蘑菇菌种与生产
蘑菇生长繁殖离不开菌种。在英语中，蘑菇菌种译为“Spawn”，此词来源于拉丁文，为扩大的意思，因此蘑菇接种的本意是“移植”。
第一节有关菌种的概念
蘑菇的“种籽”是孢子，通常所用的菌种是菌丝体，相当于高等植物的秧苗。种籽一般处于休眠状态，而秧苗常处于生长状态。蘑菇栽培用的菌种是菌丝体，就如水稻不用种籽，而用秧苗一样。
蘑菇菌种由三部分组成，即蘑菇菌株的纯菌丝体、菌丝体着生的基质和包装容器。蘑菇菌种因培养基质结构不同，有固体菌种与液体菌种之分。在固体菌种中，按基质成分的不同，又分为粪草菌种、谷粒菌种等。若按菌种生产繁殖过程的先后，又有母种、原种、栽培种之分，或称其为一级种;二级种、三级种。
蘑菇菌种的生产与作物种子的扩繁有本质的差别，其原因是菌种生产为无性繁殖过程，不发生遗传重组，母种、原种和栽培种之间的基因型是不变的，所以蘑菇菌种的分级尤其是原种与栽培种的划分是人为的。在生产实践中，原种与栽培种可能有一定的差别，这种差别不是由于菌种本身种性的差别，而是在菌种生产过程中由于隐性污染，栽培种的纯度可能比原种低。
做为食用菌生产者，弄清有关蘑菇菌种的概念是很有益的，本节介绍有关知识。
一、种、品种、菌株及菌号的区别
（一）种“种”（species）是生物分类的基本单位，在“属”（Genus）之下，特指具有一定形态特性和生理特性以及一定自然分布区的生物类群。同一种的个体之间遗传特性相似，彼此间交配可育。不同种间的个体则不能相互交配或交配后不能产生有生育能力的后代。生物的每个种都有学名，学名按双名法，用两个拉丁词组成。前一个为属名，用拉丁文名词表示，如Agaricus 意为“蘑菇属”;后一个为种名，常用拉丁文形容词表示，以描述该种的主要特征，如bisporus意为“双孢的” 。
（二）品种每一个品种均有共同祖先，有一定的经济价值，是遗传性状比较一致的人工栽培的食用菌群体，蘑菇品种参照农作物对品种的定义(variety指植物；breed指动物)。品种是人工选择的结果，是人们利用同一物种不同个体间的差异，按照人炎的经济目的不断选择培培育而成，能适应环境条件和栽培条件，在产量和品质上比较符合人类的要求。农作物品种一般指具有高产、优质、农艺性状好，可人工大量栽培的品系，所以品种的定义为“具有生产应用价值的菌株”。我国农作物品种的应用需要经过品比试验，区域性栽培试验，最后须经过作物品种审定委员会评审，批准后取得品种资格方可应用于生产。因而选育一个优良的品种往往需要几年甚至十几年。
（三）菌株在微生物学中，菌株（strain或line）又称为“品系”、“菌系” 或“小系”，含义是起源于共同祖先的相似的个体，如同一种、同一品种、同一子实体分离出来的纯的培养物。在遗传学中一般是指自交或近亲繁殖若干代后，所获得的遗传性状比较稳定的后代。菌株与品种是两个不同的概念，所有的分离培养物只要具有差异性，都可认为是不同的菌株。而品种强调的是生产性状要有代表性，品种可以是某一菌株，但不是所有的菌株都是品种，因为品种必须经过权威部门审定。优良菌株经过鉴定、品比、繁育后，即可成为品种。菌株可作为育种材料，但不是所有的菌株都具有生产应用价值。
不同菌株之间的差异可以是形态差异，也可以是农艺性状或是生理生化方面的差异。区别不同菌株传统的做法是进行拮抗实验或极性测定，现在还可应用同工酶图谱、DNA指纹图谱等鉴别技术。
（四）菌号按国际细菌命名法规（1976），菌株(Strain number)的命名可用任何形式，可
用个人的姓名、地点或数字表示。但为方便起见，一般均用数字表示，附在种名后面而成为菌号，例如法国的蘑菇品种F56、F60；美国Sylvan公司的S130、S608；荷兰的U1、U2；我国的蘑菇品种As2796、闽1号等。
我国的菌号比较混乱，有些单位或个人引进一个菌株后由于商业目的就重新编一个菌号，同一菌株在不同地方有不同的菌号，出现同种异名现象。同种异名给科研工作带来许多无意义的重复，在生产上也给菌种应用带来障碍。还有一种情况，从某栽培品种的子实体通过组织分离，冠以一个新的菌号，这也是普遍现象。一般地说，组织分离不会改变其基因型，分离物与原栽培品种种性相同，不是新菌株。如果进行组织分离的菇体是一个变异体(概率极小)，可以作为新菌株，例如白色木耳、白色金针菇都是从自然突变的个体上组织分离的著名新品种。总之，组织分离是否能编为新菌号，需要有可遗传的新性状，或通过必要的实验证明它与原菌株是不同的。
二、蘑菇品种与菌株类型
（一）蘑菇品种介绍蘑菇菌株有哪些品种？各品系的生产性状如何？具体指标有哪些？介绍如下:
从菇体色泽上区分，双孢蘑菇有白色、棕色和奶油色三个品系：
棕色品种棕色品种菌盖表面平滑，巧克力色，菌柄白色，肉质致密，有份量，抗病。因色泽差，不适合罐藏加工，仅在少数国家局部种植。
奶色品种菌盖表面平滑或鳞片状，菌柄白色，菌盖白色或奶油色，子实体较大。栽培量较小。白色品种菌盖表面平滑，是世界上栽培最多的品种。菇体为纯白色，颇受市场欢迎，世界各国栽培的主要是这个品种。
生产上常用的白色蘑菇品种，各主产国均有自己选育出来的代表品种。不同菌株在生产性状、加工性能等方面存在着差异。从生产性状上分，有适于工厂化生产的品种F56与Ul系列和适于季节性栽培的品种AsS2796系列；从加工特点上分，有适于鲜销的品种S130。表4-1例举了国内外生产上常用的有代表性的杂交品种。
表4-1 蘑菇杂交菌株生产性状简介
国别选育单位菌株名称同工酶谱主要特点
中国福建省蘑菇菌种研究推广站 As2796As3003As4607 HG4HG4HG4 中国广泛使用，抗逆性强，鲜菇适用于罐藏或鲜销。
荷兰 Horst蘑菇试验站 U1U3 HG4 欧洲、北美广泛使用，适于工厂化栽培，罐藏或鲜销
美国 Sylvan公司 S130S608S512 HG4HG4HG4 适于工厂化栽培，鲜销适于工厂化栽培，鲜销适于工厂化栽培，罐藏
法国 Somycel公司 F56F60 HG4 在欧洲广泛使用，罐藏与鲜销
近10余年来，我国推广栽培过多个蘑菇品种，积累了许多值得总结和借鉴的生产经验，介绍主要品种如下:
1．AS2796 是我国具有知识产权的杂交品种，由福建省轻工业研究所王泽生等育成，是自上世纪90年代以来在我国栽培最广的高产稳产优良菌株。据王泽生（2000）报道，在美国试种AS2796，产量也能达到3Okg/㎡，但采菇期要比美国Sylvan公司的菌株长。在国内简陋的栽培条件下比较栽培，表明AS2796比美国菌株更具抗逆性。近几年该品种在福建省的栽培面积占90%以上，在全国已推广2亿多平方米，产菇近200万吨。该菌株的主要生产性状如下：
（1）形态特征①菌丝在PDA培养基上，菌丝呈银白色，基内菌丝和气生菌丝均很发达;在常规基质中，长速中等偏快，一般不结菌被。②菇体圆正、无鳞片，有半膜状菌环，菌盖厚，组织结实，菌裙紧密、色淡，柄中粗较直短，无脱柄现象，每千克鲜菇为90～100只。菇体
基本单生，1～4潮菇产量结构均匀，通常是边长菇边扭结，因此采收要及时。③鲜菇含水较高，加工预煮出率65%，制罐质量符合部颁标准。
（2）栽培要点①较耐高温，栽培时间比一般菌株可提前7～10天。20℃通常不死菇。该菌株出菇较一般菌株晚3～5天。②耐肥，要求投料量为29～30千克/平方米，含氮量1.4%～1.6%。薄料或含氮量低，易产薄皮菇、空心菇。③耐水，结菇水要求菌丝爬上至离土层表面0.5～1厘米时重喷。结菇力强，成菇率高，且后劲大。
2.Sylvan-176 简称S-176。1979年于美国Sylvan公司引进，中科院微生物研究所编号为
S-176。是国内最早大面积栽培的贴生型菌株。
（1）形态特征①菌丝在PDA培养基上呈贴生型，
菌丝索状、分枝多、分隔短，平贴基质呈放射状扇形蔓延。菌丝先端部分稍有气生，基内菌丝较深，长速较慢。②菇体纯白，盖顶扁平，略有下凹，鲜菇80～114只/千克。肥水不足时，菌盖凹陷较明显，有鳞片。风味淡，商品质量欠佳，适于盐渍加工与鲜食。
（2）栽培要点①耐水、肥，铺料厚度不少于20厘米。吃料能力强，长速快，菌床封面较气生型菌株快3～5天。②结菇率高，出菇齐，转潮快，后期产量高，抗病力较强。产菇一般在10千克/平方米以上。③发菌适温25℃左右，出菇适温10℃～20℃。
3.Somycel-111 译名索密尔-111。法国Somycel公司育成。由上海市农科院食用菌研究所自波兰引进。高产型菌株。
（1）形态特征①菌丝在PDA培养基上，菌丝呈贴
生型，菌丝线索状，分枝多，分隔短，顶端稍有气生菌丝，稀疏、呈扇状生长。②菇体盖顶略平，呈浅棕色，柄粗短，菇体组织较疏松。适于盐渍加工与鲜食。单产与176菌株相近。（2）栽培要点①较耐肥、耐湿，铺料厚度要达到17厘米。喷出菇水要早，原基普遍发生，呈米粒大小时，喷用出菇重水。②结菇率高，出菇集中，转潮快。产菇一般在10千克/平方米以上。③较耐高温，可适当提前播种。
4.浙农1号浙江农业大学园艺系经紫外线诱变，从S-176菌株中选育出来，1985年通过轻工部鉴定。是大面积使用的高产稳产菌株。
（1）形态特征①菌丝在PDA培养基上呈半贴生半气生型，线状菌丝较少，基内菌丝较176菌株粗壮，生活力强，吃料爬土快。②菇体圆正结实，胖顶或平凹，无鳞片，菌柄粗而短，色泽洁白、菇形中等偏大，每千克鲜菇60个左右。品质较176菌株有很大改善，可作为罐藏菌株使用。③罐头加工吨耗954～986千克，预煮率63.7%，整菇率62%～77%。
（2）栽培要点①耐肥、水，抗逆性强，土层厚度应控制在3厘米内。②结菇率高，出菇早，转潮快，产菇9千克/平方米以上，高产可达18千克/平方米。③菌丝培养适温20～25℃，出菇温适10～2O℃。
5. 上海101-1 上海市农科院食用菌研究所自国内传统栽培的气生型102-1菌株中选育而成。1987年前后在各地推广应用。
（1）形态特征①菌丝在PDA培养基上，菌丝呈半气生型，线状菌丝束明显，斜面菌丝整体外观绒毛状。菌丝分隔短、分枝多，与气生型菌株长速相近。②菇体中等大小，菌盖直径大多为1.8～4.8厘米。色泽白，组织紧密，菇顶饱满，菇肉较厚。薄皮开伞菇相对较少。质量能达到罐装原料菇的要求。③加工预煮率为68%。
（2）栽培要点①较耐肥、耐湿，原基呈米粒、绿豆大小，表面光滑，无菌丝毛头时，就要喷重水。用水不足，严重影响产量，易出白心菇。菌床以湿管过冬为好。②产菇适温广，在20～23℃持续2～3天不影响出菇。冬季菇房保温措施好，仍能出菇。③结菇率高。据江苏省江阴市长泾镇2.8万平方米栽培，平均单产在8.19千克/平方米。
6.闽1号福建省轻工业研究所从罐藏优质气生型8211菌株中，分离单孢选育。经福建省蘑菇菌种审定委员会批准，自1990年起正式作为优质罐藏菌株推广使用。
（1）形态特征①菌丝在PDA培养基上呈气生型。
菌丝浓白、短而密、整齐、粗壮。②菇体圆正，洁白，菌盖厚实，无鳞片，菌裙小、色浅，菌柄粗短，不易开伞，菇形中等偏大，每千克鲜菇80～100只。③罐头加工，吨耗859千克，罐藏标准一级菇约占60%～70%。
（2）栽培要点①对营养要求中等，覆土要比同类型菌株提早3天。②提前2～3天喷水，以防止菌丝上冒板结。一旦发生土层菌丝板结，可采用低温刺激或重水冲击处理，或将石灰粉直接撒于冒菌丝部位，以抑制菌丝继续板结，但切勿大动土层或更换新土，否则将造成减产。③子实体对温度反应敏感，21℃以上会出现死菇。温差大且变化剧烈，易出现硬开伞，特别是第3潮菇更为明显。产菇量7.2千克/平方米。
（二）蘑菇菌株类型第三章曾介绍，根据不同菌株的栽培特性、鲜菇质量和罐藏加工表现等差异，蘑菇菌株大致分为高产类型、易褐变类型、中产类型、优质类型和不育类型。此外，在菌种生产实践中还常根据蘑菇菌丝在斜面培养基上的外观特征，划分为3种类型:
1．气生型例如上海101-1菌株。这类菌株的菌丝主要生长在培养基表面，延伸后高出基质表面并暴露在空气中(俗称“气生型”菌丝)，其色洁白，绒毛状，又浓又厚;而伸入基质内部的菌丝(俗称“基内型”菌丝)较少，较浅。
2．贴生型例如法国Somycel-111菌株。这类菌株的菌丝灰白色，稀疏或致密，紧贴培养基表面匍匍生长，气生菌丝极少或无，但基内菌丝较多较深。贴生型菌株又名匍匍型菌株。3．半气生型例如浙农1号。这类菌株的菌丝外观特征介于气生型和贴生型之间，白至灰白色，呈线索状在基质表面分布，气生菌丝不旺，菌丝培养初期较少，培养后期才逐渐增多，且多出现在菌丝生长先端部位;其基内菌丝比气生型菌株多，但不及贴生型菌株。半气生型菌株又名半贴生型或半匍匍型菌株。
必须指出，同一类型的蘑菇菌株，其菌丝外观特征只是相对一致，并非完全相同;例如常规气生型菌株与杂交气生型菌株之间，其菌丝外观的差异就较明显;而贴生型菌株中，菌丝形态也有云彩状、年轮状或线索状等多种区分。因此在选用蘑菇菌株时，必须对所用菌株的外观特征尽量了解，并对所用的培养基及培养条件加以分析和比较，以免判断失误。
气生型菌株与贴生型菌株不仅在菌丝细胞的形态结构上和子实体的内外质地上有所区别，而且在生物学特性上也存在一定的差异，即它们的菌丝培养和子实体发育对营养、温度、水分、空气等方面的要求不完全相同。尽管气生型菌株不一定低产，贴生型菌株不一定质次，但就大多数而言，气生型菌株与贴生型菌株相比，其耐肥、耐温、耐水性能较差，抗病力也弱，且结菇较迟，出菇较稀，转潮较慢，单产较低。
杂交型蘑菇菌株AS2796，其菌丝外观倾向于气生型，但与传统气生型菌丝形态有别，在菇质上接近气生型菌株，在产量上则接近贴生型菌株。
生产实践表明，气生型菌株与贴生型菌株在制种和栽培技术上有所不同，需要采取以下相应的技术措施：
1.菌种生产不同培养气生型母种时，要求基质略硬略干一点，如1000毫升斜面基质内，琼脂用量要比贴生型母种增加l克。同时，母种培养的前期温度宜控制在20～22℃，当菌丝布满斜面基质一半以上后，逐渐降至18℃以下，即要求培养温度偏低一些。而贴生型母种则宜控制在22～25℃范围内培养。
培养气生型原种和栽培种时，容易发生菌丝徒长、早衰和吐黄水现象，特别是基质养分过富、发酵过热、含水量过高、装料紧度不够、培养温度偏高、空气湿度大、菌龄偏长时，上述现象较为严重。因此，配制气生型原种和栽培种基质时，要控制好基质的营养配比和腐熟度。采取粪草基质时，粪草比例一般为1:1。粪肥必须粉碎，草料要求偏生一些。采用麦粒、棉籽壳等基质时，适当加些河泥、谷壳，尽量少加或不加粪肥。与贴生型菌株相比，基质含水量要减少2%以上，一般控制在50%-55%。此外，装料要适当紧一些，尤其是瓶内上部基质不
能过松。气生型菌株的菌龄宜控制在40-50天，贴生型菌株的菌龄可达100天，因而气生型菌株的制种时间要推迟进行。气生型菌株的菌丝香味较浓，菌种培养时除要避免出现温高湿大的郁闷环境外，要加强病虫害管理措施。
2.堆肥含水量不同气生型菌株的基质内菌丝较少，菌丝细胞的酶活性相对较弱，堆肥中要多使用有机肥，少用化肥，建堆时碳氮比宜控制在30～33，采用二次发酵的堆肥，气生型菌株要求前发酵堆期为14天，贴生型菌株为12天。进房前堆肥含水量前者控制在58%～60%;后者要求在65%左右。若采用常规一次发酵，气生型菌株的堆肥堆期要比贴生型菌株长2～3天，进房时堆肥的含水量控制在55%左右，而贴生型菌株在堆肥进房时要达到60%左右。
气生型菌株与贴生型菌株相比，耐湿性较差，土层菌丝生长时间长2天，出菇晚3天左右。因此，气生型菌株的菌床覆土前料面含水量要降低，以提高抗湿性，覆土层调水量1平方米减少1～2千克，结菇水和出菇水均要推迟2天左有使用。整个栽培期间，气生型菌株的菌床宜采用轻喷勤喷的方法进行水分管理，一般不要采用间隙重喷的方法。
3.播种发菌不同气生型菌株抗热性不及贴生型菌株，播种时堆肥温度不宜超过28℃，最好控制在25℃左右。播种期一般比贴生型菌株推迟5天，而贴生型菌株播种后则能承受2～3天的28～33℃高温。
气生型菌株比贴生型菌株好气性强，覆土材料的毛细孔要多，透气性要好，一般以采用下粗上细的土粒分层覆盖为好。采用河泥砻糠作覆土材料时，泥糠比例要由贴生型菌株使用的10：1改为8：1，并由一次性覆盖改为2～3次性覆盖，以提高覆土层的透气性，防止菌丝窒息萎缩或产生菌被，同时也能增加土层菌丝的储量、增加出菇后劲。整个栽培期间，气生型菌株的菌床打扦撬料次数要适当增加，菇房的通风换气必须满足。
4.抗逆能力不同气生型菌株对病虫害的抗性较弱，所以菇房的消毒工作要加强，卫生清理要日常化，特别是出菇阶段要防止菇房经常处在高温高湿的环境中。室温一般控制在17℃以下为宜，空气湿度掌握在85%～90%。贴生型菌株由于出菇密度大，菇体含水量高，菇质紧实度不够，因而空气湿度要比气生型菌株提高5%，否则质次菇的现象就会明显。
气生型菌株的春菇产量往往高于贴生型菌株，所以越冬的气生型菌床易采用湿过冬或半干半湿过冬，避免土层中绒毛菌丝枯黄老化，生活力衰退。保持土层湿润而不发白，含水量在15%左右，这是争取气生型菌株高产的关键措施之一。
总之，气生型菌株比贴生型菌株对外界环境条件敏感，堆肥养分含氮量要少一点、含水量要降一点，生长温度要偏低一些，水分管理要轻一些，通风换气要足一些。
第二节菌种制备与保藏
蘑菇菌种来源有两种途径：一是引进菌种；二是分离菌种（组织分离或孢子分离）。蘑菇菌种的分离有2种方法：组织分离和孢子分离。这些方法一般由科研单位采用，所分离的菌种须经出菇品比试验，成功后才能推广应用。
一、菌种分离技术
（一）组织分离属于无性繁殖或克隆技术，从理论上讲，所获菌种不发生遗传重组等变异，因此常被生产上采用。选择无污染并菇形健壮的蘑菇幼菇(6分成熟)，采摘后及时放入灭过菌的纸袋中带回接种室，连同母种用试管培养基等用品一起放入接种箱内消毒。在接种箱内无菌操作，先用75%的酒精消毒双手和工具，然后用0.1%升汞液消毒种菇表面，用消过毒的解剖刀从菌盖与菌柄联结处的中部纵切开，在菌盖与菌柄交界处切成长条形小块（图4-1），用接种钩钩取小块菌肉，迅速接入培养基斜面的中部，塞好棉塞，在25℃下培养3～5天后即可看到组织块周围长出白色稀疏纤细的菌丝，15～18天菌丝即可长满试管，挑选菌丝健旺无污染的菌管再进行转接扩繁，须经出菇试验合格后用于生产。
图4-1 组织分离法
（二）孢子分离孢子分离为有性繁殖，所获菌种已经发生遗传重组等变异，生产性状有可能优于母体，也有可能劣于母体。孢子分离有单孢分离和多孢分离两种方法，单孢分离主要用于遗传育种研究，多孢分离多用于生产繁种。孢子分离技术如下：
1.悬菇弹孢法采取刚弹射孢子的子实体菌盖，在无菌室经消毒处理后，将菌褶朝下悬吊于无菌容器内收集孢子（图4-2），在22～26℃下让其自然弹射孢子5～10小时，容器底部出现白色孢子印。取无菌水，粘取少量孢子制成孢子悬浮液，用灭过菌的注射器或滴管吸取孢子悬浮液，滴1～2滴于试管斜面上，经25℃培养至孢子萌发，挑选无污染的斜面进行扩繁，经严格的出菇试验，择优用于生产。
图4-2 蘑菇孢子弹射分离装置
2. 褶片粘贴法在无菌条件下取一小块子实体组
织，蘸少量无菌琼脂或浆糊，粘附于试管培养基斜面的对面玻壁上(图4-3)，加棉塞后在20℃左右静置，菌孔组织中的孢子会弹射到斜面培养基上，再去掉试管壁上的菌块，经进一步培养获得多孢子萌发的菌丝体。
图4-3 褶片粘贴分离法
3. 分离菌株的鉴定蘑菇孢子分离后得到新的菌丝体，不仅存在较大变异性，而且其单个孢子中还有20%～30%是不能结菇的，即使是组织分离得到的无性繁殖的菌丝体，也不一定能完全保持原菌株的优良性状。所以经分离、提纯后得到的纯菌丝体培养物，在末作出栽培鉴定之前，不能盲目用于生产，以防栽培后出菇不正常或不出菇。
蘑菇的菌种鉴定方法有多种，最可靠的方法是通过实际栽培，从形态特征、生理特性这两方面对菌丝体和子实体进行评价，也就是说首先要确定所分离的菌种是不是蘑菇所需的菌种，即种性要纯，再就是所得的蘑菇菌株好不好，即品质要优良。一般来说，凡是长期从事蘑菇制种生产、实践经验丰富的专业工作者用肉眼就能鉴定所分离的菌株是不是所需的蘑菇菌株。但是蘑菇菌株质量的优劣和生产性状、经济性状的好坏则绝对不能单凭菌丝形态、生长快慢来判定，还必须通过菌种的逐级培养观察，特别是对栽培出菇情况做最后的考核。即便是最好的菌种，经长期保藏后使用，仍需重新进行一次栽培试验，以保证大面积生产万无一失。
二、母种制备技术
在蘑菇菌种生产中，菌种制作通常分为三级，即母种、原种和栽培种。母种也叫一级种，由于菌丝生长在试管的斜面上，所以又称为试管种或斜面种。为了保证质量，防止退化，母种的转接扩管不超过3次，转扩次数增多，产量有下降的趋势。对长期保藏的菌株，复壮后须经出菇试验，方可用于大规模生产或销售。一般生产者都是引进母种，经扩繁后用于制备原种。
（一）培养基配方母种培养基常用琼脂做凝固剂，其又名洋菜或冻粉，从海藻石花菜或其他红藻中提取加工而成，为透明、无味、粉条或粉末状。琼脂的主要化学成分是多聚半乳糖的硫酸脂，包括D-葡萄糖醛酸、L-半乳糖、D-半乳糖、3,6-脱水-L-半乳糖和丙酮酸等。干琼脂一般含水16%，灰分4.4%，氧化钙1.15%，氧化镁0.77%，氮0.4%。琼脂化学结构稳定，不易被菌丝分解利用，在培养基中仅起凝固剂的作用，其在96℃时融化成液体，冷却到45℃以下即重新凝固。由于用琼脂配制的固体培养基清晰透明，便于观察菌丝的形态，故成为常规斜面域平板培养基不可缺少的材料。其用量因使用季节、目的和琼脂本身质量的不同而异。
一般在冬天加1.5%～1.8%，夏天为2%，分离菌种时加2.5%，生产时加1.5%～2%。用量过多，培养基较硬，保水性好，不易干燥，但成本高。须指出，即使是最纯品的琼脂，也仍然会含有微量的含氮化合物及残存无机盐，因此在进行营养要求精确的实验中不用琼脂。对于生产而言，要求培养基营养丰富，菌丝健旺，因此采用各种加富培养基。常用的母种培养基如下：1.马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(PDA)：去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升。这种培养基养分较少，菌丝不会徒长，常用于菌种分离、提纯及转管保存菌种。
2.马铃薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2.5克，硫酸镁0.5克，蛋白胨3克，维生素B120毫克，琼脂20克，水1000毫升。
3.麸皮200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，水1000毫升。
4.酵母膏20克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，水1000毫升。
5.平菇200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2.5克，硫酸镁0.5克，蛋白胨3克，琼脂20克，水1000毫升。
（二）制作试管斜面
1.配制培养基选择优质马铃薯，去皮(挖去芽眼),切成薄片，称取200克，加水1000毫升放入小铝锅内煮沸20～30分钟，趁热用3层纱布过滤后取滤液,并用热水补充到1000毫升，倒回小铝锅内。加琼脂继续加热，并用玻璃棒搅拌至琼脂全部溶化后，加葡萄糖，再补水至1000毫升。
2.分装试管母种培养基一般用试管为容器，常用的规格为2种：18毫米×18毫米及20毫米×20毫米，培养基装量为10～15毫升，为试管长度的1/4～1/5，培养基不可沾附试管内壁，如有沾附物必须擦试干净。
3.做棉塞取适量棉花制作棉塞，棉塞要做的圆滑硬实，棉塞总长3～4厘米。标准的棉塞应是塞头较大，不易变形，入管的部分占塞总长的2/3，露在管外的部分则为1/3(不少于l
厘米) 。棉塞的大小、松紧要与试管口配套，塞入试管的棉塞要紧贴管壁，不留缝隙。过紧妨碍空气流通，也不便操作;过松则达不到滤菌目的，且棉塞易脱离试管。松紧度以提起棉塞试管不脱落适为宜。
4.灭菌将6～8支试管捆成1把，上面用牛皮纸包住，用皮筋或线绳扎紧，以防棉塞受潮。直立放在高压锅内灭菌。加热灭菌时，排尽锅内冷气，当温度升到121℃(压力1.0千克/平方厘米)时，维持30～40分钟后停止加热，待指针回到零点，先打开锅盖的1/5，利用余热烘干棉塞，等到无直冲蒸汽时，再打开锅盖，取出试管。
5.摆斜面趁热将试管一端垫放到木条上，使其成一定角度的斜面，一般斜面长度达试管全长的1/2为宜。气温低时，覆盖保温，以防冷凝水过多，待完全凝固后，收取备用。
6.灭菌效果检查随机抽取5支试管，在25℃下进行空白培养3～5天后，检查斜面上有无杂菌，如果发现有杂菌，说明灭菌不彻底，要废弃或重新灭菌，无杂菌出现即可供接种用。（三）母种的转接蘑菇菌株类型不同，应采取不同的移接技巧，这对保持菌株特征和生产上的正常使用都是必要的。操作技术如下:
1.消毒接种前先将接种用具、培养基以及菌种等放到接种箱(或接种室)内，然后按每立方米用高锰酸钾5克，40%甲醛溶液10毫升的量进行熏蒸消毒30分钟，如有紫外线灭菌灯，同时开启照射30分钟后进行接种。
2.接种接种时试管口不要离开酒精灯火焰的无菌区（图4-4），灼烧接种钩并待其冷却，将斜面上的菌苔纵横划切成米粒大的小块（图4-5），深度以稍带培养基为适，然后再取种块迅速放到待接试管斜面的中心位置，抽出接种钩后，再把试管口烘烧一下，棉塞过火后迅速塞好。如此反复接种，一般每支母种可转接30～50支试管。
图4-4 母种转管无菌操作方法
图4-5 母种转管分割方法（仿陈士瑜）
在实际操作时，气生型菌株、贴生型菌株、半气生型菌株的转接技术有下述不同：
（1）气生型菌株这类菌株挑取的标准是菌落形态饱满，浓白，菌丝尖端生长挺直，生长势强，分枝清晰，菌丝尖端平齐，基内菌丝扎得较深，从基质反面可见到轮状的生长斑纹。转管移植时，种块附着的基质不要太厚;要稍带基内菌丝，注意不要桃选菌丝过于浓白、生长势过旺的菌丝。沿试管上卷爬壁的菌丝一般不要使用，以避免造成菌种培养基内或栽培菌床上过多出现菌丝徒长或结菌被的现象，以及倒毛及黄化现象。
（2）贴生型菌株分离这类菌株时，在多孢子单菌落挑选过程中要舍弃原始菌落中的气生菌丝、尽量挑选基内菌丝生长势强、扎根深、菌丝粗壮的菌落。在显微镜下观察，菌丝具有节间短、分枝多;节间处膨大等特点。据栽培实践表明，这类菌株中以外观呈云彩状和年轮状菌丝类型为好，其结菇性能好，产量高。转管移植时，种块长有贴生菌丝的一面朝向基质或采用两点接种法，可使菌丝较快长满斜面。
（3）半气生型菌株分离这类菌株时，要挑选气生菌丝和基内菌丝生长相对均衡的单菌落，移植部位的贴生菌丝要求排列稀而清晰，呈线束状;尖端挺直，健壮有力;气生菌丝不浓，所占比例适中;基内菌丝深，长势旺盛。
（四）母种的培养将接种后的试管放入25℃的培养箱或培养室进行恒温培养，一般需要15～20天的培养，菌丝才能长满试管斜面。在培养过程中要随时检查，挑除有杂菌感染或有异常现象的试管，以保证母种的质量。
蘑菇母种经一段时间培养后，其气生菌丝常会出现倒伏，俗称“倒毛”，或发黄褐变现象（图版21），其主要原因是培养基不适。此外，接种时种块培养基挑得太厚、培养环境通气不良供氧不足、培养温度偏高或温差过大、菌种本身活力差耐热耐湿性弱、菌龄过长、基质养分消耗竭尽等。因此，制做母种筛选合适的培养基配方非常重要。还应注意被移接母种活力旺盛，接种时种块所带基质宜薄不宜厚，原始种块周围的菌落最好舍弃不用。母种培养时应选用大规格试管，基质盛装量要满足母种生长需要，培养环境供氧良好，培养温度要严格控制，母种数量较大时，应放在通气较好的恒温室内培养。不能及时使用的母种，最好在菌丝尚未长满斜面时就移入4～5℃的环境中存放。
三、原种及栽培种的生产
原种是将母种转接于装有堆肥的菌种瓶或袋中进行扩大培养的菌种(二级种)。蘑菇原种的制备程序如下：
（一）麦粒培养基的配制
1.配方与处理麦粒100千克，发酵后干贮粪草或糠壳10～20千克，碳酸钙或石膏粉各1～2千克。
麦粒营养丰富，菌丝生长旺盛，为防止菌丝活力造衰，每100千克麦粒中加放硫酸镁50克，磷酸二氢钾100克，效果较好。麦粒颗粒饱满表皮厚，无虫蛀破粒。一般以经过休眠阶段的隔年陈麦浸泡效果好，吸水软化快。
将麦粒浸入1%～2%的石灰水中浸泡，水面要高出麦粒10～15厘米，并经常搅拌，捞去浮粒。浸泡时间随水温高低灵活掌握，以麦粒内部浸至无白心时为准，一般水温在26℃左右时，大约需浸12～14小时。浸好的麦粒捞出沥水，再倒在干净的水泥地面上吹晾，待麦粒表面水分适度收干后，便可拌入预湿的粪草填充料、石膏粉等，接着装入菌种瓶内。麦粒吸水量控制的标准是，每100千克麦粒吸水吹晾后，湿重达136～140千克为度。
也可将麦粒用清水浸泡8小时左右，再转入沸水中煮或放在笼屉中用汽蒸，煮沸15～20分钟或汽蒸1小时，当麦粒熟透(无白、心)不破不烂时，捞出沥水进行摊晾，待麦粒表面水分收干适度时，再按上述方法配料。此法麦粒持水均匀，对发菌有利。
麦粒吸水调湿后，含水量必须适度。含水过低，质地硬，菌丝穿透难，繁殖数量少，播种后易染菌。含水过高，质地软泡，灭菌时易破裂，淀粉渗出呈糊状，易使麦粒粘结成团，菌丝蔓延后会产生菌被现象。此外，填充料预湿后的含水量应与麦粒含水量接近。
填充料或叫封口料、导引料、过桥料等，能固定谷粒培养基，缩小谷粒之间空隙，从而有利于种块定值吃料封面，有利于菌丝均匀蔓延生长，避免了谷粒松动后造成的菌丝断裂或产生菌被等现象，同时可提高谷粒菌种的成品率，生产管理也较方便。常用的填充料有粪草、泥土、谷糠、谷壳等。填充料用量约占谷粒培养基的10%-20%，一般要求较碎较短，最好是经过堆制发酵。配制混合时，其预湿后的含水量要与谷粒含水量相对一致。发酵干贮的填充料不霉变，过长过粗的材料需粉碎。粪草要在麦粒吹晾前4小时左右，用石灰清水预湿，pH 值8左右，含水量为55%左右。预湿好的粪草用其一半作填充料，与麦粒、石膏粉等混合拌匀后装瓶，再将另一半粪草作基质表面封口料使用。
麦粒培养基分装时要上下震动，以利基质结合相对紧实，分装结束后不必打洞便可按常规灭菌、冷却后接入种源。此法省工方便，是麦粒培养基大生产时最常用的方法。
2.灭菌时间麦粒结构紧实，热穿透作用慢，灭菌时间要长，灭菌方式以高压灭菌效果较理想。通常1.5千克蒸汽压力保持3小时以上，2千克蒸汽压保持2小时以上或者常压蒸汽灭菌100℃时保持10～12小时以上。
（二）棉籽壳培养基的配制棉籽壳系颗粒型结构原料，其营养成分合理，菌丝不易徒长。是食用菌菌种广泛采用的培养材料。用棉籽壳作培养基生产蘑菇菌种，具有发菌快，菌丝粗壮，生命力强，吃料封面迅速等优点，一般1瓶棉籽壳菌种可代替2～2.5瓶粪草菌种使用。蘑菇制种采用发酵棉籽壳作培养基时，可采用以下方法:
1.棉籽壳100千克，干猪、牛粪粉10～15千克，石膏粉3～4千克，过磷酸钙0.5～1千克，石灰4～5千克。先将棉籽壳、干粪粉和一半石膏粉用石灰水或河泥浆水预湿，使其含水量为60%～65%，经混拌均匀后建堆。堆高1米，宽1.3～1.5米，建堆后覆盖薄膜，堆期15～20天，堆温控制在55～60℃。其间翻堆3次，第1次翻堆时加入另一半石膏粉，第2次翻堆时加入过磷酸钙，第3次翻堆时用石灰水调整pH值。堆制过程中，要每日揭动薄膜，并在料堆上每隔25-30厘米间距打洞，以利透气发酵。待棉籽壳发酵均匀，外观呈红棕色时拆堆，打散晒干备用。使用时，提前4小时左右用石灰清水调温，使其含水量达55%～60%、pH值8.5～9。经分装后灭菌，一般2千克蒸汽压力保持2～
2.5小时。
2.棉籽壳100千克，河泥粉30～40千克。尿素1～1.5千克,石膏粉1千克，过磷酸钙0.5千克，石灰4～5千克。先将棉籽壳用pH值l0左右的石灰水预湿，使其含水量达6O%-65%，再均匀加入1～1.5千克尿素后进行建堆。其堆制过程与制法（1）相似，堆制结束后晒干备用。使用时，在100千克发酵棉籽壳中加入30～40千克预先晒干打碎的河泥粉，经混拌均匀后，再用石灰水逐渐调湿，使其含水量在55%左右，pH值为8～8.5，经分装并灭菌后使用。该基质适宜菌丝容易徒长的气生型菌株使用。
棉籽壳团粒性好，但间隙较大，分装时要适当注意紧实，可防止“塌肩”而抑制菌丝徒长。高温干燥天气生产时，瓶口料可适当补点封口水，且灭菌后，要及时冷却接种，以避免瓶口失水偏干，不利菌丝定植。发酵料棉籽壳制种，一般40～45天菌丝即可发至瓶底，因此要掌握好制种时间。
（三）粪草料培养基的制作发酵粪草料是制作蘑菇原种、栽培种的传统优化型培养基。该基质尽管制做用工较多，但因其具有选择性，适宜蘑菇菌丝生长，至今仍为众多生产者所采用。其制作要点如下:
1.粪草堆制发酵粪草料培养基堆制方法与蘑菇栽培堆肥堆制方法基本相同，一般粪草比例为5:5或4:6。要求草料新鲜、干燥、不霉变;最好使用大麦秸秆或稻草。堆时草秆对切两段即可，以便发酵后抖去粪肥。粪肥用猪、牛粪等均可，要求先晒干、粉碎后使用。堆制时要求堆温在70℃左右，期间翻堆2～3次。低温季节堆料要增加翻堆l次，堆期也要适当延长。由于高温灭菌时会使培养基成分进一步分解熟化，所以粪草发酵腐熟度要比栽培蘑菇的堆肥略生些。尤其是气生型菌株，如粪草料偏熟，会造成菌丝徒长，形成菌被。此外，过熟的草料经高温发菌后容易糊化，通气性较差，菌种会发生“吐黄水”等早衰现象。通常当草料变为咖啡色，手感柔软时，即可拆堆，抖去粪肥(仍可用作制种或栽培)，拣出草料，经薄摊勤翻晒干后贮藏备用。
2.培养基配制培养基配制时先将草料进行粉碎或人工铡切成3厘米短段，然后加入1%石膏粉、1%过磷酸钙。如果草料在摊晒时被雨淋过或质地欠佳，还可以加入1%左右的发酵粪肥，或添加1%的硫酸铵等。由于草料吸水速度较慢，一般需在基质分装前3～4小时左右先加水拌料，以使草料吸水均匀。通常100千克草料需吸水11O～120千克，检验方法是用手握紧一把料，指缝间有水渗出而不下滴为宜。气生型菌株含水量控制在55%左右，贴生型菌株控制在60%左右，原种和前期栽培种偏干一些。以防"吐黄水";后期栽培种稍湿些，以利加快发菌。拌料加水时要用适量石灰，将料内pH值调整到7.5。
3.分装方法培养基含水量、酸碱度调好后即可分装。由于草料蓬松，不易入瓶，所以要手抓料置于瓶口，用另一手紧握木捧将草料压入瓶内并塞紧。一般750毫升菌种瓶每瓶装料量为湿重0.4千克左右，也就是装至瓶肩部位。料要装得松紧适度，上层稍紧些，下层稍松些。装料过松发菌虽快，但瓶内上部菌丝易衰老退菌;装料过紧，瓶内透气性差，发菌困难，料装好后，用锥形木棒朝料中部打下洞穴，深达瓶底，以提高瓶内透气性和固定接种块。打洞后，擦干净瓶壁，塞入棉塞。棉塞宜紧不宜松，要求距料面1.5厘米以上，这样既利于通气发菌，又可避免棉塞与湿料接触，以减少杂菌污染。
堆肥配制分装要求当日完成，当日灭菌，特别是高温天气，要特别注意，以防基料酵解变质。灭菌要求在2.5千克蒸汽压力下，保压2小时，或在2千克蒸汽压力下，保压2.5～3小时。
4. 接种方法接种前必须使瓶温降至30℃左右，防止高温接种热死菌种。有冷却室的在冷却室冷却，没有冷却室的可直接在接种室冷却。每支母种可转接3～4瓶原种。接种前，首先把接种室(箱)打扫干净，喷2%来苏尔或新洁尔灭净化空气，再把已灭菌的菌种瓶及用具全部搬进去，然后按常规对接种室(箱)进行严格消毒。接种需严格按照无菌操作进行。
接种者手持母种试管，用酒精棉球将试管擦2次，然后拔开棉塞，试管口对准酒精灯火焰上方，用火焰烧一下管口，把烧过的接种耙迅速插入种管内贴玻壁冷却，将斜面前端1厘米长的菌丝块挖去，剩余的斜面分成3～4段，另一个人在酒精灯火焰上方，在接种者取好菌种块的同时拔开原种瓶棉塞，接种者将菌种块取出，快速接入原种瓶的接种穴内，棉塞过火焰后塞好。如此一支试管可接3-4瓶原种。每接完一支试管，接种耙要重新消毒，防止交叉感染。接完种后，立即将台面收拾干净，将各种残物如试管、洒落的培养基、消毒用过的棉球等均清出室外，照前述方法进行第二轮接种。
栽培种的接种和原种有一点不同，即原种接种用的是试管母种，而栽培种接种用的是原种。
四、蘑菇液体—麦粒菌种
“液体-麦粒菌种”是以液体菌种为种源制作的麦粒菌种。一般的谷粒菌种要用谷粒培养物作种源，制种所需时间就较长。采用现代发酵技术制备液体菌种，能使蘑菇菌丝体细胞迅速分裂，因而制种时间比谷粒菌种发菌快10倍。但是液体菌种不适合直接接种在大批量的堆肥培养料上，因为保存和运输均不方便。为扬其长而避其不足，可采用液体菌种作为种源生产谷粒菌种，兼具液体菌种和谷粒菌种两者的优点，能缩短制种时间和提高菌种质量。
用作种源的液体菌种一定要纯净，未受细菌和霉菌的污染，菌丝球要密实，每毫升液体菌种
含菌丝球1000～3500个。有大量菌丝，在3000转/分速度下离心十分钟后，每100毫升发酵液中的菌丝重量达到20～25克;菌丝球小而均匀，80%菌丝球的直径小于2毫米。
笔者推荐使用“菌之家”牌机械（空气）搅拌液体制种设备（图版权49），其有如下技术特点：①规格100升，实装培养液70升，费用150元，可接栽培种5000瓶；②搅拌功率370W(380伏)，0～200转/分钟，无级可调；③电脑自动控制制种过程；④全套系统包括100升不锈钢罐体1个、电脑控制箱1个、电机调速系统1套、两级空气过滤系统1套(含中、高效滤芯各1个)、无油润滑压缩机1台、不锈钢安装底盘及支架、仪表、空气管路等；⑤搅拌转速可调，适用于任何食用菌液体制种。⑥售价33000元/台。
决定液体菌种菌丝球数量的关键因子是碳源、氮源和pH值。适于蘑菇液体培养的碳源是浓度为1～3%的糖蜜、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉。适合的氮源为浓度0.2～1.0%的蛋自胨、酵母膏、玉米粉浸出液或糊化玉米粉等。选用这些碳源和氮源培养蘑菇液体菌种，菌丝生长量较大，100～200升发酵罐一般供氧培养4天左右即可。
用小麦粒作生产菌种的培养料，将煮制好的小麦粒装入750毫升的玻璃瓶里，每瓶装250克，8000麦粒，接种15毫升液体菌种，共含有3万个丝球，经震荡后，每个谷粒上平均有3.5个菌丝球。由于这么多分布均匀的菌丝球同时生长，菌种就自然而快速地生产出来了。一般来说，用液体菌种生产蘑菇谷粒菌种所需时间仅为3～7天，这比用琼脂培养物或谷粒菌种作为原种所需的时间（30天左右）要少得多，细胞的年龄一致，老化菌丝少，污染率低，用液体-谷粒菌种栽培双孢蘑菇可增产15～25%。
五、国外的菌种公司
国外的小型菇场都是购买大公司的菌种，他们认为这样不但菌种质量有保障，从经济上也更合算。这有道理，原因如下：
（一）育种研究高水平欧美的蘑菇菌种生产已经工业化和集团化。例如全美最大的蘑菇菌种公司Sylvan，全称为Sylvan Foods Holdings.Inc.，在宾州（Pennsylvania）和内华达州（Nevada）设有科研机构。位于法国的Somycel实验室位于巴黎西部约250公里的兰吉斯（Langeais）的罗丽谷，其发明的一项菌种生产专利工艺已为世界采用40多年。瑞士Hauser 实验室有2个基地：1个在的苏黎士附近；另1个是众所周知的白色皇后公司，位于英国伦敦北部约160公里处。其发明的1个新产品能使覆土后采菇时间缩短7天。
为保证菌种的安全，1个菌株同时存放于So米ycel，Hauser及Sylvan 3个试验室中，并应用了超低温液氮保藏系统。科技人员利用这些种质开发具有商业价值的蘑菇菌株。尤其是由Kerrigan博士领导的宾州实验室，有一个稀有的野生菇及商业菌株基因库。他们每年投入大量经费，在最好的品种之间进行杂交，不断改良现有品种，培育高产、优质、耐热又抗病的商业菌株。此外，该公司还致力于研发各类培养添加剂与各类杀虫灭菌剂。
（二）菌种生产规模化 Sylvan创建十多年来，兼并了有100多年历史的法国Somycel蘑菇菌种公司和瑞士Hauser蘑菇制种公司，组成强大的Sylvan集团公司。除亚洲以外，Sylvan 在各大洲均设有分公司，共有300多名科技人员与熟练工人参与菌种研究、生产以及售后服务。年产约15000吨栽培种，可供生产鲜菇45万吨（鲜菇：菌种=30：1千克）。
Sylvan在北美和欧洲各有2家制种厂，采用现代化的菌种生产系统。对菌种的纯度、稳定性和活力的要求是一致的。对每个用作母种的菌株都做生长质量、栽培性状和遗传特征等分析。接种生产和菌种测试成了2道不可分割的工序。接种室的消毒甚至比医院的手术室更严格。制种用的谷物材料先经高温灭菌、而后接种装袋(或包)，送进有空调设施的培养室。每一个菌种袋都由电脑打上日期及有关菌株的代号等。发菌完全的菌种袋都必须移入2℃左右的冷库中储存。为了确保质量，所有菌种都由带冷藏设备的卡车或集装箱运输，包括运输到世界各地;冷藏效果由夹在菌种箱中的温度自动记录器记录。
在母种使用前和栽培种生产后作试验性栽培，如果试种出现问题，那么这批菌种就要被销毁。
试种合格的菌株，在出厂时每包菌种还得经过最后的质量检验才能装箱，检查人员发现有与质最标准不符的问题，整包菌种也要销毁。质量第一，信誉第一，在Sylvan公司的菌种生产过程中得到充分的体现。在美国宾州制种工厂，检测人员甚至比生产人员还多。其质量监控是全程的，目的是要把所有的问题消灭在产品出厂之前。
从菌种保藏的评价系统，母种的纯度，活力和遗传特征检测到制种全过程的质量监控是Sylvan公司，也是欧美各跨国公司几十年，甚至是二、三百年来积累下来的研究与技术革新的精华，他们称之为制种公司的商业秘密，公司的命根子。因此菌种在严格的质量管理之下进行生产，市售的蘑菇菌种有谷粒菌种和粪草菌种。
六、生产菌种注意事项
（一）卫生管理提前几天打扫培养室，对水泥墙壁、地面要进行清洗，并严格消毒处理后方可使用。培养室要求保持空气干燥、清洁、避强光，留有能启闭的通风口，空气流通无死角。
（二）温湿度控制将接种后的原种瓶搬入培养室，保持温度在25℃左右，保持空气湿度55～65%。一般3～5天菌丝即可吃料，7～10天菌丝即可封面。待菌丝封面后，加强通风换气，保持室内空气新鲜，一般培养25～85天菌丝即可长满瓶。
（三）检查污染发现污染杂菌应及时采取措施。原种瓶内杂菌滋生部位不同，其污染原因亦不同:如棉塞受潮，空气湿度过大，瓶口部位易滋生红色链孢霉。如瓶内上下均发生绿霉及毛霉等杂菌，则可能是灭菌不彻底。如随机发现接种块四周发生杂菌，则可能是接种操作不熟练或棉塞过松所致。如紧邻几瓶的种块全部滋生杂菌，可能是母种带杂菌或接种工具灼烧灭菌不严。不管那种情况，一发现杂菌危害后，必须及早清除，以防蔓延导致大批菌瓶发生杂菌感染。初期污染的种瓶可重新彻底灭菌，重新接种，不可延误。
除染杂菌外，有时种块不萌发。其原因是:一是接种工具灼烧后未冷却就挖取菌种块，菌丝被烫死或菌丝过火焰时被火焰烧死。二是母种干缩老化，失去萌发力。三是培养温度不适宜，菌种瓶灭菌后未冷却，菌种受热而死。
有时菌种块虽能萌发，但不吃料，其原因主要是：菌种块与堆肥结合不紧密;堆肥偏干;堆肥的酸碱度不适宜;堆肥内加入了过量抗杂菌药物如多菌灵等。因此接种时要使菌种块与堆肥紧密结合;坚持随拌料随装瓶，及时灭菌防止堆肥变酸;选用木屑时要严防混入松柏木屑;配料时不要随意添加或过量添加多菌灵等抑菌药物，以防菌丝生长受到抑制;要保持室内空气湿度55～65%，要远离热源，使种瓶受热均匀。
（四）添加尿素的影响菌种培养基种添加尿素，能够补充氮素的不足。但尿素中的氮是以尿胺态形式存在的，蘑菇菌丝不能直接吸收利用，只有经过带有尿素酶的微生物分解吸收后，才能被蘑菇菌丝间接利用，这个分解过程一般要4～6天时间。这就是说，菌种培养基添加尿素后，若按照发酵料培养基的制作方法进行，即菌种培养基在采用正规发酵技术，对原材料进行预处理时，是能够适量加入尿素的，其理由是培养基经12～20天堆积发酵后，尿素被相关的微生物分解，就可以很好地为蘑菇菌丝所用。如果菌种培养基在装瓶入袋前才添加尿素，则是不恰当的，其结果往往事与愿违，其原因是常规菌种培养基经过配制装瓶入袋后，都是尽早进行灭菌，添加的尿素未经微生物分解只能保持原状，蘑菇菌丝便无法利用;若尿素添加过量，还会不是影响菌丝生长，如果菌种培养基添加尿素配制后，只经过短时间(1～3天)堆积，就分装后灭菌，同样也是不适宜的，其原因是短期堆积过程中，基质内虽有一些微生物参与分解尿素，但尿素分解不充分，还会放出氨气，基质中含有较多的氨便能杀伤蘑菇菌丝，进而造成接种后种块不能萌发或萌发后菌丝逐渐萎缩。因此，菌种培养基在装瓶入袋前，若要补足氮素，最好加入腐熟的粪粉、肥泥粉，或麸皮、米糠、玉米粉等。
七、蘑菇菌种质量控制
（一）菌龄控制蘑菇菌种生产中所说的菌龄，一般是指菌丝长满基质培养成熟所需要的时
间。菌龄的长短与培养温度、培养基成分、接种量大小等因素有关。适龄的菌种菌丝量大，菌丝活性强，实用价值高;幼龄的菌种菌丝量少，实用价值低;超龄的菌种菌丝量虽大，但菌丝已呈衰老状态，活性下降，使用效果差。因此幼龄菌种需继续培养后再使用。适龄菌种若不立即使用，应置于低温环境下存放，以延缓菌丝衰老程度。在生产中应避免使用超龄菌种。生长在培养基或堆肥中不同部位菌丝体的菌龄不同，一般生长在接种点附近的菌丝体成熟早、衰老快，菌龄也长，而离接种点运的菌丝体发育迟，菌龄也短。以瓶装菌种为例，靠近瓶底的菌丝菌龄短。蘑菇菌种的适龄标准是，在适温培养条件下，母种长满培养基表面后再延长3～5天使用较好;气生型母种菌龄20天左右，贴生型母种菌龄30天左右。原种、栽培种长满瓶后，再延长7～10天使用较好;气生型菌株的菌龄一般为40天左右，贴生型菌株可适当延长，延长时间的目的是促进菌丝体向培养基内部生长，增加菌丝量，提高菌种实用价值。这点在制作菌丝穿透较慢的谷粒菌种和生料菌种时尤要注意。
一般来说低温下培养的菌种，时间延长一些，对菌种的质量无明显影响。但在高温下培养时，则不能随意延长时间，因为高温下菌丝体的生理代谢旺盛，它不但要大量消耗堆肥中的养分，同时还会加快自身的衰老速度。
实际生产中菌龄长短掌握的原则是，只要菌丝生长健壮，培养基不收缩，没有出现黄化倒伏以及退菌、吐黄水现象，菌龄稍长稍短，对产量不会有明显影响。
（二）菌种质量标准目前我国尚无制订蘑菇菌种的国家标准。福建省推荐的蘑菇菌种标准(FDBT/QW—33.90)如下:
1. 一级种(母种) 在同一种培养基斜面上具有原菌株的菌落形态特征，无病虫杂菌、菌丝洁白，生长健壮有力，边缘整齐，不发黄、不老化，菌龄掌握在刚长满斜面即用于扩接原种或继代培养。
2. 二级种(原种) 无感染病虫杂菌、菌丝洁白,粗壮浓密,均匀布满瓶周或管周，外观颜色一致,无不均匀斑，培养基由棕黑色转为淡棕黄色，有蘑菇特有香味，菌丝不萎缩，不发黄，接种后应在40-60天长满瓶，菌龄掌握在菌丝长满瓶10天左右使用。
3. 三级种(栽培种) 无感染病虫杂菌、菌丝洁白至米黄,粗壮有力,均匀布满瓶周(谷粒种允许出现局部徒长)，外观颜色大体一致,无明显不均匀斑，培养基淡棕黄色，有蘑菇特有香味，培养基不萎缩、不吐黄水。接种后菌丝应在30～45天长满瓶。菌龄掌握在菌丝长满瓶后15天内使用。
除上述菌种标准外，优质菌种（图版22）在种瓶中随机挖取一块菌种，成块而有韧性，不松散。劣质菌种的表现是菌丝表面出现杂菌斑纹(拮抗线)，菌丝细弱，脱壁萎缩，发黄老化，这样的菌种不能用于生产。
八、菌种生产常见问题及原因
（一）“退菌”的原因蘑菇菌种堆肥堆制发酵不良、养分差、基质分装过松、菌丝生长表现稀弱无力，若遇到高温，再加上培养室通风不良，容易造成菌丝萎缩消退，即"退菌"的现象。特别是瓶口菌丝"退菌"较为常见。控制的主要措施是，提高堆肥堆制发酵质量，改善培养基营养组分。分装基质时，要松紧适度，待别是瓶口草料必须捣紧;菌种培养期要尽量减少高温的影响。菌种发生“退菌”时，有时是由于螨类危害所引起，这点不应当忽视。（二）“吐黄水”的原因蘑菇菌种堆肥发酵过热，含水量过高，菌龄长或菌种培养时长时间处于高温环境，初期会造成菌种收缩变形，呈"塌肩"状，后期菌种软瘫呈水渍状，并有黄色水溶物出现，称“吐黄水”现象（图版23）。吐黄水是蘑菇菌丝衰老，菌丝细胞水解自溶，菌丝生长条件恶化的具体表现。"吐黄水"的菌种松软，水分大，不成块，菌丝少或不明显，无菌种香味。症状轻微的"吐黄水"菌种当气温下降后，其菌丝仍能生长，但栽培后发菌不理想，出菇晚，产量低。控制的主要措施:堆肥发酵切忌过腐，特别是采用稻草作基质时，料内含水量切忌偏高；用麦粒作基质时更要注意掌握好菌种生产季节，避免菌龄过长；菌种
培养期间要防止长时间高温影响，越夏菌种要做好降温措施。
（三）污染的原因污染蘑菇菌种的杂菌种类很多（详见第十一章），较常见及容易辨认的害菌（图版24）有黑霉（根霉）、绿霉（青霉）及黄霉（木霉）。
蘑菇菌种被污染的原因较多，有单一因素造成的，也有多种因素交叉影响引起的。检查和分析的时间应在接种后4～5天逐日进行，通常在菌种培养初期检查要勤、要细，菌种培养中后期可适当减少检查次数。若待蘑菇菌丝长满基质或基质被完全污染后再查找原因，往往主次原因混淆，真假难以断定，同时也不利于及时采取相对应的控制措施。菌种被污染的主要原因如下：
1.培养基灭菌不彻底其具体特征是杂菌不仅在基质表面发生，更多的是在培养基内的不同位置出现，即蘑菇菌丝尚未延伸到达，杂菌就在培养基的上、中、下各部位捷足先登。培养基灭菌不彻底，一般接种后2～3天即可发现，它是造成菌种成批污染、大量报废的最重要原因。
2.种源本身带菌其具体特征是污染发生时，最早发生的部位是在接种块上，而不是先在培养基上出现。种源本身带有杂菌，对菌种的危害极大。携带的数量愈多，污染的程度愈严重。种源本身若带有虫体(如螨、线虫等)，则造成菌种病虫害同时发生且蔓延速度加快。
3.接种时污染在种源纯正的条件下，若发现杂菌的始发部位都是在培养基表面的接种区内。那么这类污染多属于无菌操作不严，接种时将外界的杂菌带入而造成的。接种污染在菌种生产中最为常见，绝大多数是由于接种操作时马虎大意，或缺乏无菌操作基本知识所引起。
4.制作管理不当在培养基制作过程中或在菌种培养管理期间，只要有一道环节控制不当，污染的现象就会增多。例如，培养基配制时粪块末打散，原料渗水不匀，内部吸水少，湿料中夹带干料;灭菌装置设计不合格，种瓶灭菌时排放不合理，均能造成灭菌时产生低温死角等，即使灭菌过程符合常规要求，还可能造成少数培养基出现灭菌不彻底的现象。此外，灭菌后棉塞等封口物受潮或封闭较差，冷却室、培养室灰尘多，不卫生，环境中杂菌孢子含量高，害虫出入频繁，菌种培养时温度高，空气湿度大，封口物松脱过或菌种容器有裂纹、孔隙等，均会导致害虫的入侵和污染率的上升。其具体特征是污染区的始发部位都是从培养基的外表，即瓶、袋等菌种容器的开口、裂纹、孔隙处开始。
（四）延误菌种生产的补偿按时生产菌种，是保证菌种质量和适时播种的前提。实际生产中，由于缺乏制种经验或培养条件不善，或制种后污染率高等原因，会造成菌种生产时间来不及，即制种时间拖搁迟误的情况，此时可采用以下方法进行补救。
1.降级制种即由原先安排的母种到原种→原种→栽培种的逐级制种，降级为购买原种→栽培种的生产。
2.越级制种即由常规逐步繁殖制种改为母种多转扩l次后直接越级制作栽培种，省去原种繁殖这一级，也可以理解为原种当栽培种使用。此法是利用母种转扩培养速度快的特点来争取时间。
3.减量制种原种和栽培种由常规的满瓶培养基制种，改为装半瓶培养基制种，以缩短逐级繁殖所需的时间。用此法制种的数量，即制种的瓶数提高或加倍，满足下一级繁殖栽培时的实际需要。
4. 换料制种更换培养基成分，菌种培养时间也可以缩短。例如，用麦粒来代替粪草，不仅发菌时间能明显缩短，而且每瓶麦粒菌种可相当3～4瓶粪草菌种的使用效果。
5.多点接种即由常规的一点接种方式，改为多点接种，以增加接种量，加快菌丝繁殖速度，缩短制种时间。此外也可采用菌种瓶内打洞穴深层接种，种袋上两头接种或一侧多头接种等方式。
上述方法可单独采用，也可综合使用，使用时应结合制种时间来考虑。若栽培季节己到或栽培后发生污染报废，唯一的补救方法是向菌种生产单位直接购买栽培种。
九、菌种的退化及减缓方法
（一）菌种的退化退化(degeneration)指蘑菇菌种原有优良性状、典型性和一致性大部分丧失的现象，如产量下降、品质变劣、抗性降低、整齐度变差等。一般认为，蘑菇菌种的变异或退化主要表现为子实体形成受抑，并常常伴随着发菌出现“菌被”与出菇推迟、头潮就出现开伞菇等迹象。这里必须明确，退化是因遗传性变异引起的，而因环境改变使菌种生产性能下降的非遗传变异不能算退化。
什么是菌种的老化(ageing)？老化主要指生理性而非遗传性的衰退现象，例如长时间贮存的菌种萌发率或转管成活率下降等。
（二）退化的原因菌种的退化可能源于一个细胞发生的有害变异（variety），或一个基因的瞬时突变（Mutation），菌种呈现群体退化现象需要较长的时间。也就是说，菌种的退化是一个渐变过程，在某菌种的群体中，该菌种原有的基因型频率在下降，只有发生有害变异的个体在群体中显著增多以至占据优势时才会显露出来。 Sinden(1953)指出，如果菌种长时间在同一种琼脂培养基中，其菌丝就会出现褐变，生长缓慢生命力不强，而且紧贴在培养基的表面。这种菌株以后在菌种和堆料中亦生长缓慢，最终导致低产。因而，退化指一群个体变劣，变异则指某一个体的突变，例如某菌种产生的子实体群体中有少数子实体与亲代不同，不能算做退化，而是自然变异，例如蘑菇的白色品种就是源于其褐色品种的白化变异。1926年，美国宾夕法尼亚的菇农Downing在奶油色蘑菇中也偶然发现了纯白色子实体。
一般认为引起蘑菇菌种退化和变异的原因如下:
1.突变的发生一般说来，一个正常菌株仅是经过转管移植，因为是无性繁殖，不会导致遗传性状的改变。但是如果蘑菇菌丝细胞内的两个核或一个核发生变异，这种变异的核随着细胞分裂而增殖，并且通过隔膜孔迁移扩散，当菌丝内变异核的比例上升到一定程度时，菌种就表现出退化。此时转管扩繁的菌种，则全部是退化的菌种。
2.病毒的感染感染病毒的蘑菇菌种，其退化现象是十分明显，病毒不仅会随着菌丝体的扩大繁殖而增殖，而且出菇后会通过带毒孢子传染下一代。
3.品种间杂交在自然栽培条件下，不同蘑菇品种间的孢子随风散播，造成一定频率的天然杂交，也是引起品种混杂退化的原因之一。
（三）减缓菌种退化的方法在农作物中，从退化的植株群体中筛选出优良个体为提纯（puriety），由此而使优良种性得到恢复为复壮(regeneration)。对于微生物中的细菌、酵母而言，其菌种是由大量单细胞个体组成，因而也可通过单细胞或单菌落分离而提纯复壮。蘑菇是丝状多细胞真菌，其菌种是许多菌丝的集合体，个体与群体很难区分，因而蘑菇的退化菌种不能通过个体选择来提纯。但是据许襄中(1994)初步研究，采用挑取尖端菌丝(取染毒菌落尖端3～4mm细嫩菌丝)及高温培养(32～34℃)相结合的方法，有一定脱病毒的效果。下面是生产实践中采用的可延缓蘑菇菌种退化的几项措施：
1．防止菌种混杂在选留种菇及进行出菇试验工作中，应加强品种隔离措施，尽量避免品种间的天然杂交，以保证优良品种的遗传型在较长时期内能保持稳定。
2．控制转管次数引进一个优良菌种后，不要立即将该菌种扩大繁殖的首批母种全部用完，而应将其妥善保藏。在批量生产菌种时，每一批均从首批母种开始，逐级扩大繁殖。这样每批栽培种制作时的转接次数不致太多，既可使菌种的生活力较强，又可降低因细胞分裂而产生有害突变的机率。
另外，对菌种可能遭受病毒的感染应保持足够的警惕，对有疑问的菌种要及时检验。确证已感染病毒，尤其是病毒粒子含量大、子实体性状已受到严重影响的菌种，应及时淘汰。3．维生素E抗氧化在高温季节培养蘑菇菌种时，灭菌前每支试管加1粒维生素E胶丸，有延缓细胞衰老的作用，蘑菇菌种在28℃下，经20天不出现黄化菌丝，且菌丝无倒伏、萎缩现象发生。
以上措施虽有助于延缓菌种退化的速率，但是由于造成退化的因素具有相当程度的普遍性和随机性，因此任何一个菌种都不可能永久保持其优良性状，需要适时对菌种进行更新换代。
十、蘑菇菌种的保藏
菌种保藏是蘑菇产业的一项基础工作，是确保种质资源基因留存和现有生产用种遗传性能相对稳定的必要手段。菌种保藏的方法多种多样，有的虽然保藏效果好，但投资高或操作繁杂。在生产实践中，更需要设备投入少，能保障菌种不死亡、不污染、最大限度地保持优良种性的简便方法。保持菌种活力最简单的方法是在适宜的培养基中经常进行继代培养，并把它们存放在3～5℃的冰箱中。Kligman(1943)和Lambert(1959)已证明，尽管反复地继代培养，菌株在相当长的一段时间内仍能保持稳定不变。Kneebne(1965)和Fritsche(1966)亦证实了上述结果。
对于蘑菇来说，控制培养条件、掌握好菌龄、适宜的菌种保藏条件可有效控制菌种老化，液氮超低温保藏是公
认的最有效的保持种性的措施。然而，目前国内绝大部分菌种生产单位或个人没有这种条件，常用的是斜面低温传代保藏(冰箱保种)，这种保种方法常引起菌种老化或生理退化。对粪草生型的蘑菇菌种采用粪草培养基，结合低温(冰箱)进行保种，可获得较好的效果。
一般而言，对母种进行长期保存，对原种进行短期保存。须保证优良菌种的性状和活力不发生变异，不死亡，不被污染，确保其纯度。因此保存方法应具备取材容易，操作方便，菌种不易退化，长期保存不污染杂菌等优点。常用的菌种保存方法如下：
（一）斜面低温保藏该法的优点是保藏方便且所占空间较小。具体做法是:菌丝长满斜面后，放在0～5℃保存。以后每隔一定时间(2～3个月)转管一次。转管保存不能长期用PDA培养基，否则种性易退化。因此隔一定时间（1年左右）须把菌种转接到粪草培养基上复壮，之后挑选健壮无污染的菌丝再转回PDA培养基保存。在长期保存过程中，要防棉塞受潮滋生杂菌。菌种试管口最好用蜡烫封，以防培养基内水分过快蒸发。增加琼脂用量（2.5～3%）可减缓水分蒸发，还要防止菌种管的标签脱落而造成种系混杂。
（二）贫、富培养基轮用笔者在多年的菌种保藏实践中发现，保存菌种的培养基不能营养太丰富，否则菌丝生长过旺易老化，且产生较多的有害代谢物而导致菌种死亡。因此大都采用营养不怎么丰富的马铃薯-葡萄糖-琼脂斜面（PDA）。蘑菇在PDA培养基生长虽细弱，但不易老化、生命保持期长；而在加富（如蛋白胨、酵母膏、麸皮浸液等）的PDA培养基上菌丝生长虽旺盛，但易老化、生命保持期短。因此，蘑菇斜面菌种轮用贫、富培养基保藏，有利于其优良种性的保持和复壮。
同一菌株若长期使用某一培养基，菌丝的生长速度减慢，会出现菌丝细弱、断节、稀疏的现象，这是因为菌丝一直生长在半合成的同一基质上，与其自然生长环境不同，某些酶和活性物质长期得不到启用，会钝化或丧失活力。通过更换培养基，特别是天然营养物质的更换能改变碳、氮、矿质元素成分，恢复菌丝活力。
（三）有孔胶塞封藏棉塞封口培养基易失水干缩；而用无孔胶塞封口造成缺氧，菌丝会因缺氧而死亡或发生生理反应(菌丝或基质产生色素)。如在胶塞上钻孔，孔径1.5毫米，再用棉花封孔口来协调保水与通气的矛盾，菌种贮藏9～12个月后仍能成活80%以上。
（四）自然基质保藏 Lambert(1959)发现，如果母种保存在燕麦或琼脂培养基上，而不是保存于堆料中，则容易出现绒毛状菌丝。Stoller(1962)观察到，如果在小米培养基中加入石膏，将其pH从7.5降到6.5，就可抑止绒毛状菌丝和扇变角菌落的出现;如果在培养基中含有大量的淀粉则可诱导绒毛状菌丝和扇变角菌落的出现。
Fritsche(1968)认为，多种琼脂培养基如燕麦粉琼脂能诱导绒毛状菌丝的形成，而堆料＋琼脂培养基则不会诱导绒毛状菌丝的形成。在英国，谷粒菌种常常形成绒毛状菌丝和扇变角菌落；而粪肥菌种则不会形成绒毛状菌丝和扇状变异菌落。另外，多种化合物，主要是芳香族
化合物也诱导绒毛状菌丝和扇状变异菌落的形成。
Fritsche(1968)指出，两个单孢子培养物由索状菌丝变为绒毛状菌丝，这些菌丝在菇床表面形成致密的白色斑点，因而产量下降。Fritsche(1981)报道了另一种蓬松的绒毛状菌丝，在琼脂培养基中呈现扇形浓密菌丝，这种菌丝的大量出现将会影响产量。
在培养皿中合适的营养培养基上观察菌丝的生长特性虽能够反映菌种的退化，但有些重要的退化特征用这种方法是难以识别的。营养生长正常并不意味着该菌种没有发生退化。
根据蘑菇的特性，利用自然基质保藏其菌种的方法。草腐菌采用以粪草为主料的培养基。自然基质营养全面，且大部为缓释养分，不易产生营养过剩或饥饿；其次，培养基理化性状好，可吸收或缓冲菌丝代谢出的有害物质，水分与通气协调平衡，部分菌丝扎入基质内生长，不裸露于空气中，菌丝呼吸强度低，生命力强。
（五）石蜡隔氧封藏将液态石蜡分装入三角瓶内，装量达瓶空间的l/3，塞好棉塞，于121℃灭菌2小时，然后置40℃温箱中，使其水分蒸发，或置于干燥器内数日以除去水分，石蜡呈透明状为宜。在无菌条件下，用无菌吸管装入已长好菌丝的斜面试管，使液面高出斜面顶部1厘米左右。塞上无菌橡皮塞，竖直保存。此法可使菌种存活3年以上，但以1-2年移植一次为好。移植时不必倒出石蜡，用接种钩取一块菌丝即可。因转移时带有石蜡，菌丝生长弱，需要再转管1～2次，方能复壮。
第三节制种设施及设备
菌种生产是蘑菇生产的重要环节，所需设施如下：
一、接种设施设备
（一）接种室接种室为高度洁净的无菌区，一般长宽各2米左右，高约2.2米。墙顶装紫外线灯和日光灯各1盏。地面光洁有下水道，墙壁用防水涂料或油漆刷白，便于冲洗消毒。接种室外间为缓冲室，其长度与接种室相同，宽1米。缓冲室墙顶也装紫外线灯和日光灯各l盏，壁上有挂衣架。接种室和缓冲室的门均应为推拉门结构（图4-6）。
图4-6 接种室
1.紫外线灯；
2.日光灯；
3.工作台；
4.凳子；
5.种瓶架；
6.窗；
7.推拉门；
8.缓冲间
紫外线灯用于空气消毒，既干净又无污染，是一种很好的消毒方法，因而长期被广泛地采用。紫外线灯管以悬吊在顶棚下为宜，一般应按装在离操作台1.5米处。紫外线作用最适温度为26.7℃。在潮湿情况下，效果降低。紫外线灯一般在最初使用的100小时中很快降低功率，故需在使用100小时后测定其强度(用紫外线光度计测)。如功率下降为原有功率的70%时，就认为失效了，应当即时更换。若不即时更换，不但没有杀菌效力，这个能量还会有利于细菌生长。紫外线灯管的维护极为重要，至少2～4周，甚至每周清洁一次。可用干净软布或酒精润湿过的棉花轻轻擦，要避免在玻璃上产生痕迹，禁止用有油或有腊的布擦，装卸灯管要避兔用手直接接触灯管表面，以防灯管发生失透现象。在使用中，操作人员的眼睛和皮肤切不可直接暴露在紫外线灯光照射下，以防受伤害。
接种室单独使用紫外线照射，而不同时进行无菌通风，是不能达到无菌要求的，其原因是: 1.辐射面积有限紫外线虽有很强的表面杀菌效果，但有效辐射面积有限，即使在应用合理的情况下，也不能杀死空气中全部细菌。因此还需要配合使用化学灭菌及空气过滤，来滤除未被杀死的细菌。
2.穿透力弱细菌多数依附在灰尘上，而紫外线穿透力较弱，对灰尘上的(特别是较大颗粒)细菌，灭活效果并不彻底，而无菌通风是移除灰尘必不可少的措施。
3.通风不良接种室为密闭房间，不能自然通风，如果不采用人工通风，则由于人汗及料瓶
（袋）水份的蒸发增加了室内温度和湿度，致使细菌和霉菌繁殖，且不利于操作人员的身体健康。
条件允许时，应安装空气过滤装置，以滤除杂菌灰尘。无菌通风设备一般是由离心鼓风机、装有滤板的风箱和风道组成。理想的通风设备应有加热或和冷却空气的装置。无菌空气应自室顶棚中央进入，而由房间的下角风口排出，排风的方向应先经过缓冲间，再经过更衣室。标准接种室的气压应保持正压，大约高出室外0.3～0.5大气压，这样就防止了外界不洁空气的反流。
总之，接种室的空气处理，既不能单靠通风，也不能单靠紫外线照射，必须二者结合起来才能达到室内空气净化的目的。
接种室内也可设置超净工作台（图4-7），利用其过滤除菌的原理，先将空气过滤到无菌，然后将无菌空气从风洞处朝一个方向吹出，使工作台面成为局部无菌状态。
图4-7 超净工作台
生物粒子如细菌及真菌孢子的直径大部分在0.5微米左右，因它们不能独立存在，都寄附于尘埃上而成为一个群体，凝聚直径都大于0.5微米，故高效空气过滤器（High Efficiency Particulare Air)）在除尘时除了菌。
接种室或超净工作台的洁净效果如何，可用简便方法检验：在接种工作台上，以平均间隔位置摆放平皿3个,每个皿内装营养丰富并经灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基约20毫升。打开皿盖暴露培养基30分钟再盖上，于37℃培养48小时检查菌落数，平均每个皿中不超过4个为除菌合格。洁净度基本达到100级（国际标准：空气中≥0.5微米的尘埃的量≤3.5粒/升，即达到100级）。
（二）连续式空气消毒洁净器 MKJ空气消毒洁净器是一种新型的空气消毒洁净设备（图版50）。与传统的空气消毒设备比较，MKJ空气消毒洁净器能在有人现场操作的过程中除菌除尘，对人体无害，室内空气可达到10万级～100万级洁净度，因而特别适合接种室进行动态消毒除尘。
1．消毒除尘原理与特点传统的紫外线、臭氧、化学药物等消毒方法都不能在有人状态下持续消毒。实验证明，经过以上方法消毒的接种室，在接种过程中由于人的活动，空气中的菌类总数会达到消毒刚结束时的9倍多。也有实验证明，上述消毒方法消毒过的接种室2小时后空气中菌类含量会回升到消毒处理以前的状态。此外，传统的空气消毒方法无法在有人活动的条件下持续消毒。
MKJ空气消毒洁净器的核心是一种特殊设计的正离子发生器，它能持续不断地产生高浓度的正离子。空气中的菌类处于正离子的包围之中，使细胞迅速获得饱和电量。带负电的菌类细胞在高浓度、高能量的正离子浸润作用下，会迅速发生电解过程，这是一个能量释放过程。由于快速的能量释放，菌类细胞壁遭受严重的破坏，正离子与菌细胞表面接触，放出电荷，吸收相反的电荷。足够的正离子会穿透多孔的细胞壁，渗透到细胞内部，破坏细胞电解质，损坏细胞膜，电刺激作用杀死生物的应用例子很多，但要截杀微米级及亚微米级的细菌或直径更小的病毒，则需要很好的专业设计。
工业静电除尘器具有100多年的应用历史，它对小至0.01微米的气溶胶具有很高的捕集效率。本世纪80年代，日本JEP公司曾经根据工业电除尘器的原理开发研制过电子灭菌器。其发表的报告表明，静电除尘器用以空气除菌可以达到100%的效率。上海交通大学与上海今是净化技术有限公司合作，采用特种电除尘器的电场结构型式研究静电除菌消毒技术，并与空气动力、化学吸附等多种技术结合，研制成可以移动的空气消毒器。
2．接种室空气洁净的必要性尘粒不仅是菌类的依存条件，也是菌类的繁殖条件，并且尘粒
还起传播、扩散菌类的作用。实践证明，接种室仅仅通过消毒方法来防止杂菌污染是消极的。只有有效地拉制空气中的可吸入颗粒物，才能达到消毒的较高要求。例如10万级的洁净室标准为：生物粒子≤88.4CFU/㎡，尘埃粒子≤3500个/L。3．层
3．传统洁净设备的局限性高效空气过滤器（HEPA），虽然可以在有人操作的场合持续除菌除尘，但其结构复杂、体积大、费用高（双人工作台价格约7000元）。而且，被高效过滤器截获的菌类并没有被杀灭，在温、湿度适宜的环境中仍会繁衍。有人采用紫外线灯对过滤材料照射的方法来杀灭滤网上的菌类，这样设备就更显复杂，成本更高。建筑式层流洁净设备需要有较高的建筑要求，还需要有较高的专业施工与维护的要求，由于建筑、施工、维护达不到要求而造成层流设备失效的实例很多。
4．MKJ空气消毒洁净器的特点
（1）无毒副作用能在有人的场所持续除菌除尘，对人体无毒、副作用。
（2）广谱截杀空气中菌类该产品对空气中的气溶胶微生物都可以有同样的截杀功能。实验测试报告证明，该产品工作10分钟，对金黄色葡萄球菌的除菌效果为99.99%；工作15分钟，对枯草杆菌黑色变种芽孢的除菌效率为99.93%。对60立方米空间消毒30分钟，细菌总数可以从180OCFU/㎡下降1CFU/㎡以下。
（4）高效去除可吸入颗粒物能高效去除空气中的可吸入颗粒物，达到l～10万级洁净度。（5）移动方便为非建筑型设计，因而价格便宜（3000-4000元/台），移动方便。
（6）能消除空气中有害气体与异味由于组合式静电场装置的阻力小，因此在设备内可以设置较大吸附容量的活性炭过滤器。活性炭采用特殊的化学浸渍工艺，能有效去除空气中的一氧化碳、苯类、甲醛、氨、臭氧等有害气体，并能滤除各种异味，例如麻醉剂味、血腥味、药物味及用高频电刀手术时产生的异味。
（三）接种箱在资金与场地条件都不充裕的情况下，可用接种箱因陋就简进行接种。接种箱(图4-8)的顶部两侧呈倾斜状，斜面为可开闭的窗门，窗门与箱框需密闭。箱底部两侧箱壁上各有两孔，孔上装袖套，接种时手由袖套伸入箱内操作。箱内有紫外线灯和日光灯。
图4-8 双人接种箱 (单位:厘米)
（四）培养室接种后的种瓶需要在适温条件下培养。为提高建筑面积的利用率,室内可设置菌种架。架数、层次、层距等的设计除考虑培养空间的利用率外,还应顾及摆放种瓶及检查的方便性。床架可以是竹木结构，也可以用角钢制作。架上铺以木板或塑料板，以便摆放菌种瓶。架子的大小规格，依房间大小而定。中间摆放的床架，宽度为1.2～1.4米;依墙摆放的床架，宽度0.7～0.9米即可。床架的层数视菇房高度而定,一般5～6层，每层相距0.5米左右，底层距地面0.3米,顶层距屋顶至少1米。
这里特别强调，蘑菇菌种的培养温度不能超过25℃。否则菌丝容易老化变黄。因此，培养室必须安装空调设备，这也是蘑菇菌种生产成本较高的原因。蘑菇菌种最好避光培养，检查时采用手持式照明灯较为方便。
二、灭菌设备
年生产能力20～50万瓶菌种，加工300～500吨盐渍菇的蘑菇生产厂，必须安装1～2吨的高压蒸气锅炉。
需要指出，蘑菇菌种的生产时间一般处于7～8月份高温高湿季节，因而要求采用高压高温灭菌设备。如果采用常压常温的蒸锅灭菌，则因霉菌孢子或芽孢杆菌不易杀灭而导致麦粒染菌酸败，菌种成品率很低。
高压高温（1.5～2㎏/㎡，125℃以上）灭菌罐，其价格在2～10万元之间，价格高低取决于容积大小与建造水平。不同型号的高压灭菌设备及其适用范围参见表4-2。
表4-2 高压灭菌设备及其有关数据
设备参考价消耗能源用途生产效率
手提高压灭菌器 800元 2千瓦/小时母种制备 100支/2小时
卧式圆形灭菌罐 2万元高压锅炉制栽培种 1200瓶/4小时
卧式方形灭菌柜 6万元高压锅炉制栽培种 800瓶/4小时
利用高压蒸气设备灭菌时，应注意两点：一是灭菌罐内的菌种瓶排列密度须适当，使蒸汽畅通，无死角。二是灭菌罐内冷空气必须排尽，通蒸汽后;打开排气阀，随着罐内温度上升。锅内冷空气便逐渐排出。当有大量蒸汽从排气阀中排出时，再关闭排气阀。灭菌结束后，让其自然冷却。当压力指针回到0位时，打开罐盖1/4开度，利用余热烘烤棉塞，防止骤冷产生冷凝水。然后趁热取出，送入清洁的冷却室进行冷却。
第五章蘑菇堆肥配方与发酵
第一节原料与配方
一、堆肥主料
蘑菇堆肥所用的主料是农业生产中的副产物，如稻草、麦秸、玉米秸、高梁秸、甘薯藤，花生藤等秸秆都可以用来种蘑菇。人、马、牛、猪、羊、鸡、鸭、兔等粪便，都是蘑菇堆肥可选用的粪肥。此外，畜棚禽舍内的垫草(厩肥)，沼气渣以及种过草菇、平菇等食用菌的下脚料也可以作为堆料时的主料。主料约占堆肥总量的90～95％。不论采用那一种原料作为基本材料，都必需充分考虑其保水性和通气性是否合适，仅以营养合适为指标是不行的。例如，玉米秸秆的含糖量虽然高于麦秸，但是用其为主料的堆肥粘重，透气性差，不利于发菌，产菇率亦低。
（一）草料蘑菇菌丝不能固定空气中的二氧化（CO2），因而堆肥中的草料是蘑菇生长所需碳素的主要来源。除氮素外，草料中还含有氮、磷、钾等营养元素。以麦秸为例，1亩小麦约产麦秸400千克，含纯氮1.92千克（相当于碳铵12千克），纯磷0.9千克（相当于过磷酸钙5.62千克），纯钾2.52千克。
在我国，产稻区以稻草为堆肥主料，稻草茎秆软，叶片多，易吸水，腐熟快；产麦区以麦秸为堆肥主料，麦秸较硬且含有蜡质，不易吸水，发酵较慢；将麦秸与玉米秸搭配利用，可扬长避短，互补不足，从而提高堆肥的发酵质量。
干玉米秸应无霉变，将其铡成20～30厘米长的段并经碾压，便于吸水发酵。当年产的鲜玉米秸含水过大，须晾晒几天，含水量降到70%时再用于堆肥。软烂霉变的草料不能用。麦秸在收割之后，必须于烈日下曝晒数天，以速晒速干的麦秸质量最好。若在曝晒时遭雨淋，应及时翻晒，力求干透。优质的麦秸要呈金黄色，质地坚挺，无霉臭味。这种麦秸堆制发酵时，产热量大，养分损失小。麦秸雨淋发热后再摊开晒干，质量就差多了。晒干的麦秸最好贮放在能避雨的通风良好的场棚内。保管不当或水份过高的草料，在贮藏期容易发热霉变而草茎变软，以后堆肥时产热量小，易造成厌气发酵，不可能得到优质堆肥。
（二）畜禽粪蘑菇堆料所用畜禽粪需周年收集，鲜牛粪含水75%左右，通常400～420千克湿牛粪，才能晒出100千克干粪。较大的粪块如不晒透，贮藏时会发热霉变，对以后的堆肥发酵有不利影响。也可采用湿粪贮藏法，事先选好高地挖出粪塘，将随时收集的湿粪倒入粪塘内，用薄膜覆盖好以防雨淋。畜禽粪的营养成分和理化特性介绍如下：
1．马粪性热、质松，保水性强，发酵效果好，碳氮比为21:1，是最理想的粪肥。但马粪含氮量比牛、猪粪低，仅为0.58%，使用时增加些饼肥或含氮化肥以提高其营养成分。2．牛粪牛是反自动物，饲料消化彻底，特别是食用青草的耕牛及牧牛，其粪养分不高。1头成年牛的全年粪便，大约可栽培50平方米蘑菇。干牛粪含氮率为1.65%，比马粪含氮量高；奶牛粪含氮率次之为1.33%。牛粪性热、质粘。因此要根据牛粪的质量确定具体用量，
第一章无菌操作技术 第一节灭菌技术 一、干热灭菌 1.1、灼烧灭菌 【总操作程序】 主要分两个步骤：点燃火源灼烧2～3次。具体操作如下： ①点燃火源 一般使用酒精灯或煤气灯，点燃酒精灯或煤气灯。 ②灼烧2～3次 一般右手持待灭菌的器具，在火焰的外焰上来回灼烧2～3次。 【达标标准】 灭菌后的器具干燥，所有的微生物被杀死。 【注意事项】 ①正确使用火源，防止失火。 使用酒精灯时，先要检查灯芯，如果灯芯顶端不平或已烧焦，需要剪去少使其平整，然后检查灯里有无酒精，灯里酒精的体积应大于酒精灯容积的1/4，少于2/3。在使用酒精灯时，应注意，绝对禁止用酒精灯引烧另一盏酒精灯，而应用燃着的火柴或木条来引燃；用完酒精灯，必须用灯帽盖灭，不可用嘴去吹灭，否则可能将火焰沿灯颈压入灯内，引起着火或爆炸。不要碰倒酒精灯，万一洒出的酒精在桌上燃烧起来，不要惊慌，应立即用湿抹布扑盖。灼烧时应用火焰的外焰 ②主要用于实验室接种针、接种环、试管口和玻璃棒等的灭菌。涂布平板用的玻璃棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。 【相关知识】 干热灭菌的原理：热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 1.2、干热灭菌 【总操作程序】 主要分五个步骤：装入待灭菌物品升温恒温降温开箱取物。具体操作如下： ①装入待灭菌物品 将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱内，关好箱门。 ②升温 接通电源，拨动开关，打开电热干燥箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升，当温度上升到100℃时，关闭排气孔，在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；此时如果还未达到所需的160～170℃,则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，知道达到所需温度。 ③恒温 当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，恒温2h。 ④降温 切断电源，自动降温。 ⑤开箱取物
培菌方法： 1、所谓活性污泥培养，就是为活性污泥的微生物提供一定的生长繁殖条件，即营养物，溶解氧，适宜温度和酸碱度。 （1）营养物：即水中碳、氮、磷之比应保持100∶5∶1。 （2）溶解氧：就好氧微生物而言，环境溶解氧大于0.3mg/l，正常代谢活动已经足够。但因污泥以絮体形式存在于曝气池中，以直径500μm活性污泥絮粒而言，周围溶解氧浓度2mg/l时，絮粒中心已低于0.1mg/l，抑制了好氧菌生长，所以曝气池溶解氧浓度常需高于3－5mg/l，常按5－10mg/l控制。调试一般认为，曝气池出口处溶解氧控制在2mg/l较为适宜。 （3）温度：任何一种细菌都有一个最适生长温度，随温度上升，细菌生长加速，但有一个最低和最高生长温度范围，一般为10－45oC，适宜温度为15－35oC，此范围内温度变化对运行影响不大。 （4）酸碱度：一般PH为6－9。特殊时，进水最高可为PH 9－10.5，超过上述规定值时，应加酸碱调节。 2、培菌法： （1）生活污水培菌法：在温暖季节，先使曝气池充满生活污水，闷曝（即曝气而不进污水）数十小时后，即可开始进水。引进水量由小到大逐渐调节，连续运行数天即可见活性污泥出现，并逐渐增多。为加快培养进程，在培菌初期投加一些浓质粪便水或米泔水等，以提高营养物浓度。特别注意，培菌时期（尤其初期）由于污泥尚未大量形成，污泥浓度低，故应控制曝气量，应大大低于正常期曝气量。 （2）干泥接种培菌法：最好取水质相同已正常运行的污水系统脱水后的干
污泥作菌种源进行接种培养。一般按曝气池总溶积1％的干泥量，加适量水捣碎，然后再加适量工业废水和浓粪便水。按上述的方法培菌，污泥即可很快形成并增加至所需浓度 （3）数级扩大培菌法：根据微生物生长繁殖快的特点，仿照发酵工业中菌种→种子罐→发酵罐数级扩大培菌工艺，分级扩大培菌。如某工程设计为三级曝气池，此时可先在一个池中培菌，在少量接种条件下，在一个曝气池内培菌，成功后直接扩大至二三级。 （4）工业废水直接培菌法：某些工业废水，如罐头食品、豆制品、肉类加工废水，可直接培菌；另一类工业废水，营养成分尚全，但浓度不够，需补充营养物，以加快培养进程。所加营养物品常有：淀粉浆料、食堂米泔水、面汤水（碳源）；或尿素、硫氨、氨水（氮源）等，具体情况应按不同水质而定。 （5）有毒或难降解工业废水培菌：有毒或难降解工业废水，只能先以生活污水培菌，然后再将工业废水逐步引入，逐步驯化的方式进行。 （6）直接引进种菌种培菌：有些特殊水质菌种难于培养，还可利用当地科研力量，利用专业的工业微生物研究所培养菌种后再接种培养，如PVA（聚乙烯醇）好氧消化即有专门好氧菌。此法，投资大，周期长，只有特殊情况才用。 3、驯化：在培菌阶段后期，将生活污水和外加营养物量，逐渐减少，工业废水比例逐渐增加，最后全部转为受纳工业废水，这个过程称为驯化。理论上讲，细菌对有机物分解必须有酶参与，而且每种酶都要有足够数量。驯化时，每变化一次配比时，需要保持数天，待运行稳定后（指污泥浓度未减少，处理效果正常），才可再次变动配比，直至驯化结束。
香菇菌种生产的方法与步骤 (一)母种生产培养基的配方选择 一是马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基(PDA)：去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂16~23克，水1 000毫升。氢离子浓度1 000~10000纳摩／升(pH5~6)，用于分离、培养菌种。 二是PDA改良培养基(甲)：马铃薯(去皮)200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾(KH2PO4)2克，硫酸镁(MgSO4)0．5克，维生素B110毫克，琼脂20克，水1000毫升，灭菌后氢离子浓度3163～10000纳摩／升(pH5．0～5．5)，用于培养、分离菌种。 三是PDA改良培养基(乙)：马铃薯(去皮)200克，麸皮或米糠50克，硫酸镁0.5克，维生素B110毫克，琼脂20克，灭菌后氢离子浓度3163～3981纳摩／升(pH5．4～5．5)。 四是PDA改良培养基(丙)：心材木200克，细米糠(或麸皮)100克，硫酸铵1克，麦芽糖(或葡萄糖)20克，琼脂20克，水1 000毫升，灭菌后氢离子浓度3163～10000纳摩／升 (pH5.0～5.5)，用于分离菌种。 五是麦芽浸膏、酵母浸膏、琼脂培养基(MYD)：麦芽浸膏3克，葡萄糖10克，酵母浸膏3克，琼脂20克，蛋白胨5克，水1 000毫升(用于菌种培养)。 六是麦芽浸膏、蛋白胨培养基(MPA)：麦芽浸膏20～25克，蛋白胨10克，琼脂20克，水1 000毫升(用于分离、培养、保存菌种)。 上述6个培养基配方中，马铃薯、葡萄糖、琼脂(PDA)配方应用最普遍。在此着重介绍PDA培养基的配制方法与步骤： 1．制备培养基的操作程序 选择优质马铃薯，去皮或挖去发芽眼，削去发青皮，切成薄片，称取200克，置于钢精锅，加水1 000毫升，煮沸后小火保持30分钟，趁热用8层纱布过滤后放人有1 000毫升刻度的量杯(或量筒)中，补充水到1 000毫升，倒回钢精锅，加琼脂继续加热，待琼脂溶化后，再加葡萄糖，再补水至1000毫升，用玻璃棒搅均匀，趁热分装试管，或装入三角瓶备用。 2．分装试管 将配制好的PDA培养基，趁热(60℃)倒人事先准备好的量杯或玻璃漏斗，分装试管。每支试管装培养基为管长的1／4，培养液不可贴附管口内壁，如有沾附物必须揩拭干净。 3．做棉塞 取适量棉花做成较紧实的棉塞，塞入试管约2厘米左右，外留1厘米，紧贴试管内壁，松紧度
菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的
"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就
菌种保藏方法 中国工业微生物菌种保藏管理中心 微生物菌种保藏对于微生物菌种的研究和利用至关重要。以下是中国工业微生物菌种保藏管理中心整理的目前国际国内常用的菌种保藏方法，包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法，各种菌种保藏方法都有详细的步骤说明。 定期移植法 亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断
搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。2.1.4 密波状蜿蜒划线法
蘑菇菌种与生产 蘑菇生长繁殖离不开菌种。在英语中，蘑菇菌种译为“Spawn”，此词来源于拉丁文，为扩大的意思，因此蘑菇接种的本意是“移植”。 第一节有关菌种的概念 蘑菇的“种籽”是孢子，通常所用的菌种是菌丝体，相当于高等植物的秧苗。种籽一般处于休眠状态，而秧苗常处于生长状态。蘑菇栽培用的菌种是菌丝体，就如水稻不用种籽，而用秧苗一样。 蘑菇菌种由三部分组成，即蘑菇菌株的纯菌丝体、菌丝体着生的基质和包装容器。蘑菇菌种因培养基质结构不同，有固体菌种与液体菌种之分。在固体菌种中，按基质成分的不同，又分为粪草菌种、谷粒菌种等。若按菌种生产繁殖过程的先后，又有母种、原种、栽培种之分，或称其为一级种;二级种、三级种。 蘑菇菌种的生产与作物种子的扩繁有本质的差别，其原因是菌种生产为无性繁殖过程，不发生遗传重组，母种、原种和栽培种之间的基因型是不变的，所以蘑菇菌种的分级尤其是原种与栽培种的划分是人为的。在生产实践中，原种与栽培种可能有一定的差别，这种差别不是由于菌种本身种性的差别，而是在菌种生产过程中由于隐性污染，栽培种的纯度可能比原种低。 做为食用菌生产者，弄清有关蘑菇菌种的概念是很有益的，本节介绍有关知识。 一、种、品种、菌株及菌号的区别 （一）种“种”（species）是生物分类的基本单位，在“属”（Genus）之下，特指具有一定形态特性和生理特性以及一定自然分布区的生物类群。同一种的个体之间遗传特性相似，彼此间交配可育。不同种间的个体则不能相互交配或交配后不能产生有生育能力的后代。生物的每个种都有学名，学名按双名法，用两个拉丁词组成。前一个为属名，用拉丁文名词表示，如Agaricus 意为“蘑菇属”;后一个为种名，常用拉丁文形容词表示，以描述该种的主要特征，如bisporus意为“双孢的” 。 （二）品种每一个品种均有共同祖先，有一定的经济价值，是遗传性状比较一致的人工栽培的食用菌群体，蘑菇品种参照农作物对品种的定义(variety指植物；breed指动物)。品种是人工选择的结果，是人们利用同一物种不同个体间的差异，按照人炎的经济目的不断选择培培育而成，能适应环境条件和栽培条件，在产量和品质上比较符合人类的要求。农作物品种一般指具有高产、优质、农艺性状好，可人工大量栽培的品系，所以品种的定义为“具有生产应用价值的菌株”。我国农作物品种的应用需要经过品比试验，区域性栽培试验，最后须经过作物品种审定委员会评审，批准后取得品种资格方可应用于生产。因而选育一个优良的品种往往需要几年甚至十几年。 （三）菌株在微生物学中，菌株（strain或line）又称为“品系”、“菌系” 或“小系”，含义是起源于共同祖先的相似的个体，如同一种、同一品种、同一子实体分离出来的纯的培养物。在遗传学中一般是指自交或近亲繁殖若干代后，所获得的遗传性状比较稳定的后代。菌株与品种是两个不同的概念，所有的分离培养物只要具有差异性，都可认为是不同的菌株。而品种强调的是生产性状要有代表性，品种可以是某一菌株，但不是所有的菌株都是品种，因为品种必须经过权威部门审定。优良菌株经过鉴定、品比、繁育后，即可成为品种。菌株可作为育种材料，但不是所有的菌株都具有生产应用价值。 不同菌株之间的差异可以是形态差异，也可以是农艺性状或是生理生化方面的差异。区别不同菌株传统的做法是进行拮抗实验或极性测定，现在还可应用同工酶图谱、DNA指纹图谱等鉴别技术。 （四）菌号按国际细菌命名法规（1976），菌株(Strain number)的命名可用任何形式，可
污水处理菌种培养方法 培菌方法： 1、所谓活性污泥培养,就是为活性污泥的微生物提供一定的生长繁殖条件,即营养物，溶解氧,适宜温度和酸碱度。 (1）营养物：即水中碳、氮、磷之比应保持1００∶5∶1。?(２)溶解氧:就好氧微生物而言,环境溶解氧大于0.3mg/ｌ,正常代谢活动已经足够。但因污泥以絮体形式存在于曝气池中，以直径5０0μm活性污泥絮粒而言,周围溶解氧浓度２ｍｇ/l时,絮粒中心已低于0.1mｇ/l,抑制了好氧菌生长,所以曝气池溶解氧浓度常需高于3-５mｇ/ｌ，常按5－10mｇ/ｌ控制。调试一般认为，曝气池出口处溶解氧控制在2mg／ｌ较为适宜。 (３）温度:任何一种细菌都有一个最适生长温度，随温度上升，细菌生长加速,但有一个最低和最高生长温度范围，一般为10-４5oC，适宜温度为15-35oC,此范围内温度变化对运行影响不大。?(4）酸碱度:一般PH为6-9。特殊时,进水最高可为PH 9-１0.5,超过上述规定值时,应加酸碱调节。?2、培菌法:?（1）生活污水培菌法:在温暖季节，先使曝气池充满生活污水，闷曝（即曝气而不进污水）数十小时后，即可开始进水。引进水量由小到大逐渐调节，连续运行数天即可见活性污泥出现,并逐渐增多。为加快培养进程,在培菌初期投加一些浓质粪便水或米泔水等,以提高营养物浓度。特别注意,培菌时期（尤其初期)由于污泥尚未大量形成，污泥浓度低，故应控制曝气量，应大大低于
正常期曝气量。 (2)干泥接种培菌法:最好取水质相同已正常运行的污水系统脱水后的干污泥作菌种源进行接种培养。一般按曝气池总溶积1%的干泥量，加适量水捣碎，然后再加适量工业废水和浓粪便水。按上述的方法培菌，污泥即可很快形成并增加至所需浓度(3）数级扩大培菌法：根据微生物生长繁殖快的特点，仿照发酵工业中菌种→种子罐→发酵罐数级扩大培菌工艺,分级扩大培菌。如某工程设计为三级曝气池，此时可先在一个池中培菌,在少量接种条件下,在一个曝气池内培菌，成功后直接扩大至二三级。?（4)工业废水直接培菌法：某些工业废水，如罐头食品、豆制品、肉类加工废水，可直接培菌;另一类工业废水，营养成分尚全,但浓度不够,需补充营养物,以加快培养进程。所加营养物品常有:淀粉浆料、食堂米泔水、面汤水(碳源);或尿素、硫氨、氨水(氮源）等，具体情况应按不同水质而定。 (5）有毒或难降解工业废水培菌：有毒或难降解工业废水,只能先以生活污水培菌,然后再将工业废水逐步引入，逐步驯化的方式进行。?(6)直接引进种菌种培菌：有些特殊水质菌种难于培养,还可利用当地科研力量,利用专业的工业微生物研究所培养菌种后再接种培养，如PVA(聚乙烯醇）好氧消化即有专门好氧菌。此法,投资大,周期长,只有特殊情况才用。 ３、驯化:在培菌阶段后期，将生活污水和外加营养物量,逐渐
新修订幼儿园阶段原创精品配套教材 小班艺术教案：绘画活动《蘑菇》教材定制 / 提高课堂效率 /内容可修改 Small class art lesson plan: painting activity "Mushroom" 教师：风老师 风顺第二幼儿园 编订：FoonShion教育
小班艺术教案：绘画活动《蘑菇》 活动目标：1.会用大小不同的椭圆形和半圆形画出蘑菇的基本形状。2.学习使用多种颜色来装饰蘑菇。3、掌握从上到下，从左到右，色彩均匀的涂色技巧。 活动准备：小兔头像、蘑菇图片，范画、画纸、油画棒。 活动过程： 一、故事导入，引出课题 1.教师一边出示小兔头像，一边说：今天小白兔早早起床，拿了一只篮子要到树林里去它边走边唱，非常高兴，因为它要到树林里采它最喜欢吃的蘑菇。终于来到了树林，可这时太阳公公却躲起来了，还下起了毛毛雨，小白兔没带雨伞，怎么办呢?你猜猜小白兔想到了什么办法来避雨吗？(幼儿自由议论) 2．原来小白兔一口气跑到了蘑菇地里避雨，这里的蘑菇可神奇了（出示蘑菇图片），大大小小的，不仅有小白兔喜欢吃的小蘑菇，大蘑菇还可以做小兔的蘑菇房，这不，小白兔跑到大蘑菇下避雨来了，所以小兔子最喜欢蘑菇，它想摘很多很多回去送给它的好朋友们，我们小朋友来帮帮它吧，画
些漂亮的蘑菇送给小兔子的朋友好不好？ 二、教师示范作画 1.出示范画：我们一起来看看蘑菇长什么样子的?怎么画呢?(幼儿观察后自由讨论) 2、教师请幼儿说说，总结画蘑菇的方法，创编成儿歌的形式（ppt出示）：圆圆的，扁扁的，像房子，像花伞，一个个，地上长，小白兔，真喜欢。 3、幼儿跟读儿歌。 4、教师边念儿歌示范画两个具有代表性的蘑菇：先画椭圆形或半圆形的蘑菇顶，在蘑菇顶中间底下画上蘑菇柄，然后在蘑菇顶上画上不同颜色的小圆点或者斜纹作装饰，最后给蘑菇涂上漂亮的颜色(教师示范时，强调涂色规则：从上到下，从左到右，色彩均匀)。 5、带领幼儿边说边画：请小朋友伸出右手食指，边读儿歌边画蘑菇。(书空练习) 三、幼儿作画，教室巡回指导 1.发放画纸和油画棒，鼓励幼儿大胆落笔，画出大小不同的蘑菇，并提醒幼儿作画时注意顶和柄的衔接。 2、会用多种颜色给蘑菇画上漂亮的花纹。 3、帮助能力差的幼儿画好蘑菇顶，并鼓励孩子自己模仿作画。 四、讲评作品
低温保存管（cryo tube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryo tube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环
（2）平板划线法 冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b ) 适用于霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期 ( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养 (Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。
中班美术大蘑菇教案 【篇一：大班音乐评课稿】 《大班音乐活动：拨浪鼓》评课稿——冯静聪听了徐慧老师的音乐活动，总体印象可以用一个字“妙”字来概括：选材妙——具有迁 移性；教具妙——有效解决重难点；师生互动妙——轮唱方式多样化；具体表述如下几点： 一、选材妙——具有迁移性；能站在幼儿原有歌唱经验的基础上进行教学，我觉得是教师的一大成功之处。徐老师有 意识的将回声唱和轮唱的共同点作为开展教学活动的切入点，不但构思巧妙，而且也符合幼 儿的学习特点。但轮唱的要求又高于回声唱，因此，教师在一开始“山谷回音真好听”中非 常巧妙的揉入发声练习，又引导幼儿对原声和回声进行了比较和演唱，为学习轮唱作好了铺 垫。使选材上既有基点，又有高点。 二、教具妙——有效解决重难点；在教具上的“妙”主要体现在两个转化上。一是将“回音唱”的图片巧妙的转化为“轮 唱”的图谱：教师运用图片分割的方法，将幼儿在“波浪鼓”的学唱过程中逐条翻转，让我 们可以感受到“山谷回音真好听”自然的迁移转换到“拨浪鼓”中。二是将轮唱的难点在图 谱中巧妙转化：教师利用形象的图案（如“天晴朗用太阳表示）帮助幼儿快速记忆歌词，用 第一、二声部图案错开的办法来帮助幼儿掌握轮唱的技巧。正是基于这两个转化，教师巧妙 的解决了幼儿的学习难点——迁移回声唱经验和掌握轮唱方法。三、师生互动妙——轮唱方式多样化在教学过程中，教师充分挖掘了师生、生生的互动关系，运用第一、二声部换唱、换角 色唱、与配班老师唱等方法，与听课老师唱等方法，使轮唱方式呈现了多样化的特点，也使 幼儿的参与兴趣有效保持，同时也有效的挖掘了听课现场中教师、配班的教学资源，使师生 互动发挥的淋漓尽致。
常用的几种微生物接种方法 接种细菌应用接种针（环）来沾取细菌标本，进行接种。接种环与接种针为用白金丝或合金丝所制，亦可用电炉丝代替，因它能耐高热且散热快，便于接种前后通过火焰灭菌（整个接种环烧红即达到灭菌目的）。在使用接种环时一般用右手持笔式较为方便，左手可持培养基进行配合，其接种程序可分为：灭菌接种环→稍冷→沾取细菌样品→进行接种（包括：启盖或塞、接种划线、加盖或塞）→进行接种环灭菌等五个程序。不同培养基，接种方法也不同，分述如下： 一、平板划线接种法（分离培养法） 是将细菌分离培养的常用技术，其目的是将混有多种细菌的培养物，或标本中不同的细菌（病原菌与非病原菌）使其分散生长，形成单个菌落或分离出单一菌株，便于识别鉴定。平板划线接种方法较多，其中以分段划线法与曲线划线法较为常用。 （一）分段划线法 平板分段划线(左)及培养后菌落分布图 本法多用于含菌量较多的标本。方法是以接种环沾取少许样品先涂布于平板培养基表面一角作为第一段划线（划线时接种环与培养基表面呈45度角），然后将接种环置火焰上灭菌，俟冷（可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却），于第二段处再作划线，且在开始划线时与第一段的划线相交接数次，以后划线不必再相接，待第二段划完时，再如上法灭菌，接种划线，依次划至最后一段，灭菌接种环。这样每一段划线内的细菌数逐渐减少，即以获得单个菌落，划线接种完毕，盖好平皿盖，倒置（平板底部向上）于37℃温箱中培养。 （二）连续划线法：此法多用于接种材料中含菌数量不太多的样品或培养物。方法是先将样品或培养物涂于平板表面的一角，然后用接种环自样品涂擦处开始，向左右两侧划开并逐渐向下移动，连续划成若干条分散的平等线。
菌种培养方法 污水处理-生活污水培菌法：在温暖季节，先使曝气池充满生活污水-污水处理，闷曝（即曝气而不进污水）数十小时后，即可开始进水。引进水量由小到大逐渐调节-污水处理，连续运行数天即可见活性污泥出现，并逐渐增多。为加快培养进程-污水处理，在培菌初期投加一些浓质粪便水或米泔水等，以提高营养物浓度。特别注意，培菌时期-污水处理（尤其初期）由于污泥尚未大量形成，污泥浓度低，故应控制曝气量-污水处理，应大大低于正常期曝气量。 1. 前期准备阶段 1.1. 物料准备①污泥准备对于万立方米级污水处理装置而言，其 生化池体积较大，为了保证生化池初始污泥浓度，需要准备投加的原始污泥量很大。理论上讲，投加后生化池的污泥的质量浓度最好控制在2 500mg/L左右。实际运行时，为了节约成 本，调试期间初始污泥的质量浓度可控制在1 500mg/L左右，一日处理1×104m3污水生化 时间为12h的污水处理装置为例，调试前需准备含水率在80%的活性污泥约40m3。污泥品种最好是同类或相似的活性污泥。如有困难，其它活性较强的污泥也可使用。污泥在使用前为保证一定的活性，对待用的污泥需进行喷水保湿处理，在保湿条件下污泥的活性至少可保持15d以上。 ②碳源培养前的准备生化调试过程中理想的碳源是大粪及淀粉。一般来说调试前期以加入大粪为主，中后期以加入淀粉为主，为接生成本，淀粉可用地脚面粉替代。由于大粪无法事先储存，因此，事前需和有关部门确定好调试期间需要的数量。调试期间碳源准备量一般按如下原则进行估算。每天投加到生化池的COD量按混合后生化池COD的质量浓度在200~300mg/L水平计，其中地脚面粉COD的质量折算量约为1t[COD]/t[面粉]。大粪的COD 折算比较困难，根据经验，在整个调试期间需100~150 m3的大粪。加入大粪的目的除补充 碳源外，还可增加生化池菌种的引入。地脚面粉可准备10~15t。③磷源、氮源的准备补 充碳源一般以普钙Ca（H2PO4)2为主，补充的氮源以尿素CO（NH2）2为主。生化池COD的质量浓度在300mg/L时估计BOD5值一般以100mg/L计，补充量按 m（BOD5）：m（N）：m （P）=100：5：1折算，每天需补充淀粉2000-3000kg，尿素100kg，补普钙200kg，质量比按照淀粉：尿素：普钙=20-30：1：2补给。调试期间需准备尿素2~3t，普钙5~6t。另外如有条件可准备10~20kg粉状阴离子聚丙烯酰胺（PAM）。 1.2. 物料化制及输送设备由于调试期间需要的物料量很大，加之生化调试无污水进入，池内污水流动性较差，为提高接种速度，需要将污泥及补充碳源尽可能均匀地输入各生化池内。因此，对于一定规模的污水处理设施设置物料化制及物料输送系统，对减轻劳动强度提高调试效率是必需的。根据经验，物料化制池宜设于地下，池内设空气搅拌装置，池容积一般在20~30m3。池内分二区，一区为化制区，该区需设置物料化制及初级垃圾清理装置；二区为输送取，设置潜水泵或液下泵，同时在泵周围设置垃圾同以防泵发生堵塞。输送管道在生化池附近宜使用软管以便根据需要调整投加料点位置。另外，物料化制旁最好设置一个消火栓或供水管，用于化制污泥及其它物料时供水。 1.3. 监测仪器准备为配合生化调试，需对生化池中的COD（铬法）、溶解氧、pH值、细菌等指标进行监测。一般生化处理调试需配备以下监测仪器：COD测定仪、溶解氧测定仪、pH值测定仪、显微镜。 2. 调试阶段 2.1. 初期（3d）①首先将生化池注入一定量的清水和部分待处理的污水， 然后将污泥倒入物料化制池。一般第1次投加20m3污泥，同时投加大粪等培养料，加水搅
《蘑菇圆圆把家住》课堂实录 一、创设情境，导入新课： 1、同学们都看过动画片《熊出没》，请问：熊大、熊二住在什么地方？ 2、我昨天收到熊大的一封信，请你大声地朗读信的内容，那么我们今天就一起创作属于熊 二的“蘑菇房”。 二、仔细观察，分析作品： 1、请同学们仔细观察52页的效果图，蘑菇房有哪些形状组成？ 2、老师认为蘑菇房是由房顶、烟囱、门窗三部分组成的，同意吗？从上到下观察：（1）、烟囱由矩形和2条直线组成。 （2）、房顶有圆弧、直线组成，内部有圆形装饰。 （3）、墙体、门窗由矩形、圆角矩形、直线组成。 3、请同学们观察52页的3副小图，告知我们了绘画步骤，第一步：绘制房顶，第二步：绘制烟囱，第三步：绘制门窗，老师称之“绘画三步曲”。 三、小试牛刀，绘制房顶： 1、让我们一起打开“画图”软件，开始创作房顶吧。请思考：怎么画出半圆形的房顶？ 你说：利用椭圆工具画出一个圆形，再用橡皮擦工具擦除一半。 （想法很好，表达清楚，谢谢你请坐）老师按照你的想法画图。 老师也想出了一种方法：请看老师操作，老师认为蘑菇房的线条稍粗点好看感觉房顶更结实，我会选择直线中的加粗线条，我认为房顶是正圆形会不会好看一些，结合课题蘑菇圆圆把家住，要借助键盘上的SHIFT键帮助我画出正圆。（要领：按住SHIFT键不松开，拖动鼠标画正圆） 刚才这位同学使用橡皮擦工具擦除圆的一半，有没有发现两边的点不能完全保持在一条直线上，所以说橡皮工具我们会拿捏不准。我使用选定工具，单击选定工具，在正圆形的一半拖动选定，在选定区域点击鼠标右键，单击清除选定内容，这样能保证2点在一条水平线上。 单击直线工具，拖动绘制直线（发现直线不直还得使用SHIFT键帮助），（要领：按住SHIFT 键不松开，拖动鼠标绘直线），请同学们观察2个房顶，有什么发现？ A、直线不直 B、第一幅图没有封闭 2、实验：教师分别给2个房顶填色，请同学们仔细观察结果，分析为什么？（封闭图形），老师教大家一个小技巧：使用放大镜工具放大图形，检查是否封闭。如有多余部分，使用橡皮擦工具小心擦除。（精益求精，认真完成我们的首副作品） 3、同学们修饰房顶，绘制大小不等的圆形，这样房顶就绘制好了，同学们想尝试吗？（请参照书本53-54页的绘制房顶的2，3，4，5步或者求助组员和老师）（计时4分钟） 四、添加烟囱： 师：绘画三部曲，第一步绘制房顶已经完成，下面我们一起添加烟囱，通过之前的介绍，烟囱是由2条直线和1个矩形构成的。同学们一起来看老师的操作：首先选择“直线”工具画出烟道，利用“选定”工具选择两条直线的顶端，然后按delete键删除选定部分，使得两条直线顶端对齐，最后选择“矩形”工具，绘制出烟囱顶。再使用放大镜工具和橡皮擦工具检查是否封闭和完善。其实老师的操作都是来自书本55页的步骤1和步骤2，下面请同学们参照书本步骤完成创作吧！（时间3分钟）（同桌互助，组长检查成员是否都已经完成）五、大显身手、完善作品： 师：绘画三部曲，第一步绘制房顶、第二步添加烟囱都已经完成，下面我们一起绘制门窗，请同学们打开书本56-57页，（讲解步骤）同学们已经掌握了“椭圆”“直线”“矩形”工具
活性污泥菌种培养
活性污泥有多种培养方法，但不同的方法所要求的培养时间和人力物力均不同。应根据废水水质、气候、实际许可的条件等情况来选择培养方法。 1.培养前的准备工作 （1）各构筑物建成，并经清池清除建筑垃圾，静压试验证明无渗漏，无下沉位移，最后按有关规程验收合格。 （2）电器、机械、管路等全部设备建成并经单机试车、联动试车正常。最后按有关规程（说明书）验收合格。 （3）根据日后运行管理需要，有条件的污水处理厂（站）需进行最基本的常规化验测试，如pH、水温、COD、DO、生物相等，用以指导活性污泥的培养过程和日常运行。 （4）基础数据的调查摸底，包括污水流量昼夜变化情况，水质（pH、水温、COD、BOD5/CODCr、含氮、含磷、有毒物质等）及其变化情况，各种设施和设备的技术参数。有条件的地方最好对受纳水体(如接纳排污的河流等)本底水质调查备案，以便考察若干年后对受纳水体的影响提供依据。
（5）根据处理水质状况备足必需的营养物(碳源、氮源、磷源)，以备缺什么补什么。采用接种培菌法还需备足污水性质相似其他污水处理厂（站）的干（或浓缩）污泥作为活性污泥微生物培养用的菌种。 （6）操作人员应熟悉整个系统的管道布置和公用工程方面的情况，了解污泥培养的基本过程和控制要求。 （7）人员到位，自培养和驯化后一般应使系统连续运行，不能脱人。 （8）编制必要的化验和运转的原始记录报表以及初步的建章立制。从培菌伊始，逐步建立较规范的组织和管理模式，确保启动与正式运行的有序进行。 自然培菌 自然培菌，也称直接培菌法。它是利用废水中原有的少量微生物，逐步繁殖的培养过程。城市污水和一些营养成份较全、毒性小的工业废水，如食品厂、肉类加工厂废水，可以考虑这种培养方法，但培养时间相对较长。自然培菌又可分为间歇培菌和连续培菌二种。 （1）间歇培菌。将曝气池注满废水，进行闷曝（即只曝气而不进废水），数天后停止曝气，静置沉淀1 h，然后排出池内约1/5的上层废水，并注入相同量的新鲜
污水处理菌种培养方法 污水处理生化段需要用到哪些微生物菌种？目前市面感觉比较好用的是甘度污水处理菌种，比如甘度复合菌种、甘度反硝化细菌、甘度硝化细菌等；这些菌种都可以去除什么指标？今天我们就来聊聊甘度复合菌种、甘度反硝化细菌、甘度硝化细菌污水处理常用菌种培养方法？ 具体污水处理菌种对应的功效介绍： 1、甘度复合菌种：降解COD/BOD/氨氮/总氮/总磷等污染物；助力新老系统快速启动。 复合菌种主要是降解COD/BOD/氨氮/总氮/总磷等污染物，复合菌种是一个复合型菌种，属于兼性菌种，主要成分硝化细菌属、反硝化细菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和活化酶以及多糖等等。同时应用于新老系统启动也具有非常好的效果。 2、甘度硝化细菌：主要降解氨氮 氨氮的去除所用的细菌是硝化细菌，硝化细菌属于好氧菌种，主要应用于好氧池，其成分主要是亚硝酸菌和硝酸菌组成。 3、甘度反硝化细菌：主要降解总氮 总氮的去除所用的细菌是反硝化细菌，属于厌氧菌，主要应用于厌氧池或缺氧池，其主要成分是假单胞菌属、芽孢杆菌科等等。 硝化阶段 硝化阶段：含氮有机物（有机氮）在有氧货无氧环境中被氨化为氨氮，改部分污水进入有氧的处理构筑物后，在亚硝酸细菌和硝化菌的做一下转化为硝酸盐氮，为后续反硝化提供准备。 控制条件： 1、溶解氧：溶解氧控制在2~3mg/l之间，溶解氧低于0.6mg/l硝化过程将受到较大抑制， 2、水温：硝化菌比较合适的水温25~35℃之间。通常低于5℃时，细菌的活性会受到抑制，硝化菌就很难发挥它的作用。 3、PH值：硝化菌最佳的PH值7.5~8.5之间 4、底物浓度：硝化细菌是自养型好氧菌，底物浓度对于硝化菌不是其生产的必要因素。 5、污泥龄：需要保证好氧系统的微生物有足够的硝化菌，提供硝化菌的浓度，通常将污泥龄控制在10d左右。 反硝化阶段 反硝化阶段：承接硝化段的产物硝酸盐氮，对其进行反硝化反应，使硝酸盐氮转化为氮气排出水体。 PH值：反硝化过程合适的PH值6.5~7.5，PH值控制不当，将影响反硝化细菌的生长速率及
如何选育菌种？ 为了获得适合大规模工业生产所需的优良生产菌种，一般首先是从自然界分离筛选具有产生目标产物能力的菌种，但这样获得的菌种的生产能力往往较低，生理生化特性不一定能满足生产要求，还需要进行大量的诱变选育，进一步提高其生产能力，改善性能；也可以对现有的生产菌种进行改造，即经诱变育种，选育出符合实际生产需要的菌株。 自然界中微生物资源异常丰富，土壤、水、空气、腐败的动植物残骸，都是微生物的主要集居和生长繁衍的场所。其种类之多，至今仍然是一个难于估测的未知数。以其集居环境（包括特殊和极端环境）、营养类型、生存方式、生理类型、代谢途径、合成能力等比较，均居生物界之冠。因此，微生物资源的开发和应用是当今世界瞩目的重大课题。 菌种的分离，不仅是把混杂的各类微生物有效地分开，得到纯种，更重要的是依着生产实际的要求，有的放矢、快速、准确地将能产生所需产物，或具有某种生化反应性能的菌种，从大量的微生物中挑选出来。有时是设计一种在分离阶段便能识别所需菌种的方法，更多的是利用特定的方法分离，获得所需菌种后，再进行识别。为了使获得的菌种能满足工业生产的需要，须考虑各种性能指标。因此，菌种分离和筛选的方法和策略就十分重要。 一般的菌种分离纯化和筛选步骤可分为采样、增殖与分离、发酵与性能测定等几个步骤。步骤和方法如下图所示：
3.发酵培养基如何配制？ 首先需了解微生物需要的营养物质。 （1）微生物需要的营养物质 营养物质应满足微生物的生长、繁殖和完成各种生理活动的需要。它们的作用可概括为形成结构（参与细胞组成）、提供能量和调节作用（构成酶的活性和物质运输系统）。 微生物的营养物质有六大类要素，即水、碳源、氮源、无机盐、生长因子和能源。 ① 水 水是微生物的重要组成部分，在代谢中占有重要地位。水在细胞中有两种存在形式：结合水和游离水。结合水与溶质或其他分子结合在一起，很难加以利用。游离水（或称为非结合水）则可以被微生物利用。 ② 碳源 碳在细胞的干物质中约占50%，所以微生物对碳的需求最大。凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，称为碳源。
菌种的分离与培养 在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。 (一）母种的分离培养 食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。 1.孢子分离法 孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。 （l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。 （2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法，有以下几种：
①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形 成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。用接种针沾取少量孢子在试管 中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。 还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入20℃ 左右恒温箱培养。 ②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇， 用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。 ③钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用无菌不锈钢丝（或铁丝、棉线等其他 悬挂材料）悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到培