第二章基因工程工具酶
第—节限制性核酸内切酶
第二节DNA连接酶
第三节DNA聚合酶
第四节末端脱氧核苷酸转移酶
第五节核酸酶
第六节核酸外切酶
第七节碱性磷酸酶
第八节T4噬菌体多核苷酸激酶
第—节限制性核酸内切酶
1、宿主的限制和修饰现象
2、限制性核酸内切酶的类型
3、限制性核酸内切酶的命名
4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性
4.1识别位点的长度识别靶序列长度4、5、6 bp居多，也有识别7、
8bp的
4.2 识别序列结构：回文对称
4.3 切割位置：（1）内部（大多数）；（2）两端（3）同裂酶与同尾酶
4.4 Ⅱ型限制性核酸内切酶不具有甲基化功能
4.5 Ⅱ型内切酶可以对单链DNA的切割
4.6 星号活性(star activity)
（1）星活性产生的原因
（2）抑制星星活性的条件(措施)
5、Ⅱ型限制性核酸内切酶的酶切反应
5.1 标准酶解体系的建立
5.2 酶切反应的基本步骤
5.3 终止反应常用方法：
（1）加EDTA：（2）加SDS（3）加热：（4）其它
5.4 多酶联合酶解策略：
（1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切
（2）对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法
5.5 DNA分子酶切常用缓冲液
5.6 内切酶对DNA分子的不完全酶解
5.7 内切酶酶解反应中的注意事项
6、影响限制性核酸内切酶活性的因素
6.1. DNA的纯度
6.2 DNA的甲基化程度
6.3 酶切消化反应温度
6.4 缓冲液(Buffer)
6.5 DNA分子的构型
6.6 反应时间
6.7 酶量使用
第二节DNA连接酶
1、DNA连接酶的发现
2、概念及其特点
3、DNA连接酶的种类
?大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端。
?T4噬菌体的连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平末端。
?T4噬菌体RNA连接酶：催化单链DNA或RNA的5’磷酸与相邻的3’羟基共价连接。
4、DNA连接酶的反应体系
5、影响连接反应的因素
5.1 DNA末端的浓度
5.2 反应温度
5.3 ATP浓度
6 、DNA连接的策略
6.1 粘性末端DNA片段的连接
6.2 平末端DNA片段的末端连接法
? 6.2.1 常规连接
? 6.2.2 平末端DNA片段加接头连接法
? 6.2.3 平末端DNA片段的末端加尾连接法
6.3 防止自连--载体去磷酸化
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。 2．类型：来自原核生物，有三种类型。 Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。 Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。 Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。 三种限制酶的区别如下表所示： Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型 DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA 辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP 识别序列特异特异特异 切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处） 与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用 3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序。如HindⅢ是来自Haemophilus influenzae D（嗜血流感杆菌D 株第三种限制酶）。 4．切割位点和结果：限制酶位点在DNA链上是随机分布的，若识别位点为4bp，则44（256）个核苷酸可遇一个切点。若为6bp，则平均46（4096）个核苷酸才遇到一个切点。限制酶沿回文结构的对称轴切开，则产生平头末端（flush or blunt ends）如BalⅠ。多数限制酶错位
1.2基因工程的基本操作程序 一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是人教版选修3专题1基因工程中第2节内容，本节是《基因工程》专题的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》一节，下接《基因工程的应用》。 对于基因工程，学生接触得很少，文字描述中会感到抽象，为此，教材中采用形象化得呈现方式简述了基因工程基本操作程序的四个步骤。例如，基因文库中把基因组文库比作国家图书馆，而把cDNA文库比作某市图书馆，这样便于学生理解和掌握。此外，在教材处理中还呈现主干，割舍枝杈，将非主干内容以《生物技术资料卡》、《拓展视野》等方式呈现，做到有主有次。 二、学情分析 学生经过上一节的学习已经掌握DNA重组技术所需三种基本工具的作用及基因工程载体所需条件等知识，具备学习基因工程的基本操作程序一节的基础；而且经过一年必修教材的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，应在教师引导下适时加强学生解决问题和运用概念图等生物学语言归纳结论等方面的能力。 三、教学目标 3.1 知识目标 ⑴简述基础理论研究和技术进步催化了基因工程 ⑵简述基因工程的原理和基本步骤 3.2 能力目标 ⑴学会运用概念图总结基因工程的基本步骤及方法 ⑵尝试运用基因工程原理，提出解决某一实际问题的方案 3.3 情感态度与价值观 ⑴关注基因工程的发展 ⑵认同基因工程的应用促进生产力的提高 四、教学重点与难点 4.1 教学重点基因工程基本操作程序的四个步骤 4.2 教学难点 ⑴从基因文库中获取目的基因 ⑵利用PCR技术扩增目的基因 五、教学整体思路 采用从“整体-部分-整体”的教学思路，首先引用基因工程案例使学生从整体上了解基因工程的四个步骤，其次采用分步探究的形式帮助学生理解各个步骤的原理、方法和过程，最后教师引导学生用概念图将所学的知识从整体上再次整合。
高中生物选修3第一章基因工程习题 1. SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈后，其血清可用于 治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了研究，其研究的方向如下图 所示。请根据下图回答： SARS 病毒 [丙的研究] 抽取血清 蛋白质X [乙的研究] 注射 注射 灭活或 培养 非典病人B 治愈的病人B 非典病人D 减毒处理 动物实验 健康人C 健康人C 健康人C 治愈的病人D （1）从免疫学的角度看，SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人A 的血清中因 为含有 ，所以可用来治疗“非典”病人B 。 （2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质X 是 ，它可以通过化学的方法合成，也 可以通过生物学方法—— 技术生产。 （3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康人C 获 得抵抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （4）图中丙主要研究不同国家和地区SARS 病毒的异同，再按照免疫学原理，为研究一种 或多种 提供科学依据。 2. 聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术， 反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。 反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要 过程如右图所示。 （1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则 经过PCR 仪五次循环后，将产生 个DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的 数量至少是 个。 （2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是 。 （3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处： ① 。 ② 。 ③ 。 3. 逆转录病毒的遗传物质RNA 能逆转录生成DNA ，并进一步整合到宿主细胞的某条染色 体中。用逆转录病毒作为运载体可用于基因治疗和培育转基因动物等。 （1）病毒在无生命培养基上不能生长，必须依靠活细胞提供 循环重复 [甲的研究] 用激素等治疗 非典病人A 治愈的病人A 健康人合成或生产 其他辅助治疗 接种 提纯、
第Ⅱ卷非选择题 三．非选择题： 29．（7分）SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈后，其血清可用于治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了研究，其研究的方向如下图所示。请根据下图回答： SARS 病毒 [丙的研究] 抽取血清 蛋白质X [乙的研究] 注射 注射 灭活或 培养 非典病人B 治愈的病人B 非典病人D 减毒处理 动物实验 健康人C 健康人C 健康人C 治愈的病人D （1）从免疫学的角度看，SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人A 的血清中因为含有 ，所以可用来治疗“非典”病人B 。 （2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质X 是 ，它可以通过化学的方法合成，也可以通过生物学方法—— 技术生产。 （3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康人C 获得抵抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （4）图中丙主要研究不同国家和地区SARS 病毒的异同，再按照免疫学原理，为研究一种或多种 提供科学依据。 30．（8分）聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。 （1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则经过PCR 仪五次循环后，将产生 个DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是 个。 （2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是 。 （3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处： ① 。 ② 。 循环重复 [甲的研究] 用激素等治疗 非典病人A 治愈的病人A 健康人合成或生产 其他辅助治疗 接种 提纯、
第一章基因工程概述 1?什么是基因工程，基因工程的基本流程？ 基因工程（Genetic engineering ）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多 种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大 要素。 1. 分离目的基因 2?限制酶切目的基因与载体 3. 目的基因和载体DNA在体外连接 4?将重组DNA分子转入合适的宿主细胞，进行扩增培养 5. 选择、筛选含目的基因的克隆 6. 培养、观察目的基因的表达 第二章基因工程的载体和工具酶 1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？ 具有对受体细胞的可转移性或亲和性。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。 分子量小，拷贝数多。具有安全性。 2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒 3. 质粒的构建 （1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。一般来说，大于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。 （2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒扩 散污染环境，保证DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数 （3 ）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多 克隆接头（Polylinker ），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。 （5 ）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。 4. 什么是人工染色体载体？ 将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体 5. 什么是穿梭载体？ 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和 复制的载体。 6. 入-噬菌体载体及构建 hDNA为线状双链DNA分子，长度为48.5kb，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。 1缩短长度提高外源DNA片段的有效装载量删除重复的酶切位点 引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性 灭活某些与裂解周期有关基因。 使入-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染现 象的发生。加装选择标记，便于重组体的检测 7. M13单链噬菌体DNA载体
基因工程基因操作过程中的工具酶 09生物工程（2）班0902012010 摘要：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶和修饰酶四大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。 关键词：基因工程工具酶聚合酶连接酶内切酶 正文：一、基因工程工具酶 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。 所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。 在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。 二、限制性核酸内切酶及其应用 （一）限制性核酸内切酶的发现 当λ(k)噬菌体侵染E.coli B时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coli B的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB 甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。Eco B核酸酶不能识别已甲基化的序列。 最早分离出的限制内切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K 菌株，Eco B和Eco K，是I型的，没有实用价值。 首个II型限制内切酶是在1970年，由H.O.Smith等从Heamophilus influenzae 的Rd菌株中Hin d II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。 从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的。 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）：是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5－磷酸二酯键。 （二）限制性核酸内切酶的分类 分为I型、II型和III型。
基因工程的载体和工具酶 第一节 载体 引言 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达， 制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于 来实现。 作为基因克隆的载体必须具备以下特性： ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS ）,便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 一、质粒载体 （一） 质粒的生物学特性 （1） 质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状 （少数为线形和 RNA ） DNA 分 子。 广泛从在于细菌细胞中， 比病毒更简单。 在霉菌、 蓝藻、 酵母和一些动植物细胞中也发现了 质粒， 目前对细菌的质粒研究得比较深入， 特别是大肠杆菌的质粒。 大肠杆菌的质粒主要有 F 质粒（F 因子）、R 质粒（抗药性因子）和 Col 质粒（大肠杆菌素因子）三种。 （2） 质粒的大小差异很大，最小的只有 1kb,只能编码中等大小的 2-3种蛋白质分子，最大 的达到 200kb 。 （ 3 ）质粒的生存在寄主细胞中 “友好 ”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往 往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。 （4） 质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将 质粒分为两种复制型： 严紧型"质粒（stigent plasmid ），拷贝数为1-3 ；松弛型"质粒（relaxed plasmid ） ,拷贝数为 10-60。不过即使是同一质粒， 其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生 长环境也可能有很大的变化。 （5） 质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。 载体 质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。 ⑹ 质粒的转移 转移性质粒，含有 tra 基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。 非转移性质粒，不含 tra 基因；可以为转移性质粒所带动转移。 （ 7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种， （二） 质粒 DNA 的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒 DNA 。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解 细胞，将质粒 DNA 与染色体 DNA 分开及除去蛋白质和 RNA 。 1. 碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 片断之间，在拓扑学上的差异而发展 出来的。 在pH 值12.0?12.5范围内时，线性的 DNA 会被变性而共价闭合环状质粒 DNA 却不 会被变 性。 通过冷却或恢复中性 pH 值使之复性，线性染色体形成网状结构，而 cccDNA 可以准确 迅速复性， 通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA 的上清液，最后用乙醇沉淀，获得 质粒 DNA 。 2. 碱变性法提取质粒的步骤： 而目的基因本身无法进行复 “载体 ”及其“寄主细 胞
基因工程的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶 限制性核酸内切酶 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 防御机制: 任何物种都有排除异物、保护自身的防御机制 人：免疫系统 细菌：限制与修饰系统 寄主控制的限制与修饰现象 限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段, 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA 双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。 限制酶(restriction enzyme) 修饰酶(modifying enzyme) 核酸酶切位点： 既可以在3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键的3ˊ酯键处（A）， 也可以在5ˊ酯键处（B）切断磷酸二酯键
1）核酸限制性内切酶的类型 2）核酸限制性内切酶的基本特性 3）同裂酶和同尾酶 4）核酸限制性内切酶的命名法 5）影响核酸限制性内切酶活性的因素 限制性核酸内切酶的类型及特性 按照限制酶的组成、与修饰酶活性的关系以及切断核酸的情况不同，分为三类： Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型 第一类（I型）限制性内切酶： 能识别专一的核苷酸顺序 并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链 但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的 这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因 如：Eco B、Eco K等 第二类(II型)限制性内切酶： 能识别专一的核苷酸顺序（回文对称顺序） 并在该顺序内的固定位置上切割双链 是DNA重组技术中最常用的工具酶之一 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的 回文对称顺序：有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同 切割后形成具有粘性末端（cohesive end）的DNA片段 切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段 限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段没有突出的单链
第二章基因工程中常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 §2-1 核酸内切限制酶 定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图） 一、限制修饰系统的种类（图） 二、限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichia coli RI Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是 随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点 切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分 子移动，因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性， 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点： ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA 分子形成链的断裂；——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——单链切割
第一章 第二章 第三章基因工程概述 1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？ 基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。 1.分离目的基因 2.限制酶切目的基因与载体 3.目的基因和载体DNA在体外连接 4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养 5.选择、筛选含目的基因的克隆 6.培养、观察目的基因的表达 第四章基因工程的载体和工具酶 1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？ 具有对受体细胞的可转移性或亲和性。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。 分子量小，拷贝数多。 具有安全性。 2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒
3. 质粒的构建 （1）删除不必要的DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA 片段的装载量。一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。 （2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数 （3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。 （4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。 （5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。 4. 什么是人工染色体载体？ 将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体 5. 什么是穿梭载体？ 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。 6.入-噬菌体载体及构建 -DNA为线状双链DNA分子，长度为48.5kb，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。 1缩短长度提高外源DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点 引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性 灭活某些与裂解周期有关基因。 使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染现象的发生。 加装选择标记，便于重组体的检测 7.M13单链噬菌体DNA载体
第二章基因工程中常见的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。§2-1核酸内切限制酶 定义: 核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列, 并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到当前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。 核酸内切限制酶的发现及其生物功能( 图) 一、限制修饰系统的种类( 图) 二、限制性内切酶的定义、命名 1.定义: 广义指上述三个系统中的限制酶; 狭义指II型限制酶。 2.命名: 限制酶由三部分构成, 即菌种名、菌系编号、分离顺 序。 例如: Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae, ”ｄ” 表示菌系为ｄ型血清型; ”Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichiacoli RI
Hin dⅢ—Haemophilusinfluensae dⅢ Sac I(II)—Streptomycesachromagenes I(Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列, 但它们的切割作用却是随机的, 在距特异性位点至少1000bp的地方能够随机地切割DNA分子, 因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b.Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分 子。——远距离定点切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶, 在切割反应过程 中, 都会沿着DNA分子移动, 因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶, 一般都是大型的多亚基的复合 物, 既具有内切酶活性, 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点: ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列, 即所谓的识别序 列, 并由此切割DNA分子形成链的断裂; ——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布, 一般不是彼此直接 相正确; ——单链切割部位 ③因此, 断裂的结果形成的DNA片段, 也往往具有互补的单链
第Ⅱ卷非选择题 三．非选择题： 29．（7分） SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈 后，其血 清可用于治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了 研究，其研究的方向 如下图所示。请根据下图回答： 减毒处理 接种 动物实验 健康人 C 健康人 C 健康人 C 治愈 的病人 D （ 1）从免疫学的角度看， SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人 A 的血 清中因为含有 ，所以可用来治疗“非典”病人 B 。 （ 2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质 X 是 ，它可以通过化学的方法 合成，也可以通过生物学方法—— 技术生产。 （ 3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康 人 C 获得抵抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （ 4）图中丙主要研究不同国家和地区 SARS 病毒的异同， 再按照免疫学原理， 为研 究一种或多种 提供科学依据。 30（． 8分）聚合酶链式反应 （PCR 技术）是在实验室中以少量样品 DNA 制备大量 DNA 的生 化技术，反应系统中包括微量样品 DNA 、 DNA 聚合酶、引物、足量的 4 种脱 氧核苷酸及 ATP 等。反应中新合成的 DNA 又可以作为下一轮反应的模板， 故 DNA 数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。 灭活或 培养 非典病人 B 治愈的病人 B 非 典病人 D
- 2 - （ 1） 某个 DNA 样品有 1000 个脱氧核苷酸，已 知它的 一条单链 上碱基 A:G:T:C=1:2:3:4 ，则经过 PCR 仪五次循环后， 将产生 个 DNA 分子， 其中需要 提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是 个。 （ 2）分别以不同生物的 DNA 样品为模板合成的各个新 DNA 之间存在差异，这些 差异是 3）请指出 PCR 技术与转录过程的三个不同之处： ① 31．（ 10 分）逆转录病毒的遗传物质 RNA 能逆转录生成 DNA ，并进一步整合到宿 主细胞的 某条染色体中。用逆转录病毒作为运载体可用于基因治疗和培育转基因动 物等。 （ 1）病毒在无生命培养基上不能生长，必须依靠活细胞提供 等物质基础，才能繁殖。逆转录病毒较 T 2 噬菌体更容易变异，从分子水平看，是由 于。 （2）基因治疗时，将目的基因与逆转录病毒运载体结合的“针线 将带有目的基因的受体细胞转入患者体内，患者症状会有明显缓解，这表明 。 （ 3）若将目的基因转入胚胎干细胞， 再经过一系列过程可获得目的基因稳定遗传 的转基因动物。 ①将带有目的基因的胚胎干细胞注射到普通动物的 胚中，胚胎发育成嵌 合型个体。如果转化的胚胎干细胞正好发育成 细胞，则嵌合型个体生下的 幼体就极有可能带有目的基因。 ②从胚胎干细胞转化到获得目的基因纯合子，配合基因检测，最少需要 代。试简述育种的基本过 程： 。 32．（8分）下图 a 示基因工程中经常选用的运载体—— pBR322 质粒， Amp r 表示氨 苄青霉素抗性基因， Tet r 表示四环素抗性基因。目的基因如果插入某抗性基因中， 将使该基因失活， 而不再具有相应的抗性。 为了检查运载体是否导入原本没有 Amp r 和 Tet r 的大肠杆菌（受体细胞） ，将大肠杆菌涂布在含氨苄青霉素的培养基上培养， 得到如图 b 的结果（黑点表示菌落） 。再将灭菌绒布按到培养基上， 使绒布面沾上菌 落，然后将绒布按到含四环素的
第一章基因工程概述 1.什么是基因工程，基因工程的基本流程 基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。 1.分离目的基因 2.限制酶切目的基因与载体 3.目的基因和载体DNA在体外连接 4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养 5.选择、筛选含目的基因的克隆 6.培养、观察目的基因的表达 第二章基因工程的载体和工具酶 1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件 具有对受体细胞的可转移性或亲和性。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。 分子量小，拷贝数多。 具有安全性。 2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型 1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建 （1）删除不必要的 DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源 DNA 片段的装载量。一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。 （2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证 DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，
提高质粒的拷贝数 （3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。 （4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。 （5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。 4. 什么是人工染色体载体 将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体 5. 什么是穿梭载体 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。 6.入-噬菌体载体及构建 -DNA为线状双链DNA分子，长度为，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。 1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点 引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性 灭活某些与裂解周期有关基因。 使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染现象的发生。 加装选择标记，便于重组体的检测 单链噬菌体DNA载体 过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口。 引入合适的选择性标记基因，如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列（lacZ’）的乳糖操纵子片段（lac）、组氨酸操纵子片段（his）以及抗生素抗性基因等。 将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部，使得含有重组子的噬菌斑呈白色，而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色。 （4）在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列，使得重组DNA 分子的单链形式经分离纯化后，可直接进行测序反应。 8. II类限制性内切核酸酶的特点
高中生物选修3第一章基因工程习题 1. SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈后，其血清可用于 治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了研究，其研究的方向如下图 所示。请根据下图回答： SARS 病毒 [丙的研究] 抽取血清 蛋白质X [乙的研究] 注射 注射 灭活或 培养 非典病人B 治愈的病人B 非典病人D 减毒处理 动物实验 健康人C 健康人C 健康人C 治愈的病人D （1）从免疫学的角度看，SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人A 的血清中因为 含有 ，所以可用来治疗“非典”病人B 。 （2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质X 是 ，它可以通过化学的方法合成，也可 以通过生物学方法—— 技术生产。 （3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康人C 获得抵 抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （4）图中丙主要研究不同国家和地区SARS 病毒的异同，再按照免疫学原理，为研究一种 或多种 提供科学依据。 2. 聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术，反 应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。反 应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要过 程如右图所示。 [甲的研究] 用激素等治疗 非典病人A 治愈的病人A 健康人合成或生产 其他辅助治疗 接种 提纯、
（1）某个DNA样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则经过PCR仪五次循环后，将产生个DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是个。 （2）分别以不同生物的DNA样品为模板合成的各个新DNA之间存在差异，这些差异是 。 （3）请指出PCR技术与转录过程的三个不同之处： ①。 ②。 ③。 3. 逆转录病毒的遗传物质RNA能逆转录生成DNA，并进一步整合到宿主细胞的某条染色体中。用逆转录病毒作为运载体可用于基因治疗和培育转基因动物等。 （1）病毒在无生命培养基上不能生长，必须依靠活细胞提供 等物质基础，才能繁殖。逆转录病毒较T2噬菌体更容易变异，从分子水平看，是由于。 （2）基因治疗时，将目的基因与逆转录病毒运载体结合的“针线”是。 将带有目的基因的受体细胞转入患者体内，患者症状会有明显缓解，这表明 。 （3）若将目的基因转入胚胎干细胞，再经过一系列过程可获得目的基因稳定遗传的转基因动物。 ①将带有目的基因的胚胎干细胞注射到普通动物的胚中，胚胎发育成嵌合型个体。如果转化的胚胎干细胞正好发育成细胞，则嵌合型个体生下的幼体就极有可能带有目的基因。 ②从胚胎干细胞转化到获得目的基因纯合子，配合基因检测，最少需要代。试
第二章基因工程的载体和工具酶 【教学时数】9小时 【教学目录与学时分配】 2.1 载体（6） 2.1.1 质粒载体 2.1.2 噬菌体载体 2.1.3 其他载体 2.1.4 穿梭载体与表达载体 2.2 工具酶（3） 2.2.1 限制性内切核酸酶 2.2.2 DNA聚合酶和Klenow大片段 2.2.3 DNA连接酶 2.2.4 碱性磷酸酶 2.2.5末端脱氧核苷酸转移酶 【教学目的】 让学生掌握什么是基因工程的载体，有哪些典型的基因工程载体，哪些常用的基因工程工具酶，什么情况下使用工具酶等基本常识。 【教学重点】 常用基因工程载体的结构、工具酶的用途。 【教学难点】 基因工程载体的结构和使用 【教学方式】 多媒体讲解结合启发讨论式教学 第一节载体 一、质粒载体（3） 【教学重点】 质粒载体的构建与标记基因；克隆质粒载体的克隆过程 【教学难点】 质粒的结构 【教学过程与内容】 载体是指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。 作为载体必须满足的条件：①有多种限制性内切酶的切点，但每一种酶最好只有一个切点；②外源DNA插入以后载体在受体细胞中自我复制；③有便于选择的标记基因；④具有促进外源DNA表达的调控区。 2.1.1 质粒载体 质粒是在许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。它是闭合环状双链DNA分子，大小1kb到200kb不等。能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系。有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的。 质粒的复制分松弛型和严谨型两种。松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色体的复制不同步，一般在一个菌体内能复制10-200 拷贝；严谨型质粒是指质粒复制跟细菌染色体同步，一般含有1-10 拷贝。 一、质粒的基本特性 1．质粒的复制 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制
第一章基因工程 一、工具酶的发现和基因工程的诞生 1、基因工程的概念： （1）广义的遗传工程：泛指把一种生物的遗传物质（细胞核、染色体脱氧核糖核酸等）移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。 （2）基因工程： 就是把一种生物的基因转入另一种生物体中，使其产生我们需要的基因产物，或者让它获得新的遗传性状。基因工程的核心是构建重组DNA分子。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 （3）基因工程诞生的理论基础： DNA是遗传物质的发现过程、DNA双螺旋结构的确立、遗传信息传递方式的认定。 2、基因工程的基本工具 （1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） ①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能切割（使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开），因此具有专一性。 例如：某种限制性核酸内切酶能识别的序列是GAATTC,能在G和A之间切割DNA，如下图所示。黏性末端 黏性末端 ③结果：能将DNA分子切割成许多不同的片段。 备注：不同DNA分子用同一种限制性核酸内切酶切割形成的黏性末端都相同；同一个 DNA分子用不同限制性核酸内切酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 （2）“分子缝合针”——DNA连接酶 ①作用：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起（缝合磷酸二酯键）形成的DNA分子称为重组DNA分子。 因此，DNA连接酶具有缝合DNA片段的作用，可以将外源基因和载体DNA连接在一起。 （3）“分子运输车”——载体——质粒 ①载体具备的条件： 1）能在受体细胞中复制并稳定保存。
基因工程常用的工具酶 常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系 生物制药0911 刁亚军学号:2009423134 引言:在基因工程的研究和发展过程当中，有许多必不可少的因素影响和制约着基因工程的进展。本篇综述主要讲述的是基因工程常用的一些工具酶，他们包括限制性内切酶，DNA聚合酶，T4噬菌体DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶，碱性磷酸酶，核酸酶。这些酶在基因工程中发挥着非常重要的作用。 限制性内切酶 限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。 限制性内切酶的由来 一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组
限制性核酸内切酶 成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。别名Endodeoxyribonuclease简称限制酶酶反应限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。单位定义在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。性状制品不含非专一的核酸水解酶(由10单位内切酶与1μg λDNA，保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示),这类酶主要是从原核生物中分离出来的，迄今已经从近300多种不同的微生物中分离出约4000种限制酶。 类型 根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。 第一型限制酶