第一讲体外细胞培养的基本技术
●体外细胞培养条件和基本技术
●体外细胞培养
●体外培养物的生长生物学
●细胞系和细胞株
●培养物的冷冻与复苏
●培养物的污染、检测和排除
●一、体外细胞培养条件和基本技术
体外细胞培养的优缺点
优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。
体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。
一、体外细胞培养条件
（一）、体外培养实验室
1. 准备室
2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。
3. 缓冲室
4. 其他实验室
（二）、体外培养的设备和器具
设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值
3. 倒置显微镜
4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器，
超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置
8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平
培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器，
针头式加压塑料小滤器
2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿
（4）多孔培养板（5）离心管
3. 移液器
4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网
（三）培养用液
?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS)
水：离子交换水，蒸馏水
平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖
常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液
2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
3.无血清培养基：
干粉型培养基的配制：1）. 制备高质量的去离子水(玻璃三蒸馏水)或超纯水2）. 加温水至15-30℃之间3）. 加干粉入水中，搅拌令之溶解4）. 加NaHCO3 5）. 加水至最终量6）. 必要时用1N HCl或1N NaOH调节pH，因滤过时pH 可能受影响7）. 用0.22um或小于此微孔滤膜滤过消毒
?其他用液：消化液等
1.消化液：胰蛋白酶、EDTA溶液
2.pH 调整液：NaHCO3溶液、HEPES溶液
3.抗生素液：青链霉素
常用的生长培养液：基本培养基80-90％
血清(多用小牛血清) 10-20 ％
抗生素(多用青霉素100单位／毫升和链霉素100微克／毫升
一、细胞体外培养的其它条件
一）、无污染的气、液相环境：1、O2 （5%CO2 + 95% 空气，O2: 21%）
2、CO2- pH
3、液相环境-渗透压
二）、温度
三）、生长基质1、多聚赖氨酸：0.05mg/ml 2、纤维连接蛋白：1mg/ml 3、胶原：1~3mg/ml 4、层粘连蛋白：5~10 g/ml
一、清洗和消毒
1.1玻璃器皿的清洗：浸泡→刷洗→酸浸→冲洗
浸酸液：强液：63克重铬酸钾，1000毫升浓硫酸，200毫升蒸馏水。
次强液：120克重铬酸钾，200毫升浓硫酸，1000毫升蒸馏水。
弱液：100克重铬酸钾，100毫升浓硫酸，1000毫升蒸馏水。
胶塞清洗：胶塞入水中浸泡→2％Na0H煮沸10-20分钟→自来水冲洗→1％稀盐酸浸泡30分钟→自来水冲洗和蒸馏水漂洗2-3次，晾干备用
1.2塑料器皿的清洗：
2.包装：局部包装；全包装
3.消毒：紫外线，干热消毒，湿热消毒，滤过消毒，射线消毒，消毒剂的使用
二、体外细胞培养
体外细胞培养类型：原代培养，继代培养
一）、基本流程：１mm3的植块→植块培养
原代培养：↗
动物器官或大组织块→洗去血污→剔除多余成分
↙
组织剪碎→蛋白酶消化→机械吹打→铜网过滤→
离心→细胞悬液→调整细胞数→分离细胞培养二）、实验要点：
1、常用实验材料的取材：胚胎、组织、人体手术或活检材料
2、分散细胞的方法：
１）. 机械解离细胞法：吸管吹打法,过筛法,单细胞分离器
２). 蛋白酶学处理法: 胰蛋白酶, 胶原酶
３). 螯合剂解离细胞法: EDTA , 柠檬酸钠
3、接种和培养过程:：
１）. 植块培养：接种与培养：
优点：比较简单，保留了在体时细胞间的相互作用，因而在体外培养时，植块内细胞容易存活和生长。
２）.分散细胞培养：操作过程:
优点：解除了植块内部细胞间的组织关系，从而可以反映出单个细胞的生物学特征。可实现对单一细胞类型进行细胞生物学研究。
4、讨论和注意事项
?相对于植块内的细胞，分离散细胞在体外更难以存活和生长。
?对于大多数贴壁依赖型细胞来说，如何尽快让接种的细胞贴壁，是
决定培养物生长快慢的关键步骤。可选用生长基质表面；降低浮力。
?细胞密度：105个/ml左右，对大多数动物细胞是比较适中的。
三）、原代细胞培养的注意事项
1、培养液：培养基的选择，添加剂，培养液的酸碱度，换液。
2、培养的空间：通常培养液与液面上空间的体积比以1:10为宜。
一、原代培养物需要传代的指标:
继代培养
1、植块培养;
2、分离细胞培养物;
3、悬浮细胞培养物
二、传代的过程
1、主要材料：
（1）蛋白酶消化液；（2）培养器皿；（3）培养液及平衡盐溶液
2、方法：
（1）贴壁生长细胞培养物的传代：
吸去旧培养液→PBS 或D-Hanks洗→酶消化解离细胞→终止消化→吹打培养器皿底部→收集细胞、洗涤、调整细胞数→接种
（2）悬浮培养物的传代：
培养物移入离心管→离心、去上清→培养液重悬→接种培养皿→补加培养液
三、传代培养的注意事项
1、传代的时机与再培养的细胞密度
2、传代数与培养物的生长
●三、体外培养物的生长生物学
一、培养细胞的生长与增殖
?原代培养期：细胞性状与体内原组织相似性大，异质性。
?传代培养期：细胞增殖旺盛（潜伏期、指数生长期、停滞期），逐渐趋
向同质化，正常细胞约可传30-50代，应及早冻存。
?衰退期：细胞增殖减慢，直至死亡。
二、体外细胞培养物的生长类型:：（黏附型细胞；悬浮型细胞）
1、黏附型细胞
1）多数培养细胞贴附生长，属贴壁依赖性细胞。
2)体内：粘附全方位，外形具有复杂的立体特征。
体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同。成纤维细胞型：梭形、长条形或不规则多角形，胞体一般铺展很开，成群细胞呈现放射状、旋涡状等走行形式。
起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为此型，如成纤维细
胞、肌肉细胞、骨与软骨细胞以及血管内皮细胞等。
上皮细胞型：扁平、多角形，细胞间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列，呈“铺路石样”，形成单层膜。
起源于内、外胚层的细胞体外培养时可能呈现此型，如皮肤表皮及其
衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等。
游走细胞型：细胞相互分散，一般不形成集落；在器皿壁上生长位置不固定，经常处于较活跃的变形和游走状态，因此外形不规则且不断变化。
主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞细胞系统的细胞，如颗粒性白细
胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞以及某些肿瘤细胞。
多形细胞型：形态不规则，一般分为胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形。
主要是神经元和神经胶质细胞
2、悬浮型细胞
细胞在培养时不粘附于支持物上，而是呈悬浮生长状态，如某些癌细胞和血液白细胞。
细胞悬浮生长时胞体为圆形。适于大量繁殖。
三、培养细胞的生长状况观察
一）常规观察
1培养液：颜色、透明度等；2细胞生长概况及形态变化：细胞轮廓、折光性、胞内颗粒等；3微生物污染状况：
二）细胞生长状况观察
1. 细胞计数：细胞计数仪；细胞计数板
制备细胞悬液，稀释成合适的浓度；
加至细胞计数板中央凹槽处，显微镜下计算四角大方格内细胞总数；
按照公式计算悬液中细胞密度。
2. 细胞生长曲线
细胞生长曲线是衡量细胞增殖快慢的重要指标。
细胞计数法：MTT（CCK-8）法
潜伏期：细胞有生长话动而无细胞分裂。潜伏期一般为6～24小时。
对数生长期：细胞数随时间成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，虽有活力但基本不再分裂。
3. 细胞分裂指数（mitotic index, MI）
培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。
一般细胞的MI约为0.1－0.5%。原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%－5%。
4. 细胞周期
流式细胞仪测定；同位素标记测定：3H-TdR 掺入法
细胞群体倍增时间：培养物中细胞数量翻倍的平均时间。
群体倍增时间通常长于单个细胞周期。
四、细胞活力的检测方法
1、台盼蓝排斥试验
台盼蓝（Trypan blue）染色使死细胞呈蓝色，活细胞不着色。计数法得到活细胞比例。
此法简单快速。
注意及时检测，时间过长部分活细胞亦被染色
2、克隆（集落）形成试验
测定单个细胞增殖能力，克隆形成率高者独立生存能力强。
平板克隆形成试验
软琼脂克隆形成试验：多用于检测肿瘤细胞或转化细胞。利用肿瘤细胞的非锚着生长依赖性，将其悬浮培养于软琼脂内。可根据其克隆形成率判断细胞的恶性程度，亦可用此法进行亚克隆分离
3. 3H-TdR 掺入法
3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（TdR），在DNA复制时掺入至新合成的DNA链中，从而使子细胞被3H标记，测定3H的放射性脉冲数即可比较细胞增殖活性。
4. 细胞活力测定的MTT比色法
?MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴盐）是线粒体琥珀酸脱氢酶的作用
底物，在活细胞中MTT能被其线粒体脱氢酶还原为formazan颗粒，溶于异丙醇或DMSO之后，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比，因此根据呈现的OD值可反应细胞的代谢水平。死细胞无此酶活性。
?MTT 法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、
肿瘤放射敏感性实验等。
?亦常用于测定生长曲线。
●四、细胞系和细胞株
一、基本概念
细胞系(cell line)：从原代培养物经传代后得来的一群不均一的细胞。由原先组成原代培养物的所有细胞类型组成，但一般以某种细胞为主。
细胞株(cell strain)：通过选择或克隆化培养，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化性质或特异标记的细胞群。
如一定标记染色体、对某种病毒的敏感性或抗性、特殊的抗原性等，这些特性在以后的培养中必须持续存在。
有限细胞株（finite cell strain）
连续细胞株（continuous cell strain
二、建立细胞系（株）的档案
1、培养细胞的来源
交代细胞供体所属物种、年龄、性别、器官或组织来源。对肿瘤组织，应说明临床病理诊断结果、组织来源、病例号等。
说明培养基、血清等的使用条件。
2、细胞生物学特性
说明细胞的一般形态、特征性结构、生长曲线与分裂指数、倍增时间、集落形成率、染色体特性等。对腺细胞应查明有无蛋白质或激素等分泌产物；对肿瘤细胞应作琼脂培养、异体动物成瘤性、组织浸润能力等检测。
●五、培养物的冷冻与复苏
一、培养物的冷冻保存与复苏原理
冷冻保存：将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70℃的超低温条件），并在此温度
下对其长期保存的过程。
复苏：以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。
一）冷冻保护剂
甘油、DMSO
渗透到细胞内，避免细胞过分脱水皱缩，减少水分子形成冰晶，保护酶和蛋白质等。
添加浓度通常为10%。
二）冷冻速率
速度过慢：脱水严重，体积严重收缩，溶质损伤；速度过快：胞内冰晶损伤严重三）冷冻保存温度
1、液氮温度（-196℃）是目前最佳的冷冻保存温度。
2、-70℃～-80℃，
短期保存一个月内3、冰点到-40℃保存效果不佳
四）复温速率
37-40 ℃水浴中，于1~2min内快速完成复温
二、冻存方法
（1）待冻存细胞悬液的准备（2）分级冷冻（3）记录
三、冻存细胞的复苏
从液氮中取出后，立即投入到37～40℃温水中，溶解后尽快离心弃除冷冻保护液。
●六、培养物的污染、检测和排除
一、培养物的污染与检测
1. 污染的内容：1）微生物：真菌、细菌和病毒2）化学物：
影响细胞生存非细胞所需的细胞成分3）细胞：其他非同一种细胞
2. 污染对细胞的影响：
轻者：细胞生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、轮廓增强
重者：细胞增殖停止、分裂相消失、胞质中出现大量堆积物、细胞变圆、脱落
3.污染的途径：
空气、清洗消毒、操作、血清、组织块
4. 细菌污染与检测：
怀疑有污染时，用无抗生素的培养液培养检测。如果有的话，几小时内培养液外观就浑浊，呈现黄绿色，在倒置相差显微镜下有点状的细菌颗粒，培养背景变的模糊。
5. 真菌污染与检测：
酵母菌污染：类似细菌污染，倒置相差显微镜下可以看到圆形或卵圆形的酵母菌；有酒或酸的发酵样异味；液体呈现黄绿色。
霉菌污染：丝状或树枝状生长的菌丝，成白色丝状团块
6. 支原体污染与检测：
支原体污染的培养细胞，在显微镜下无特殊的外观表现，培养液也不浑浊。因而在污染早期相当难以发现。
如果发现细胞增殖缓慢、破碎的细胞甚多、培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应怀疑培养物可能受到支原体污染。
检测技术：DNA荧光染色法、PCR、免疫学方法以及支原体培养法。
7. 病毒污染的检
?感染了病毒的宿主细胞形态上不一定有显著的特异性改变，因此较难判断。
?判断方法：电子显微镜观察，免疫学方法，和PCR方法
二、污染的预防
1、培养操作前的准备：
a.定期清洗或更换超净工作台的空气滤网，检查其空气净化标准
b.培养液和培养器皿的无菌检查
c. 操作野的消毒
d.操作者的清洁与消毒
2. 培养操作时的注意事项：
a.培养瓶瓶口与风向一
b.培养瓶的开启、吸管帽的安装等
c.操作时，动作轻软、不许交谈
d. 操作完毕后的清理与消毒
3、其他注意事项：
a.及时冻存有价值的培养物
b.血清的灭活
c.定期更换培养体系中的抗生素
d.定期清洁CO2培养箱
e.新引进的细胞株应严加观察
三、污染的排除
1.抗生素
2.巨噬细胞共培养的方法
3. 小鼠腹腔过继培养方法
思考题
细胞培养的基本条件？
细胞冻存和解冻的原则是什么？
名词解释：细胞系和细胞株。
如何进行细胞计数？细胞计数的公式是什么？请详细说明。
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
2014年细胞培养重点 名词解释： 1组织工程应用工程科学和生命科学的原理，开发用于恢复、维持及提高受损伤组织和器官功能的生物学替代物。从而使组织工程学研究的内容、应用范围和任务更加明确。组织工程的主要n的或内涵是对人体器官和组织修复。 2.接触抑制.指细胞相互接触后失去运动的现象。 3.肿瘤干细胞肿瘤中具有自我更新并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。 4.平衡盐溶液简称盐溶液，集缓冲液的缓冲能力、生量盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体。在生理盐水的基础上，分别加入了无机盐、葡萄糖以及少量酚红，具有维持渗透压，调节溶液的PII值，同时能供给细胞生存所需的能量和无机离了成分的作用, 常用的BSS有PBS、Hanks液等。 5.密度抑制由于细胞密度过大，培养液营养耗尽，代谢产物过多，和生存空 间消失所引起细胞增殖抑制的现象。 6.去分化指己成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚的状态，但是分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态，可重新表现出分化的特点。 7.iPS诱导多功能干细胞即诱导多能干细胞，是指体细胞经过基因“重新编排”, 回归到胚胎细胞的状态，从而具有类似胚胎干细胞的分化能力。这种方法可以不需要用人胚胎或卵母细胞，就能制造干细胞。 8.confluent汇合指细胞增殖生长相互连接成片占据所有底物面积现象。 9.细菌污染培养的细胞被细菌污染均会造成细胞受损和死亡，是细胞培养工作的大敌。 细胞发生污染时，常有培养液变浑浊和PH发生改变等现象，镜下观察细胞变形、生长缓慢或分裂相消失，以及细胞圆缩脱落等现象。常有抗生素预防该污染。 10.灭菌杀灭物体上所有微生物的方法，包括病原微生物和非病原微生物、繁殖体和芽胞。 11.单克隆抗体，指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识别一种抗原决定簇的均质抗体。 问答题； 1 .试述“克隆”的基本概念并举例说明其在细胞培养工作中的实际意义。 克隆(Clone):指由从一个共同的祖先通过无性繁殖而来的、遗传上同一的细胞群或后裔；Clone也可作动词用，用于指细胞形成克隆细胞群的过程，即从群体中把单个细胞分离出来, 通过增殖形成细胞群或后裔的过程;
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 The final edition was revised on December 14th, 2020.
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
细胞传代培养（胰蛋白酶消化法） 具体操作： 一. 传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 二.胰蛋白酶消化； 1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 三.吹打分散细胞： 1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 四.分装稀释细胞： 1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 五.继续培养： 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。 传代细胞培养注意事项： 1.严格的无菌操作 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
细胞工程知识点 1、细胞工程：以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。 2、细胞工程的应用： 1)动植物快速繁殖技术：植物组织培养、人工种子、试管动物、克隆动物 2)新品种的培育：细胞融合、细胞水平的重组 3)细胞工程生物制品：单克隆抗体制备、疫苗生产 4)细胞疗法与组织修复： 2细胞工程理论基础 1、细胞全能性：每个活的体细胞都具有像胚性细胞那样，经过诱导能分化发育成为一个新个体的潜在能力，并且具有母体的全部的遗传信息。 2、细胞分化：指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程。 3、细胞的脱分化：在一定营养和刺激因素作用下,具有特定结构与功能的植物组织的细胞被诱导而改变原来的发育途径,逐步失去原来的分化状态,细胞特性消失,转变为具有分生机能的细胞,并进行活跃的细胞分裂,这一过程称为去分化。 3细胞工程技术 1、实验室条件：组成：准备室、无菌间、操作间、培养室、分析室。 2、无菌技术、显微技术、细胞观察与分析、细胞分离、细胞保存与复苏 （1）细胞保存方法传代培养保存法低温冷冻保存法(低温、超低温保存) 液体固化的方式（形成冰晶、形成无定型的玻璃化状态） 玻璃化指液体转变为非晶态（玻璃态）的固定化过程，在此状态时，水分子没有发生重排，不产生结构和体积的变化，因此不会由于机械或溶液效应造成组织和细胞伤害，化冻后的细胞仍有活力。 冷冻方法（缓慢冷冻法、快速冷冻法预冷冻法包括逐级冷冻和两部冷冻） 细胞复苏按一定复温速度将细胞悬液由冻存状态恢复到常温的过程。 复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。 细胞培养和代谢调控：
人体外周血淋巴细胞培 养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
肝癌细胞培养 一、培养基 1、RPMI-1640+10%胎牛血清培养基 2、DMEM+15%胎牛血清培养基 成分表
二、实验前准备工作: 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。 1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。 （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
2、橡胶制品清洗消毒： 0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用 3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）： 使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。 三、细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。 实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台（1）取一15ml离心管用滴管在其内滴加5--9ml培养液（取8ml）。 （2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s 内完成。 （3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。 （4）低速离心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培养液再清洗离心一次。 （5）离心后倒掉上清液，在离心管中滴加3ml培养液（RPMI-1640），混匀（可用滴管轻柔吹打）。 （6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加15滴10%小牛血清，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。2-3天换一次培养基。 四、细胞传代： 当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。 （1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。（细胞贴壁生长）。 （2）向瓶内加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化（将培养瓶翻转过来，以保证细胞没有脱壁）。 备注：若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液8ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。 （4）倒出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量（约2ml），轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再加3ml培养液+15滴小牛血清。 （5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。 （6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1000r／min) 5min。 （7）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。
细胞工程 （1）绪论 1．根据研究对象的不同，细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程。 2．克隆羊多莉的诞生证明了动物细胞核具有全能性。 （2）第一章基本技术 1. 培养基基本成分 大量元素培养基的大量元素使用量一般在每升几十毫克到几千克。 ①无机盐类包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素微量元素的用量一般低于10-5-10-7克分子浓度。植物所的 微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mn、Mo、Co ②有机成分：糖、维生素、肌醇、氨基酸、其他 ③植物激素：生长素、细胞分裂素 ④水：不同实验室要求使用不同级别的纯化水 ⑤其它附加成分：琼脂、活性炭、附加复合成分 2. 外植体(explant)：指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。 外植体的三种来源：①生长在自然环境下的植物 ②在温室控制环境条件下生长的植物 ③无菌环境下培养的植物 3. 外植体取材总体原则:①根据培养需求选择植物部位 ②多年生植物注意树龄和季节 ③在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作为外 植体 4. 外植体灭菌顺序：外植体→清洗整理→杀菌剂灭菌→无菌水清洗 外植体灭菌后应及时接种培养 5. 外植体培养条件的控制 ①光照光照时间影响外植体再生状态；光照强度因植物类型不同而异；光质 研究报道较少 ②温度适温有利于细胞分裂，而在一定范围内降低培养温度则使细胞的质量 增加。 ③pH 通常使用的pH值范围是5.5—6.5。pH在4.0以下或者7.0以上培养 物就不能正常生长。由于外植体的吸收，引起培养过程中的pH变化； 高压灭菌引起pH值变化 ④气体生长量与气体含量关系呈现倒“V”形，折点处的气体含量对应最大生 长量
植物细胞工程和动物细胞工程默写 1、细胞工程是在或的操作 2、细胞工程按操作对象分为和 3、植物细胞工程通常采用的技术手段是：和 4、植物组织培养的理论基础是： 5、理论上每一个活细胞都应该具有。因为 6、受精卵的全能性最高，受精卵生殖细胞体细胞 7、为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官？ 8、植物组织培养的外界条件：， 内在原理是： 9、植物组织培养的过程：经过形成 经由过程形成，最后移栽发育成。 10、是指已分化细胞经诱导，失去其特有的结构和功能而变为未分 化细胞的过程。 11、是指由外植体长出来高度液泡化、无定形状态薄壁细胞组成 的排列疏松无规则的组织。 12、植物体细胞杂交的意义（优势）：。 13、去除细胞壁的常用方法：（纤维素酶、果胶酶等） 14、人工诱导原生质体融合方法：物理法：等； 化学法： 15、融合完成的标志是： 16、植物体细胞杂交过程包括：和。 17、植物体细胞杂交的原理是：和 18、人工种子的特点是： 19、作物脱毒(1)材料: (2)脱毒苗: 20、单倍体育种：(1)方法: (2)优 点: ; 21、动物细胞工程常用的技术手段： (基础)、、 、
22、动物细胞培养的原理是：。 23、用处理，一段时 间后获得单个细胞。 24、细胞贴壁： 25、细胞的接触抑制： 26、原代培养：，培养的第1代细胞与传10代以 内的细胞称为原代细胞培养。 将原代细胞从培养瓶中取出，用处理后配制成，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为 27、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为 28、细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡， 少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代 细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失 去接触抑制，容易传代培养。 29、动物细胞培养的条件：1. 2. 3. （培养 液的Ph为7.2-7.4）4. 30、细胞所需营养：等， 按种类和所需数量严格配制而成的合成培养基。培养基内还需加入、等天然成分 31、动物细胞培养所需的气体环境：95%的空气和5%的二氧化碳的混合气体。氧 气：；二氧化碳： 32、植物组织培养和动物细胞培养的比较：
实验原理 人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。实验材料 人的外周血淋巴细胞
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。 2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶 口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消 毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器 上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6.将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱 底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 二、培养液的更换
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
细胞培养的一般过程 一、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。 二、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。 一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。 四、冻存及复苏 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。 复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。 冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 培养细胞的细胞生物学 一、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞
体外培养包括组织培养、细胞培养、器官培养 Tissue culture: 从体内取出组织摹拟体内的生理环境，在无菌、适当温度、和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 细胞培养：培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。器官培养：与组织培养条件相似，培养的是器官的原基，器官的一部分或整个器官，以便能够在体外生存、生长和保持一定功能的方法 体内外细胞分化的差异： “反祖”（Atavism)现象：细胞失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显；表现为细胞趋于单一化，或获得永生性，或变成具有恶性性状的细胞群。 不适应（deadaption) 细胞在原体内时所拥有的分化特征减弱或不显。（培养的肝细胞酪氨酸转移酶特性丧失）。生存条件改变使分化阻抑。 脱分化或去分化：细胞失掉发生分化的能力（培养的肝细胞失掉产生精氨酸酶、氨基转移酶等特性后，则失去储存肝糖原能力）。是基因突变所致 培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。 细胞分化的关键在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子 原代培养（primary Culture) 从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。细胞群是异质的，细胞相互依赖性强。细胞独立生存性差。 传代培养：当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，继续接种进行培养。这一过程称为传代。否则将影响细胞的继续生存。 组织培养细胞生命期：原代培养期传代期衰退期 细胞系（cell line)：初代培养细胞一经传代后，称做细胞系。 无限细胞系：细胞获永久性增殖能力。核型大多变成异倍体。 克隆形成率（Cloning Efficiency)：细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。 克隆细胞株:从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群 冻存配方：向培养液中加入DMSO或甘油，封与安瓶，存于温度达-196℃液氮中长期储存连续细胞系：获得持久性增殖能力的细胞群体。细胞获得永生性或称为恶性性，而获得不死性的细胞核型大多变成异倍体，接触抑制消失 “一代”指细胞接种到分离再培养的所用的时间。与细胞倍增一代不是一个含义。在细胞一代中，细胞能倍增3～6次，经历三个阶段： 潜伏期：接种——经过——悬浮期（细胞质回缩，胞体呈球形）——贴壁 初代培养细胞经过10~24h或更多连续细胞系和癌细胞系经过10~30min 指数增生期：细胞增殖最旺盛，细胞分裂相增多。是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最好和最主要的阶段。持续3-5天。 停滞期/平顶期：细胞量和密度达到饱和，细胞停滞增殖。表明细胞进入到停滞期,细胞数量持平。特点：细胞不增殖,有代谢活动。培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH 降低，此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。 细胞分裂指数（Mitotic Index, MI)：细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。条件：分裂相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。 接触抑制：细胞相互接触抑制细胞运动的现象。肿瘤细胞没有此现象
实验五人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理 外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 三、实验材料 人的外周血。 四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。
实验5 细胞的传代培养 一、实验目的 熟练掌握动物细胞的传代培养法。 二、实验原理 哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。 三、仪器、材料与试剂 1仪器 CO2培养箱，倒置显微镜，超净台 2材料 培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。 3试剂 完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。 四、实验步骤 1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。 2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。 3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。 4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。 5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。 6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。 8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。
9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。 10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。 五、注意事项 1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。 2.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。 六、实验报告 1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤？ 2.细胞传代培养的目的是什么？