 8.0):在800mL水中溶解121g Tris碱,用浓HC1调节pH至所需值pH 8.0(约42mL HC1),加水定容1000mL,分装后高压灭菌。2)0.5M EDTA(pH 8.0):在400mL水中加入90.05g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2·2H2O),搅拌溶解,用NaOH调pH至8.0(约10g NaOH颗粒),定容至500mL,高压灭菌。

3)5 M NaCl:称取292.2 g NaCl,用双蒸水定容到1000mL,高压灭菌备用。4)TE缓冲液(pH 8.0):10mM Tris-HC1(pH 8.0),1.0mM EDTA(pH 8.0)。5)2×CTAB提取液(pH 8.0):2%(w/v)CTAB,1.4 M NaCl,20mM EDTA,100mM Tris-HC1,0.2%巯基乙醇(v/v)。即称取CTAB 2 g,加蒸馏水40mL,加1 M Tris-HCl(pH 8.0)10mL、0.5 M EDTA(pH 8.0)4mL和5 M NaCl 28mL,待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100mL。

CTAB提取DNA缓冲液配方

CTAB 4g

NaCl 16.364 g

1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)

0.5M EDTA 8ml,先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌。

TE缓冲液配方

TE的组成浓度为:10mM Tris-HCl ;1mM EDTA PH=8.0,配制过程如下:

量取下列溶液于500ml烧杯中

1M Tris-HCl Buffer PH=8. 0 5ml

0.5M EDTA PH=8.0 1ml

向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后,高温高压灭菌;室温保存.

CTAB法提取植物基因组DNA

1 实验原理

1、在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在, 在制备核酸时,通过研磨破坏细胞壁和细胞膜,使核蛋白被释放出来。

2、在浓氯化钠溶液(1~2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA 核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大。因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。

3、进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白:用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相。用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。反复使用上述方法多次处理DNA 核蛋白溶液,就能将蛋白等杂质较彻底地除去,得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA,可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖,在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。

在DNA提取、制备的过程中,核酸极不稳定,

许多因素可破坏其完整结构:

①化学因素,核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定,pH值在此范围外就会使核酸变性降解,故制备过程应避免过酸过碱。

②物理因素,DNA分子链很长,是双螺旋结构,既有一定的柔性。又有一定的刚性,故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂,不利于收集,应加以避免。

③酶的作用,细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来,它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。

操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。SDS和苯酚作为蛋白变性剂,同时可使核酸酶被破坏而失活。

CTAB法原理

CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。

通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB分离缓冲液

2%CTAB, 1.4mol/LNaCL, 20mmol/LEDTA(PH8.0), 100mmol/LTris-HCL(pH8.0), 0.2%巯基乙醇

100mL: 2gCTAB,8.18g NaCL,0.74g EDTA.Na2.2H2O,加入10mL 1mol/L 的Tris-HCL(pH8.0), 0.2mL巯基乙醇,加水定容到100mL。

1、Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;

2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;

3、NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解于液相;

4、CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;

5、β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除; PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。

1、用酚抽提细胞DNA时,有什么作用?

使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。

使用酚的优点:1.有效变性蛋白质;2抑制了DNase的降解作用。缺点:1.能溶解10-15%的水,从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。所以提取RNA时只用氯仿抽提。

2、氯仿的作用?

氯仿:加速有机相与液相分层;去除核酸溶液中的迹量酚。(酚易溶于氯仿中)

3、用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?

异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡

(异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定)

4、用乙醇沉淀DNA时,为什么加入单价的阳离子?

用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或 NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀。

1.十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法

在目前众多的DNA提取方法中,CTAB法是其中最为广泛应

用的一种。它既可以裂解细胞,又可以有效地去除多酚类和多糖

类物质的沉淀,因而经常被应用于植物的DNA提取工作中。

1.1原理及方法

CTAB是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜。同时它能与核

酸形成复合物,这些复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可解离的,从而可使DNA和多糖物质分开。当溶液盐浓度降低到

一定程度(0.3mol/L NaCl)时,这些复合物将会从溶液中形成沉淀,随后通过离心技术就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白类、

多糖类物质分开。而对于富含多酚、多糖物质的植物组织,则通过增加提取缓冲液中β-巯基乙醇的用量,便可有效地控制酚类物质的氧化褐变及DNA的降解,用氯仿/异戊醇来沉淀蛋白质,从而提高产物的纯度。最后用乙醇来沉淀DNA,除去CTAB。

1.2适用范围及一些改良

由于CTAB提取法能够有效地去除多糖及酚类物质的沉

淀,因而适用于从含酚类及糖类物质较高的植物材料中提取DNA。经研究发现CTAB提取法在落羽杉属树木、黑木相思、野

生稻、野燕麦、枸杞、花生的DNA的提取中,相比较其他提取方法来说都是最好的提取方法。

为了缩短提取流程,提高提取质量,研究人员在传统方法

的基础上,针对不同植物的特点,对一些提取步骤进行了改进。李先进[1]在对四种药用蕨类DNA提取的比较研究中发现,由于酚类物质极其容易被氧化,因此可以在最开始研磨材料

的时候加入4%PVP,以防止研磨中细胞组织破裂后酚的氧化,

从而获得更为理想的DNA。黄永莲[2]首先将材料在4℃放置1—

2天,以便于其叶片中的多糖类物质的降解;然后在用CTAB处

理的同时加入蛋白酶K,提高提取缓冲液中β-巯基乙醇用量,

增加氯仿/异戊醇的量和使用次数,以及缩短异丙醇沉淀DNA的时间。用此改良的CTAB法提取菠菜和榕树叶片DNA,获得了良好的效果。袁燕[3]对蒜头果基因组进行DNA提纯的研究中发现,EDTA的浓度在20—30mmol/L时,提取DNA的效果较好,同时在提取的过程中,往研钵中加入少量PVP和VitC固体与蒜头果种仁共同研磨,不仅能阻止多糖、多酚氧化物等与DNA的结合和反应,而且能除去大部分油脂和杂质,可以大大提高DNA的纯度。

电泳技术的基本原理介绍

电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。

带电分子由于各自的电荷和形状大小不同,因而在电泳过程中具有不同的迁移速度,形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷,如果它们的分子大小不同,由于它们所受的阻力不同,因此迁移速度也不同,在电泳过程中就可以被分离。

琼脂糖凝胶电泳原理:

琼脂糖是从琼脂中提纯出来的,主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。

琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制,低浓度的琼脂糖形成较大的孔径,而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。

DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电的磷酸根残基,因此在电场中向正级移动。

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