Gateway克隆技术，简单易操作 在过去数十年，用限制性内切酶产生黏性末端，在DNA连接酶的作用下，连接两个甚至更多片段的克隆方法，是载体构建的经典方案。但是现如今我们再提到克隆的时候，远远不再只有传统的限制酶克隆一种选择。其中Gateway克隆技术作为一种可以快速、高效将DNA 序列转移到载体上的克隆方法已经流行开来。不要觉得Gateway克隆技术高深莫测，其实了解一下你就能懂。 Gateway克隆方法是λ噬菌体感染细菌时发生的整合和切割重组反应的体外形式。在体内，噬菌体（attP）和细菌（attB）的附着位点发生重组反应，噬菌体整合到细菌基因组中，两侧为两个新的重组位点（attL-left-和attR-right-）。在某些条件下，attL和attR位点可以重组，导致噬菌体从细菌染色体上切除并重新生成attP和attB位点。 即Gateway技术依赖于下面描述的两个反应：BP反应和LR反应，通过BP反应获得入门克隆(有时候我们也说中间克隆)，再通过LR反应将目的DNA以正确的方向连接到各种目的载体上，形成不同的表达载体。GeneCopoeia的EZShuttle?重组克隆体系应用E.coli 和λ噬菌体特异位点的重组酶促体系使DNA片段在载体间相互转换，其原理与Gateway 克隆技术相同。 BP反应-构建入门载体： 通过PCR将attB位点添加到目的DAN序列两侧，形成attB-PCR产物。用attB-PCR产物或者含attB位点的供体质粒和含attP位点的质粒发生重组生成入门克隆。EZRecombinase BP混合物，货号：RCBM-1002-020
LR反应-构建表达载体： 制作表达载体时，选择适合的目标载体非常重要。这种选择取决于许多因素，如宿主类型，所需的表达水平和实验目的。选定的attR表达载体与attL-入门载体重组以产生表达载体。EZRecombinase LR混合液，货号：RCBM-1001-020
2011年《现代分子生物学与基因工程》课程论文 克隆技术——对人类社会的影响 学校： 所在院、所、中心： 年级： 专业： 姓名： 学号： 指导老师： 日期：
目录 摘要 2 引言 2 1.克隆技术 2 2.“多利”羊特别之处 2 3.“多利”羊成功诞生的科学意义和应用价值 3 4.克隆技术是否应用于复制人类 3 5.人类不同的态度和看法 4 5.1赞成者的理由 4 5.2不赞成者的理由 5 6.应该如何正确看待和应用克隆技术克隆绵羊“多利”的问世 5 参考文献 6
克隆技术——对人类社会的影响 摘要： 本文分析克隆技术的科学意义和应用价值，研究科技进步对伦理学提出了哪些挑战，讨论如何正确看待和应用克隆技术。 关键词：克隆技术，克隆人，克隆的科学意义和应用价值，伦理挑战，正确看待和应用克隆技术 引言： 1997 年2 月23 日世界上第一头克隆羊“多利”(Dolly)诞生在英国苏格兰爱丁堡罗斯林研究所以来，有关克隆技术及克隆人的讨论一直沸沸扬扬，始终是人们关注的焦点。随着时间的推移，克隆技术不断成熟完善，继克隆羊之后克隆兔、克隆猪、克隆猴等不断获得成功。照这样的速度下去，过不了多久人类将很有可能“遭遇”克隆人。但是，是否应将克隆技术引向人类自身却引发了全球范围内的大讨论。 1. 克隆”技术 何为“克隆”技术，何为克隆克隆是英文“clone”一词的音译，简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式，即人工操作动物的繁殖过程。这门生物技术叫克隆技术。清华大学生物科学与技术系教授郑昌学说，克隆通俗地讲就是“复制”、“拷贝”生物，而不是靠父母繁育。随着生物科学技术的发展，克隆的内涵也在不断地扩大，只要是从一个细胞得到两个以上的细胞、细胞群或生物体，就可以称为克隆。由此分化所得到的细胞、生物体就是克隆细胞、克隆体。 2.“多利”羊特别之处 “多利”羊特别之处何在多利早在本世纪六十年代末，英国科学家戈德就运用克隆技术成功培育出了青蛙，自１９８６年以来，科学家又成功培育出了兔子、猪、牛、羊、猴，都从未引起过轰动，而克隆羊“多利”却引起了巨大反响，这是为什么呢？无性繁殖的手段有多种。其中的细胞核移植，就是用机械的办法，把一个称之为“供体细胞”的细胞核移入另一个被称之为“受体”的、去除了细胞核的细胞质，生命科学导论论文中。核移植采用的供体细胞有两种，一种是胚胎细胞，一种是体细胞，但二者有本质的区别。胚胎细胞克隆属于异体复制，复制的是提供受精卵胚胎的动物的下一代，而体细胞克隆属于自体复制，“拷贝”的是提供体细胞的动物本身。严格的说，只有基因组全都来自于单亲的体细胞克隆，才是真正的无性繁殖。另外，从技术操作的难度考虑，前者难度小，后者难度大。因为胚胎细胞是有全能性的，而体细胞却失去了全能性，只有用特殊方法处理后才能恢复其全能性。“多利”是世界上第一只由成年动物的体细胞——
浅谈生物克隆技术及其未来应用问题与前景 肖婷2012333500202 浙江理工大学经管学院工商管理专业 指导老师：解纯刚浙江理工大学生科学院 【摘要】：随着生命科学时代的到来，基因研究已经取得了巨大的进展，克隆技术特别是人的克隆技术作为基因研究的重要组成部分，愈来愈引起社会各界的广泛关注。克隆技术作为人类的创造性活动，有其产生和存在的合理性，在诸多领域蕴藏巨大的应用潜力与巨大应用价值和广阔的发展前景。但克隆技术目前仍存在一些问题,如克隆技术对社会伦理和人类健康的影响。人类克隆技术的进步为人类带来的利益是巨大的,因而它的发展是难以阻止的。应对人类克隆技术带来的巨大挑战。 【关键词】：克隆技术；利弊；社会影响；应用前景 一、克隆是什么？ 克隆是英文Clone一词的音译，意为无性繁殖系，即通过无性繁殖（如细胞丝分裂）可连续传代并形成的群体，常用于细胞水平的描述。克隆的定义是指独立细胞繁殖系，指后代完全由一个细胞复制，具有完全相同的物遗传质。 一个细菌经过20分钟左右就可一分为二；一根葡萄枝切成十段就可能变成十株葡萄；仙人掌切成几块，每块落地就生根；一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐茎，一年内就能长出数百株草莓苗。凡此种种，都是生物靠自身的一分为二或自身的一小部分的扩大来繁衍后代，这就是无性繁殖。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡来自一个祖先，经过无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。 自然界的许多动物，在正常情况下都是依靠父方产生的雄性细胞（精子）与母方产生的雌性细胞（卵子）融合（受精）成受精卵（合子），再由受精卵经过一系列细胞分裂长成胚胎，最终形成新的个体。这种依靠父母双方提供性细胞、并经两性细胞融合产生后代的繁殖方法就叫做有性繁殖，但是，如果我们用外科手术将一个胚胎分割成两块，四块、八块……最后通过特殊的方法使一个胚胎长成两个、四个，八个……生物体，这些生物体就是克隆个体，而这些个体就叫做无性繁殖系。 二、克隆技术是什么？ 克隆技术是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，含义是无性繁殖。
基于Gateway技术的表达载体构建 1. Gateway-T载体（pGWC）的酶切反应 pGWC除具有传统T载体的克隆功能外，还可以作为入门克隆（Entry Clone）与Gateway 重组克隆技术兼容。该载体中的ccdB基因编码一个能够使大多数E. coli致死的毒蛋白，可作为重组子的负选标记取代了蓝白斑筛选。 该载体在使用前，需经过AhdI（实验中采用其同裂酶Eam1105 I）酶切，使载体两端产生5’T，用与PCR产物的两端的3’A互补。PCR产物回收后与pGWC载体连接，挑取正向克隆送测序。 pGWC载体的酶切反应体系如下： pGWC 10 μl（约2μg） 10×Eam1105 I Buffer 5 μl Eam1105 I 2 μl ddH2O 34 μl 共计 50 μl 将反应混和液于37℃温育6h。取1μl酶切反应液走1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，估测载体片段的浓度，该酶切反应液可直接用作连接无需纯化。 2. PCR产物的回收与连接反应 PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）进行回收，与pGWC载体进行连接。 DNA片段与pGWC-T的连接： pGWC-T 1μl（约50ng） DNA回收片段 4μl（600bp片段约需40ng） Solution I （TaKaRa） 5μl 共计 10μl 反应混合液于4℃下连接过夜（约12~16h）。 3. 连接产物的转化 取大肠杆菌DH5α感受态细胞（50μl/管）于冰上融化，加入5μl连接产物，用移液器轻轻吸打混匀，在冰上放置30min，42℃水浴热激90s，冰上放置5min，加入无抗生素的LB培养基300μl，37℃，160rpm振荡培养45min，将菌液铺在氯霉素抗性（25mg/L）LB平板上，在超净台吹干后37℃倒置培养过夜。 4. LR反应与表达载体构建 表达载体均采用Gateway重组克隆技术构建，目标基因连入pGWC后即为入门克隆（Entry
克隆技术介绍 张勋学号：160820216 摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。 一、克隆技术实质 1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克 隆(Clone)”的术语。学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。 克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。 正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。目前，在玉米，水稻、油菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。现对在植物基因克隆过程中运用的主要技术进行综述，以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。
第1章思考题及习题1参考答案 一、填空 1. 除了单片机这一名称之外，单片机还可称为或。答：微控制器，嵌入式 控制器. 2.单片机与普通微型计算机的不同之处在于其将、、和三部分，通 过内部连接在一起，集成于一块芯片上。答：CPU、存储器、I/O口、总线 3. AT89S52单片机工作频率上限为 MHz。答：33 MHz。 4. 专用单片机已使系统结构最简化、软硬件资源利用最优化，从而大大降低和提 高。答：成本，可靠性。 二、单选 1. 单片机内部数据之所以用二进制形式表示，主要是 A．为了编程方便B．受器件的物理性能限制 C．为了通用性D．为了提高运算速度 答：B 2. 在家用电器中使用单片机应属于微计算机的。 A．辅助设计应用B．测量、控制应用 C．数值计算应用D．数据处理应用 答： B 3. 下面的哪一项应用，不属于单片机的应用范围。 A．工业控制 B．家用电器的控制 C．数据库管理 D．汽车电子设备 答：C 三、判断对错 1. STC系列单片机是8051内核的单片机。对 2. AT89S52与AT89S51相比，片内多出了4KB的Flash程序存储器、128B的RAM、1个中断 源、1个定时器（且具有捕捉功能）。对 3. 单片机是一种CPU。错 4. AT89S52单片机是微处理器。错
5. AT89C52片内的Flash程序存储器可在线写入，而AT89S52则不能。错 6. 为AT89C51单片机设计的应用系统板，可将芯片AT89C51直接用芯片AT89S51替换。对 7. 为AT89S51单片机设计的应用系统板，可将芯片AT89S51直接用芯片AT89S52替换。对 8. 单片机的功能侧重于测量和控制，而复杂的数字信号处理运算及高速的测控功能则是DSP 的长处。对 四、简答 1. 微处理器、微计算机、微处理机、CPU、单片机、嵌入式处理器它们之间有何区别？ 答：微处理器、微处理机和CPU它们都是中央处理器的不同称谓，微处理器芯片本身不是计算机。而微计算机、单片机它们都是一个完整的计算机系统，单片机是集成在一个芯片上的用于测控目的的单片微计算机。 2. AT89S51单片机相当于MCS-51系列单片机中的哪一型号的产品？“S”的含义是什么？ 答：相当于MCS-51系列中的87C51，只不过是AT89S51芯片内的4K字节Flash存储器取代了87C51片内的4K字节的EPROM。 3. 单片机可分为商用、工业用、汽车用以及军用产品，它们的使用温度范围各为多少？ 答：商用：温度范围为0～+70℃；工业用：温度范围为-40～+85℃；汽车用：温度范围为-40～+125℃；军用：温度范围为-55～+150℃。 4. 解释什么是单片机的在系统编程（ISP）与在线应用编程（IAP）。 答：单片机的在系统编程ISP（In System Program），也称在线编程，只需一条与PC机USB口或串口相连的ISP下载线，就可把仿真调试通过的程序代码从PC机在线写入单片机的Flash存储器内，省去了编程器。在线应用编程（IAP）就是可将单片机的闪存内的应用程序在线修改升级。 5. 什么是“嵌入式系统”? 系统中嵌入了单片机作为控制器，是否可称其为“嵌入式系统”? 答：广义上讲，凡是系统中嵌入了“嵌入式处理器”，如单片机、DSP、嵌入式微处理器，都称其为“嵌入式系统”。但多数人把“嵌入”嵌入式微处理器的系统，称为“嵌入式系统”。目前“嵌入式系统”还没有一个严格和权威的定义。目前人们所说的“嵌入式系统”，多指后者。 6. 嵌入式处理器家族中的单片机、DSP、嵌入式微处理器各有何特点？它们的应用领域有何 不同？ 答：单片机体积小、价格低且易于掌握和普及，很容易嵌入到各种通用目的的系统中，
克隆技术的发展及应用前景 克隆通常是一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（如植物）。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（就像同卵双生一样）。但是通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 目前，克隆技术发展十分迅速。各国政府有关人士、民间对克隆技术的评价褒贬不一。克隆技术已展示出广阔的应用前景，包括以下四个方面： （1）培育优良畜种和生产实验动物； （2）生产转基因动物； （3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法； （4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。 在不久的将来，克隆技术技术将可以用来治疗糖尿病、中风、癌症、爱滋病、心脏病以及诸如帕金森综合症等精神疾病，并极大改变现有的器官移植理论和治疗手段，给人类带来福音。 克隆技术会给人类带来极大的好处，例如，英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升。一只母羊就好比一座制药厂，用什么办法能最有效、最方便地使这种羊扩大繁殖呢？最好的办法就是“克隆”。同样，荷兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛，以色列LAS公司育成了能生产血清白蛋白的羊，这些高附加值的牲畜如何有效地繁殖？答案当然还是“克隆”。母马配公驴可以得到杂种优势特别强的动物——骡，骡不能繁殖后代，那么，优良的骡如何扩大繁殖？最好的办法也是“克隆”，我国的大熊猫是国宝，但自然交配成功率低，因此已濒临绝种。如何挽救这类珍稀动物？“克隆”为人类提供了切实可行的途径。具体应用有以下几个方面： 转基因动物研究 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.doczj.com/doc/fe17891148.html,
Gateway 基因克隆 Gateway 基因克隆就是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中,可应用于大片段的基因克隆,并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。 这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1与att L2两个侧端重组序列,来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”(Gateway Entry Clone)。据Invitrogen宣称Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应,如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法,避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性,大大提高了克隆效率,常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体,因此又称之为高通量基因克隆技术(Gateway Cloning Technology)。 一、Gateway 基因克隆的原理及机制 Gateway被视为一种克隆操作平台:把目的基因克隆到入门载体(Entry Vector)后,就不用依赖限制性内切酶,而靠载体上存在的特定重组位点与重组酶,高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体(Destination Vector,目的载体)上。 Gateway的原理就是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体与细菌的整合因子(INF、Int)的作用下,lambda的attP位点与大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组,lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中,两侧产生两个新位点:attL与attR。这就是一个可逆的过程,如果在一个噬菌体编码蛋白Xis与IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB与attP位点,噬菌体从细菌基因组上裂解下来(见图1)。这一过程的方向就是受控于两个重要因素:存在的介导蛋白与重组位点。
科技与社会 克隆技术及其应用 陈大元 (中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室 北京 100080) 摘要 “克隆”的含义是无性繁殖,即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系,这个细胞系中每个细胞的基因彼此是相同的。动物克隆,就是指通过无性繁殖由一个细胞产生一个和亲代遗传性状一致,形态非常相像的动物。随着动物克隆研究的发展、克隆技术将广泛应用于医学、畜牧业和濒危动物保护等领域。 关键词 克隆,动物,胚胎细胞, 体细胞 “克隆”是“clone” 的音译,其含义是无性 繁殖,即由同一个祖先 细胞分裂繁殖而成的 纯细胞系,该细胞系中 每个细胞的基因彼此 是相同的。动物克隆, 就是指通过无性繁殖 由一个细胞产生一个 和亲代遗传性状一致、形态非常相像的动物。 科学家们很早就开始了动物克隆的研究。早在1938年,德国胚胎学家Sp emann即提出“奇异的实验”的设想。1952年,英国科学家Briggs和King 首次报道了蛙的核移植研究。1962年,英国剑桥大学的Gurdon获得了成年蛙。我国已故科学家童第周教授在20世纪60—70年代曾用囊胚细胞进行鱼类细胞核移植工作,获得属间和种间移核鱼,使我国鱼类核移植研究居世界领先水平。 早期的动物克隆研究仅限于两栖类和鱼类,直到20世纪80年代,核移植克隆技术才开始应用于哺乳动物。根据供核细胞的不同,可将动物克隆研究分为三个阶段: 1 胚胎细胞克隆阶段 1981年,Illmensee和Hop pe报道了他们用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的内细胞团细胞作为核供体,直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞质中,重构胚体外发育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宫,获得克隆小鼠,这是第一次用胚胎细胞对哺乳类进行核移植获得成功。1983年,美国科学家利用核移植技术和细胞融合方法获得了克隆小鼠。1986年,英国的Willadsen用绵羊的8—16细胞阶段的胚胎细胞作为供体进行核移植,首次应用电融合的方法克隆出一只小羊。此后,科学家们又相继克隆出小鼠、绵羊、牛、兔、猪和猴等。我国科学家也在20世纪90年代成功开展了胚胎细胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和猪等研究。 2 同种体细胞克隆阶段 1997年2月,英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布,他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植,成功地获得了克隆羊“多莉”[10]。这是第一次用成年体细胞作为供核细胞,由此说明高度分化的成年动物的体细胞可在适当条件下发生逆转, 2002年中 国 科 学 院 院 刊第3期 收稿日期:2002年4月25日 DOI:10.16418/j.issn.1000-3045.2002.03.005
Gateway技术提供以下可能：通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 同时将您的基因转移到多个表达系统 在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达 一、一种更好的克隆方法 Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。 图1 Gateway技术的灵活性 Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客 目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。 Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内
切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。 此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。 二、一项强大而可靠的技术 Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。 Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。 LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。 图2 Gateway技术总结 下载 (22.19 KB) 6 天前 19:23 Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客 在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。
克隆技术及其应用与发展 目前克隆技术、基因工程研究正突飞猛进向前发展，基因概念及其理论的建立，打开了人类了解生命并控制生命的窗口。基因研究已成为当前科学研究中最有决定性的领域之一，成为推动生物、食品和制药产业发展的引擎。众所周知，20世纪遗传学的发展举世瞩目，由于遗传学的发展，科学的社会功能以及社会对科学的制约更受关注，从试管婴儿到克隆技术再到人类基因图谱的绘制无不牵动着世人的心。21世纪是生物技术革命的世纪，克隆技术的应用将促进遗传学，细胞发育生物学，产科学等学科的研究进展，有利于整个世界的科学进步和生活质量的提高，对人类的生活将会产生深远的影响。 克隆、克隆技术 以及克隆的基本过程 “克隆”一词源于“Clone”的音译，指的是人工诱导动、植物的无性繁殖过程，这门生物技术就叫克隆技术。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合，只由一个生物体产生后代的生殖方式，如：由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后再被植入动物子宫中使动物怀孕便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。我们可将其研究或操作的对象分为基因克隆、细胞克隆和个体克隆三大类。 基因克隆是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。 细胞克隆则是在细胞水平上开展研究工作以获得大量相同的细胞。 个体克隆则是经过一系列的操作产生一个或多个与亲代完全相同的个体，这种克隆所用的生物材料可能是一个细胞，也可能是一个组织。可以看出，基因克隆、细胞克隆和个体克隆是在三个不同的层次上开展的研究工作，以原有的基因或细胞或生物个体作为模板，复制出多个与原来模板完全相同的基因或细胞或生物个体来。这就有点像大家利用复印机复印资料，或用胶片冲洗照片一样，从原有的资料或底片复制出许多完全一样的资料或照片来。但实际上并非复制胚胎，只是从成年人体内的一个细胞抽取当中包含的基因资料，然后将植入一个没有核子的卵子细胞内，通过体外受精的方法使这个新细胞发育成一个胚胎。例如小羊多利就是利用体细胞进行细胞核移植而克隆成功的，多利羊的产生与三只母羊有关，其克隆过程如下：科学家选取了三只母羊，先将一只母羊的卵细胞中所有遗传物质吸出，然后将另一只6岁母羊的乳腺细胞与之融合，形成一个含有新遗传物质的卵细胞，并促使它分裂发育成胚胎，当这一胚胎生长到一定程度时再将它植入第三只母羊的子宫中，由它孕育并产下克隆羊多利，出生的“羊多”小绵羊与6岁母羊具有完全相同的外貌。 克隆技术在相关领域的应用 克隆的最终产物，如克隆牛、克隆鼠等都不是最重要的成果，基因克隆技术应是建立转基因动物模板的核心和关键性技术，利用转基因动物的体细胞大量复制出具有相同优良性状的个体。由于动物体细胞克隆可以复制出的数量巨大的优良个体，因此动物克隆技术可以首先应用于畜牧业育种上。通常在动物育种中所采用的方法主要是杂交育种，即把两个具有不同优良性状的雌雄个体进行交配，然后在后代中去选择人们所需要的个体。要获得一个优良品种，往往需要几年甚至几十年的时间，而且必须不断地进行育种。如果采用动物个体克隆技术，就可以大量复制出人类所需要的优良个体，还可以大大缩短育种时间和节省大量的人力、物力。克隆技术的完善为转基因动物的繁殖开辟了一条通道，应用克隆技术可以将转基因绵羊
Gateway? Cloning Protocols The Basics of Gateway? Reaction ?BP reaction—to create a Gateway? entry clone ?LR reaction—to create a Gateway? expression clone ?One tube format—to create a Gateway? expression clone from a PCR product ?Gateway? Vector Conversion—converting your favorite cloning vectors to Gateway? Technology TOPO? TA Cloning - To Create a Gateway? Entry Clone Step One - Produce PCR product Produce PCR products using Taq polymerase and your own protocol. End the PCR reaction with a final 7 to 30 minute extension step. Step Two - Perform the TOPO? Cloning Reaction 1. Set up one of the following TOPO? Cloning reactions using the reagents in the order shown. For electroporation, dilute Salt Solution 4-fold to prepare Dilute Salt Solution. Reagent Chemical Txn Electroporation Fresh PCR product0.5 to 4 μl0.5 to 4 μl Salt Solution 1 μl-- Dilute Salt Solution -- 1 μl Sterile Water to a final volume of 5 μl to a final volume of 5 μl TOPO? Vector 1 μl 1 μl Total volume6μl6μl 2. Mix gently and incubate for 5 minutes at room temperature. 3. Place on ice and proceed to transform One Shot? chemically competent E. coli, below
第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆
1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建
目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：
等电子原理及其应用 等电子原理：含有相同原子数（除氢外）和价电子数的分子或离子往往具有相似的几何构型和化学键合情况。 1、同族元素互换法 即将既定粒子中的某元素换成它的同族元素。如：（1）CCl4的等电子体确定：换IVA族元素有SiCl4、GeCl4等；换VIIA族元素有CF4、CBr4、CI4、CFCl3、……；同时换可有SiF4、SiFCl3、……。 （2）CO2的等电子体确定：可将O原子换为S原子得COS、CS2，注意不能将C原子换为Si原子，因为CO2和SiO2的结构不同（前者为分子晶体，后者为原子晶体）。同理，不能将BeCl2的等电子体确定为MgCl2或BeF2（后两种为离子晶体）。 （3）SO42－的等电子体确定：将一个O原子换为S原子得S2O32－；NO3－的等电子体可确定为PO3－。（4）对于原子晶体类也可作类似推导：金刚石C n与晶体硅Si n互为等电子体。 2、价电子迁移法 即将既定粒子中的某元素原子的价电子逐一转移给组成中的另一种元素的原子，相应原子的质子数也随之减少或增加，变换为具有相应质子数的元素。 一般来说，讨论的元素为s区或p区元素，即主族元素居多，通常相关元素的族序数满足A+B=C+D（或A+B=2C）关系的，可考虑将A、B等个数换为C、D（或1A、1B换为2C）。如：
（1）CO2的等电子体确定，除了上述结果以外，还可以采用价电子迁移法：C、O原子的价电子数分别为4、6，从周期表中的位置看，中间夹着N元素，N原子价电子数为5，一个O原子拿一个电子给C原子，在电性不变条件下质子数同时变为7（价电子同时变为5），则可换为两个N原子（由此也可以看出N2与CO互为等电子体）得N2O；如果将C原子的两个价电子转移给两个O原子，元素原子分别转换为1个Be、2个Cl，就可以得到CO2的另一个等电子体BeCl2。 同样可以判断：金刚石C2n与晶体硅Si2n的等电子体还可以为金刚砂 (SiC)n、GaAs、AlP等；石墨C2n与白石墨(BN)n互为等电子体；无机苯B3N3H6与有机苯C6H6互为等电子体。 （2）离子之间的等电子体也可以推导：与N3－的等电子体查找方法，可将2个N原子换为1个C原子和一个O原子可得CNO－。 3、电子—电荷互换法 即将既定粒子中的某元素原子的价电子转化为粒子所带的电荷。这种方法可实现分子与离子的互判。如： CN－的等电子体查找可用N原子1个电子换作1个负电荷，则N原子换为C原子，离子带2个负电荷，其等电子体即为C22－；反之，将CN－的电荷转化为1个电子，该电子给C原子，即得N2，若给N 原子即得CO。同样可判断HNO3的等电子体为HCO3－；ICl4－与XeCl4互为等电子体
．克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2．克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3．克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 4．生长周期短，遗传性状稳定 克隆技术的应用前景: 克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面： （1）培育优良畜种和生产实验动物； （2）生产转基因动物； （3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法； （4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。 以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来