第六章胚胎发育
精子和卵子相遇后，在受精的同时，也使得卵子得以激活。受精卵中的雌原核和雄原核融合后，细胞质中发生重排，然后开始进行分裂和分化，从而开始多细胞有机体的形成过程，由一个全能性的细胞逐渐形成能够执行不同功能的各种各样的细胞。此外，由于卵子的体积一般都比体细胞大很多倍，通过多次的有丝分裂可将大量的卵细胞质分配到较小的细胞中，使所形成的细胞的大小达到体细胞的水平。
第一节卵裂
一、卵裂的过程
卵裂(cleavage)为动物发育的第一个阶段，受精卵分裂产生很多小的细胞，称为卵裂球（blastomere）。虽然不同动物中，卵裂的方式变化很大，但大多数动物在经过卵裂后，都形成一个细胞球，称为囊胚（blastula），中间为囊胚腔（blastocoel）。但在昆虫等无脊椎动物中并不形成腔。
除哺乳动物外，很多动物的卵裂是一个迅速且同步的过程。由于没有胚胎的净生长期，分裂速度很快，细胞数目越来越多,但细胞变得越来越小。卵裂最终导致胚胎中卵裂球的大小达到正常体细胞的水平。此外，由于卵裂过程使卵裂球之间产生差异，从而分化为不同的细胞。
体细胞在分裂时经历正常的细胞周期，即G1、S、G2及M期，而且在M期伴随一迅速的细胞增长期，使子细胞增长到母细胞的水平，然后再分裂。然而，在卵裂的胚胎中，并不通过这一生长期，从而使卵裂球越分越小，达到体细胞的水平。海胆中，从最初胞质为核体积的550倍，减少到最后的6倍。
另外，在卵裂中，细胞周期缩短，并无G1及G2期，只有S及M期，而且S及M 期均较短，这期间DNA从多位点上合成，而体细胞中仅在几个位点上合成。爪蟾在第12次卵裂后才有G1及G2期，而果蝇则在第14及17次卵裂时才有G1及G2期。
由于受精卵的基因组处于相对的转录不活跃状态，卵裂是同步的过程，主要依赖于卵细胞质中的母源性物质。通常，即使在抑制转录或去细胞核的情况下，卵裂也能正常进行。在两栖类，直到原肠形成期之前，早期胚胎可以从母体核糖核蛋白体（RNP）中得到所有需要的mRNA，mRNA从这些微粒体中释放出来后，可用于翻译，并不需要合
子基因组指导蛋白质的合成。在细胞质中存在很多拷贝的组蛋白mRNA和其它染色体蛋白，并且这些蛋白质可以快速地供给，使染色体的复制在20-30分钟内结束，然后很快凝集形成染色体。
但当母源性基因产物失活后或消耗尽后，发育过程开始依赖于合子的基因转录。在有些物种中，合子基因一开始表达后，通常都伴有细胞分裂的突然变慢、失去同步化及细胞表型发生改变。将胚胎发育过程中的这一现象称为囊胚中期转换（midblastula transition, MBT）。以后，细胞周期开始变长，并且细胞的分裂开始不同步。哺乳动物的卵是一例外，卵裂的细胞周期很长。
二、卵裂的方式
典型的动物受精卵是小的圆形细胞，并且沿着垂直轴极化，带极体的一半通常叫做动物半球，另一半球含有丰富卵黄的为植物半球。不同的动物中，受精卵的卵裂方式也不同。卵裂方式主要由三个因素决定：一是核的特定位置，决定特定的卵裂沟位置；二是卵黄的数量，可阻碍细胞浆的移动；三是卵的细胞质，不同的细胞质成分和极性决定卵裂沟的方向。但卵裂的方式主要由卵中的脂肪含量及分布所决定。
大多数动物的卵裂为完全卵裂（holoblastic cleavage），胚胎沿着卵裂沟将子细胞彻底分开。而在另一些物种中为不完全卵裂（meroblastic cleavage），胚胎并不完全分裂开（最起码在发育的初期如此），子细胞之间有细胞质相连续，即不完全卵裂并不产生子细胞，而是产生一多核细胞，叫做多核体。由于第一次卵裂后，所产生的卵裂球在大小上有所差异，又将卵裂分为等裂和不等裂。卵裂后，植物半球的卵裂球中卵黄丰富且体积稍大，称为大分裂球（macromere）; 而动物极的卵裂球体积较小，称为小分裂球（micromere）。可将各种动物的卵裂方式分为以下6类。
1．完全等裂
这些动物的卵为均黄卵，含有极少量的卵黄。受精卵经过完全分裂后得到的卵裂球大小相等，卵裂球呈辐射对称。这种卵裂方式的代表动物为海星和海胆。
2．完全不均等卵裂
这些动物的卵为极性均黄卵。受精卵分裂后得到大小不等的卵裂球，动物极的分裂球较植物极的小。这种卵裂方式的代表动物为文昌鱼。但另外一些动物的卵为具有中等
程度卵黄的极性端黄卵，卵裂后动物极分裂球的体积远远小于植物极。由于植物极半球的卵黄阻滞了胞浆的流动，动物极半球进行同步分裂并且分裂速度快于植物极。这种卵裂方式的代表动物为远古鱼类及两栖类。
3．盘状卵裂
为不完全分裂的一种，卵裂时子细胞之间的细胞质并不完全分开。首先，在卵表面进行极少量的垂直分裂，随后进行与卵表面平行的分裂。卵裂只在卵表面的一个很小区域内进行。这种卵裂方式的代表动物为现代鱼类、爬行类及鸟类。
4．旋转卵裂
为完全卵裂的一种类型，为有胎盘哺乳动物中特有的一种卵裂方式（图6-1）。第一次卵裂为经裂，将受精卵分为两个相等的卵裂球。第二次卵裂时，一个卵裂球为经裂，而第二个卵裂球则为纬裂。由于在以后的卵裂过程中，每个卵裂球的卵裂速度不同，可能会出现3、5、6及7个等不同数目卵裂球的胚胎。哺乳动物的卵裂不仅不同步，而且每次卵裂间隔的时间也很长。
5．表面卵裂
为不完全卵裂的一种。细胞核分裂但细胞质并不分开，之后大多数细胞核迁移到卵表面的细胞质中，表面细胞质在细胞核之间分裂。这些动物的卵为中央黄卵，代表动物为昆虫。
6．螺旋式卵裂
与辐射型卵裂不同，胚胎的卵裂方向不是与卵轴呈平行或垂直方向进行，每次的卵裂方向之间有一定角度。在分裂到8细胞期时，动物极半球的4个卵裂球正好位于植物极半球的4个卵裂球之间。这种卵裂方式的代表动物为扁虫、线虫、环节动物及软体动物。
三、小鼠与人的卵裂过程
1．小鼠
小鼠卵裂为旋转式卵裂，卵裂速度很慢。在受精18小时后合子基因开始转录，24小时后进行第一次卵裂，之后每间隔约12小时进行一次卵裂。8细胞期的卵裂球仍具全能性。如果在此期将每个卵裂球分开，它们将会形成8个遗传性状同一的小鼠。在过渡到16细胞期时，发生致密化（compaction）。这时胚胎中看不到单个的圆形卵裂球，卵裂球之间最大限度地由E-钙粘素等细胞黏附分子紧密地连接在一起。致密化发生后，胚胎细胞开始具有极性，内部细胞和外部细胞之间发生了很大的变化。胚胎发育到桑椹胚时，大约具32个细胞。以后胚胎的外部细胞开始分泌液体，逐渐出现胚泡腔，标志着胚泡的形成。在胚泡期，第一次出现两个不同的组织，组成胚泡腔壁的细胞为滋养层细胞（trophoblast），而位于一侧且紧贴滋养层的一小团细胞为内细胞团（inner cell mass, ICM）（图6-1）。胚胎滋养层将成为胎儿的胚外结构，而内细胞团注定成为胚胎及一部分的胚外结构。胚泡在子宫中自透明带中孵出，并在子宫中着床。
图6-1 示哺乳动物的卵裂过程
2．人
人也为旋转卵裂。大约在受精后30小时，开始第一次卵裂。第一次分裂是将合子以与赤道面呈一定角度，并与极体呈一线的面分裂。以后的分裂就不同步了。第二次卵裂在受精后40小时完成，产生4个相等的卵裂球。到第三天发育到6-12细胞期。在第四天由16-32个细胞组成。在32细胞期的胚胎为桑椹胚。桑椹胚的细胞不仅发育成为胚胎，还发育成为胎盘以及相关的组织。从8细胞阶段开始，刚开始互相结合比较疏松的卵裂球开始扁平，胚胎显示出内、外极性，使卵裂球之间最大限度地接触。之后外层的细胞开始凸起，而内层细胞开始内陷，这个重组的过程为致密化，包括细胞骨架蛋白以及卵裂球黏附性的改变。不同卵裂球之间的粘附也导致胚胎中的细胞发生分离，一些细胞进入桑椹胚的中心，而其它细胞则位于胚胎的外表面。一般认为，位于内部的细胞将发育形成内细胞团，而外围的细胞则发育形成滋养层。
在发育到第四天时，桑椹胚开始吸收液体。液体可能最初是在卵裂球间细胞内的空隙中产生的，在细胞之间聚集。同时，在外层细胞间形成紧密连接，液体继续进入腔内主要分布在内层细胞和外层细胞之间。随着胚胎中液体压力的增大，胚胎形成了腔，到达胚泡阶段。
四、着床前胚胎的极性及分化
与其它动物不一样，哺乳动物的卵只有很少的卵黄，营养主要由胎盘供给。从外观上虽不能区分卵的极性，但分子水平上可以确立极性。瘦素（leptin）和信号转导和转录激活因子3（STAT3）等与极性分布相关的母本蛋白主要在人和小鼠卵的动物极表达。
第一次卵裂为经裂，将细胞质分为几乎相等的半球，但它们之间存在微小的差异。瘦素和STAT3在卵极性轴中的分布与胚胎分裂轴中的分布有大约20％的不同。这些蛋白在2细胞期的每个子细胞中得以继承，表明每个2和4细胞分裂球已具有特定的发育命运。
2细胞胚胎的第一个卵裂球的分裂也是经裂，得到的两个子细胞大小完全相等，并且胚胎轴与卵中的轴完全一致。相比之下，第二个卵裂球因纺锤体轴旋转产生了横向的卵裂。纺锤体旋转可能标志着产生了其它类型的分化细胞。在胚胎中，在第二个卵裂球进行的水平分裂也会产生不同的子细胞，各自继承大多数动物极或植物极的细胞质。因此，控制卵裂的平面可能决定4细胞胚胎中每个卵裂球的发育方向。
在小鼠和人的2细胞及以后的胚胎中，瘦素和STAT3在动物极有高水平的分布。在以后的发育中，瘦素和STAT3的表达仅限于4细胞胚的一个卵裂球中、8细胞胚的两个卵裂球中以及最后仅存在于滋养层中。滋养层明显地继承了动物极的细胞质，许多母本蛋白均存在于动物极中。在4细胞胚胎中，其它三个子细胞的命运更加难以确定。带有大部分植物极细胞质的卵裂球推测成为生殖细胞系的前体，另外两个4细胞胚的卵裂球继承了卵母细胞的极性以及种间瘦素和STAT3的数量，可能成为多潜能体细胞的前体，因为这些蛋白在内细胞团中的表达下降。滋养层的前体细胞可能已经定位在4细胞胚胎的一个子细胞中，甚至可能在2细胞胚胎的一个子细胞中。瘦素和STAT3为很好的滋养层的标志分子。
对hCGβ在人早期胚胎的每个卵裂球中表达的分析表明，在未受精的卵母细胞以及4-和5-细胞胚胎中均检测到低水平的hCGβ mRNA表达，这些可能为潜在的母源性表达。hCGβ的转录水平从7细胞阶段逐渐升高，可能与4细胞期后胚胎基因组的转录相一致。
五、哺乳动物卵及胚胎轴的形成。
未受精的小鼠卵是圆的，具有动物－植物（A-V ）极轴，动物极是以第二极体的位
置为标记的（图6-2）。这个轴在胚泡阶段也可以确认（图6-2）。小鼠卵沿A-V 轴极化，动物极位于细胞质帽的中心，没有微绒毛，而卵子其余的部分则覆盖微绒毛。最近的研究显示，胚轴在第一次卵裂或更早时就特化了。第一次卵裂发生的平面接近或穿过A-V 轴。这个平面也为穿过两个卵裂球的垂直轴。当进行几次细胞分裂形成胚泡后，胚极（embryonic pole ）以及对胚极（abembryonic pole ）分布在相同的垂直轴上，第一次卵裂面的一侧为胚极的滋养层，而另一侧则为对胚极的滋养层。2细胞胚的第一个卵裂球在经历第二次卵裂后形成胚极，而第二个卵裂球则形成对胚极。在胚泡中仍保留A-V 轴。将胚极和对胚极一分为二的横切面来看，胚泡是椭圆形的（图6-2）。
第一次卵裂产生了两个不同的半球，但这种不同产生的原因还不清楚。排出的成熟
卵中特定mRNAs 或转录因子的不均匀分布可能导致2细胞期胚胎中的不同。细胞骨架等成分的不均匀分布可能也引起这种差异。第二次卵裂是不同步的，第一个卵裂半球主要分裂形成胚泡的内细胞团。胚泡腔的形成是卵极性的内在特性所决定的，在二细胞阶段就已建立了。因此，胚泡腔的特定位置在发生第一次卵裂之后就确定了。这个微妙的作图6-2 小鼠着床前发育四个阶段的示意图。第二极体（灰色）和动－植物极（A-V ）
轴处于同一方向。（a ）为受精卵，具有两个原核。以后的胚极－对胚极（Em-Ab ）
轴与A-V 轴成直角。(b)为二细胞胚胎，显示A-V 轴和将来的Em-Ab 轴。(c)为致密化的16细胞期胚胎。(d)为胚泡，显示A-V 轴和Em-Ab 轴的交叉平面。
第二极体的位置为胚极滋养层和胚泡壁滋养层的分界处。(e)为图d 中的胚泡
旋转直角后的横切面。从A-V 轴来看，胚泡是椭圆形的（自Stanton JL ，2003）。
用对于滋养层及内细胞团的命运有明显的影响。第一次卵裂的平面通过或接近精子融合的位置。卵表面80%的区域覆盖微绒毛，精子可在这些覆盖微绒毛的区域与卵融合。
二细胞胚的第一个卵裂球的卵裂是经裂，与A-V轴平行（图6-3）。第二个卵裂球的卵裂在同一个平面进行，但是这个平面因为细胞质移动，相对于第一个卵裂球的卵裂发生了旋转，结果形成了一个平面。这时四个四分之一卵裂球的位置象一个四面体。在兔子中，第二个卵裂球分裂时旋转的方向与第一个卵裂球分裂的方向一致。每个四分之一卵裂球具有不同的发育潜能。现在仍不清楚这种旋转为何出现在小鼠和人中，以及是否在发育过程中起重要作用。
四细胞期胚胎分裂形成8细胞胚胎，在第三次卵裂后经历致密化以及紧密连接的形成。致密化过程使卵裂球出现了顶部、底部和侧面。虽然8细胞期的卵裂球外表看起来相同，但它们并不相同，因为8细胞期胚胎中已具有原始的胚极－对胚极轴（Em－Ab）。8细胞期细胞的分裂在几何学上不同，一些细胞的分裂为侧向分裂，一些细胞的分裂则为辐射分裂。经历侧向分裂的细胞大约为辐射分裂细胞的两倍。在16细胞期的胚胎中，位于外层的细胞数与内层细胞数的比例为2:1。在32细胞期，胚泡腔开始在对胚极形成。
在胚泡以后的发育过程中，内细胞团分化成为外胚层和原始内胚层。着床后，位于胚极的滋养层向对胚极扩展形成胚外外胚层，而原始内胚层扩展成为脏壁以及体壁内胚层。外胚层位于脏壁及体壁内胚层之间。由靠近第二极体的那部分内细胞团来的内胚层主要形成卵柱的近端，而由另一端的内细胞团来的细胞则形成卵柱的远端。
图6-3 小鼠卵最初两次卵裂的示意图。（a）小鼠卵沿第二
极体的一个半球切面。切面与A-V轴在同一个平面
上。以后的胚极－对胚极轴与此平面成直角。精子在
卵上的结合部位为第一次卵裂的面。（b）二细胞胚
胎，显示第二极体与第一次卵裂平面和A-V轴接近。
（c）第一个卵裂半球经历卵裂后的位置。（d）第二
个卵裂半球分裂后形成的四细胞胚胎。图中保留了原
始的卵裂平面。（e）四细胞期胚胎，显示第二个卵
裂半球卵裂时，在细胞质分裂期间卵裂面发生旋转，
正好与旋转前的卵裂面成直角（自Stanton JL，2003）。
第二节早期胚胎发育过程中的基因表达
一、合子的基因激活
在很多动物中，受精后不久，胚胎处于转录的非活性状态，胚胎发育的启动并不需要RNA合成。在几个细胞周期后，转录得以恢复并且为胚胎发育所必须。不同动物中的这个细胞周期数是不同的。
在哺乳动物中,合子的基因激活实际上是两个阶段，由辅助时相（minor phase）和主要阶段(major phase)。因此，早期小鼠胚胎中转录活性可分为三个转变时期：（1）在1细胞晚期，合子基因激活的辅助期开始，仅具有很微弱的转录活性; （2）在2细胞早期（G1/S期）合成少量的蛋白质，包括70kDa热应激蛋白（heat-shock proteins）、TRCs (transcription-requiring complexes)、U2afbp-rs剪切因子（splicing factor）及翻译起始因子—eIF-4C。在第一次有丝分裂后，无增强子的启动子的活性受到抑制; 近来发现，经显微注射进入1细胞小鼠胚胎的原核中的报告基因，可在合子基因激活的辅助阶段转录。然而，如果没有合适的增强子存在，报告基因的转录在第一次有丝分裂后就受到抑制。（3）第二轮DNA复制后在2细胞晚期，开始合子基因激活的主要期，转录和翻译活性增加，导致蛋白质合成的型式发生巨大变化。
在其它哺乳动物中，合子基因激活的时间稍晚一些，发育过程中需要转录的时间也稍迟一些。通常，合子基因激活的主要期在第2-3次卵裂后开始，兔胚胎在第4次卵裂后开始。在兔中，虽然在2细胞期前还未检测到合子的转录产物，但合子基因激活的辅助期在1细胞期结束时就已开始，与小鼠中相同。
在两栖类和哺乳动物中，控制合子基因激活的控制机制是很保守的。在爪蟾中，合子基因激活的主要期发生在囊胚中期的转换期，主要依赖于复制基因的抑制因子的浓度。爪蟾卵母细胞中储存的大量的母体组蛋白可能竞争性得到基本的转录装置。在囊胚中期的转换期前，转录激活因子活性的缺失可能导致转录的不活跃。在小鼠最初的几个细胞周期中，发生大量染色质重排和核蛋白组成的改变，这些因素可能控制合子基因激活。
在爪蟾和小鼠的卵母细胞中，包含大量的功能性的RNA聚合酶II。胚胎发育的启动必须利用母体储存的这种酶。RNA聚合酶II的最大的亚基（RPB1亚基）的磷酸化可能与合子基因激活有关。在体外及体细胞中，转录过程确实涉及到这个亚基羧基端
（carboxy-terminal domain, CTD）的磷酸化和去磷酸化的周期性变化。在病毒感染、热应激和减数分裂成熟过程中，CTD的磷酸化也发生变化。在合子基因激活期间，RPB1亚基磷酸化后，便转位到细胞核中。
RPB1亚基的“分室”分布以及CTD的磷酸化可能控制哺乳动物胚胎的合子基因激活。在小鼠和兔中，合子基因激活的时间不同，RNA聚合酶II特性的4个主要变化与合子基因激活的辅助期和主要期的转换紧密相关：（1）在合子基因激活的辅助期，RPB1亚基逐渐迁移到细胞核中;（2）在合子基因激活辅助期开始前的第一个细胞周期，RPB1亚基是去磷酸化的; （3）在整个辅助期，RPB1亚基并未显示转录因子TFIIH磷酸化的特点;（4）在主要期开始时，RPB1超磷酸化的型式类似于体细胞中。
二、生长因子在早期胚胎发育中的作用
小鼠着床前胚胎中的基因表达，使得2细胞阶段轴的建立以及8细胞阶段发生致密化后滋养层和内细胞团的发育成为可能。现在已证实，在小鼠着床前胚胎中有大约15700个基因表达。研究小鼠着床前胚胎中大量基因的表达，是理解着床前胚胎发育的一个主要手段。目前研究基因功能的主要方法是通过基因敲除的办法使基因表达沉默，然后检测这些基因表达沉默后是否会引起表型和功能的异常。到目前为止，利用基因敲除方法对很多基因的功能已经进行了大量的研究，其中一些基因敲除后对小鼠的胚胎发育影响很大，甚至引起胚胎死亡。
着床前的胚胎在生殖道中处于游离状态，缺乏血液的供应，而且周围的液体环境在不断改变。在这期间，胚胎主要依赖于输卵管以及子宫腔的分泌物来供给营养。胚胎的卵裂及细胞分化等均受到雌性生殖道环境的影响。在胚胎发育、胚胎着床和妊娠维持过程中，都涉及到母体和胚胎之间的分子对话。
在小鼠和其它物种中，输卵管和着床前胚胎表达一些多肽生长因子及其受体，这些生长因子包括胰岛素、胰岛素样生长因子（IGF）家族、表皮生长因子（EGF）家族、成纤维细胞生长因子（FGF）家族、血小板衍生生长因子（PDGF）家族和肿瘤坏死因子（TNF）家族。生长因子在着床前胚胎发育过程中的表达呈时空特异性变化。转化生长因子β2（TGFβ2）在小鼠胚胎基因组激活后开始表达，到胚泡期时仅在滋养层细胞上表达。在小鼠胚胎中，TGFα定位在内细胞团上，而其受体—EGF受体主要定位在滋养层细胞的侧面及底部。但不同物种中，早期胚胎中的基因表达形式不同。EGF在人胚胎中表达，但在小鼠和牛胚胎中不表达。IGF-1虽在人胚胎中没有表达，但在小鼠、牛及
猪胚胎中均有表达。不同动物的着床前胚胎中，基因表达的形式均有所不同。表6-1中列出了人着床前胚胎中一些基因的表达时期。
外源性的生长因子对于着床前胚胎的发育并不是必须的。小鼠或人的胚胎可在补加丙酮酸盐和白蛋白的简单生理溶液中，依靠自身的营养来存活，并发育到胚泡期。但是，对体外发育和体内发育胚胎的详细研究表明，与体内发育的胚胎相比，体外培养的着床前胚胎的发育速度较慢，而且体外发育的小鼠胚泡的凋亡比率是体内发育胚胎的三倍。此外，在体外将几个胚胎在一起培养时，胚胎的发育率比单个胚胎培养时要高，胚胎细胞的凋亡率也比单个培养时要低。这表明胚胎所处的内分泌环境对胚胎的发育起到很关键的作用。人着床前胚胎表达IGF-1的受体，但是不表达IGF-1。在培养液中加入IGF-1后，可将胚胎发育到胚泡阶段的比例增加约25％，并使这些胚泡中内细胞团细胞的数目增加59％。如在培养液中加入IGF-1受体的特异性抗体后，可消除IGF-1的作用，表明IGF-1是通过IGF-1受体在胚胎中起作用的。此外，目前已经对很多种哺乳动物的胚胎在体外进行了培养。在体外培养过程中，补加一些生长因子或细胞因子后，对胚胎的发育及胚泡的孵化等过程都有促进作用。但由于这些方面的研究很多，很难进行详细的介绍。表6-2中仅列出了一些主要的细胞因子或生长因子对早期胚胎发育的影响。
表6-1 细胞因子及其受体在人着床前胚胎和生殖道中的表达
细胞因子胚胎发育时期及生殖道
或受体1细胞2-4细胞8细胞桑椹胚胚泡生殖道参考文献
VEGF －＋＋＋Krussel et al. (2000) VEGFR ＋Moller et al. (2001) LIF －－－－Sharkey et al. (1995) ＋＋＋＋＋Chen et al. (1999)
＋Charnock-Jones et al. (1994)
＋＋Cullinan et al. (1996)
LIF-R
＋Charnock-Jones et al. (1994)
－－－＋Sharkey et al. (1995) ＋＋＋＋＋Chen et al. (1999)
＋＋＋＋van Eijk et al. (1996)
＋＋Cullinan et al. (1996) TNF-α－＋－－Sharkey et al. (1995)
＋Zolti et al. (1991) TNF-R ＋＋－－Sharkey et al. (1995)
GM-CSF
＋Giacomini et al. (1995)
＋＋Zhao & Chegini (1999)
PAF ＋Collier et al. (1990) PAF-R －－－－Sharkey et al. (1995)
＋＋Ahmed et al. (1998) IL-1 ＋＋＋Zolti et al. (1991)
IL-1β＋＋＋＋＋De los Santo et al.
(1996)
IL-1Rt1
＋＋＋－＋
De los Santos et al.
(1996)
＋Simon et al. (1993)
IL-6 －－－＋Sharkey et al. (1995) ＋＋＋Zolti et al. (1991)
IL-6-R －－－＋Sharkey et al. (1995) TGFβR-T1 ＋＋－－＋Osterlund & Fried
(2000)
TGFβ-T2 ＋＋－－－Osterlund & Fried
(2000)
VEGF：血管生长因子LIF：白血病抑制因子TNF：肿瘤坏死因子
GM-CSF：巨噬细胞集落刺激因子PAF：血小板激活因子IL：白介素
TGFβR-T1：转化生长因子β的I型受体
表6-2 生长因子和细胞因子对体外哺乳动物着床前胚胎发育的影响
对胚胎的影响生长因子物种参考文献
胚泡形成↑Insulin 小鼠Harvey & Kaye(1990)
牛Matsui et al.(1995)
IGF-I 小鼠Harvey & Kaye(1992a)
牛Matsui et al.(1995); Palma et al.(1997)
IGF-II 小鼠Harvey & Kaye(1992b)
CSF-1 小鼠Pampfer et al.(1991)
TGF-α牛Larson et al.(1992)
LIF 小鼠Lavranos et al.(1995)
羊Fry et al.(1992)
GM-CSF 牛de Moraes & Hansen (1997)
小鼠Robertson et al. (2001)
HB-EGF 大鼠Tamada et al. (1999)
发育比率↑ IGF-II 小鼠Rappolee et al. (1992)
CSF-1 小鼠Bhatnagar et al. (1995)
PAF 小鼠Stoddart et al. (1996)
EGF 小鼠Brice et al. (1993)
胚泡细胞数目↑IGF-I & -II 小鼠Rappolee et al. (1992)
GM-CSF 小鼠Robertson et al. (2001)
PAF 小鼠Ryan et al. (1990b)
特异影响ICM ↑ Insulin 小鼠Harvey & Kaye (1990)
IGF-I 小鼠Harvey & Kaye (1992a)
IGF-II 小鼠Harvey & Kaye (1992b) 特异影响TE ↑ CSF-1 小鼠Bhatnagar et al. (1995)
胚泡腔扩展TGF-α小鼠Dardik & Schultz (1991)
EGF
胚泡孵出/黏附↑ GM-CSF 小鼠Robertson et al. (2001)
蛋白合成（TE）↑Insulin 小鼠Harvey & Kaye (1988)
IGF-II Rappolee et al. (1992)
EGF Wood & Kaye (1989)
蛋白合成(ICM) ↑ TGF-α小鼠Dardik et al. (1992)
内吞作用Insulin 小鼠Dunglison et al. (1995)
葡萄糖转运Insulin 小鼠Kaye et al. (1992)
GM-CSF 小鼠Robertson et al. (2001) 新陈代谢PAF 小鼠Ryan et al. (1990a)
基因表达IGFs 小鼠Shi et al. (1994)
TGFs Babalola & Shultz (1995) 细胞凋亡↓TGF-α小鼠Brison & Schultz (1997)
PAF 小鼠O’Neill (1998)
IGF-I 兔子Herrler et al. (1998)
小鼠Brison (2000)
细胞凋亡↑TNF-α小鼠Pampfer et al. (1997); Wuu et al. (1999) ICM：内细胞团; TE：滋养外胚层; IGF：胰岛素样生长因子; CSF：集落刺激因子; HB-EGF：肝素结合样表皮生长因子; LIF：白血病抑制因子; TGF：转化生长因子; GM-CSF：巨噬细胞集落刺激因子; PAF：血小板刺激因子; EGF：表皮生长因子; TNF：肿瘤坏死因子
三、Oct-4在小鼠早期胚胎中的表达
从胚泡期到原条期的发育过程中，将来发育为生殖系的前体细胞就已从体细胞中独立出来。转录因子Oct-4只在原始生殖细胞、卵母细胞和体外培养的胚胎干细胞中表达。POU区域结构蛋白组成了相关转录因子家族，这些蛋白的特点是可结合POU区域的DNA结合区域。大多数的POU蛋白在胚胎形成期间表达，表明可能在发育以及细胞分化中起重要的作用。Oct-4为POU转录因子家族的成员。这个蛋白的序列、基因结构和POU基因在染色体上的位置高度保守。小鼠与牛的Oct-4蛋白序列约81.7%的同源性，人与小鼠的Oct-4蛋白有87％的同源性。
已证实，小鼠的成熟卵母细胞中具有Oct-4活性，而精子则没有，表明Oct-4因子是母性遗传的。母性遗传的Oct-4是受精卵中Oct-4的唯一来源，以后母性遗传的Oct-4减少。直到4～8细胞期时，胚胎的Oct-4基因才开始转录。桑椹胚和早期胚泡的所有细胞均表达Oct-4。但在孵化胚泡中，Oct-4仅在内细胞团中高水平表达，而在滋养层细胞却不表达。在胚胎着床后的卵柱期，仅在原始外胚层中可检测到Oct-4的表达。在妊娠第7～8天的胚胎中, Oct-4仅在神经外胚层中表达。到妊娠第8.5天时，Oct-4的表达就已限定在原始生殖细胞中。Oct-4作为许多基因的转录因子特异的表达在全能性细胞中。虽然，Oct-4基因缺失的小鼠胚胎可发育到胚泡期，但并不能形成全能性的内细胞团，在胚胎着床不久便死亡。在体外，将Oct-4的表达水平提高或降低约30％，可使胚胎干细胞分别分化为内胚层或滋养外胚层。因此，Oct-4表达的微小变化可能对着床前的早期胚胎发育影响很大。
四、热休克蛋白（HSP）与早期胚胎发育
所有的有机体在外界蛋白毒性的压力下(应激条件)，可以通过合成大量的蛋白来发生反应，所产生的这些蛋白为热休克蛋白（Heat shock protein, HSP）。在正常的生长和发育过程中，热休克蛋白也有不同水平的表达。热休克蛋白根据分子量及诱导性不同分为不同的家族。一些热休克蛋白为组成性表达，而其它的热休克蛋白仅在刺激后表达。热休克蛋白与其它蛋白相互作用来起作用，在细胞不同部位的功能主要通过多肽精确的折叠和转位来控制。
在胚胎发育过程中，特别是早期胚胎发育时期，基因转录活跃、蛋白质大量合成以及细胞所处的环境在不断变化，细胞对外界的刺激十分敏感。在爪蟾中，HSP70在囊胚
中期表达。在小鼠中，HSP70在二细胞期胚胎中表达，与合子基因组的激活相一致，对于胚胎的发育起到关键性作用。在合子基因组开始激活时，就可观察到热休克蛋白的合成，并且在随后的发育阶段持续表达，与此蛋白的管家特性是相符的，这种保守性对于所有细胞的存活是很关键的。诱导性HSP70基因在小鼠着床前胚胎发育过程中的特异性表达有两个特点，一是当合子基因组转录开始时，在缺乏外界刺激的条件下，HSP70基因可自发地表达，二是直到胚泡阶段HSP70基因都对外界刺激没有反应。
HSP90是类固醇激素受体，在两栖类、鸡、果蝇、小鼠及人的胚胎中表达，主要以同源二聚体或与其他蛋白形成复合物定位于细胞膜上，参与胚胎发育过程的信号传导和发育调控。在人中，HSP90在早期胚胎阶段诱导表达，在后期阶段表达降低并达到基础水平。在爪蟾中，HSP90直到囊胚中期阶段才被诱导表达。
HSP30包括HSP30A、HSP30B(一种假基因)、HSP30C和HSP30D。这些基因在爪蟾胚胎中的表达量高，且表达形式复杂。这些蛋白在卵母细胞及胚胎中持续地合成。在应激条件下，热休克蛋白可能参与了胚胎中被损坏蛋白的聚合或错误的折叠。
胚胎发育过程中，热休克基因表达具有阶段和组织特异性。胚胎发育中，合子基因组激活后，最先表达的基因之一是热休克基因。2-细胞期的小鼠胚胎自发表达HSP68和HSP7。在爪蟾中，合子基因组表达启动的时间为囊胚中期，此期与HSP70基因的表达启动时间同步。HSP89、HSP70和HSP59在小鼠胚胎的外胚层细胞中高水平表达。正常情况下，胚胎发育的时期不同，被激活的热休克蛋白基因也不同; 在胚胎的不同组织中，热休克蛋白的种类和分布亦不完全相同。可见，热休克蛋白基因的自发性表达是受发育调控的。
五、连接蛋白（connexin）与早期胚胎发育
间隙连接在胚胎发育早期就存在，对胚胎的细胞分化、形态发生及生长调控起重要作用。连接蛋白基因的表达对细胞诱导、分化、增殖、细胞程序性死亡及衰老等生物过程的关系十分密切。在早期胚胎中，神经系统和循环系统尚未建立或未发育完善，长距离的信息传递难以进行。要使胚胎中的细胞向各种组织或器官分化，就离不开细胞间化学信息的交换。将连接蛋白的抗体注入非洲爪蟾8-细胞期的胚胎中，可以阻断通讯通道，使注射过抗体的胚胎的发育出现明显的区域性形态缺陷现象，如脑和眼发育不良或完全缺失，这些缺陷可能是直接阻断了控制局部分化的信息传递而造成的。间隙连接复合体在小鼠早期胚胎中就已经建立，发生在8细胞期的致密化过程。当间隙连接形成后，由
间隙连接建立的细胞间的偶联状态可一直保持到胚胎着床时。
间隙连接由一对连接小体(connexin)构成的中间有孔道的结构，每个连接小体由6个连接蛋白组成。连接小体两两相对分别整合在两个相邻细胞的质膜中。一般来说，只有相同或相似的连接蛋白形成的连接小体才能在细胞之间建立间隙连接，即一对连接小体中的12个连接蛋白是同一类型的连接蛋白，从而保证了一种组织中的大多数细胞主要与同一类型的细胞建立代谢偶联，阻止不同类型的细胞之间建立代谢偶联。间隙连接的建立可使代谢物（如氨基酸、葡萄糖、核苷酸和维生素等）及第二信使（如cAMP、Ca2+等）可在细胞间自由通过。
在哺乳动物中，连接蛋白由很多基因家族的基因编码。由不同连接蛋白组成的间隙连接，在渗透性、生物学特性以及调节特性等方面有所不同，每种类型的通道可能在调节中起到独一无二的作用。连接蛋白43（Cx43）最早在小鼠4细胞期胚胎中表达，并在以后逐步累积。Cx43在4细胞胚胎的细胞质中也表达; 到8细胞期发生致密化时，Cx43在细胞质中及间隙连接部位开始表达。在着床前胚胎中，未检测到Cx26、Cx32和Cx46连接蛋白的表达及间隙连接小体的形成。Cx43基因在2细胞期的胚胎中就已转录，但是最初产生的Cx43在细胞内处于悬浮状态。当一个还不清楚的信号与生物钟相偶联后，可激活Cx43并使其组装成为间隙连接。然而，当将Cx43基因敲除后，这些缺陷型胚胎仍可正常进行着床前的发育，并可完成整个妊娠过程。这一实验对Cx43在胚胎发育过程中的重要性提出了质疑。但最近发现，在着床前胚胎中也表达Cx30.3、Cx31、Cx31.1、Cx40和Cx45等5种连接蛋白。在Cx43基因敲除的胚胎中，很可能胚胎利用其它的连接蛋白来保持细胞间的偶联，从而支持发育。细胞间的偶联不依赖于细胞的变平，而需要卵裂球保持致密化状态，从而继续进行发育。另外，在大鼠着床前胚胎中发现Cx31与Cx43共表达。Cx31和Cx43的转录水平在受精卵中很高，到在2和4细胞期降到最低，其中Cx31基本检测不到。Cx43和Cx31 mRNA在致密化的8细胞期胚胎重新开始升高。在胚泡中，两种连接蛋白都在滋养层及内细胞团中共表达。Cx31特异性地在外胎盘锥及胚胎外胚层细胞中表达，而Cx43仅限于胚胎本部细胞。这样的分工表达可能是由不同的发育程序导致的。Cx31似乎在胚胎滋养层的形成过程中作用不大，在着床前的发育中仅作为补偿途径。多种连接蛋白的表达可能为哺乳动物胚胎发生过程中的普遍特征。
牛胚胎在桑椹胚和胚泡期开始表达Cx43，可能牛胚胎在桑椹胚期才建立起间隙连接方式。而在小鼠中，早在4-细胞期便能检测到Cx43表达，但有功能的间隙连接最早出现在8-细胞期的致密化阶段。在人的早期胚胎发育中，间隙连接最早出现在4细胞阶段，
并在以后的发育中逐渐增多。
六、E钙粘素与早期胚胎发育
在胚胎发育中，相似细胞的聚集能力对于细胞群体的建立是很重要的。细胞分选的过程代表了形态发生的开始，因为形成的细胞群体将形成组织结构。典型钙粘素参与发育早期这样的细胞运动。在体外培养时，如向每个2细胞期胚胎注入E-钙粘素的反义RNA，可使胚胎发生致密化的时间延迟，认为胚胎的致密化延迟是由于E钙粘素基因的表达被反义RNA抑制所致。以后又证明，E-钙粘素介导小鼠胚胎8-细胞期钙依赖性卵裂球的致密化。E-钙粘素突变小鼠中，纯合型在胚胎着床前死亡，死亡的原因是由于E-钙粘素缺失后导致不能形成滋养外胚层上皮或者胚泡腔。有意思的是，缺失E钙粘素的胚胎的卵裂球之间还可以形成桥粒以及紧密连接。所以，母体E钙粘素对于致密化的起始是足够的，但不能维持进一步的胚胎发育。
七、胚胎的体外发育阻滞
除了一些纯系的小鼠品系和它们的F1代的杂交系外，小鼠的1细胞胚胎的体外发育均被阻滞在2细胞期，此现象称为2细胞阻滞（2-cell block）。以后陆续发现，其它哺乳动物的胚胎在体外培养时也被阻滞在不同的发育阶段，这种现象称为发育阻滞（developmental block）。发育阻滞是哺乳动物早期胚胎体外培养时遇到的一个普遍问题。不同动物中发生阻滞的时间不同，仓鼠发生在2-8细胞期，大鼠在2-4细胞期，山羊、绵羊、牛和恒河猴发生在8-16细胞期，猪在4细胞期，人在4-8细胞期。
由于培养液的成份不同，来自不同品系小鼠的胚胎在体外的发育也不同，特别在存在或缺乏葡萄糖及无机磷酸盐时更是如此。在一些培养条件下，葡萄糖的作用既有刺激性作用，又有抑制性作用。葡萄糖是大多数动物生殖道中存在的一种能源的底物。磷酸盐对于ATP的产生是必需的，是细胞活动的基本的能量来源。然而，在培养液中加入葡萄糖和磷酸盐后，对很多动物的胚胎发育是抑制性的，包括啮齿类、家畜及人。在改进的无蛋白的Tyrode's液中培养仓鼠胚胎时，如果不加磷酸二氢钠，有97%的2细胞胚胎可发育到4细胞或4细胞期以上; 但如果加0.1-1.05 mM的磷酸盐，则仅有9-21%可发育到4细胞期。不论葡萄糖存在与否，磷酸盐对胚胎发育都起抑制作用。但在缺乏
磷酸盐时，葡萄糖并不阻滞胚胎发育。当存在磷酸盐时（0.35 mM）,葡萄糖则抑制胚胎发育（Schini and Bavister, 1988）。
如果在培养基中加入微摩尔浓度(μM)的EDTA，或用不含磷酸根的培养基进行培养时，1细胞期的胚胎也可发育通过2细胞期。然而，这些培养条件远非生理性的，因为输卵管液中并不具有EDTA，但却具有磷酸根。
将由朝鲜黑山羊（Capra hircus aegagrus）超数排卵获得的胚胎在体外培养6天，所用培养液为合成的输卵管液培养液，其中补加BSA或血清。如果不加谷胱甘肽（GSH），所有的培养胚胎均不能发育超过8-16细胞期阻滞。加入谷胱甘肽后，对这些胚胎发育到胚泡的能力有明显的促进，但谷胱甘肽的作用很大程度上依赖于培养液中加入的蛋白。当培养液中加入胎牛血清时，谷胱甘肽的作用明显强于加BSA或山羊血清的效果，有91%的胚胎可发育到胚泡期。已证实谷胱甘肽特异性地作用于8-16细胞期的胚胎，从而促进胚胎的发育。
Ham's F-10培养液通常用于人和动物的体外受精中。用Ham's F-10培养液培养，可使92%的CD-1小鼠的胚胎阻滞在2-细胞期，但并不使杂交的纯系小鼠（BDF1）的胚胎发生阻滞。相反，BWW是一个改进的Kreb's-Ringer 碳酸氢钠培养液，可支持CD-1及BDF1系的小鼠胚胎发育到胚泡期。如果在BWW液中补加15%的Ham's F-10培养液，则可使CD-1小鼠的胚胎发育受到阻滞。从这两种培养液成份的比较发现，6-30μM的次黄嘌呤与CD-1小鼠胚胎的发育阻滞有关。加入EDTA可部分（40%）解除次黄嘌呤对胚胎发育的阻滞作用。
将从爪蟾卵中提取的MPF注射入来自ICR小鼠2细胞胚胎的一个卵裂球中后，可使这些胚胎的2细胞阻滞得以克服。此外，将小鼠的1细胞胚胎与分离的小鼠壶腹部共同培养，也可克服小鼠的发育阻滞，但这种效应仅限于第二个细胞周期的G2期。
已证实，阻滞在2细胞期的胚胎为四倍体，胚胎在发生阻滞前能整合溴脱氧尿嘧啶，在这些阻滞的胚胎中也未见核膜破裂和染色体凝集的现象。这表明阻滞在2细胞期的胚胎是在第二细胞周期的G2期发生阻滞的。
磷酸盐可诱导大鼠的胚胎在2细胞晚期发生阻滞。在未发生阻滞的处于2细胞期间期的胚胎中，细丝样的微管均匀地分布在细胞质中，并在M期时迁移到纺锤体上。在阻滞在2细胞期的胚胎中，则形成更粗的纤维性微管，以粗的网状结构存在于细胞质中。在未发生阻滞的2细胞期的M期，微丝在核周围及质膜下分布。但在发生2细胞阻滞
的胚胎中，微丝则形成颗粒样结构，分布于细胞质中。这些结果表明，微丝和微管也与大鼠胚胎的发育紧密相关。
通过杂交实验证实，母体遗传来的发育信息可能在控制小鼠胚胎的早期卵裂方面起重要作用。另外，将非阻滞胚胎的细胞质转移到受阻滞的胚胎中后，也能使这些受阻滞的胚胎恢复在体外的发育能力。有人提出，在很多哺乳动物中，受精卵可在体外早期发育的各个时期发生阻滞。还有人提出，胚胎体外发育的阻滞是与合子基因激活的时间相对应，认为发育阻滞和胚胎的转录活性间存在一定的相互关系。
尽管利用一些办法能够克服胚胎培养时的发育阻滞，但仅有很少的研究试图解释阻滞的遗传机理。由于可通过改变培养环境来克服2细胞阻滞，这说明有可能利用确认不同条件培养的胚胎中的差异性表达的基因，来了解发育阻滞的机理。尽管有一些关于着床前胚胎中基因表达的报道，但对基因表达和发育阻滞间的相互关系仍不清楚。
第三节基因印迹
一、基因印迹（gene imprinting）的发现
在哺乳动物中，基因印迹的存在最早是通过细胞核移植实验得到证实的。从妊娠小鼠体内获得受精卵后，在雄原核和雌原核融合前，通过显微操作方法将其中一个原核取出后，再将另一个来自精子或卵子的原核注入该受精卵内，结果含有两个雄原核或两个雌原核的胚胎均不能正常发育。如果原有的雄原核被另一雄原核代替后，或者原来胚胎中的雌原核被另一卵子来的雌原核代替后，在新构建的受精卵中具有正常互补的雄性和雌性基因组，此时胚胎能够进行正常的胚胎发育。哺乳动物精子和卵子的基因组是不同的。如果受精卵中的遗传物质来自两个雄原核或两个雌原核时，合子不能正常发育。发育缺陷可能是由于某些基因只有来自精子和卵子时才处于活性状态。在人及小鼠中已证实，一个突变基因从一亲本遗传来时引起严重的或致死性缺陷，但从另一亲本遗传来时则不产生这些缺陷。如胰岛素样生长因子-2(insulin-like growth factor-2)基因位于第七条染色体上，从父本来的此基因在早期胚胎中处于活性状态，而此基因的受体（IGF-2R）位于第17条染色体上，仅从母本来时才处于活性状态。从父本遗传来的IGF-2R缺失的小鼠正常，但同样的缺失从母本来源时，发育则受阻。
利用细胞核移植等技术可建立孤雄生殖（胚胎只含有父方的基因组）和孤雌生殖（胚胎只含有母方基因组）模型，但所得到的胚胎均不能发育到分娩期。即使有的胚胎能发
育到胚胎着床期，但孤雄生殖的胚胎在着床部位仅见到胚外成分（如胎盘等），而孤雌生殖的胚胎在着床部位则缺乏胚外成分。从一种自交品系小鼠产生的孤雌生殖胚胎可以发育到胚泡或原肠阶段，然而从其它品系小鼠产生的孤雌生殖的胚胎可能发育到具40体节阶段。这也表明母源基因的产物对胚胎的发育尤其重要，而父源基因的产物则是胚外组织正常发育的关键。由于母源和父源基因之间存在功能上的差异，母系和父系配子间平衡的改变必然会导致表型异常和病理变化。
哺乳动物的印迹基因对胚胎的发育也会产生影响。表6-3中列出了一些哺乳动物中的基因印迹位点。H19基因、IGF2基因及IGF2受体基因是目前研究最多的印迹基因。H19基因是母系表达基因，在小鼠的桑椹胚和早期胚泡中不表达，但在晚期胚泡的滋养层中表达。胚胎着床后，H19基因在许多组织内表达; 到出生后，H19基因的表达减弱。当H19基因失活后，雌性胎儿出生时的体重比正常胎儿重27%。IGF2基因是父系表达基因，在2细胞胚胎中就开始表达，并在以后的胚胎发育中广泛表达。将IGF2基因突变后，出生胎儿的体重仅为野生型胎儿的60%。IGF2受体基因是母源性表达的基因。IGF2受体可与IGF2结合后，将IGF2转运到溶酶体中使其溶解，从而维持IGF2在机体内的平衡状态。当将IGF2受体基因敲除后，所产胎儿的体重比正常胎儿重30%，这时IGF2的水平也升高，从而导致胎儿在产前死亡。但如将IGF2基因与IGF2受体基因同时敲除，则胎儿不再致死。IGF2受体基因敲除后胎儿致死的原因可能是由于IGF2基因过度表达所致。现在发现，H19基因的母系表达可以通过抑制母源性染色体的转录来降低IGF2的含量，这可能主要是由于H19、IGF2和Ins2基因之间对共享增强子的竞争作用所致。这也表明，通过H19、IGF2和Ins2这三种印迹基因之间的相互作用，可精确调节IGF2基因的表达，从而维持胚胎的正常发育。
表6-3 哺乳动物的一些内源性基因印迹的位点
印迹位点激活的等位基因参考文献
IGF2 父本DeChiara et al.,1991
IGF-2R 母本Barlow et al.,1991
H19 母本Bartolomei et al.,1991
Snrpn 父本Leff et al.,1992
Ins1和2 父本Gidclings et al.,1994
U2aflop-rs 父本Hayashizaki et al.,1994
Znf127 父本Nicholls,1994
Par1 父本Nicholls,1994
Par5 父本Nicholls,1994
Xist 父本Kay et al.,1994
Mas 父本Villar et al.,1994
IPW 父本Wevrick et al.,1994
WT1 母本Jinno et al.,1994
Mash-2 母本Guillenmot et al.,1995
P57(KIP2) 母本Hatada et al.,1995
Peg1/MEST 父本Kaneko-ishino et al.,1996
ApoE 父本Mann et al.,1995
Pk3 父本Mann et al.,1995
Pplcy 父本Mann et al.,1995
自Martin CC（1998）
二、基因印迹与甲基化
现在认为，大多数哺乳动物雄及雌原核的差异涉及到其甲基化形式的差异。甲基化与非甲基化CG二聚体的分布可用限制性内切酶HpaII及MspI来分析。这两种酶都切同一位点(-CCGG-)，但中间的C甲基化时则HpaII不能切DNA，而MspI不论甲基化与否都能酶切。因此，一特定细胞类型的DNA可用这两种酶的不同切法来进行研究。雌性及雄性哺乳动物的原始生殖细胞（PGC）的核为明显的低度甲基化。随着配子的成熟，精子及卵子的基因经历大量的甲基化，似乎在生殖细胞形成期间，以前的信息被抹去。
试管婴儿之胚胎停育原因解析 好不容易怀上孩子，医生却告诉你胚胎停育了。试管婴儿之胚胎停育你知道原因吗？ 妊娠的诊断标准 * 妊娠试验: * B超：妊娠囊(gestational sac, GS) 妊娠最早标志，形态为圆形或椭圆形，TVB最早在孕4-5周可测到 空孕囊和胚胎停育---相关定义 空孕囊 * 受精卵着床后发育异常，尚未形成胚胎就停止发育 * B超：宫腔内只有孕囊而无胎芽组织的异常妊娠，孕囊直径>20mm，而囊内仍未见到胚芽，提示空囊 * 自然流产的一种形式 胚胎停育 * 妊娠早期胚胎因某种原因停止发育 * B 超：妊娠囊内胎芽或胎儿形态不整，无胎心搏动或表现为枯萎囊等 * 临床表现：一般有停经史，无腹痛，有或没有阴道流血 * 自然流产的一种形式 空孕囊和胚胎停育---超声诊断 经阴道超声 (1) 胚胎长度≤5 mm，无心管搏动，7-10d 后复查仍无心管搏动 (2) 胚胎长度>5 mm，无心管搏动或妊娠囊平均内径>20mm，无卵黄囊及胚胎 (3) 妊娠囊平均内径≤20mm，无卵黄囊及胚胎，1-2 周后复查仍无卵黄囊及胚胎 经腹部超声 (1) 胚胎长度≤9 mm，无心管搏动，7-10d 后复查仍无心管搏动 (2) 胚胎长度>9 mm，无心管搏动或妊娠囊平均内径>25mm，无卵黄囊及胚胎 (3) 妊娠囊平均径线≤25mm，无卵黄囊及胚胎，1-2 周后复查仍无卵黄囊及胚胎 空孕囊和胚胎停育---自然流产 * 自然流产：妊娠过程失败、胚胎死亡和胚胎及附属物排出，胚胎及附属物< 1000g，孕周<28周? * 复发性流产（recurrentspontaneous abortion，RSA)：连续发生2 次自然流产 * 习惯性流产：连续发生3 次或3次以上自然流产 空孕囊和胚胎停育---原因 遗传因素
作者姓名：吴侠 论文题目：牛胚胎发育过程组蛋白修饰及克隆胚胎表观遗传重编程的作者简介：吴侠，男，1980年09月出生，2003年07月师从于内蒙古大学旭日干教授，于2008年07月获博士（硕士）学位。 随着十年前第一只体细胞克隆哺乳动物的诞生，近年来，体细胞核移植技术已经在其他物种中得到实现，且体细胞核移植技术已经越过了种属的界限。但就目前的技术水平而言，体细胞克隆胚胎怀孕率低、出生后胎儿异常的问题依然没有解决，这些问题的存在严重制约了体细胞克隆技术的广泛应用。许多研究证实，供体细胞核在受体卵母细胞中的不完全或异常表观遗传重编程是导致克隆胚胎发育异常的重要原因。基因组DNA甲基化、组蛋白的共价修饰是重要的表观遗传修饰，二者具有复杂而广泛的生物学功能。正常生殖细胞发生及胚胎发育过程，染色体要经历广泛的DNA甲基化、去甲基化，核小体核心组蛋白也要通过各种共价修饰调节染色体功能，从而完成遗传信息的传递和调控胚胎的发育。目前，对于克隆胚胎重编程机理的研究还处于初级阶段，虽然证实克隆胚胎存在DNA甲基化的异常，但是组蛋白共价修饰是否也存在异常，还不是很清楚。为了深入探讨克隆胚胎组蛋白修饰的重编程，进而改善克隆效率，阐明胚胎的发育机理，本研究探讨了牛卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎体外发育过程中组蛋白修饰的动态变化，比较了体外受精胚胎与克隆胚胎早期发育过程中组蛋白修饰的差异。使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂对供体细胞及受体卵母细胞进行了处理，检测了药物对供、受体表观遗传修饰，以及克隆胚胎发育的影响，并对处理后供体核在去核卵母细胞中组蛋白修饰的重编程进行了分析。 1. 牛卵母细胞减数分裂、体外受精及胚胎体外发育过程中组蛋白修饰动态变化的研究 本研究探讨了组蛋白H3、H4不同甲基化、乙酰化修饰位点在牛卵母细胞成熟、体外受精及胚胎体外发育不同阶段的动态变化。结果显示，组蛋白H3、H4甲基化，乙酰化具有明显的阶段性变化。牛卵母细胞成熟过程不同组蛋白不同修饰位
中国海洋大学实验报告 年月日姓名：专业年级：同组者： 课程：发育生物学实验题目：硫酸铜对斑马鱼胚胎发育的影响 一．【实验目的】 1、锻炼独立开展科学实验、分析和解决实际问题的能力； 2、加深环境对动物受精及早期发育影响的理解 二.【实验原理】 重金属污染是近年渔业环境污染的公害之一。随着工农业的发展，浓度严重超标的一些重金属离子被排入水体而造成污染，对鱼类有毒害作用。目前水体中的重金属主要有Cd、Cu、Pb、Zn等。其中Cu离子就具有较强的毒性，可以和蛋白质中游离的羧基形成不溶性的盐，使蛋白质变性，因此常被用作杀菌剂。 斑马鱼（Danio rerio）是常见的暖水性（21~32℃）观赏鱼，鲤科,个体小（4~5㎝），常年产卵，鱼卵易收集，性成熟周期短且胚胎透明，便于观察药物对其体内器官的影响。雌性斑马鱼可产卵200枚，胚胎在24小时内就可发育成形，繁殖水温24℃时，受精卵经2~3天孵出仔鱼；水温28℃时，受精卵经36小时孵出仔鱼，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因。由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视。 在斑马鱼的整个生活周期中，胚胎期和仔稚幼鱼早期发育阶段对重金属污染最为敏感。据报道，波罗的海春天产卵的鲱鱼，在10 ppb 的Cu2+，水的盐度为5.7条件下即对它的受精和发育有影响。30 ppb的Cu2+引起大西洋鲱鱼（Clupea harengus）卵的死亡，而35 ppb 的Cu2+也使太平洋鲱鱼（C.pallasi）的胚胎发生大量死亡[1]。吴玉霖等1990年依据不同金属对褐牙鲆胚胎的滞育、致畸、成活率及孵化率的综合影响指际，得出5种金属对褐牙鲆胚胎的毒性大小顺序为：Cu2+>Zn2+>Cd2+>Pb2+>Cr3+,对仔鱼的毒性大小顺序为Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+>Cr3+ [2]。 三.【实验步骤】 1、实验材料 斑马鱼囊胚、CuSO4为分析纯，充分曝气的去离子水、24孔细胞培养板、恒温培养箱、用充分曝气的蒸馏水配置成浓度为5 mg/L 的CuSO4母液，用时稀释。. 2、实验方法 1）硫酸铜浓度梯度的设定 经查阅文献，确定斑马鱼胚胎发育从受精到孵化出幼鱼过程中的CuSO4半致死浓度和安全浓度范围，设定5个浓度梯度和和1个对照组。 研究表明，Cu2+对大银鱼受精卵的安全浓度为0.00112 mg/L[3]，对鮸状黄姑鱼仔鱼的安全浓度为0.006mg/L[4]，所以设定对照组CuSO4的浓度梯度分别为0（空白对照），0.001 mg/L，0.01 mg/L，0.1 mg/L，1.0 mg/L，2.0 mg/L。每个浓度组设定4个平行组。使用暴晒后的
斑马鱼动物模型的应用 斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。 斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。 一、斑马鱼的品系 经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。 二、斑马鱼突变品系的筛选 斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。插入诱变是以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵，整合到基因组中，干扰正常基因表达。射线照射产生的突变率是ENU 化学诱导的10倍，但由于突变涉及多个基因，突变的表型是受若干基因调控的结果，不利于基因功能的分析，因此，ENU化学诱导法是斑马鱼突变的主要方法。研究含有纯合致死
斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色 斑马鱼胚胎的全组织免疫化学染色被广泛应用，这一技术需要额外的步骤来固定和通透以确保卵膜能够完全被溶液渗透。固定、封闭、抗体孵育、洗脱、通透以及底物显色过程都需要比正常的免疫细胞化学/免疫组化更长的时间，以使得溶液可以渗透到达样品的中心。 实验步骤： 1. 将胚胎置于5ml的器皿中固定1h。固定液的选择要谨慎，取决于两点：一是对于同一 种抗体，在冰冻切片中成功使用的固定液，可用来做全胚胎染色实验，二是根据目的蛋白。可用4%的多聚甲醛或者预混合的固定液来固定，预混合的固定液十分适合于神经蛋白。 使用Pasteur移液管来移动胚胎、吸取溶液，这有利于防止来自于移液管窄末端对胚胎的损坏。 2. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。 3. 将胚胎置于冰丙酮/PBS混合液中8分钟。 丙酮可用帮助通透坚固的卵膜，对于其他样品如鸡和鼠这一步可省略。 4. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。 5. 用封闭液（含1%Triton、10%胎牛血清的PBS）室温孵育胚胎1h。 6. 阻断过氧化物酶：将胚胎置于含0.1%H2O2的封闭液中4°C过夜。 7. 用封闭液清洗胚胎2次。 8. 将Pasteur移液管末端剪掉形成2ml的管子，用其转移胚胎。加入合适浓度的一抗。 一般在全胚胎染色中抗体孵育的时间比较久，为了防止微生物的生长，在稀释一抗的封闭液中会加入0.02%的叠氮化钠。 9. 样品在混合器上4°C缓慢旋转孵育1-4天。 根据不同的抗体以及胚胎的大小，孵育的时间需要进行一些优化。 10. 用含1%Triton、10%胎牛血清的PBS清洗胚胎3次，每次1h。 11. 用含1%Triton的PBS清洗3次，每次10分钟。 12. 用DAB底物室温孵育胚胎2-3h。 13. 将胚胎转移到一个碟子中，加入新鲜的配制的显示底物（每1mlDAB加5ul的过氧化氢）。 14. 用PBS清洗3次，使得样品达到理想的染色强度。 15. 爬片观察胚胎：观察分析前样品于4°C避光储存。 爬片：用融化的含1%琼脂糖的PBS爬片。一旦加入琼脂糖后，用含70%甘油的PBS 覆盖琼脂糖，再在样品上放置一个盖玻片。
人的胚胎发育过程 1个月 受精卵一旦形成，随即启动卵裂机制。在第3、4天时受精卵已分裂为约图1 人卵细胞受精到受精卵卵裂植入的过程100个细胞的内细胞团。经输卵管蠕动细胞团被送入子宫腔，通过表面粘性物，贴附与子宫内膜，靠近子宫内膜的细胞分泌一种酶，将子宫内膜细胞裂解，形成一个小洞，从受精后的5、6天开始至第11、12天，整个胚泡埋入内膜，该过程称为“着床”或“植入”。胚泡植入后，子宫内膜重新长好，胚泡表面的滋养层细胞不断分裂，长出绒毛状突起，形成许多绒毛，伸入子宫内膜，吸收母体营养（图1）。 2个月 胚胎呈扁平的盘状，称胚盘，直径约2cm，漂浮在羊膜腔中，此时胚胎的三个胚层已经形成，并开始分化。除形成胎盘处的绒毛不脱落外，其余胚泡四周的绒毛均脱落，表面变得光滑（图a）。胚胎由存留的胚泡绒毛和子宫内膜共同形成，待胚胎第12周胎盘才完全形成。第6周出现两条管道合并的心脏原基，虽然不具备心脏形态，但已经开始跳动。 之后，胚胎渐渐出现一条封闭的循环血管，胚胎开始制造自己的血液(包括其中的各种血细胞)。第7周神经管出现，后端部分形成脊髓，前端部分稍膨大，为脑的原基（图2）。第8周胚胎约长20 mm，心脏在腹侧呈一小突起，并轻轻跳动，此时还没有四肢，只有小尾巴在后面凸出。
(图2) 3个月 胚胎先长出胳膊，然后长出双腿，头和尾屈成一团，头部有耳、鼻孔和下巴，头约占身长的1/3。第11周出现椭圆的手和脚，有五条深纹会形成指（趾）。头部两侧长出两眼，出现嘴唇和齿龈、尾巴消失。胚胎发育早期，胎儿发育很快，第2、3个月时所有器官原基基本上已经形成。其后只是内部细胞增殖使其体积增大。 4个月 胎儿性器官出现，两眼转入脸的正面，前额突出，鼻孔张开，耳朵裂缝可见，四肢变长，手指可辨并有指（趾）甲。头颈能转动，会张嘴吞咽羊水。 5个月 胎儿身长约25 cm，体重250g，头占身长的1/4，皮肤上出现胎毛和头发，皮脂腺和汗腺出现；肠道内有胎粪积聚，主要为胆囊排出的胆汁。肾已经能排尿，尿液排入羊水中，胎儿的四肢能活动。 6个月
鲁东大学生命科学学院学院20 10 －20 11 学年第二学期学院______________ 专业_____________ 年级________ 班________ 学号 _____________姓名______________ 密封线 学生须将文字写在此线以下 《发育生物学》课程论文 课程号：2522080
.关键词：斑马鱼；发育；葡萄糖；溶液浓度；温度；TCDD 一、斑马鱼简介 斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼。 斑马鱼是一种常见的热带鱼。斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm，对水质要求不高。孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。发育温度要求在25-31℃之间。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关 斑马鱼的资料可供查询和下载，方便了研究。斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可做为人类疾病模型。斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力. 二、斑马鱼的发育过程 1〕卵子的发生 斑马鱼卵子发生过程中乱母细胞的发育是不同步的。在卵子发生早期，核内许多小核仁开始富集，其数目在接下来的时期中可以达到1500个，他们分布在和的外围和靠近内部核膜。 斑马鱼卵子发生过程一般分为5个时期，即StageⅠ-Ⅴ;有时也将StageⅡ和Ⅲ作为一个时期将卵子发生分为4个时期。各个时期的基本特征是： StageⅠ是原始滤泡生长阶段，乱母细胞没有卵黄，是一个有细胞质包围着升值滤泡的圆形球体。其染色体去浓缩并出现灯刷装 状表型，此时DNA高度延伸，形成一个具有典型形态学上的包含RNA和蛋白质的恻环。染色体的这一构型被认为有利于母源性基因的转录激活，其出现与斑马鱼卵母细胞中RNA合成的高速率是一致的。在这时期，卵母细胞和滤泡细胞的微小突起（microvilli）开始伸展并延伸到彼此的区域。一旦形成，这些连接包含粘附连接、细胞桥粒和间隙连接，它们可能与滤泡细胞和卵母细胞间的交流和卵母细胞附近小分子的吸收有关。同时，卵黄膜组分开始在滤泡细胞和卵母细胞之间富集；其他结构，如线粒体、高尔基体和内质网等富集，反映了产生大量产物的需要。 StageⅡ卵母细胞的特点是富集了大量蛋白质和油脂，对于卵子激
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复旦学报（医学版）２００６年１月，３３（１） 脏的发生与发育过程中的作用提供依据。 材料和方法 斑马鱼胚胎固定收集不同发育时期的ＡＢ野 生型斑马鱼（购自俄勒冈大学，斑马鱼养殖系统从美国ＡｑｕａｔｉｃＨａｂｉｔａｔｓ公司引进）胚胎：６ｈｐｆ（ｈｏｕｒｓｐｏｓｔ—ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，受精后６ｈ）、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、２０、２４、３６、４８ｈｐｆ，用４％多聚甲醛溶液固定过夜（至少固定１２ｈ），保存于甲醇溶液中，置一２０℃备用。 引物设计与合成首先根据Ｇｅｎｂａｎｋ数据库查得斑马鱼Ｍｅｆ２ｃｃＤＮＡ序列（Ｇｅｎｂａｎｋ：３０５７５），以包含密码子１３１９～２３８５位的基因序列为ＲＮＡ探针序列，探针序列总长１０６６ｂｐ。ＲＮＡ探针的引物序列（由上海赛百盛生物有限公司合成）为：Ｆｏｒ—ｗａｒｄ：５＇－ＣＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＣ一３ ７Ｒｅｖｅｒｓｅ：５＇－ＣＧＣＣＣＧＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＧＡ ＧＡＧ一３ ７。 ＰＣＲ扩增以斑马鱼基因组总ＤＮＡ为模板，用以上两条引物特异扩增ＲＮＡ探针序列。扩增条件为：９５℃预变性２ｍｉｎ，９５℃变性４５Ｓ，５７℃复性４５Ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，重复３０个循环，最后７２℃延伸７ｍｉｎ。１％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 合成反义ＲＮＡ探针将纯化的扩增产物连接到ｐＧＥＭ—Ｔ载体（Ｐｒｏｍｅｇａ）中，然后转化到ＤＨ５ａ感受态菌株（博大泰克）中进行克隆。根据Ｈａｒｌａｎｄ的方法［４３抽提转染后的连接载体质粒（测序验证质粒中插入序列是否正确），ＮｏｔＩ内切酶（ＮＥＢ）酶切完全，以其为模板转录合成反义ＲＮＡ探针。 整体原位杂交取不同发育时期的胚胎，用１×ＰＢＳＴ溶液洗去多余的甲醇溶液，将胚胎置于６５℃水浴进行预杂交３ｈ，然后加入所合成的反义ＲＮＡ探针６５℃水浴杂交过夜。多余的探针用０．２×ＳＳＣ溶液洗去，加入ａｎｔｉ—Ｄｉｇ—ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）与反义ＲＮＡ探针结合过夜。未结合的抗体用１ＸＰＢＳＴ溶液洗去，再加入ＢＣＩＰ／ＮＢＴ／ＮＴＭＴ溶液显色３０ｍｉｎ，迅速用１ＸＰＢＳＴ溶液洗去多余的显色液，在显微镜下观察并记录结果。 结果 探针合成效果琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，本实验中设计的引物能够特异性地扩增目标基因片段。图１Ａ为特异扩增的ＲＮＡ探针序列电泳检测结果，扩增的ＲＮＡ探针序列大小约１０６６ｂｐ。图１Ｂ为酶切后电泳迁移率的改变，２、３泳道是未被酶切的质粒序列，４、５泳道是酶切后的质粒序列。酶切后质粒电泳速率要比未酶切质粒的速率要快。同时，我们将该序列测序后进一步验证（由上海赛百盛生物有限公司测序），连接至ｐＧＥＭ—Ｔ载体中的ＲＮＡ探针的序列是正确的。 图ｌ凝胶分析ＰＣＲ结果（Ａ）和质粒酶切结果（Ｂ）Ｆｉｇ１ＧｅｌａｎａｌｙｓｉｓＰＣＲ（Ａ）ａｎｄｐｌａｓｍｉｄ（Ｂ） Ａ：１：ｍａｒｋｅｒ；２－５；ＲＮＡｐｒｏｂｅ．Ｂ：１：ｍａｒｋｅｒ；２－３：Ｍｅｆ２ｃＲＮＡ—ｐＧＥＭＴ； ４－５：Ｍｅｆ２ｃＲＮＡ－ｐＧＥＭＴｃｕｔｂｙＮｏｔ－１ 斑马鱼整体原位杂交在斑马鱼胚胎发育早期，Ｍｅｆ２ｃ在胚体中没有自身的转录产物，仅少许从母体自带的Ｍｅｆ２ｃｍＲＮＡ存在，胚体染色呈现为弥散均染状态（图２：ａ，ｂ见封二）。当胚胎逐步发育到１３ｈｐｆ，Ｍｅｆ２ｃ在体节中开始表达，此时约已形成８个体节，表现为在背侧出现两条条带状的深染部位；同时，在心脏中的表达也开始出现，在靠近头侧部出现有深染的片状区域，代表早期的生心区的细胞中有Ｍｅｆ２ｃ表达（图２：ｃｌ，ｃ２见封二）。当胚胎发育至１５ｈｐｆ时，体节以及心脏中Ｍｅｆ２ｃ的表达更加明显，Ｍｅｆ２ｃ在体节的表达表现为各个体节之间能清晰区分，并表现为典型的Ｖ型结构；同时，心脏中的表达表现为生心区细胞开始集中，逐步靠近体轴开始形成心管结构，体现出染色更为集中，由片状染色转变成为线状（图２：ｄｌ，ｄ２见封二）。随着胚胎进一步发育，体节逐步完善，心管逐步形成，Ｍｅｆ２ｃ仍然保持较高的转录水平，体节中表现为随着体节的增多，Ｖ型染色的体节也随之增多；在心脏的表达呈现出明显的线管状结构（图２：ｅ，ｆ见封 －－）。斑马鱼的胚胎发育随着时间的进展而逐步完 万方数据
第三节人的生殖和胚胎发育 典型例题一 人体发育的整个过程的起点是（） A.受精卵 B.胎儿 C.婴儿 D.卵细胞 【答案】A 【解析】睾丸能产生精子，卵巢能产生卵细胞，但他们并不是个体发育的起点，因为他们单独存在时无法发育为新个体。精子与卵细胞结合形成受精卵，由受精卵进一步发育为个体，所以个体发育的起点是从受精卵开始的。故答案为A。 典型例题二 一正常妇女摘除子宫后（） A.没有生殖能力，第二性征消退 B.没有生殖能力，第二性征不消退 C.有正常的月经，第二性征不消退 D.有生殖能力，第二性征消退 【答案】B 【解析】卵巢是女性的生殖腺和主要性器官，位于盆腔内子宫的两侧，它的作用是产生生殖细胞并分泌雌性激素；月经，又称作月经周期，是生理上的循环周期，育龄妇女每隔一个月左右，女性月经周期的形成主要是由于调控卵巢功能的上级机构（下丘脑和垂体）与卵巢之间相互作用的结果；子宫是胎儿发育的场所和形成月经的地方。此人子宫摘除，但卵巢是完好的，因此能正常排卵，但不会形成月经，也无妊娠能力，即怀孕能力。故选B。 典型例题三 正确排列下面各生理过程的顺序： A.精子上行到输卵管
B.精子经过阴道 C.发育成熟，分娩 D.进行细胞分裂，产生两个、四个…细胞 E.形成一个小胚泡 F.细胞分裂和分化形成胚胎 G.植入子宫内膜 H.精子通过子宫 I.形成受精卵 J.初具人形，成为胎儿 【答案】BHAIDEFGJC 【解析】人体生殖发育的过程是：首先是精子进入阴道，缓缓通过子宫，在输卵管内与卵细胞相遇，精子与卵细胞结合形成受精卵。受精卵不断进行分裂，逐渐发育成胚泡。胚泡缓慢地移动到子宫中，最终植入子宫内膜，这是怀孕。胚泡发育，其中的细胞开始分化成各种组织，由组织再形成各种器官、系统，逐渐发育成胚胎。胚胎进一步发育成胎儿，胎儿在母体的子宫内发育成熟，最后分娩产出新生儿。 典型例题四 “试管婴儿”和“克隆羊”都属于生物工程技术的杰出成果。下列有关这两项技术的叙述中，正确的是（） A.都属无性生殖，能保持母本性状 B.都是细胞水平的操作，属细胞工程技术范围 C.都应用了转基因技术 D.都不会产生变异 【答案】B 【解析】“试管婴儿”是由受精卵发育成的，经过了两性生殖细胞的结合过程，是有性生殖，“克隆羊”是直接由动物的体细胞繁殖的，是无性生殖，都没有利用转基因技术，有性生殖的生殖过程中会产生变异。故选B。
斑马鱼性腺促熟和早期发育模式 XXX,YYY,ZZZ 一、目的与要求： 1、掌握斑马鱼性腺促熟和产卵调控技术。 2、加深硬骨鱼早期形态发育模式的理解。 二、实验内容： （一）斑马鱼性腺促熟和产卵调控。 1、斑马鱼特性： 斑马鱼一般4月龄性成熟，5月龄鱼繁殖较好；繁殖周期短，一般7天左右。 雌雄分辨：雌性（偏银灰色，体形丰满，腹部膨大、松软，仰腹可见有明显的卵巢轮廓，手摸富有弹性）；雄性（偏柠檬色，腹部扁平，身材显得修长）。【如图一、图二】 图一：雄鱼图二：雌鱼 精、卵体外受精，体外发育，且速度快。发育速度与温度密切相关：在25℃的培养条件下，从受精卵到孵化约需36h；在28℃的培养条件下，从受精卵到孵化约需24h，即胚胎发育成熟。 2、斑马鱼繁殖准备： 将亲鱼雌、雄分开饲喂2～3天（要在饲养箱中加一玻璃隔板，将雌、雄分开，但同时相互之间又要能够看到），繁殖时将雌、雄按1：1或2∶1比例放入产卵池中进行产卵受精。在此过程中一般采用10h光照，14h黑暗的光周期。斑马鱼一般在混合的次日凌晨产卵，为防止亲鱼吞噬鱼卵，可用网孔2～3mm的网将亲鱼限制在产卵池的上半部活动，以防止亲鱼吞吃鱼卵。每条雌鱼可产卵300～1000粒。 （二）斑马鱼早期发育观察： 斑马鱼早期胚胎发育主要有以下七个时期（附有相应的时间）： （1）合子期Zygote Period(0-0.75h) （2）卵裂期Cleavage Period(0.75-2.2h) （3）囊胚期Blastula Period(2.25-5.25h) （4）原肠胚期Gastrula Period(5.3-10h) （5）体节期Segmentation Period(10-24h) （6）咽期Pharyngula Period(24-48h) （7）孵化期Hatching Period(48-72h)
斑马鱼胚胎整体原位杂交 (Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos) 北京大学遗传与发育生物学实验室 整理者：肖安版本：V6.22 Build 2006-8-17 说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。 在整个实验中应当注意： (1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止污染。操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA 在常温或37℃放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。实验间隙中RNA放置在-20℃，过夜或更长时间保存在-80℃。 (2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。避免漏加溶液。 (3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。 (4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。吸时动作要轻。任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。 (5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。 第一天 以下操作需戴乳胶手套。 1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。 1.1吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。 梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。稀释时间宁长勿短。 特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。 1.2 PBST处理5分钟，两次。 2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。 2.1用蛋白酶K的PBST溶液(在管中原有的约1mLPBST中加入1uL10mg/mL的蛋白酶K，终浓度 消化的目的是使探针更容易进入组织中。应根据胚胎质量、以前原位杂交结果适当增减时间。注意双氧水脱色的胚胎受损害较大，蛋白酶K处理时间应大大短于培育时加入PTU阻止色素生长的胚胎。 理论上换新的酶和新胚胎都应该重试处理时间。 以下操作室温进行，注意溶液预热。 2.2消化时间到后，先尽快用PBST暂时漂洗，然后PBST洗5分钟，一到两次。 在PBST洗后或下一步多聚甲醛固定后可以按照探针将胚胎分管和混合，注意同一管中的胚胎发育时期不宜相隔过近，以免最后观察结果时难以分辨。但若相隔过远，后面的染色时间可能会有很大差异，并且处于发育较早期的胚胎破裂时卵黄可能污染发育较晚期的胚胎。 每一时期每一探针需15枚左右(发育早期的胚胎在实验中容易损坏，宜多取一些)。 若做正负对照，正对照用已明确的Marker基因探针(反义RNA链)，或者对胚胎进行双染。负对照使用正义RNA链，或者不加探针(如粗略筛选时)。注意及时写上新的标签编号并记录下每个编号对应的各胚胎时期。 2.3 4%多聚甲醛(paraformaldehyde, para)固定20分钟。 提前解冻，每次实验都尽量用一管新的多聚甲醛，避免RNase污染。未使用完部分可用于固定胚胎。 用于原位杂交的胚胎都使用多聚甲醛固定。甲醛苦味酸混合液固定胚胎虽然能更好的保持形态，但将破坏胚胎抗原性，导致零结果。 2.4 PBST洗5分钟，两次。
第一胎胎停的原因 对于女性来说，只有怀过孕做过妈妈才是完整的。怀孕不管是对女性还是家人，它都是一件让人高兴的事情。不知道有没有女性朋友遇到过第一胎胎停即胚胎停育的情况。大家对此有了解多少呢，想知道第一胎胎停到底是什么，什么原因导致的，它又会有着什么样的后果。那么，下面就跟大家讲一讲有关胎停的知识。 胚胎停育是指妊娠早期胚胎因某种原因所致发育停止。B 超检查表现为妊娠囊内胎芽或胎儿形态不整，无胎心搏动，或表现为妊娠囊枯萎。“胚胎停育”不同于孕中期和孕晚期的流产，它是在胚胎尚未形成的时候就停止了发育。如果发生胚胎停育，孕母的一切妊娠反应都会逐步消失。首先是不再有恶心、呕吐等早孕反应，乳房发胀的感觉也会随之减弱。然后阴道会有出血，常为暗红色血性白带。最后还可能出现下腹疼痛，排出胚胎。上述表现因人而异，有的甚至一点迹象都没有，就直接出现腹痛，然后流产，或胚胎停育后无症状通过常规B超检查发现。 胚胎停育的原因
1、内分泌失调：胚胎着床及继续发育都依赖于复杂的内分泌系统支持，任何一个环节失常，都可导致胎停育。 2、免疫因素：因为胎儿是父母遗传物质的结合体，所以和母体不可能完全相同，免疫反应可引起母体对胎儿的排斥，如血型不合等。 3、子宫异常：由于子宫缺陷引起的胎停育约占10%～15%，常见的有：先天性子宫畸形、子宫肿瘤、宫腔粘连、宫颈异常、子宫动脉发育异常。 4、染色体异常：在胎停育中，约50%～60%的妊娠物有染色体异常，包括数量和结构异常，多数在妊娠13周内均发生流产，仅有极少数可妊娠至分娩，但都伴有严重的发育畸形或先天病。 5、全身性感染疾病：妊娠早期严重的TORCH感染可引起胎停育。TORCH包括弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒
受精到胚胎发育全过程 作者：佚名2005-2-8 受精和胚胎发育是生命的开始，每个人都要经历，但大多数人都一头雾水。心里有好多疑惑，可又不好意思问出口。那就看看这里吧！ 受精 精子 精子是男性的生殖细胞，由睾丸产生，平时就储存在睾丸和附睾里。正常男子每次射出精液2～6毫升，每毫升约有0.6～1.5亿个精子。射出的精子依靠鞭毛的摆动奋力向前游去，与等候在输卵管的卵子结合。 成熟卵泡（箭头所指处） 卵子是女性的生殖细胞，由卵巢产生并排出。女性进入生育期以后，卵巢每月会排出一个卵子，有时 可以排两个。卵子从卵巢排出后进入输卵管内，停留在输卵管的峡部与壶腹部的交界处等待受精。
性交过程 男性通过性交将精液射入女性的阴道内，精子离开精液经宫颈管进入宫腔，当精子与卵子相遇，精子通过酶的作用得以穿过卵子的外围到达卵子的表面，一当精子与卵子表面接触便开始了受精过程。到达卵子表面的精子会借助尾部的摆动而进入卵子的内部。 受精卵（箭头所指分别为精原核和卵原核） 精子和卵子各带23条染色体，受精即精子和卵子的染色体结合，这样就有了46条染色体，受精卵由单细胞分裂成两个相同的细胞，并慢慢向宫腔移动，边移动边分裂，到子宫时已成为约有48个细胞的中空团块，叫胚泡或囊胚，进行下一步的植入。 受精卵的发育与着床
卵子受精后即开始有丝分裂，并在一边分裂的同时一边向子宫腔方向移动。受精卵在输卵管内36小时后分裂为2个细胞，72小时后分裂成16个细胞，叫桑椹胚。受精后第4日，细胞团进入子宫腔，并在子宫腔内继续发育，这时，细胞已分裂成48个细胞，成为胚泡准备植入。胚泡可以分泌一种激素，帮助胚泡自己埋入子宫内膜。受精后第6-7日，胚泡开始着床。着床位置多在子宫上1/3处，植入完成意味胚胎已安置，并开始形成胎盘，孕育胎儿了。 1、受精卵 2、精原核和卵原核开始互相融合 3、受精卵开始有丝分裂 4、几近完成的有丝分裂
Sciecne：2013年突破--人体胚胎克隆终获成功咖啡因助力 Tags: 克隆胚胎来源：MedSci 历经了十几年的不断失败，科学家们终于成功了。就在今年，有科研人员宣布，他们成功克隆出了人类胚胎（human embryos），而且从这种胚胎里获得了人体胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES cells），实现了大家期盼已久的科学目标。这些ES细胞能够分化成为我们体内的任何一种人体组织，而且从遗传学角度来看，这些细胞与组织也和被克隆个体完全匹配，所以这种ES细胞不论是在科研工作中，还是在医学应用工作中都有着无限的潜力。不过毁坏胚胎所带来的伦理学问题，以及成本更低、操作更简便的新技术也有可能妨碍人体胚胎克隆技术成为一种主流的科研操作手段。 这种克隆技术的全称是“体细胞核移植技术（somatic cell nuclear transfer, SCNT）”，其实就是17年前克隆出克隆羊多莉的那种技术。科研人员们先将卵细胞（egg cell）的细胞核取出，然后将被克隆个体的细胞与这个去核的卵细胞共同孵育、融合。最后给这个融合细胞一种特定的刺激信号，促使其开始分裂，然后细胞就会按部就班地一步步变成胚胎了。科学家们已经成功地使用SCNT技术克隆过小鼠、猪、狗，以及其它多种动物，但是一直没能成功克隆出人体胚胎。经过了多年的努力（期间也出现过不少的学术造假丑闻），也只是获得过少数几个质量很差的胚胎，这些胚胎根本不能够提供合格的ES细胞。 不过在2007年，美国奥勒冈州国家灵长类动物研究中心（Oregon National Primate Research Center in Beaverton）的科研人员终于成功地克隆出了猴子的胚胎，而且从中获得了ES细胞。他们在试验过程中还发现了不少的小窍门，可以更有效地克隆灵长类动物的细胞，当然也包括人类细胞。他们总结出的这套克隆技术效果非常明显，成功率达到了10%，
HEREDITAS (Beijing) 2008年3月, 30(3): 347―351 ISSN 0253-9772 https://www.doczj.com/doc/02858285.html, 研究报告 收稿日期: 2007?09?04; 修回日期: 2007?12?21 基金项目: 江苏省属高校自然科学重大基础研究项目(编号：2007KJA36029)、江苏省青蓝工程中青年学术带头人培养项目(编号：2004)、江苏省 药用植物生物技术重点实验室课题和徐州师范大学自然科学基金重点项目(编号:07XLA09)资助[Supported by the Major Fundamental Research Program of Natural Science Foundation of Jiangsu Higher Education Institutions of China (No.2007KJA36029), Grants from Qing Lan Project of Jiangsu Province, P. R. China (No.2004), Grants from Key Laboratory of Jiangsu Province, and Grants from Key Natural Sci-ence Foundation of Xuzhou Normal University (No.07XLA09)] 作者简介:张子峰(1975?), 男, 江苏无锡人, 讲师, 硕士, 研究方向：动物分子遗传学、动物发育生物学。E-mail: zhangzifengsuper@https://www.doczj.com/doc/02858285.html, 通讯作者:郑元林(1961?), 男, 江苏泰州人, 教授, 博士, 博士生导师, 研究方向：动物分子遗传学、动物发育生物学。 E-mail: ylzheng@https://www.doczj.com/doc/02858285.html, DOI: 10.3724/SP.J.1005.2008.00347 小鼠ER β 基因片段的克隆及其在胚胎发育中的表达 张子峰1,2, 樊少华1,2, 陆军2,3, 吴冬梅2, 单群1,2, 胡斌1,2, 李飞1, 郑元林1,2 1. 徐州师范大学生命科学学院, 徐州 221116; 2. 江苏省药用植物生物技术重点实验室, 徐州 221116; 3. 东南大学基础医学院, 南京 210000 摘要：为探讨ER β在小鼠胚胎发育过程中的表达, 首先设计ER β引物并扩增ER β基因片段, 构建ER β/pGEM-3Z 重组质粒进行克隆, 分别用Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ进行酶切得到线性化DNA 片段, 以Sp6和T7聚合酶合成地高辛标记的(dig )正、反义RNA 探针。然后通过胚胎整体原位杂交技术分析ER β 在小鼠胚胎中的表达。运用该探针检测到ER β 基因在10.5 dpc 胚胎的脑、脊神经管、生殖脊、心包、肢芽及颌弓部位表达, 在13.5 dpc 胚胎的端脑、中脑、延髓、脊髓、肢芽中表达。推测ER β基因可能在小鼠胚胎性别分化过程中起调节作用; 可能在小鼠胚胎神经管的早期区域化过程中起作用并在3个原始脑泡进一步分化及脊髓的分化过程中起作用; 可能在小鼠胚胎肢芽中的骨与软骨的形成与分化中起调控作用; 可能在小鼠胚胎心脏发育过程中起作用, 可能在小鼠胚胎颌弓的表面分化过程中起调控作用。 关键词：雌激素受体β; 基因克隆; 整体原位杂交; 小鼠胚胎 Cloning of gene fragment of estrogen receptor-β and its expression in mouse embryo ZHANG Zi-Feng 1,2, FAN Shao-Hua 1,2, LU Jun 2,3, WU Dong-Mei 2, SHAN Qun 1,2, HU Bin 1,2, LI Fei 1, ZHENG Yuan-Lin 1,2 1. School of Life Science , Xuzhou Normal University , Xuzhou 221116, China ; 2. Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plants of Jiangsu Province , Xuzhou 221116, China ; 3. School of Basic Medical Science , Southeast University , Nanjing 210000, China Abstract: In order to study the expression and regulation effects of estrogen receptor-β (ER β) in the development of mouse embryo, the primer of ER β was designed, the ER β fragment was first obtained by RT-PCR and subcloned into plasmids pGEM- 3Z, then the recombinant plasmids were linearized with the restriction enzymes of Eco R Ⅰand Hin d Ⅲ. Using Sp6 and T7 RNA polymerase, the digoxigenin(dig) labeled sense and anti-sense probes were transcriped in vitro , respectively. Then the expression of ER β in mouse embryo was examined with the probes by whole-mount in situ hybridization. The results indicated that ER β is expressed in the brain, spinal neural tube, genital ridge, pericardium, limb bud and mandibular arch of 10.5 dpc embryo, and is also expressed in the telencephalon, mesencephalon, medulla oblongata, spinal cord and
胎儿在母体内10个月的生长发育过程（图文） 胎儿在母体子宫内经过10个月的生长发育，就会成为人类社会的一员。母亲要为新生命的诞生度过一段快乐而又难忘的10个月。孕妇体内胎儿发育一目了然，做母亲的不易与艰难，是一个没做过母亲的女人所不能体会的！让我们来看下孕期10月胎儿的发育过程吧！ 妊娠第一个月（第1周~第4周）： 妊娠第一个月是指孕妇从末次月经第一天算起四周以内的时间。 受孕第一周 妊娠第一个月生理特点及孕妇须知： 生理特点： 如果孕妇的月经周期为28-30天妊娠第二周末精卵结合。受精后约4天分裂成细胞团的精卵沿着输卵管到达子宫。第三周细胞团脱去外膜为着床作准备。第四周胚胞已牢固地种植入子宫里。 妊娠三至妊娠第一个月四周称为胎芽期。胎芽身上0.5-1厘米状如小海马。
孕妇须知： 在妊娠第一个月大部分孕妇没有什么反应。第一个月是神经管、四肢、眼睛开始分化时期此时一旦遇到有害物质这些组织和器官的细胞就停止发育而残缺不全出现畸形。 不要到剧院、舞厅、商店等人集聚的地方避免与患流感、风疹、传染性肝炎等患者接触。尽量不用药。病毒和药物都可能影响宝宝的发育。 远离电磁污染听音响、看电视时要保持一定的距离。尽量少用电脑、微波炉、手机等。暖气刚停的时候孕妇不要睡电热毯因为它可以产生电磁场对孕妇和胎儿存在危害。 避免饮浓茶、浓咖啡及可乐型饮料孕妇最理想的饮料是白开水。 洗衣要用肥皂不宜用洗衣粉；洗碗要选用不含有害物质的洗洁精。 你在切生肉后一定要洗手炒菜、吃涮羊肉等时一定要把肉炒熟涮透。以防生肉中的弓形体原虫感染胎儿。 淘米、洗菜不要将手直接浸入冷水中寒冷刺激有诱发流产的危险。没有热水器的家庭要买几副胶皮手套。 妊娠第一个月宝宝需要的营养并不多。不过从现在开始必须培养良好的饮食习惯不挑食不偏食保持营养平衡。 特别提示： 在医生指导下继续补充叶酸，它将最大限度地保护受精卵不发生畸形 妊娠第二个月（第5周~第8周）：
受精到胚胎发育全过程加上减数分裂从无性人体实在来不及同时进化出男女世蔚摘要自网页 作者：佚名2005-2-8 受精和胚胎发育是生命的开始，每个人都要经历，但大多数人都一头雾水。心里有好多疑惑，可又不好意思问出口。那就看看这里吧！ 受精 精子 精子是男性的生殖细胞，由睾丸产生，平时就储存在睾丸和附睾里。正常男子每次射出精液2～6毫升，每毫升约有0.6～1.5亿个精子。射出的精子依靠鞭毛的摆动奋力向前游去，与等候在输卵管的卵子结合。 成熟卵泡（箭头所指处） 卵子是女性的生殖细胞，由卵巢产生并排出。女性进入生育期以后，卵巢每月会排出一个卵子，有时 可以排两个。卵子从卵巢排出后进入输卵管内，停留在输卵管的峡部与壶腹部的交界处等待受精。
性交过程 男性通过性交将精液射入女性的阴道内，精子离开精液经宫颈管进入宫腔，当精子与卵子相遇，精子通过酶的作用得以穿过卵子的外围到达卵子的表面，一当精子与卵子表面接触便开始了受精过程。到达卵子表面的精子会借助尾部的摆动而进入卵子的内部。 受精卵（箭头所指分别为精原核和卵原核） 精子和卵子各带23条染色体，受精即精子和卵子的染色体结合，这样就有了46条染色体，受精卵由单细胞分裂成两个相同的细胞，并慢慢向宫腔移动，边移动边分裂，到子宫时已成为约有48个细胞的中空团块，叫胚泡或囊胚，进行下一步的植入。 受精卵的发育与着床
卵子受精后即开始有丝分裂，并在一边分裂的同时一边向子宫腔方向移动。受精卵在输卵管内36小时后分裂为2个细胞，72小时后分裂成16个细胞，叫桑椹胚。受精后第4日，细胞团进入子宫腔，并在子宫腔内继续发育，这时，细胞已分裂成48个细胞，成为胚泡准备植入。胚泡可以分泌一种激素，帮助胚泡自己埋入子宫内膜。受精后第6-7日，胚泡开始着床。着床位置多在子宫上1/3处，植入完成意味胚胎已安置，并开始形成胎盘，孕育胎儿了。 1、受精卵 2、精原核和卵原核开始互相融合 3、受精卵开始有丝分裂 4、几近完成的有丝分裂