2012级制药专业
工业微生物学实验报告
姓名: 刘甜甜学号: 2012304090 班级: 制药12-2班指导老师：王健
日期：2014.6.11
一、实验目的
1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。
2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。
3、了解细菌的形态特征、染色特点。
4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。
5、掌握细菌分离划线培养的方法。
6、掌握细菌的初步生化反应。
7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌K-B药敏纸片法。
二、实验内容
1 细菌Gram’s stain染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征
1.1 实验原理：染色原理：G+菌与Gˉ菌细胞壁不同，G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高，G+菌比Gˉ等电点低。
1.2 实验步骤：
1.2.1.制片：○1涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混匀，均匀涂布约1cm2大小，自然干燥；
②固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面；
1.2.2染色：①初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域；
②媒染：取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗；
③脱色：取95%酒精2~3滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗；
④复染：取1：10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水冲洗；
⑤吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥；
1.2.3 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜（100倍目镜）下。
图1：Gram’s stain（1000×）图2：染色试验
三、分离培养
1实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
2.1示教：观察普通平板、麦康凯平板、血平板、四区分离划线平板，手机摄像。
2.2 分离划线培养：
预实验：以灭菌接种环与普通平板背面做四区分离划线；
正式试验：○1以灭菌接种环取细菌少许，在普通平板上划线，划线区域约占整个平板的1/10~1/5,划线间不能有交叉现象；
○2以灭菌接种环自第一区2~3个交叉，然后依次分离划线，约占整个区域的1/3~1/4；
○3依上法进行3、4区分离划线；
○4倒置平皿置37℃温箱培养24h，观察记录实验结果，手机摄像。
图1：培养前图2：培养后
四、细菌初步生化反应：
1实验原理：具有的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
2实验步骤
2.1色素试验：取滤纸条，两次对折，以折角小心取菌落少许，小心展开，观察记录，手机拍照；
2.2 氧化酶试验：取上述含菌滤纸条，滴加氧化酶试剂一滴，观察记录，手机拍照；
2.3 触酶试验：以灭菌接种环取细菌少许，置一洁净玻片表面，另设NS对照，各加一滴新制的3%H2O2,观察记录，手机拍照；
图3：色素试验、氧化酶试验（前）图4：色素试验、氧化酶试验（后）
图5：触酶试验（前）图6：触酶试验（后）
五、细菌药敏试验：
1实验原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取平板中的水分溶解后并不断先向纸片周围扩散，形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反应测试细菌对测定药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关（抑菌圈越大，MIC越小）。
2实验步骤：
2. 1以灭菌接种环取细菌少许，与普通平板做密集划线；
2.2 以无齿镊小心夹取定量药效纸片，按六边形贴于培养及表面，倒置平皿置37℃温箱培养24h，观察记录实验结果，手机拍照。
3 实验结果：
图7：药敏培养前图8：药敏培养后
六．实验分析与讨论
1无菌操作：所有取菌种前都要将接种环灭菌，取菌时培养基也不能开太大的口，取完以后应及时盖好并放好，以防止菌种被污染。操作应当在火焰旁做。
2冷却操作：加热灭菌接种环后，应室温下冷却，否则会因高温杀死细菌。。
3接种操作时应当执笔式握接种环，轻轻触碰菌种，再接种到有生理盐水的玻片上，太少或者太多对实验都有所影响。
4染色操作：边染色边轻轻晃动以让染色剂充分覆盖菌种，冲洗时不要倾斜太大角度，不可直接对着菌落冲洗,以防把细菌冲洗下去。
5分离培养琼脂很软，划线时注意手腕用力，只在其表面划线。
6生化实验过程中细菌出现气泡说明细菌中有过氧化氢酶。用试纸取菌种注意是否取到，否则做出来是无色的。对照实验时注意菌种没有加生理盐水，而空白对照式生理盐水，触酶实验时注意及时拍照。
7药敏实验：纸片旁边出现抑菌环。贴纸片时应注意力度不要把琼脂划破。
七．实验小结
1.革兰氏染色法除了可以观察细菌形态外还可以鉴别细菌：不被酒精洗脱色保留蓝紫色的为革兰氏阳（G+），被酒精脱色复染成红色的为革兰氏阴性菌（Gˉ）可知细菌为阴性菌。本次革兰氏染色实验结果呈现为红色的棒状杆菌，细菌单个存在，染色效果非常好，实验很成功。
2.分离培养是培养单一菌种的有效方法，本次试验以小组形式呈现，每组2个平板，由于操作不熟练，细菌分布不够均匀，有部分区域细菌并未呈单个分布，培养后的·细菌形态不够漂亮，与老师相差甚远。
3.药敏试验是探究细菌在体外培养时对不同抗生素敏感性的有效试验。透明圈越大说明该药物对此细菌的抑制作用越强。
4.生化实验常用来鉴定一些形态和其他方面不易区别的微生物，是微生物分类鉴定的依据之一。触酶实验有气泡则为阳性，无气泡·则为阴性。氧化酶实验阳性变色，阴性不变色。
实验感悟
通过微生物实验的学习与操作，我认识到了微观世界的神奇与精彩，神秘而又充满危险的微生物世界让我充满了好奇感，我曾想我会为亲手将这种繁殖速度快，种类繁多，生命力顽强，无处不在的细菌，真菌培养出来而疯狂！而后我终于亲眼见证在工业微生物的课堂上培养出来的大肠杆菌！棒状的大肠杆菌充满了顽强的生命力，我为见到它而高兴！
在微生物实验过程中，我们还学习到了显微镜的用法，虽然在高中时我们便已学过显微镜的用法，但早已忘却，我用显微镜观察到了呈现红色的棒状大肠杆菌。革兰氏染色实验中我意识到了实验严谨性的重要性，取菌时需要无菌操作，只能用大拇指顶开皿盖一个小口，接种环需要用酒精灯不断高温灭菌，冷却，取菌时动作需小心，否则取到的只会是琼脂，实验宣告失败。染色也应小心谨慎，时间必须控制在30〃~40〃，否则染色效果可能不明显。
这个实验对于我们制药工程的学生来说是一次难得的体验，这对于我们以后药学实验的研究奠定了一个良好的基础，同时微生物学实验使我们的眼界开阔，让我意识到微生物制药这个前景很好的研究方向，微生物与生化药学一直广受推崇，这也是一个新新的研究方向，想从事学术研究的同学可以考虑。
微生物学老师很认真负责，这也让我们受益匪浅，王老师教会我们很多微生物学知识，同时也教会我们实验室安全知识，并且努力让我们有机会去医学院实验室学习体验这个实验。
我喜欢微生物学，也希望能有更多的机会接触其他的微生物，美丽又变化莫测的微生物界就这样走进了我的心里！
图7：药敏培养前
图8：药敏培养后
图1：Gram ’s stain （1000×） 图2：染色试验
图3：色素试验、氧化酶试验（前） 图4：色素试验、氧化酶试验（后）
图5：触酶试验（前） 图6：触酶试验（后）