一、实验目的
1.了解细菌生长的基本营养条件，熟悉培养基的种类，掌握培养基制备的原则和一般方法；
2.掌握无菌操作技术，掌握病原菌的分离与培养方法；
3.了解实验室和医院空气的有菌环境，加强消毒灭菌的观念；掌握医院病房空气的细菌检测方法；掌握空气的卫生细菌学监测指标及意义；
4.了解人体体表的有菌环境，加强消毒灭菌的观念；
5.掌握油镜的使用方法，掌握细菌涂片标本的制备及革兰氏染色法的原理及操作，熟悉细菌的基本形态
6.掌握几种常用的生化反应的名称、原理、方法、结果讨论及用途；
7.掌握血浆凝固酶的原理、方法、结果观察及判断；
8.掌握抗菌素敏感性试验的种类、原理及应用，掌握纸片扩散法；
9.掌握玻片凝集反应试验的原理、方法、结果观察及判断。
二、实验器材
1.培养基的制备：试管架、移液管、棉塞、牛皮纸、手套、石棉网、橡皮筋、蒸馏水、天平、称量器皿、药勺、锥形瓶、量筒、电炉、试管、洗耳球、干粉培养基。
2.细菌的分离培养：接种环，酒精灯，打火机，浓汁标本1支，粪便标本1支；碘酒棉球1瓶，酒精棉球1瓶，眼科镊子2把；伊红美蓝平板2个，营养琼脂平板5个。
3.细菌的纯培养：接种环，酒精灯，打火机，中性笔，斜面4支，细菌分离培养物（上次实验平板）
4.细菌的形态学检查：接种环，酒精灯，打火机，中性笔，斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张，显微镜，革兰氏染色试剂6组，染色架8个。
5.细菌的生化试验等：接种环，接种针，酒精灯，打火机，中性笔，斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，镊子2把，兔血浆，生理盐水。
6.细菌的血清学试验、结果分析：接种环，酒精灯，打火机，玻片、志贺菌诊断血清，半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。
1.2操作过程
1.3注意事项
①称量时：调零，使用时遵循“左物右码”。天平保持干燥、清洁。用过的药勺、称量皿要清洗干净。
②使用完干粉培养基后，瓶子内盖扭紧，外盖盖紧。
③煮沸培养基时：培养基隔石棉网煮沸，使完全溶解（加热时常摇动，沸腾时，不能摇动）。营养肉汤煮沸1次，含琼脂的培养基煮沸3次(煮至刚刚冒泡,立即放置台面，半分钟后再煮)。
④分离培养基时：培养基乘热分装，用洗耳球和刻度吸管分装培养基。
棉塞1/2塞入试管口内，松紧合适。
⑤培养基装筐待灭菌：放置试管筐内，罩上硫酸纸牛皮纸，用橡皮筋扎好。
⑥刷洗玻璃器材：
Ⅰ无污染器皿:洗涤剂洗刷→流水冲洗10次→晾干。
Ⅱ病原菌污染的器材→高压蒸汽灭菌→趁热倒出污物→洗涤剂浸泡→瓶子、试管、吸管用毛刷，平皿用纱布，洗刷干净→流水冲洗10次→晾干。
2.细菌的分离培养
2.2采用平板划线分离法
①接种环烧灼灭菌。
②取标本3～6ul。
③平板采光，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。
④接种环与平板呈30～40度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。
⑤烧掉接种环上多余的标本。
⑥转动平板，通过第一区5～7次，使接种环重新沾上少量细菌，同样的方法划第二区。
⑦转动平板，接种环通过第二区1次，划第三区。转动平板，接种环通过第三区1次，划第四区。转动平板，种环通过第三区1次，第五区。
2.3 注意事项
⑤无菌取材：在火焰旁边，左手斜持标本管下端，右手小指夹住试管棉塞上端，缓慢拔出棉塞并夹持之（棉塞下端不得接触到管口外任何物体）→管口迅速通过火焰3次→取标本→管口通过火
3.2细菌的纯培养采用斜面接种法
①在菌落分布最稀疏的区域，选择平板上相同的菌落数多的、典型的、容易挑取的单菌落。
②接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉一条细菌接种线。
③再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线。接种时，接种杆连接部不能碰到斜面培养基。
④细菌涂布接种在斜面培养基的表面。
3.3注意事项
①接种完后：收集平板→灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置）→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。
②接种时：甲在接种金黄色葡萄球菌时，不可挑选。黄色菌落可能是空气污染的杂菌，不能挑选。
4.空气的细菌学检查
4.1实验方法(自然沉降法)
根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养以后，计数菌落形成单位，可了解空气的污染情况。
4.2实验步骤
5.2操作过程
5.2.1常规的洗手方法（甲和丙操作）——能有效地去除大多数暂住菌
5.2.2医学微生物学教学实验室标准洗手方法（乙丁操作）
5.2.3三个手指分别在培养基表面触摸2～3厘米
第1格为洗手前，
6.1.2主要步骤
涂片：
①接种环取盐水3ul×2滴,水滴间距小于2cm。
②取菌苔少许（1mm小菌落半个）与盐水混匀，涂成大于1cm2均匀涂膜。
③涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。
干燥：
①手持载玻片一端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2～3秒钟。
②促使菌体蛋白质凝固，固定在载玻片上，以免染色水洗的时候，细菌被水洗掉。
染色：
6.1.3注意事项——油镜的使用：
7.1.2操作过程
观察细菌对糖的分解情况,常用于肠道杆菌鉴定。
①用砂轮在糖发酵管液面上方2～3cm处切割，然后，向切口外侧分离掰断，管口烧灼灭菌。
②接种针斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。
7.2.2操作步骤
划平板：
①先取菌液3～6ul。
②沿平板直径拉一条细菌接种。
③再取菌液1次。
④旋转平板90度角，拉另一条接种线，使两条细菌接种线呈“十字形”。
然后在平板上半部，作连续来回密集划线，每次划二分之一平板。
⑤旋转平板90度角，二次密集划线。
⑥转平板90度角，三次密集划线。
⑦转平板90度角，四次密集划线。
贴药物纸片：
①设三点,呈等边三角距离。点距离平板边缘约15mm。作标记：
7.4.2操作过程
①接种针斜面取菌，从半固体中心,垂直刺入，到达培养基底部5分之4处，再循原来的路线,退出接种针。
②管口、接种针经火焰烧灼灭菌。
8.细菌的血清学试验、结果分析
8.1取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul，8.2用接种环分别取粉红色菌苔，约2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀。
小组内的丙同学划线结果最好，本人为丁同学，划得最差。主要失误原因是第一次划平板，没经验，而且取的脓汁过多（细菌量多），划到后面的时候第五区基本和第一区重复了，使得菌落十分密集，且杂乱无章，基本的单一的菌落，会对接下来的实
6.1用普通平板，从浓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
6.2用伊红美蓝平板，从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。
7.血浆凝固酶凝集试验结果
金黄色菌和血浆凝固酶凝集试验为阳性，白色为阴性，则金黄色菌为致病菌。
8.福氏志贺菌血清凝集试验结果
紫黑色和福氏志贺菌血清凝集试验为阴性，粉红色为阳性，则粉红色菌为致病菌。
9.细菌的糖酵解试验结果