健康人群IL-1α启动子(-889位点)基因
多态性与血脂水平的关系
黄 鹤1 李 艳2 徐 朴2 张平安2 李庚山1
1武汉大学人民医院心内科 武汉 430060
2武汉大学人民医院检验科 武汉 430060
摘要 目的:探讨白细胞介素-1α(IL-1α)基因多态性与健康人群血脂水平的关系。方法:应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法检测184例湖北地区汉族健康人群IL-1α(-889位点)基因多态性,同时检测血脂水平并进行比较。结果:健康人群血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C、apo A
1
、apo B)水平在IL-1α(-889位点)不同基因型间差异无显著性(P>0.05)。结论:湖北地区汉族健康人群IL-1α(-889位点)基因多态性与血脂水平间无相关性。
关键词 白细胞介素-1;基因;多态现象;脂蛋白
中图分类号 R363.2+5
白细胞介素-1α(interleukin1,IL-1)是一个重要的前炎症细胞因子,具有广泛的生物学作用,它不仅参与炎症和免疫反应,还参与脂类物质代谢[1,2]。IL-1α是IL-1家族中的一员,其编码基因(IL-1A)位于人类2号染色体的长臂上,在其启动子区域-889位点存在一个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),由C※T转换所引起,可引起IL-1表达水平的差异[3]。笔者应用PCR-RFLP的技术,分析了湖北地区汉族健康人群IL-1α(-889位点)基因多态性的分布,并探讨健康人群IL-1α(-889位点)基因多态性与血脂之间的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象 中国湖北地区184名体检健康者,其中男113名,女71名,年龄13～82岁,平均年龄(43.0±13.2)岁,均为汉族(无血缘关系),排除肝脏、肾脏、内分泌和心脑血管疾病。取空腹12h静脉血和EDTA-K3抗凝血。
1.2 研究方法
1.2.1 标本采集 禁食12h以上,空腹取不抗凝静脉血2ml,分离血清,置-20℃冻存,用于检测血脂;另取静脉血2ml,EDTA-K3抗凝,参照改良碘化钠法[4],提取白细胞基因组DNA,置-20℃冻存,用于检测IL-1α(-889位点)基因多态性。
1.2.2 IL-1α(-889位点)基因多态性分析 IL-1α(-889)位点基因SNP检测采用的PCR引物(大连宝生物工程有限公司合成)[5]:正引物5'-AAGCTTGTTC-TACC ACCTGAAC TAGGC-3',负引物5'-TTAC ATAT-GAGCCTTCC ATG-3'。PCR反应体系为25μl,TaqDNA 聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)为Promega产品,变性、退火和延伸条件分别为94℃1min,48℃1min,72℃1min,30个循环(美国PE公司GeneAmp PCR System2700扩增仪)。IL-1α(-889)目的基因扩增片段长度为104bp,经限制性内切酶Nc oⅠ酶切后产生88bp和16bp两条片段,即存在酶切位点者为等位基因C;若PCR产物未被切开,则仍为一条片段(104bp),即酶切位点变异者为等位基因T。PCR 扩增产物和酶切产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)-溴化乙锭染色法检测,紫外灯下鉴定结果,并用法国VL自动凝胶成像及分析系统进行成像和分析。
1.2.3 血脂、脂蛋白及载脂蛋白水平测定 酶法测定血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG);遮蔽法直接测定高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C);apoA1、apoB用双波长免疫透射比浊
第24卷 第2期武汉大学学报(医学版)Vol.24,No.2 2003年4月M edical Journal of Wuhan Univers ity Apr,2003
作者简介:黄鹤,男,1978～,医学硕士生,主要从事感染与冠心病的研究
通讯作者:李艳,女,1961～,医学硕士,教授,主要从事感染与冠心病的研究
法测定。以上测定均在Olympus1000型全自动生化分析仪(美国)上进行,每次测定均选用高、中、低3种质控样品进行质控分析。
1.3 统计学处理 计算出正常人群IL-1α(-889位点)等位基因频率,然后经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验,表明各等位基因频率已达到遗传平衡,具有群体代表性。不同性别间IL-1α(-889位点)等位基因及基因型频率的比较用χ2检验;血脂水平数据均以x±s表示,不同基因型间血脂、脂蛋白及载脂蛋白水平的比较采用两样本t检验。
2 结果2.1 中国湖北地区汉族健康人群IL-1α(-889位点)基因多态性的分布 用PCR-R FLP方法对184名中国湖北地区汉族健康人群进行IL-1α(-889位点)基因多态性研究,结果发现3种基因型:即CC基因型(88bp、16bp两条带);TT基因型(仅有104bp一条带);CT基因型(88bp、16bp、104bp3条带)。IL-1α(-889位点)基因型频率以CC纯合子型最多见,CT杂合子型次之,TT纯合子型最为罕见;IL-1α(-889位点)等位基因频率的分布以C等位基因最为多见,其次为T等位基因。这种分布在不同性别之间差异不显著(P>0.05),见表1。
表1 中国湖北地区汉族健康人群不同性别间IL-1α(-889位点)基因多态性的分布
性别n
基因型频率(%)
CC CT TT
等位基因频率(%)
C T
男11397(85.8)16(14.2)0(0.0)210(92.9)16(7.1)女7160(84.5)10(14.1)1(1.4)130(91.5)12(8.5)合计184157(85.3)26(14.1)1(0.6)340(92.4)28(7.6)
2.2 IL-1α(-889位点)不同基因型间血脂、脂蛋白和载脂蛋白水平比较 经对IL-1α(-889位点)不同基因型间血脂水平的比较发现,血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、apo A1、apo B的水平在不同基因型间并无显著性差异(P>0.05),见表2。
表2 IL-1α(-889位点)不同基因型间血脂水平比较(x±s)
基因型n TC TG HDL-C LDL-C apo A
1
apo B CC1574.41±0.701.16±0.491.43±0.292.39±0.691.40±0.220.88±0.21 CT264.46±0.521.17±0.371.52±0.402.51±0.251.49±0.260.84±0.18 P>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05
3 讨论
IL-1α(-889位点)存在基因多态性,而且该基因多态性可引起IL-1表达水平的差异[3]。因此,正确分析和阐述其基因多态性在不同种族和地域健康人群中的分布特点,有利于进一步探讨IL-1α与疾病的相关性。本文利用PCR-RFLP的方法探讨了我国湖北地区汉族健康人群中IL-1α(-889位点)基因多态性的分布情况,结果发现,IL-1α(-889位点)基因型以CC纯合子型最为多见,CT杂合子型次之,TT纯合子型最为罕见,其发生频率依次为85.3%,14.1%, 0.6%。
IL-1除参与炎症和免疫反应外,还可参与脂类物质代谢。Khovidhunkit[6]等研究发现,IL-1能降低肝脏B类Ⅰ型清道夫受体水平,进而降低胆固醇酯进入肝细胞的量,从而影响胆固醇的逆运输。Feingold[2]等通过体外实验证明,IL-1还可使肝脂酶mRNA和肝脂酶水平降低,进而影响富含甘油三酯的脂蛋白颗粒的清除,并导致富含甘油三酯的高密度脂蛋白水平的升高。因此,IL-1α(-889位点)基因多态性可能会影响脂类物质代谢,进而影响一些与脂类物质代谢有关疾病的发生、发展和治愈。
通过分析IL-1α(-889位点)不同基因型间血脂水平发现,湖北地区汉族健康人群血脂水平与IL-1α(-889位点)基因多态性间无相关性(P>0.05)。对该现象的可能解释是:IL-1不是影响脂类物质代谢的唯一因素,IL-1α(-889)位点基因多态性对IL-1表达水平的影响不足以独立引起健康人群血脂水平的显著性改变。
然而,在病理状况下,由于多种因素的影响,IL-1α(-889位点)基因多态性对IL-1表达水平的影响是否会影响血脂水平的显著性改变,尚值得进一步研
100武汉大学学报(医学版)第24卷
究。本研究为进一步研究IL -1α(-889位点)基因多态性与疾病的关系打下了一定的基础。
参考文献
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(2002-09-23收稿)
The Relationship Between the Gene Polymorphism of Interleukin -1Alpha (-889)and the Plasma Lipoprotein Level in Healthy Population
Huang He ,Li Yan ,Xu Pu ,et al
Department of Cardiology ,Renmin Hospital ,Wuhan University ,W uhan 430060,China
A bstract
Objective :To detect the relationship between the gene polymorphism of interleukin -1alpha and the plasma lipopro -tein level in healthy population .Methods :The gene polymorphism at the position -889in the promoter of interleukin (IL )-1alpha was analyzed by a combination polymerase chain reaction -restriction fragment length polymorphism (PCR -RFLP ),and the plasma lipoprotein level was inspected in 184healthy Chinese Han Population of Hubei simultaneously .Results :The plasma lipoprotein level ,including TC ,TG ,HDL -C ,LDL -C ,apoA 1,and apoB ,was not significantly differ -ent a mong different genotypes of IL -1alpha (-889).Conclusion :There is no relationship between the gene polymor -phism of IL -1alpha (-889)and the plasma lipopr otein level in healthy Chinese Han Population of Hubei .
Key Words interleukin -1;gene ;polymorphism ;lipoprotein
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第2期黄 鹤,等.健康人群IL -1α启动子(-889位点)基因多态性与血脂水平的关系
药物代谢酶基因多态性简介 代谢酶基因多态性是指由于编码代谢酶的DNA序列的单核苷酸多态性等可遗传变异，导致的不同种群之间代谢酶的底物特异性无变化，但是代谢酶的活性存在显著的差别的现象。由此可能造成个体间PK和药物反应的差异，进而造成不必要的治疗失败和毒副作用。单核苷酸多态性（SNPs）存在于Ⅰ相代谢酶、Ⅱ代谢酶和转运体等多个方面，其中临床影响较大的为CYP450酶的基因多态性，因此了解不同人群代谢酶活性的差异有助于理解种群间PK差异和实现个性化治疗。SNPs存在于许多亚型的代谢酶中，Sarah等人的研究结果显示如下图，其中高加索人种中CYP2D6多态性的频率最高，其次为CYP2A6和2B6。但是并非所有的CYPs均参与药物代谢，既存在较高频率的多态性，又与药物代谢相关的为CYP1A2, 2D6, 2C9和2C19，其中CYP2D6与多数药物的代谢相关,下文将以CYP2D6为代表阐述其进化特征、功能多样性和临床影响等相关内容。 CYP2D6是由497个氨基酸组成的多肽，其对生物碱类物质具有较高的亲和力，该酶不可被环境因素调控且不能被诱导。最早CYP2D6的多态性是由
于个体间PK差异引起人们注意的，而后随着生物技术手段的提升才逐渐揭开其遗传基础。CYP2D6位于染色体22q13.1上，其邻近包含两个假基因CYP2D7和CYP2D8。至今发现了几十种CYP2D6的等位基因，大多数编码有缺陷的基因产物，最常见的突变型等位基因分布于不同种群中，如CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10和CYP2D6*17等，详细见下图，其可分为彻底失活、活性降低、正常、活性增加和活性本质上的改变五大类，在不同种群中分布特点有明显的差异。亚洲人群最常见的CYP2D6*10，其发生了P34S的有害突变导致了P450折叠功能的丧失而造成不稳定性，且降低了底物的亲和力。非洲人群中常见突变体为CYP2D6*17发生的错义突变导致其活性位点结构发生改变，由此造成底物特异性发生改变，且其活性低于野生型。 如下图演示了CYP2D的演变规律，啮齿动物与人的活性CYP2D基因的数量存在巨大的差异，小鼠有9个不同的活性基因，而人只有1个，且7%的高加索人群缺失该活性基因。由于CYP2D6对于生物碱类的生物毒素具有高亲和力，进化角度可以认为小鼠需要保留较多的活性基因来维持解毒能力，而人类的饮食结构更为严谨进而逐渐不需要更多的活性基因。 不同人群中的CYP2D6的代谢活性可分为超快代谢（ultrarapid metabolizers, UMs）、快代谢（extensive metabolizers, EMs）、中等代谢（intermediate metabolizers， IMs）和慢代谢（poormetabolizers, PMs）四种类型。一般而言，白人种PMs的频率较高约为10%左右，而亚洲人群中
. 人基因多态性分析 一、实验目的 1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。 2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。 二、实验原理 基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 三、器材与试剂 1. 器材 ⑴离心机。 ⑵DNA扩增仪。 ⑶电泳仪。 ⑷水平电泳槽。 ⑸紫外检测仪。 ⑹移液器。 2. 试剂 . . ⑴口腔拭子DNA抽提试剂盒。 ⑵琼脂糖。 ⑶1×TAE电泳缓冲液：980ml蒸馏水中加入50×TAE母液20ml。 ⑷50×TAE母液：Tris 121g，0.5M EDTA（pH8.0）50ml，冰醋酸28.55ml，定容至500ml。
ALDH2基因多态性检测 项目简介：ALDH ( aldehyde dehydrogenase gene ) 人类乙醛脱氢酶，是一种四 联体蛋白，催化乙醛和其他脂肪族醛氧化。目前已发现ALDH 有19 种同工酶，主要有ALDH1～4 四种，其中ALDH2最为重要。在肝和胃中具有很高的表达量，是乙醇代谢途径中最重要的酶之一。ALDH2基因位于人类第12号染色体，由于ALDH2 基因存在G1510A 多态性，导致氨基酸序列第487位上的谷氨酸被赖氨酸所替换( Glu487 Lys)，其中具有催化活性的野生型称为G等位基因(ALDH2*1)，催化能力失活的变异型称为 A 等位基因(ALDH2*2)。在亚洲的黄种人群中， ALDH2*2是频率最高且最重要的突变型。 临床用药医生应考虑的因素： ALDH2基因突变致乙醛脱氢酶活性下降引起的临床表现： 1、ALDH2与硝酸甘油治疗：硝酸甘油是治疗心绞痛的经典药物，研究发现硝酸甘油的舒血管作用是通过释放一氧化氮（NO）所介导。但临床上部分病人舌下含服硝酸甘油不能迅速有效地缓解心绞痛，使心肌严重缺血加重。近来发现， ALDH2与硝酸甘油转化为NO密
切相关。有研究表明，ALDH2*1基因型的患者硝酸甘油治疗心绞痛的疗效明显优于ALDH2*2患者，且前者迅速起效率也明显高于后者。 2、ALDH2与酒精性疾病：乙醛脱氢酶( aldehyde dehydrogenase, ALDH)和乙醇脱氢酶( alcohol dehydrogenase, ADH) 在人体内共同组成了人乙醇脱氢酶系, 负责催化人体的乙醇分解代谢。ALDH2在肝和胃中具有很高的表达量，是乙醇代谢途径中最重要的酶之一。研究发现，突变型基因ALDH2*2的存在能导致ALDH2活力的严重缺失，并与过度饮酒导致的酒精依赖、酒精性中毒、酒精性肝病、消化道癌症等疾病之间存在深刻的联系。过度的饮酒行为，不仅使ALDH2*2 携带者对酒精产生依赖，还可能引起肝癌等的酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)。ALD是长期、大量饮酒所引起的肝脏病变，已成为现代社会的主要健康隐忧之一。研究显示，携带ALDH2 变异基因型者大量饮酒将显著增加患肝癌的危险性。虽然摄入人体的乙醇有90 %以上是在肝脏内完成代谢过程的，但其在摄入过程中与消化道上皮细胞的直接接触也不容忽视。在饮酒人群中，尤其是重度饮酒者，由于其上消化道长期地与大量酒精直接接触，该区域出现癌变(食道癌、口咽癌等)的几率较高。研究发现，ALDH2*2突变与饮酒人群患消化道癌的风险之间具有明显的联系。此外，ALDH2*2显性突变与胃癌的易感性也存在一定的联系。由此可见，ALDH2*2突变是增加区域性癌化几率的重要因素之一。 ALDH2基因多态性检测标本采集及出报告时间：病人抽静脉血2ml（用 EDTA-K2抗凝）送检验科分子生物诊断室，4个工作日出报告。 电话：8801063 手机：余宗涛65327 高波 64444 ALDH2基因多态性检测临床意义： 1、指导临床硝酸甘油的个体化差异用药剂量：虽然硝酸甘油是心绞痛急性发作的常规首选药物，但该药的临床疗效常因人而异。中国汉族人群中，硝酸甘油含服无效的比例高达25%以上。复旦大学、瑞金医院、华山医院等的一项研究显示：部分国人服用硝酸甘油治疗心绞痛无效的原因为线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因发生突变。ALDH2*2携带者服用硝酸甘油无效风险大幅增加；ALDH2*2携带者在中国约占30-50%，比重大；建议患者在使用硝酸甘油前进行ALDH2基因检测，ALDH2*2携带者建议慎用或不用硝酸甘油，改用其它药物。 2、ALDH2与酒精代谢：①ALDH2异常的饮酒者与正常人群相比，其发生肝癌的风险是正常人的3倍以上；②乙肝病毒携带者，如果又正好是ALDH2异常，其饮酒发生肝癌的危险性将升高52.17倍；③持续的过量饮酒导致肾的代谢压力过大，残留的酒精附着在肾细胞上，致使大量肾细胞处于休眠状态，会导致肾功能下降。 3、ALDH2与消化系统疾病：ALDH2异常的饮酒者与正常人群相比，其发生食道癌的风险是正常人的12.95倍，出现口腔癌的风险则为11.72倍。 4、ALDH2与心血管系统疾病：ALDH2异常的冠心病患者，发生心肌梗死的相对风险也为ALDH2正常的3.42倍。 5、ALDH2与内分泌系统疾病：ALDH2异常的人发生II型糖尿病的风险是正常人的6.08倍。
如何用PCR法检测基因的多态性 多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA 位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longth polymorphism)。 基因多态性的主要检测方法简述如下： 1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变， 用限制酶切割基因组时， 钠 问 亢兔扛銎 蔚某ざ染筒煌 此 降南拗菩云 纬ざ榷嗵 裕 贾孪拗破 纬ざ确⑸ 谋涞拿盖形坏悖 殖莆 嗵 晕坏恪W钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。 2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。 3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。 4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素
基因多态性的检测方法 多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longth polymorphism)。 基因多态性的主要检测方法简述如下： 1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性，导致限制片段长度发生改变的酶切位点，又称为多态性位点。最早是用Southern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。 2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。 3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。 4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行
基因多态性 多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦称遗传多态性（genetic polymorphism）或基因多态性。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。 基因多态性分类生物群体基因多态性现象十分普遍，其中，人类基因的结构、表达和功能，研究比较深入。人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异，以及双等位基因的转换或替换。按引起关注和研究的先后，通常分为3大类：DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性、单核苷酸多态性。 DNA片段长度多态性DNA片段长度多态性（FLP），即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化。又称限制性片段长度多态性，这是一类比较普遍的多态性。 DNA重复序列多态性DNA重复序列的多态性（RSP），特别是短串联重复序列，如小卫星DNA和微卫星DNA，主要表现于重复序列拷贝数的变异。小卫星（minisatellite）DNA由15~65bp的基本单位串联而成，总长通常不超过20kb，重复次数在人群中是高度变异的。这种可变数目串联重复序列（VNTR）决定了小卫星DNA长度的多态性。微卫星（microsatellite）DNA 的基本序列只有1~8bp，而且通常只重复10~60次。 单核苷酸多态性单核苷酸多态性（SNP），即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，在CG序列上频繁出现。这是目前倍受关注的一类多态性。 SNP通常是一种双等位基因的（biallelic），或二态的变异。SNP大多数为转换，作为一种碱基的替换，在基因组中数量巨大，分布频密，而且其检测易于自动化和批量化，因而被认为是新一代的遗传标记。 遗传背景知识遗传和变异各种生物都能通过生殖产生子代，子代和亲代之间，不论在形态构造或生理功能的特点上都很相似，这种现象称为遗传（heredity）。但是，亲代和子代之间，子代的各个体之间不会完全相同，总会有所差异，这种现象叫变异（variation）。遗传和变异是生命的特征。遗传和变异的现象是多样而复杂的，正因为如此，才导致生物界的多种多样性。
药物基因组学 PART 01 药物基因组学 一、药物基因组学 药物基因组学：是研究人类基因变异和药物反应的关系，利用基因组学信息解答不同个体对同一药物反应存在差异的原因。 基因组（genome）：是指生物体单倍细胞中一套完整的遗传物质，包括所有的基因和基因间区域（即编码区和非编码区）。 人类基因组计划是由序列（结构）基因组学向功能基因组学的转移。开启了人类的“后基因组时代”。 后基因组时代研究的重要方向： 功能基因组学 比较基因组学 结构基因组学 蛋白质组学 药物基因组学 …… PART 02 基因多态性 二、基因多态性 基因多态性是指在一个生物群体中，呈不连续多峰曲线分布的一个或多个等位基因发生突变而产生的遗传变异。 CYP450酶超大家族 共涉及1000种药物的代谢（拓展） 12种亚型：CYP1、CYP2、CYP3…… 15个亚家族：A～Q 如：CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A5等 药物转运蛋白－MDR1（多药耐药基因）（拓展） 调控许多药物吸收、分布和排泄过程 与胆红素、抗癌化疗药物、强心苷、免疫抑制剂、糖皮质激素、HIVⅠ型蛋白抑制剂有关 药物靶蛋白－ADRB2 编码人β2肾上腺受体 人类白血球抗原－HLA－B HLA－B变异，将引起某些药物的严重皮肤反应 内容： 1.药物代谢酶的多态性 同一基因位点上具有多个等位基因引起，其多态性决定表型多态性和药物代谢酶的活性，造成不同个体间药物代谢反应的差异。是产生药物毒副作用、降低或丧失药效的主要原因之一。 细胞色素P450酶（CYP）是药物代谢的主要酶系。在细胞色素P450的亚群中，CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19对许多药物的效应非常重要。（拓展） 例： 奥美拉唑、兰索拉唑和泮托拉唑等质子泵抑制剂由P450酶代谢，主要由CYP2C19，部分由CYP3A4代谢。 因此，CYP2C19的基因多态性会影响质子泵抑制剂的药动学，从而影响后者治疗相关疾病的临床效果。 艾司奥美拉唑仅经CYP3A4代谢。 2.药物转运蛋白 在药物的吸收、排泄、分布、转运等方面起重要作用，其变异对药物吸收和消除具有重要意义。
人基因多态性分析 一、实验目的 1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。 2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。 二、实验原理 基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 三、器材与试剂 1. 器材 ⑴离心机。 ⑵DNA扩增仪。 ⑶电泳仪。 ⑷水平电泳槽。 ⑸紫外检测仪。 ⑹移液器。 2. 试剂
1定义： 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。理论
应用TaqMan探针技术检测MTHFR基因的C677T和A1298C多态 性 目的探讨一种快速、准确运用于临床检测MTHFR基因多态性的方法。方法提取43例胃癌患者的外周血基因组DNA，用TaqMan探针技术对MTHFR 基因的C677T和A1298C两个多态性位点进行分型，并采用直接测序法对TaqMan探针分型结果进行验证。结果43例样本的MTHFR C677T基因型分别为14例CC、23例CT和6例TT；A1298C基因型为24例AA、18例AC、1例CC，两种分型方法结果一致。结论本研究选用的TaqMan探针分型方法结果准确可靠，能够用于MTHFR的C677T和A1298C两个多态性位点分析。 标签：TaqMan探针；MTHFR；多态性；DNA测序；胃癌 胃癌（Gastric cancer）是世界范围内的高发肿瘤之一[1]。近年研究表明，低叶酸水平可增加包括胃癌在内的许多肿瘤发生的危险性[2]。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢途径中的一关键酶，MTHFR参与的体内同型半胱氨酸（Hcy）和甲硫氨酸之间的循环反应，反应中生成的S腺苷甲硫氨酸（SAM）是体内代谢唯一的甲基供体，涉及DNA 的修复与合成，影响DNA代谢，与许多肿瘤化疗药物的疗效相关。 MTHFR的活性很大程度上可能受基因多态性的影响，从而影响疾病的发生和药物的疗效。MTHFR基因C677T和A1298C为两个常见的多态性位点，有研究表明该位点的基因多态性会导致MTHFR酶活性的改变[3]，可能导致患者之间出现较大的个体差异。因此，测定MTHFR的基因型对疾病的预防和合理用药有重要的意义。现已有的MTHFR基因多态性的研究，大多数采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术，该技术不仅费时，且易污染造成假阳性。不适宜用于临床检测。本研究旨在探讨一种可用于临床快速准确检测MTHFR基因型的方法，故选用TaqMan探针技术对MTHFR的C677T和A1298C 两个多态性位点进行分型。 1资料与方法 1.1一般资料经CT、MRI或病理组织学活检确诊的胃癌患者43例，来源于昆明医科大学第一附属医院，收集样本人群的外周静脉血2 mL。采用Genomic DNA Purification Kit（PROMEGA公司）对基因组DNA进行提取，使用Nanodrop 2000测定DNA的浓度和纯度。 1.2 TaqMan探针技术检测MTHFR基因C677T和A1298C位点的多态性TaqMan探针试剂由ABI公司为MTHFR基因C677T（SNP ID：rs1801133），A1298C（SNP ID：rs1801131）多态性设计的TaqMan SNP分析试剂，每个位点的TaqMan SNP基因分型试剂中，含有两条MGB探针。MTHFR C677T一条以VIC荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基A，
2003 年 Kripp l等[ 1 ]报道VEGF 936 C等位基因携带者患乳 腺癌的危险性降低, 1 Kripp l P, LangsenlehnerU, RennerW, et al. A common 936 C /T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor is associated with decreased breast cancer risk. Int J Cancer, 2003, 106: 4682 471. 我们进行了一系列的生长因子基因多态性与结 直肠癌关系的研究,已经发现VEGF 61 G/G基因型 和G等位基因与结直肠癌的发生有关[ 9 ] 。VEGF 936 T/C 基因多态性与结直肠癌关系的研究表明 VEGF 936 C /C基因型或936 C等位基因与结直肠 癌的生成无关,但有助于减少术后结肠吻合口瘘的 发生。含有VEGF 936 T基因的结直肠癌患者术后 并发吻合口瘘的机会增加,或许VEGF 936 T基因 可作为检测结直肠癌或预测结直肠癌术后并发吻合 口瘘的一个危险因素,但这需要进一步的研究。同 时观察这一基因多态性在其他伤口愈合并发症中的 作用也将很有意义。 血管内皮生长因子936 T/C基因多态性 与结直肠癌及术后吻合口瘘的关系 吴国洋王效民Michael Keese Till Hasenberg JêrgW. Sturm 血管内皮生长因子基因多态性与肺癌危险度的关系 Lee SJ , Lee SY, Jeon HS, et al/ / Cancer Ep idemiol Biomarkers Prev, 2005, 14: 571 - 575 背景和目的:血管生成是包括肺癌在内的恶性肿瘤发 生、发展和转移中的一个重要过程。血管内皮生长因子基 因( vascular endothelial growth factor, VEGF)变异可以导致 其编码蛋白的产量和活性的改变,通过作用于肿瘤的血管 生成过程,从而引发个体对肺癌易感性的差异。为了检验 这一假设,作者研究了韩国人VEGF基因的3个单核苷酸多 态性( - 460T >C、+ 405C > G和936C > T)及其单倍型和肺 癌危险度之间的关系。方法:研究对象包括432名肺癌患者 和432名年龄和性别匹配的对照。运用贝叶斯定理构建单 体型。采用logistic回归校正相关协变量计算OR值。结果: 在+ 405位点,与CC和CG基因型比较, GG基因型个体小 细胞肺癌危险度显著降低,调整OR 值为0136, 95%可信限 为0117～0178; 936位点变异基因型(CT和CT + TT)个体较 野生基因型(CC)个体小细胞肺癌的危险度降低,调整OR 值分别为0147和0144, 95%可信限分别为0126～0185和 0124～0180。CGT单体型与小细胞肺癌的危险度降低相关, 调整OR值为0139, 95%可信限为0118～0187;而TCC与小 细胞肺癌的危险度增加相关,调整OR 值为1163, 95%可信 限为1114～2133。上述多态性对小细胞肺癌以外的肺癌类 型的危险度没有影响。单体型TCT和TGT与整体肺癌危险 度相关,调整OR值分别为0138和3194, 95%可信限分别为 0125～0160和2100～7176, TCT和TGT单体型的这种作用 在3种主要的肺癌组织类型中均有发现。结论: VEGF基因 多态性与个体肺癌遗传易感性有关。 (冷曙光) Objectives: Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potent stimulus
CYP2C19基因多态性检测 项目简介：CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢 酶，在肝脏中有很多表达。CYP2C19基因座位于染色体区10q24.2上，由9个外显子构成。CYP2C19具有很多SNP位点，最常见的是CYP2C19*2和CYP2C19*3。CYP2C19*2会导致转录蛋白的剪切突变失活，而CYP2C19*3能构成一个终止子，破坏转录蛋白的活性。据统计，CYP2C19*2和CYP2C19*3两个突变位点能解释几乎100%的东亚人和85%的高加索人种的相关弱代谢遗传缺陷，而其他两种等位基因CYP2C19*4和CYP2C19*5主要在高加索人种中分布。大量证据证实，不同人种在CYP2C19的底物的代谢能力有很大差异；2–5%高加索人是弱代谢者，而13–23%的亚洲人是弱代谢者。这是由于在亚洲人口中CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因的高频率造成的。通过CYP2C19基因检测，判断患者对相关药物的代谢能力，可以指导临床用方案的制定，实现个体化用药治疗。 临床上常用的经由CYP2C19酶代谢的药物： 1、治疗胃酸相关性疾病：如质子泵抑制剂：奥美拉唑（omeprazole）、兰索拉唑（lansoprazole）、泮托拉唑（pantoprazole）、 雷贝拉唑（rabeprazole）、埃索美拉唑 （Esomeprazole）。 2、治疗心血管疾病：Clopidogrel、氯吡格雷、抗凝血药物。 3、抗真菌药物：Voriconazole、伏立康唑、广谱抗真菌药物。 4、神经类药物：①S-美芬妥英mephenytoin为乙内酰脲类抗癫痫药，在体内的羟化代谢主要由单基因CYP2C19编码表达的CYP2C19酶蛋白介导，由羟化酶CYP2C19氧化生成4’-羟基美芬妥英；②地西泮diazepam，一种长效的镇静、安眠药；③丙米嗪imipramine ，抗抑郁药，N-去甲基化和2-羟化；④苯巴比妥phenobarbital，传统的抗癫痫药；⑤抗心律失常药,抗抑郁药,抗精神病药，β受体阻断剂,抗高血压药和止痛剂。 5、抗肿瘤药：环磷酰胺。 6、抗结核药：利福平。 7、孕激素：黄体酮。 8、抗疟疾药：氯胍。 9、HIV蛋白酶抑制剂。 10、抗移植排斥药物：他克莫司、兰索拉唑。 CYP2C19基因多态性检测标本采集及出报告时间：病人抽静脉血2ml（用 EDTA-K2抗凝）送检验科分子生物诊断室，4个工作日出报告。 电话：8801063 手机：余宗涛65327 高波 64444 CYP2C19基因多态性检测临床意义： 1、基因剂量效应。 2、CYP2C19基因多态性，导致了个体间酶活性的多样性。等位基因的突变使酶活性降低，对药物代谢的能力随着等位基因的不同组合而呈现出一定的规律性，表现出正常基因纯合子>正常基因与突变基因杂合子> 突变基因纯合子或杂合子的变化趋势。 3、对于不同代谢能力的个体，运用不同的药物剂量等策略是非常必要的，可达到更好的治疗效果。 4、根据CYP2C19基因型给予个性化的药物和剂量可以降低副作用发生率-安全性；提高治
检测基因多态性的方法 一种用于快速检测基因多态性的方法，具有如下特征：(a)根据所测样本靶序列设计两对引物，其中一对为锚定引物；(b)将上述两对引物及一个与锚定引物的锚定部分序列相同的引物加入到含有底物及其它PCR扩增反应试剂的溶液中，进行PCR扩增反应；(c)以适当的方法检测扩增产物中链长不同的DNA片断；(d)根据反应产物中DNA片断的多少及其长短判断基因多态性的类型。本发明涉及一种基因多态性检测方法，可用于单碱基多态性、基因突变、单碱基插入或缺失、微卫星分析等。本方法是首先设计两对引物，其中一对为通常PCR引物，用于扩增含有基因多态性位点的DNA片段；另一对为锚定引物，用于判断基因多态性的类型。再将上述两对引物及一个与锚定引物的锚定部分序列相同的引物加入到含有底物及其它PCR扩增反应试剂的溶液中，在单管中进行PCR扩增反应，并使扩增反应产生与基因多态性相对应的DNA扩增产物，然后以凝胶电泳法、或毛细管电泳法、或微流控芯片法，或高效液相色谱法等分离技术检测，根据扩增产物中DNA片段的多少及链长判断基因多态性的类型。为提高延伸反应的特异性，在锚定引物的3’端区域人为地引入一个与模板不互补的碱基。 用于检测遗传多态性的方法，包括：生成寡核苷酸探针和／或寡核苷酸引物，使得该寡核苷酸探针和／或引物包含在编码受体的基因或与其互补的序列中存在的多态位点，或者，当编码受体的所述基因和与其互补的所述序列至少其中之一得到扩增时，使得多态位点包含在扩增片段中；并使用由此生成的寡核苷酸探针和／或寡核苷酸引物检测编码靶受体的基因中的至少一种遗传多态性。 多态性是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因的多态性。这种多态性可以分为两类，即DNA 位点多态性和长度多态性。 基因多态性的主要检测方法： 1，限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）:由DNA的多态性，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。 2，单链构象多态性：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。 3，PCR-ASO探针法：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。 4，PCR-SSO法：原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。 5，PCR-SSP法：SSP（序列特异性引物）只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的。 6，PCR-荧光法： 7，PCR-DNA测序：是诊断未知突变基因最直接的方法。 8，PCR指纹图法：实用于快速的同种异性DR/DW配型。 9，基因芯片法：又称为DNA微探针阵列。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针，通过与被标记的若干靶核苷酸序列互不匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图像，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图像，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹
氯吡格雷是一种前体药物，本身无抗血小板作用，需要经过细胞色素P450将其转化为活性代谢产物才能实现其血小板抑制效应。部分患者在长期服用氯吡格雷后，血小板活性未得到有效控制导致严重支架内血栓形成、再发心肌梗死等不良心血管事件发生，临床上称这种现象为氯吡格雷抵抗。CYP2C19是氯吡格雷活性代谢产物生成过程中的主要酶，而CYP2C19基因多态性是导致氯吡格雷抵抗的最重要的因素[1]。 2010 年3 月, 美国食品药品监督管理局(FDA) 宣布氯吡格雷抵抗的“黑框警告”，提醒应用氯吡格雷后出现心血管不良事件与CYP2C19 功能缺失的等位基因有关。 CYP2C19 不同位点的等位基因对氯吡格雷的代谢的作用强度不同, 在各等位基因中,*1 为正常功能等位基因；*2 和*3 为功能缺陷型等位基因（其在亚洲人群中突变频率分别为30％～50％和5％～10％）；*17 是功能增强等位基因（其在我国人群中的突变频率为1.2％～3％），携带CYP2C19*2 和*3 等位基因者为CYP2C19 慢代谢型，此类人群氯吡格雷体内活化速率降低、活性代谢产物减少、抗血小板活性降低。Meta 分析的结果表明，在服用氯吡格雷的患者中，携带1～2 个CYP2C19 功能缺陷型等位基因的患者发生不良临床事件的危险性可能会增加55~76％[2]。
建议（1）基因多态性所致血小板反应性差异对个体临床结果的影响尚不能肯定，不推荐常规进行CYP2C19基因型检测。（2）这些个体化用药建议主要用于行PCI 的ACS 患者。目前还没有数据支持CYP2C19基因型检测用于其他场合的用药指导[3]。 常用经由CYP2C19代谢的药物： ①质子泵抑制剂：奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑 ②抗抑郁药：氟西汀、西酞普兰、艾司西酞普兰 ③抗癫痫药：丙戊酸钠、苯妥英钠、苯巴比妥、地西泮 ④其他：伏立康唑、利福平 [1]张丽娜,王浩然,丁虎,等.氯吡格雷吸收和代谢通路相关基因变异与临床个体化用药实践.分子诊断与治疗杂志,2013,5(5):289-294 [2]刘俊,朱艳虹,栾佳杰,等.基因型检测在氯吡格雷个体化抗血小板治疗中的应用价值.中国药房,2014,25(12):1097-1098. [3]钟诗龙,韩雅玲,陈纪言,等.氯吡格雷抗血小板治疗个体化用药基因型检测指南解读.中国实用内科杂志,2015,35(1):38-41